Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của rong câu chỉ ( gracilaria tenuistipitata (zang et xia) gracilariaceae) ở hải phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ Gracilaria tenui

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ

(Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia)

- Gracilariaceae) Ở HẢI PHÒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ

(Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia)

- Gracilariaceae) Ở HẢI PHÒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

nhất tới hai người Thầy đáng kính TS Bùi Hồng Cường và TS Đàm Đức Tiến –

người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Tất Thành, ThS Trần Quốc Toàn cùng các anh chị cán bộ Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm

khoa học Việt Nam Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

cùng các anh chị cán bộ của Khoa Dược lý Sinh hóa - Viện Dược liệu Đã nhiệt

tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu của đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy Cô giáo và các anh chị kỹ

thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn

hỗ trợ kịp thời và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại

bộ môn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể

các Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn yêu quý của tôi đã luôn

động viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt qua mọi khó khăn

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, luận văn này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn

Đinh Thị Quyên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Gracilaria tenuistipitata trong hệ thống phân loại 3

1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.3 Phân bố và Sinh thái 3

1.4 Thành phần hóa học 5

1.5 Tác dụng sinh học 6

1.5.1 Độc tính 6

1.5.2 Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan 8

1.5.3 Tác dụng chống viêm 11

1.5.4 Một số tác dụng sinh học khác 11

1.6 Công dụng theo dân gian, y học cổ truyền của rong Câu 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Phương tiện nghiên cứu, động vật thí nghiệm 14

2.2.1 Hóa chất, dung môi 14

2.2.2 Máy và thiết bị 14

2.2.3 Động vật thí nghiệm 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 16

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 16

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học 21

2.4 Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 25

3.1.1 Đặc điểm hình thái ngoài 25

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 26

3.1.3 Đặc điểm sinh sản 27

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 30

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong rong Câu Chỉ bằng phản ứng hóa học 30

3.2.2 Định lượng một số nhóm chất có trong rong Câu Chỉ 31

3.2.3 Phân lập chất trong rong Câu Chỉ 32

3.3 Nghiên cứu một số tác dụng sinh học 39

3.3.1 Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 39

3.3.2 Thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 40

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 44

4.1 Về thực vật 44

4.2 Về thành phần hóa học 45

4.2.1 Định tính 45

4.2.3 Định lượng 45

4.2.2 Phân lập chất 46

4.3 Về tác dụng sinh học 47

4.3.1 Tác dụng chống oxy hóa in vitro 47

4.3.2 Tác dụng chống oxy hóa in vivo 47

KẾT LUẬN 49

1 Về thực vật 49

2 Về thành phần hóa học 49

3 Về tác dụng sinh học 49

KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ALT Alanin amino transferase

AST Aspartat amino transferase

BHA Butyled hydroxylanisol

TLTK Tài liệu tham khảo

UV Ultra violet (tia cực tím)

δ Độ dịch chuyển hóa học (Đơn vị tính học ppm)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Gracilaria ở Việt 4

2 Bảng 1.2 Tác dụng dọn gốc oxy hóa của dịch chiết một số loài rong Câu 9

3 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 30

4 Bảng 3.2 Hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ 31

5 Bảng 3.3 Hàm lượng lipid của rong Câu Chỉ 32

6 Bảng 3.4 Thành phần các acid béo của rong Câu Chỉ 32

7 Bảng 3.5 Phổ 1H - và 13C - NMR của hợp chất RC1 35

8 Bảng 3.6 Phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất RC2 37

9 Bảng 3.7 Tỉ lệ dọn gốc DPPH của các cắn dịch chiết rong Câu Chỉ 39

10 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của cắn dịch chiết methanol RCCh lên hoạt độ

ALT trong huyết thanh chuột bị tổn thương gây bởi paracetamol

40

11 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cắn dịch chiết methanol RCCh lên hoạt độ

AST trong huyết thanh chuột bị tổn thương gây bởi paracetamol

41

12 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của cắn dịch chiết methanol RCCh lên hàm lượng

MDA dịch đồng thể gan

43

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 2.1 Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ 13

2 Hình 2.2 Nguyên tác định lượng MDA trong dịch đồng thể gan 23

3 Hình 3.1 Toàn thân rong Câu Chỉ 25

4 Hình 3.2 Mặt cắt ngang thân (10x) 26

5 Hình 3.3 Mặt cắt ngang thân (40x) 26

6 Hình 3.4 Mặt cắt dọc qua túi tứ bào tử 27

7 Hình 3.5 Nhánh rong Câu mang tảo quả 27

8 Hình 3.6 Mặt cắt dọc qua tảo quả 27

9 Hình 3.7 Sinh sản dinh dưỡng ở rong Câu (40x) 28

10 Hình 3.8 Hình ảnh bào tử của rong Câu (40x) 28

11 Hình 3.9 Chu trình sống của rong Câu Chỉ 29

12 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất RC1 (cholesterol) 36

14 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất RC2 39

15 Hình 3.12 Đường chuẩn hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với bờ biển dài hơn 3200km Do trải dài trên nhiều vĩ độ nên có sự đa dạng về các loại hình nền đáy và khu hệ (các kiểu thủy vực như đầm, phá, cửa sông, vũng vịnh và các loại nền đáy khác nhau nên nền đáy cát, sỏi, đá, san hô chết) Đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự tồn tại, phát triển và đa dạng của các loài rong biển

Rong Câu Chỉ Gracialria tenuistipitata Zhang et Xia, họ rong Câu Gracilaria

(Gracilariales, Rhodophyta) có tổng trữ lượng lớn, được sử dụng làm nguyên liệu chính chế biến agar - agar, ethanol ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới và mang lại giá trị kinh tế cao Trong lĩnh vực Y - dược, agar - agar được dùng làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chế thuốc nhuận tràng, làm vỏ bọc thuốc, phối liệu chế thuốc viên, thuốc cao, làm khuôn răng và mắt giả, thuốc đông máu, chỉ khâu trong phẫu thuật [6] Ngoài ra, rong Câu Chỉ còn được dùng làm nộm, nấu thạch giải khát, làm bánh tương đối phổ biến trong dân gian ở nước ta cũng như ở một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Brazil [6], [17]

Ở Việt Nam, rong Câu Chỉ mọc khá phổ biển ở các bãi triều và được trồng với diện tích lớn tại các hệ thống đầm, phá ở các tỉnh ven biển trải dài từ Bắc vào Nam Hải Phòng là một trong số địa phương có diện tích trồng và khai thác rong Câu Chỉ lâu đời và lớn nhất trong cả nước Nước ta nghiên cứu về rong Câu từ những năm

1945, tuy nhiên các nghiên cứu mới tập trung vào đánh giá đa dạng loài, nguồn lợi, điều kiện nuôi trồng, hay tối ưu hóa quy trình chế biến agar mà chưa đi sâu vào đánh giá tác dụng sinh học của rong Câu

Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy rong Câu chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Chan và cộng sự công bố, sản phẩm thủy phân

từ polysaccharid thu từ rong Câu là agaro – oligosaccharid có tác dụng chống oxy

hóa và bảo vệ gan trên cả mô hình in vitro và in vivo [26] Rong Câu Chỉ thu tại

Trung Quốc có tác dụng làm hạ men gan trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan bằng CCl4 [59] Với mục đích tìm nguồn nguyên liệu ứng dụng trong ngành dược,

chúng tôi tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro, cho thấy rong Câu Chỉ

có tiềm năng có tác dụng chống oxy hóa Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:

« Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng

sinh học của rong Câu Chỉ (Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) –

Gracilariaceae) ở Hải Phòng »

Đề tài thực hiện với 3 mục tiêu:

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học của loài rong Câu Chỉ

2 Định tính, định lượng một số nhóm chất chính trong rong Câu Chỉ Phân lập, xác định cấu trúc 1-2 chất từ rong Câu Chỉ

3 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, tác dụng chống oxy hóa và bảo

vệ gan của cắn dịch chiết rong Câu Chỉ

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Gracilaria tenuistipitata trong hệ thống phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật, theo A.L Takhtajan (1987), vị trí phân

loại của Gracilaria tenuistipitata là:

Giới thực vật: Planta

Phân giới thực vật bậc thấp

Ngành tảo Đỏ: Rhodophyta

Bộ rong Câu: Gigartinales

Họ rong Câu: Gracilariaceae Nag [34]

Chi rong Câu: Gracilaria Grve [31]

Loài: Gracilaria tenuistipitata

1.2 Đặc điểm thực vật

Thân rong dạng trụ tròn, dạng phiến hoặc dạng bản dẹt chia nhánh theo kiểu mọc chuyền, chạc hai hoặc thành chùm, bàn bám ở gốc

Cấu tạo của thân rong gồm có: phần lõi là sợi trục chính được hình thành bởi

tế bào lớn, chung quanh có một hoặc hai hàng tế bào vây trụ, phần da gồm 2 - 4 hàng tế bào liên kết chặt chẽ với nhau, càng ra ngoài tế bào càng nhỏ dần Túi bào

tử bốn cắt thành hình chữ thập hoặc bốn mặt hình chùy, hình thành trong phần da của cả thân Túi tinh tử ở dạng ổ vùi trong phần da hoặc tập trung thành đám trên bề mặt Túi bào tử quả dạng bán cầu hoặc hình nón, lồi trên bề mặt thân, chung quanh

có lớp vỏ phát triển thành vỏ bao dầy Sợi liên kết giữa nhánh quả bao và vỏ bao có hoặc không, có lỗ thoát bào tử ở đỉnh [5]

1.3 Phân bố và Sinh thái

Rong Câu (Gracilaria) do chữ gốc Latinh gracilis nghĩa là mảnh khảnh, được Greville mô tả đầu tiên vào năm 1830, chi Gracilaria có 328 loài, nhưng mới

định loại được 186 loài [34] Trung Quốc có 24 loài, Nhật Bản – 17 loài, Malaixia –

5 loài; Đài Loan: 7; Thái Lan: 12 loài; Phillipin: 17 loài; Indonesia: 4 loài [8]; miền Bắc nước Nga: 4 loài [50] Ở Việt Nam đã phát hiện được 12 loài, và 1 biến thể được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Gracilaria ở Việt Nam [8]

3 Gracilaria cuneifolia (Okamura) Lee et Kurogi rong Câu Nêm

5 Gracilaria longirostric Chang et Wang rong Câu Vòi Voi

6 Gracilaria mammillaris (Montagne) Howe rong Câu Phiến Quăn

8 Gracilaria spirunlosa (Okam.) Zhang et Xia rong Câu Gai

9 Gracilaria salicornia (C Agardh) Dawson rong Câu Đốt

10 Gracilaria textorii (Suringar) Hariot rong Câu Dẹp

11 Gracilaria yamamotoi Zhang et Xia rong Câu Nan Quạt

12 Gracilaria tenuistipitata Zhang & Xia rong Câu Chỉ

13 Gracilaria tenuistipitata var liui Zhang & Xia rong Câu Chỉ Mảnh

Trong đó loài rong Câu Chỉ là loài có phân bố và trữ lượng lớn là rong Câu Chỉ Rong Câu Thắt phân bố chủ yếu ở miền Nam và cũng có trữ lượng lớn, còn các loài khác chỉ có ý nghĩa về mặt đa dạng sinh học Trong thời gian qua nhiều công trình công bố liên quan tới nguồn lợi rong Câu như Nguyễn Hữu Dinh, 1969 [4]; Phạm Hoàng Hộ, 1969 [9]; Huỳnh Quang Năng và Nguyễn Hữu Đại, 1978 [11]; Nguyễn Văn Tiến và cộng sự, 1991, 1994, 1996 [12], [14], [13]; Nguyễn Hữu Đại

và Phạm Hữu Trí, 2001 [7], đã cho thấy ngoài nguồn lợi rong Câu khai thác tự nhiên từ các bãi triều ven biển còn có một nguồn lợi lớn từ nuôi trồng tập ở một số vùng trọng điểm như hệ thống đầm nhà Mạc (Quảng Ninh), Đình Vũ, Cát Hải, Tràng Cát (Hải Phòng), Thụy Vân (Thái Bình), Hải Hậu (Nam Định), Hoằng Hóa

4

(Thanh Hóa), Xuân Hội, Kỳ Hải (Hà Tĩnh), sông Gianh (Quảng Bình), phá Tam Giang (Thừa Thiên Huế) ở các tỉnh miền Bắc và Hội An (Quảng Nam), Sa Huỳnh (Quảng Ngãi), Đề Gi, Cồn Chim (Bình Định), đầm Ô Long, sông Cầu (Phú Yên), Ninh Hòa, Cam Gianh (Khánh Hòa), đầm Nại (Ninh Thuận), bến Súc (Bà Rịa - Vũng Tàu), Hòn Chông (Kiên Giang) [8]

Rong Câu Chỉ này thường phân bố trên nền đáy là cát - bùn hoặc bùn, rất ít khi trên đáy cát Nếu phân bố trên đáy cát, thường bám vào vật bám là vỏ sinh vật chết hoặc các loại vật liệu khác

Theo niên giám thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm

2008 Tổng trữ lượng rong Câu Chỉ miền Bắc vào khoảng 4300 tấn khô/năm Tỉnh

có trữ lượng lớn nhất là Ninh Bình (8400 tấn Khô/năm) và thấp nhất là Thanh Hóa (730 tấn khô/năm) với diện tích nuôi trồng khoảng 4.180ha [8]

1.4 Thành phần hóa học

Trên thế giới:

Các tài liệu thu thập được cho thấy, thành phần hóa học của rong Câu Chỉ có: chất xơ (polysaccharid, oligosaccharid ), phần tro (các nguyên tố kim loại), protein, lipid, polyphenol (flavonoid), carotenoid (β - caroten, zeanxanthin, lutein), sắc tố (chlorophyll a) Trong đó polysaccharid là thành phần chính [63], [22], [28], [24]

Gracialaria tenuisitpitata ở Thái Lan gồm: polysaccharid (54,89%), phần tro

(22,91%), độ ẩm (18,87 %), protein (6,11%), lipid (0,26%), chất xơ (4,96%) [28]

Theo công bố của Benjanma và cộng sự, thành phần hóa học của G

tenuistipitata ở miền nam Thái Lan chứa: chất xơ (polysaccharid, oligosaccharid,

chitin, pectin ) khoảng 58,4%; protein 21,6%; lipid 2,8%; hàm lượng tro 17,0%; hàm ẩm khoảng 3,6% [22]

Agar là một polysaccharid chính trong rong Câu

Hàm lượng: Các loài chi Gracilaria đều có agar, hàm lượng agar phụ thuộc

vào loài, chu kỳ sống, mùa và điều kiện môi trường [50], [22] Và do quy trình xử

lý, G tenuistipitata khi chiết không qua xử lý kiềm hàm lượng agar khoảng 17, 1%; còn khi có xử lý kiềm hàm lượng agar tăng lên khoảng 23,6 – 26,1% [64]

Cấu trúc: agar có thể phân tách thành 2 phân đoạn, agarose và agaropectin

+ Agarose được cấu tạo bởi nhiều đơn vị agarobiose Agarobiose là disaccharid của β – D – galactose và 3 - 6 anhydro – α – L – galactose (cấu trúc được xác định sau khi thủy phân trong môi trường acid Nếu đem thủy phân bằng enzyme cấu trúc có khác)

+ Agaropectin,có galactose, anhydrogalactose, L - galactose, nhiều gốc của aicd uronic và este sulfuric [17]

Theo Hemmingson và cộng sự agar được cấu tạo từ các đơn vị: galactopyranosyl, 6 – O – sulfo – L - galactopyranosyl, 3,6 - anhydro – L - galactopyranosyl [38]

D-Ở Việt Nam:

Rong Câu Chỉ: chứa polysacharid 50% (trong đó agar thô chiếm 22,3%); tro

23,9%; lipid 2% (các acid béo bão hòa, không bão hòa); protein 17% [8]

Hàm lượng agar thu ở các loài chi Gracilaria thu ở nước ta dao động khoảng

23,55 - 46,18% trọng lượng khô (trung bình 40,79%) nếu trồng tại hệ thống đầm nuôi thủy hải sản Ở ao, đầm tự nhiên hàm lượng Agar thấp hơn (28,49%) [18]

1.5 Tác dụng sinh học

Ở trong nước, chưa có công trình nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh của rong Câu Chỉ Các công trình liên quan tới loài này hiện đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, đặc biệt ở các nước như Trung Quốc, Thái Lan, Brazil

1.5.1 Độc tính

+ Trên tế bào

Cắn dịch chiết nước của G tenuistipitata liều 800 µg /ml không ảnh hưởng

tới khả năng sống của dòng đại thực bào RAW 264.7 [59]

Cắn ịch chiết ethanol của G tenuistipitata có tác dụng chống tăng sinh dòng

tế bào ung thư miệng (Ca9-22) thông qua cơ chế cảm ứng quá trình chết theo chu trình (apoptosis) và điều tiết quá trình stress oxy hóa [65]

Cắn dịch chiết methanol của G tenuistipitata có tác dụng gây độc tế bào trên

dòng tế bào ung thư miệng Ca9-22, có IC50 = 326 µg /ml (trong 24h) bằng con

6

đường cảm ứng quá trình chết theo chu trình (apoptosis), gây hại ADN, và stress oxy hóa [66]

Hiện chưa có nghiên cứu về độc tính của loài rong Câu Chỉ trên động vật, cũng như chưa có trường hợp báo cáo bị ngộ độc liên quan tới loài này, mặc dù loài này trong dân gian được sử dụng như một loài thực phẩm hàng ngày Chúng tôi có tổng quan một số nghiên cứu độc tính trên động vật và một số trường hợp ngộ độc

liên quan tới một số loài khác thuộc chi Gracilaria nhằm khuyến cáo cho người dân

lưu ý, tránh nhầm lẫn khi thu hái về sử dụng

+ Trên động vật

Cắn dịch chiết aceton của loài G coronopifolia, dùng đường tiêm dưới phúc

mạc gây triệu chứng ỉa chảy ở liều thấp, và gây chết chuột ở liều cao sau khi tiêm

15 phút [37]

Trong thí nghiệm gây độc cấp tính, bột G domingensis liều 2000 mg /kgtt

không gây chết chuột, cũng như không ảnh hưởng tới cân nặng, các cơ quan [49]

Cắn dịch chiết phân đoạn polysaccharid của G cornea, với liều 9 mg/kgtt

chuột, dùng đường tiêm dưới màng bụng liên tục trong 14 ngày, không tìm thấy tổn hại trên các cơ quan gan, thận, tim, lá lách, tuyến ức [21]

Cắn dịch chiết ethanol 50% G corticata có LD50= 1 g /20 g cân nặng chuột, dùng đường tiêm dưới màng bụng [39]

+ Trên người

Năm 1991, ở Guam có báo cáo 13 trường hợp bị ngộ độc, có 3 trường hợp tử vong, với các triệu chứng như buồn nôn, nôn, giãn cơ, hạ huyết áp có liên quan tới

loài G tsudai [37]

Năm 1993, ở Nhật Bản có 2 trường hợp ngộ độc, 1 trường hợp tử vong sau

đó liên quan tới các Protaglandin E2 trong loài G verrucosa [43]

Năm 1994 ở Hawaii, 7/13 người tham gia chuyến cắm trại có ăn thức ăn chế biến từ tảo Cả 7 người này đều có dấu hiệu của bỏng rát họng và bệnh đường ruột như buồn nôn, nôn và đau bụng Nguyên nhân được xác định là do 2 chất độc

debromoaplysiatoxin, plysiatoxin có trong loài G coronopifolia mà họ ăn phải [42]

1.5.2 Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan

Có một số công trình nghiên cứu rong Câu Chỉ ở Trung Quốc cho thấy tác dụng dọn gốc tự do và chống oxy hóa trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan

Cắn dịch chiết nước của G tenuispititata có tác dụng dọn hơn 60% (63,37 ±

0,91%) gốc tự do DPPH ở tế bào chỉ với liều 4 mg /ml, tỉ lệ này cao hơn khi dùng

10 ppm BHA và 100 ppm acid ascorbic ( p < 0.0001) Cắn dịch chiết nước của G

tenuispititata có tác dụng ngăn ngừa sự tổn thương ADN, tăng trưởng tế bào và

giúp phục hồi chu kỳ tế bào bị gây ra bởi H2O2 [63]

Agaro - oligosaccharid, sản phẩm thủy phân trong môi trường acid từ

polysaccharid thu được từ rong Câu Chỉ có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan in

vitro và in vivo Agaro - oligosacchrid có khả năng dọn gốc tự do đáng kể và cải

thiện khả năng sống của tế bào Ở nghiên cứu in vivo, trên mô hình chuột bị gây tổn

thương gan bằng CCl4 chỉ ra rằng agaro - oligosaccharid nâng cao hoạt động của superoxidedismutase (SOD), glutathion peroxidase (GSH-Px), giảm một cách đáng

kể hoạt động của malondialdehyd (MDA), glutamate oxaloacetate transaminase (AST), glutamic pyruvic transaminase (ALT) Ở liều 400 mg /kgtt, MDA giảm 44%

và 21% ở gan và tim, SOD và GSH - Px tăng lên mức cao nhất trong gan và huyết thanh, trong khi ALT giảm 22,16% trong huyết thanh [26]

Trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan bằng CCl4: cắn dịch chiết nước

của G tenuistipitata liều 150 mg /kgtt, và liều 300 mg /kgtt làm giảm nồng độ AST,

ALT so với nhóm chứng Phân tích mô bệnh học, lô chuột dùng cắn dịch chiết nước

G tenuispititata gan không bị hoại tử, viêm hay thoái hóa mạch máu như nhóm

chứng [59]

Để có nhiều cơ sở cho nghiên cứu tiến hành thực nghiệm, chúng tôi tiến hành

tổng quan về tác dụng chống oxy hóa các loài khác thuộc chi Gracilaria Tác dụng dọn gốc oxy hóa in vitro thử qua tác dụng dọn gốc tự do (DPPH, OH-, peroxy lipid)

và trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan

Cắn dịch chiết ethyl acetat của G verrucosa có tác dụng giảm sản xuất

DPPH với EC50 = 172,7 ppm Tuy nhiên cắn dịch chiết methanol không có tác dụng

8

chống oxy hóa [62] Cắn dịch chiết nước có tác dụng dọn 44,2% gốc tự do DPPH [40]

Cắn dịch chiết diethyl ether của G foliifera tham gia phản ứng với hỗn hợp

chất oxy hóa (600 mM axit sulfuric, 28 mM natri phosphat và 4 mM amoni molybdat) tương đương 1,3 mg acid galic/g cao [29]

Ở điều kiện chiết khác nhau (chiết với nước ở 22 0C, nước ở 22 0C có kèm siêu âm, nước ở 22 0C có ủ với enzyme tiêu hóa, nước ở 22 0C có siêu âm và ủ enzym, chiết với kiềm NaOH 0,1M ở 220C kèm siêu âm, chiết với kiềm NaOH 0,1M ở 220C có siêu âm và ủ enzyme) của G birdiae đều cho hoạt tính chống oxy

hóa tương đương với khoảng 41,6 mg đến 75,9 mg acid ascorbic Cắn dịch chiết cho hiệu quả nhất là chiết với NaOH 0.1M có siêu âm và ủ men tiêu hóa [30]

Tác dụng dọn 50% gốc oxy hóa (IC50) của cao chiết một số loài rong Câu được trình tại bảng 1.2

Bảng 1.2 Tác dụng dọn gốc oxy hóa của cắn dịch chiết một số loài rong Câu

Hexan DPPH

Gracilaria manilaensis 1,5 mg /ml [19]

G birdiae 0,6 mg /ml [35] Peroxy lipid 3,5 mg /ml

G.domingensis 1,0 mg /ml Butanol

DPPH

G birdiae 1,5 mg /ml

[35] Peroxy lipid 1,0 mg /ml

G.domingensis 1,4 mg /ml Methanol DPPH G birdiae >2,0 mg /ml [35]

0,8 mg /ml [52]

G cornea 0,9 mg /ml Peroxy lipid G birdiae 0,3 mg /ml

[35]

G.domingensis 0,7 mg /ml Ethanol

DPPH G manilaensis

0,5 mg /ml

[19] Cloroform 1,2 mg /ml

Dicloromethan 1,4 mg /ml

Qua bảng 1.3, tác dụng 50% gốc tự do (IC50) cho phép suy luận rằng, những cắn dịch chiết sử dụng dung môi phân cực (nước, ethanol, methanol, aceton) cho tác dụng dọn gốc tự do tốt hơn các cắn dịch chiết sử dụng dung môi không phân cực (cloroform, dicloromethan, hexan) Và điều này cũng giải thích tại sao mẫu thử đem

đi nghiên cứu ở các công bố [25], [47], [59] tác dụng chống oxy hóa in vivo đều

được chiết với dung môi phân cực

Trên mô hình chuột bị gây viêm gan bởi 1 ppm aflatoxin B1, cắn dịch chiết

nước G corticata (liều 250 mg /kgtt) có tác dụng đưa các chỉ số bilirubin toàn phần,

transaminase (GOT, GPT), LDH (lactate dehydroase), APT (alkalin phosphate) về gần tới chỉ số bình thường [46]

Trên mô hình chuột Sprague – Dawley được cho ăn chế độ giàu chất béo Lô

chuột được bổ sung 5% hoặc 10% bột đông khô G changii có tác dụng làm giảm

peroxy lipid (LP), làm tăng superoxid dismutase, catalase, glutathione peroxidase, giảm nồng độ ALT, AST trong huyết tương so với nhóm chứng [25]

10

Trên mô hình chuột bị gây viêm gan bởi Rifampicin 1g /kgtt Cắn dịch chiết

aceton của G crassia liều 100 và 200 mg /kgtt chuột, làm giảm nồng độ ALT, AST

và billirubin trong huyết thanh chuột và đạt ý nghĩa về mặt thống kê [47]

1.5.3 Tác dụng chống viêm

Trên mô hình in vitro: 800 mg /ml cắn dịch chiết nước của G tenuistipitata

giảm NO và Protaglandin E2 sản xuất đến 6,3 ± 0,8 µM và 2,8 ± 0,5 ng /ml, tương ứng, so với lipopolysaccharid kích thích sản xuất NO và Protaglandin E2 đến 14,2 ± 2,2 mM và 6,6 ± 0,9 ng /ml, tương ứng [59]

Trên mô hình Ex-vivo (trên dòng đại thực bào RAW 264.7): cắn dịch chiết nước G tenuistipitata làm giảm một cách đáng kể nồng độ NO và Protaglandin E2, các chất tiền gây viêm của cytokin (TNF-α, IL-1β, IL-6) so với lipopolysaccharid thông qua cơ chế bằng cách ức chế tín hiệu IKK / IκB / NF-κB, và tỉ lệ giảm có phụ thuộc vào nồng độ Ở nồng độ 800 µg /ml làm giảm sản xuất TNF-α, IL-1β, và IL-6

từ 3 đến 5 lần so với nhóm dùng với lipopolysaccharid [59]

Trên mô hình chuột bị tổn thương gan do CCl4: nồng độ chất trung gian gây viêm iNOS, COX-2 giảm so với nhóm chứng Các chất tiền viêm của cytokin (NF-

α, IL-1β và IL-6) trong huyết thanh giảm từ 3,5 đến 4 lần so với nhóm chứng [59]

1.5.4 Một số tác dụng sinh học khác

Cắn dịch chiết nước của G tenuistipitata (liều 100, 200, 400, 600, 800 và

1000 µg /ml) có tác dụng ức chế sự tổng hợp protein HCV phụ thuộc vào liều sau 3 ngày điều trị do ức chế sự tháo xoắn ARN HCV với EC50 = 300 ± 0,3 µg /ml Tác

dụng chống virút HCV của cắn dịch chiết nước G tenuistipitata có EC50 = 325 ± 0,7

µg /ml [27]

1.6 Công dụng theo dân gian, y học cổ truyền của rong Câu

Rong Câu Chỉ là một nguồn lợi từ biển, có nhiều chất dinh dưỡng nên được dùng để ăn Ngoài ra rong Câu là nguyên liệu sản xuất agar, dùng trong y học và công nghệ sinh học [17]

Thạch (agar) có vị ngọt, mặn, tính lạnh, trơn nhầy có tác dụng bổ mát, nhuận tràng [17] Chữa táo bón, khi uống thạch vào trong cơ thể, thạch sẽ hút nước, phồng lên, làm cho thể tích phân trong ruột lớn lên, gây một môi trường rất tốt cho trực

trùng ruột phát triển, trực trùng này đóng vai trò rất quan trọng trong sự co bóp của ruột già 1-10 g bột/ngày (phải dùng dạng bột mới có tác dụng), dùng nhiều ngày [10]

Thạch được dùng làm thuốc thanh nhiệt ở thượng tiêu, trị bốc hỏa lên đầu,

uất nóng ở trong, và viêm tinh hoàn [17]

Rong câu được dùng trong dân gian như thực phẩm (làm nộm, nấu canh…) ở nước ta và nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên tài liệu y học cổ truyền sử dụng rong Câu để chữa bệnh còn ít

12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là rong Câu Chỉ, thu tại đầm nuôi nước lợ xã Tràng Cát (Hải An – Hải Phòng) vào tháng 05/2015, đúng vào mùa vụ của rong Câu

Dựa trên kết quả mô tả, đối chiếu với khóa phân loại, và được sự hỗ trợ của chuyên gia thực vật TS Đàm Đức Tiến: mẫu được giám định tên khoa học là

Gracilaria tenuistipitata Zhang et Xia (Phụ lục 2)

Tiêu bản thực vật số HP29051501 được lưu tại: Phòng Sinh thái và Tài nguyên thực vật biển, Viện Tài Nguyên và Môi Trường Biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), (Phụ lục 1)

Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ được trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ

Mẫu toàn cây rong Câu Chỉ sau khi thu hái, loại tạp chất, rửa sạch, để ráo, cân khối lượng Tiến hành sấy ở 1100C trong 15 phút, sau đó sấy ở 600C tới khô, để nguội Hàm ẩm của rong Câu khô là 14 %

2.2 Phương tiện nghiên cứu, động vật thí nghiệm

2.2.1 Hóa chất, dung môi

- Hóa chất nghiên cứu thực vật

+ Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn và nước cất

- Hóa chất nghiên cứu thành phần hóa học

+ Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nước cất, Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussiat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, (CH3CO)2O, dung dịch gelatin 1%, CHCl3, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam

10 % trong EtOH 96% hơ nóng để phát hiện vết chất

- Hóa chất và nguyên liệu nghiên cứu tác dụng sinh học:

+ Acid thiobarbituric, DPPH của hãng Sigma-Aldrich

+ Paracetamol (biệt dược Efferalgan 500 mg)

+ Silymarin (biệt dược Livosyl) dạng viên nang, hàm lượng 140 mg của UAB

“aconitum” (Litva)

+ Và các dung môi hóa chất khác đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.2.2 Máy và thiết bị

- Máy và thiết bị để nghiên cứu thực vật

Quan sát, phân tích đặc điểm hình thái ngoài, vi phẫu của rong Câu và chụp ảnh trực tiếp dưới kính hiển vi Leica, tại phòng Sinh thái và Tài nguyên môi trường

14

biển, viện Tài nguyên và Môi trường biển

- Máy và thiết bị để nghiên cứu thành phần hóa học và nhận dạng các chất

+ Cột sắc kí pha thuận, cột Sephadex – LH20

+ Bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 (Merck, Germany) được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ

+ Các dung môi hóa chất đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

+ Máy GC - MS – QP2010, Hãng sản xuất Shimaru, Nhật Bản

+ Đo phổ khối trên máy 5989B- MS tại phòng cấu trúc – Viện hóa học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR, 13C – NMR, HMBC và HSQC trên máy Bucker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy móc và thiết bị để thử tác dụng sinh học

+ Máy ly tâm thường Universal PLC – 012E

+ Máy sắc kí khí khối phổ: GC/MS – Aligent 6890N

+ Máy ly tâm Mikro 22 R của hãng Hettich (Đức)

+ Máy đo quang UV - VIS: UV mini 1240 (Shimazu)

+ Máy định lượng sinh hóa Humalyser 2000 của Human (Đức)

+ Máy nghiền đồng thể Ultra Turrak T25 của IKA (Malayxia)

+ Máy định lượng ELISA Lx 800 (Mỹ)

+ Kít định lượng ALT, AST của hãng JAS (Mỹ)

+ Kít định lượng Protein toàn phần của Human (Đức)

2.2.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng

23,0 ± 2,0, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Học Viện Quân Y cung cấp

Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng chăn nuôi, Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày

và trong suốt thời gian nghiên cứu theo các tài liệu hướng dẫn thường quy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

Mẫu được phân tích trong phòng thí nghiệm của Phòng Sinh thái và Tài nguyên Thực vật Biển, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Việc định loại chủ yếu dựa vào các tiêu chuẩn về hình thái ngoài (dưới kính Lúp) và cấu tạo trong Để nghiên cứu cấu trúc trong căn

cứ vào các tiêu bản lát cắt dưới kính hiển vi Leica với độ phóng đại 10 và 40 lần Việc phân loại rong biển tuân theo nguyên tắc chung phân loại thực vật [1]

Tài liệu định loại căn cứ vào các tác giả như Taylor (1960) [55], Segawa (1960) [45], Phạm Hoàng Hộ (1969) [9], Tseng (1983) [58], Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút và Nguyễn Văn Tiến (1993) [5]

Quan sát tại thực địa, thu mẫu, mô tả chi tiết đặc điểm hình thái, làm và lưu

tiêu bản thực vật, đối chiếu khoá phân loại thực vật của chi Gracilaria, giám định

tên khoa học loài nghiên cứu với sự hỗ trợ của chuyên gia thực vật

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất trong rong Câu bằng phản ứng hoá học

Chiết xuất và định tính các nhóm chất hữu cơ trong Gracilaria tenuistipitata

bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo phương pháp ghi trong tài liệu [2], [3]

2.3.2.2 Định lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ

- Nguyên tắc: polysaccharid trong rong Câu Chỉ chủ yếu là agar Chúng tôi

dùng phương pháp định lượng agar để định lượng polysaccharid trong rong Câu Do vậy để tách được polysaccharid trong dược liệu dựa vào độ tan trong nước rồi thêm cồn cao độ để tủa, thu tủa, sấy khô thu được polysaccharid thô [16]

- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 30 g (m0) rong Câu khô, cắt nhỏ, cho vào

bình nón dung tích 1000 ml, thêm 250 ml hỗn hợp dung môi MeOH - CHCl3 - H2O (2:4:1) vào bình nón, ngâm ở 250C trong 30 phút, lọc bỏ dịch, phần bã rong được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với 400 ml dung dịch HCl 0,1% ở 250C trong 24 giờ, lọc thu được 380 ml dịch lọc Cho từ từ 300 ml ethanol 960 vào dịch lọc, khấy nhẹ, để lắng, sau 24 giờ ở nhiệt độ phòng đem lọc hút chân không, thu tủa, để bay

16

hơi dung môi 1 giờ ở nhiệt độ phòng, sấy ở 700C đến khối lượng không đổi, thu được polysaccharid dạng bột, cân khối lượng m (g) [16]

- Tính kết quả: phần trăm hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ được

tính theo công thức:

% HLpolysaccharid = x 100%

Trong đó:

m0: khối lượng dược liệu rong Câu Chỉ khô

m: khối lượng polysaccharid thô thu được

Ha: hàm ẩm của rong Câu Chỉ khô

2.3.2.3 Định lượng lipid của rong Câu Chỉ

Định lượng lipid trong dược liệu có nhiều phương pháp như: Chiết bằng dung môi hữu cơ (ether, cloroform), bốc hơi dung môi hữu cơ, cân cặn còn lại và tính tỷ lệ, sử dụng cụ chiết như Shoxhlet, Zaisenco hay Kumagawa [2]; phương pháp Folch (1956) [32], phương pháp Bligh & Dyer (1959) [23] Phương pháp Bligh & Dyer ưu điểm là thực hiện nhanh, tốn ít dung môi, cho kết quả tin cậy Nguyên liệu rong Câu Chỉ chứa hàm lượng nước lớn tới 84%, tỉ lệ lipid nhỏ hơn 2% nên thích hợp cho việc áp dụng phương pháp Bligh & Dyer Vì vậy chúng tôi định lượng lipid của rong Câu Chỉ theo phương pháp của Bligh & Dyer và điều chỉnh phù hợp với phòng thí nghiệm

- Nguyên tắc: rong Câu tươi được chiết bởi hỗn hợp dung môi chloroform và

methanol Cùng với lượng nước có trong rong, dịch lọc thu được sau loại bã rong sẽ tách làm 2 pha Pha chloroform chứa lipid, pha methanol và nước chứa chất không phải lipid Chiết thu dịch chiết chloroform, đem bốc hơi dung môi thu được cắn lipid [23]

- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 30 g (m0) rong Câu Chỉ tươi đã loại tạp, rửa sạch, để ráo nước, cắt nhỏ, cho vào bình nón thể tích 500 ml, bổ sung 250 ml dung môi (CH3OH : CHCl3 = 2 : 1) tới ngập dược liệu Đem siêu âm ở 300C, tần số máy siêu âm 30.000 Hz trong 90 phút, lọc, thu được dịch lọc 1 Bổ sung 200 ml CHCl3, tiếp tục đem siêu âm ở 300C, lọc thu được dịch lọc 2 Gộp dịch lọc 1 và 2,

bổ sung 50 ml H2O, cho vào bình chiết, chiết thu dịch chiết CHCl3 Loại nước bằng

m x 100

m0 x (100 – Ha)

Na2SO4 khan Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không dưới áp suất giảm ở 400C, thu cắn, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng 30 phút, cân khối lượng lipid (m) g

- Tính kết quả: phần trăm hàm lượng lipid của rong Câu Chỉ được tính theo

công thức sau:

% HLlipid = x 100%

Trong đó:

m0: Khối lượng dược liệu rong Câu Chỉ tươi

m: Khối lượng lipid thu được

HLnước: Hàm lượng nước trong rong Câu Chỉ tươi

2.3.2.4 Phân tích lipid bằng GC - MS

- Chuẩn bị mẫu

- Tiến hành methyl hóa các acid béo: cân chính xác khoảng 20 mg cắn lipid cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt loại 10 ml, thêm 2 ml H2SO4 2% pha trong methanol, đậy kín, lắc, đem sấy ở nhiệt độ 800C trong 2 giờ Thêm 1 ml dung môi n - hexan,

lắc, để phân lớp, chiết lấy dịch chiết phía trên (lớp dung môi hexan) Sục khí trơ, thu cắn (m = 8,2 mg)

- Cắn trên đem tiến hành sắc ký điều chế:

+ Bản mỏng: silica gel G tráng sẵn được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ, kích thước

20 x 7,5 cm

+ Dung dịch chấm sắc ký: Cắn ở trên đem hòa trong 0,5 ml dung môi n - hexan

Chấm sắc ký thành dải

+ Hệ dung môi: n - hexan: diethyl ete: acid acetic (85:5:1)

+ Chất chuẩn: acid oleic chuẩn

+ Triển khai sắc ký: thời gian khai triển 2,5 phút, tiến hành cắt mỗi bên bản mỏng

1cm, đem đi phun thuốc thử hiện mầu

+ Thuốc thử hiện màu: H2SO4 10 % / MeOH, hơ trên tấm nóng

+ Cạo vết trong khoảng Rf (0,6 - 0,7), phản hấp phụ bằng hệ dung môi CHCl3 :

CH3OH (70 : 30), sục khí trơ để đuổi dung môi, thu cắn (A)

m x 100

m0 x (100 - HLnước)

18

- Phân tích các thành phần trong lipid bằng sắc ký khí - khối phổ (GC - MS)

Hòa tan cắn (A) thu được ở trên bởi dung môi chloroform Khai triển phân

tích sắc ký khí – khối phổ trên máy với điều kiện khai triển như sau:

+ Tốc độ dòng 8,8 ml /phút

+ Nhiệt độ 1600C bắt đầu tiêm mẫu, sau tăng 20C /phút, tăng đến 2600C thì duy trì tới kết thúc khai triển

+ Thời gian khai triển: 70 phút

+ Phổ khối chuẩn các acid béo được xây dựng từ việc tiến hành GC – MS dung dịch hỗn hợp các chất acid béo (C7 – C30) chuẩn

2.3.2.5 Phân lập 1-2 chất của rong Câu Chỉ bằng sắc ký cột

- Chiết xuất

Rong Câu Chỉ khô chiết bằng methanol, cho khoảng 1 (kg) RCCh vào bình thủy tinh 20 lít, thêm 15 lít methanol cho ngập dược liệu, đậy kín đem đi siêu âm ở tần số 30.000 Hz ở 300C trong 90 phút, rút dịch lọc Bổ sung 12 lít methanol vào bã rong

để chiết lần 2 Tiến hành chiết 3 lần, dịch chiết lần 3 làm dung môi chiết mẻ mới Gộp dịch lọc và cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không dưới áp suất giảm, ở 400C, lấy cắn, để bay hơi dung môi, cân khối lượng Kết quả chiết 6 (kg) RCCh khô thu được 103 (g) cắn dịch chiết methanol Hàm ẩm của cắn dịch chiết methanol của RCCh là 6,1%

- Chuẩn bị cắn dịch chiết phân đoạn

Lấy 70 g cắn dịch chiết methanol phân bố trong 50 ml nước cất và chiết lần

lượt bằng n - hexan, dicloromethan và ethyl acetat (300 ml/ lần x 3 lần) Các dịch chiết phân đoạn n - hexan, dicloromethan, ethyl acetat đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn dịch chiết phân đoạn n - hexan (30 g),

dicloromethan (35 g), ethyl acetat (2 g) và cắn nước (2 g)

- Chuẩn bị chất hấp phụ

Hòa tan 20 g cắn dịch chiết dicloromethan của RCCh với lượng dicloromethan vừa đủ (khoảng 10 ml), hấp phụ cắn dịch chiết lên bột silicagel G (tỷ lệ 1: 1) được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ Làm bay hơi dung môi bằng cách bằng máy cất quay chân không dưới áp suất giảm, thu được bột khô tơi

- Chuẩn bị cột

Sử dụng phương pháp nhồi cột ướt: cân 300 g silicagel G được hoạt hóa như trên (tỷ lệ silicagel và cắn dịch chiết methanol RCCh là 15:1), bổ sung 400 ml dung môi (hệ dung môi sẽ triển khai sắc ký) ngập bột silicagel, khuấy đều, ngâm 1 giờ Sau đó nhồi lên cột sắc ký có kích thước 6 x 35 cm Tiến hành khai triển với 300 ml dung môi để ổn định cột Sau đó thêm phần bột silicagel hấp phụ cắn dịch chiết đã chuẩn bị ở trên vào cột, chiếm khoảng 1-1,5 cm Phủ nhẹ lên bề mặt lớp bột silicagel G hoặc cát sạch

- Khai triển cột và rửa giải cột

Dung môi triển khai dicloromethan: methanol (30:1 →1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) Hứng dung dịch rửa giải bằng lọ thủy tinh 10 ml Kiểm tra từng lọ bằng sắc ký lớp mỏng Sau đó gộp các dung dịch rửa giải có Rf giống nhau lại, bay hơi dung môi, thu được cắn các phân đoạn nhỏ hơn Thu phân đoạn khi kiểm tra với sắc ký bản mỏng cho vết mầu hồng (Rf = 0,5) rõ trên bản mỏng sau khi phun thuốc thử hiện màu H2SO4 10 % / MeOH, hơ trên tấm nóng Bay hơi dung môi thu cắn Cắn phân đoạn này được tiến hành chạy sắc ký cột silicagel (d = 3cm) với hệ pha

động n - hexan: ethyl acetat (15:1, v/v, 1,5L), thu được phân đoạn là tập hợp của các

lọ hứng dung dịch rửa giải cho kết quả là một vết mầu hồng khi kiểm tra bằng sắc

ký bản mỏng, để bay hơi dung môi dịch phân đoạn, thu được chất kết tinh

- Tinh chế:

Chất kết tinh thu được hòa tan vào 2 ml methanol, triển khai qua cột sắc ký pha đảo sephadex LH-20 Hứng dung dịch rửa giải, bay hơi dung môi, thu được chất kết tinh sạch

Kiểm tra độ tinh khiết của chất kết tinh phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng Sau khi chấm lên bản mỏng chất phân lập được, đem khai triển với hai hệ dung môi khác nhau Sau đó phun thuốc thử H2SO4 10 % / MeOH, hơ trên tấm nóng Chất phân lập được tinh khiết khi bản mỏng chỉ xuất hiện 1 vết

Tiến hành tương tự với cắn dịch chiết phân đoạn n- hexan Cắn dịch chiết ethyl

acetat và cắn nước thu được lượng ít (2g) nên không tiến hành phân lập các chất

20

- Xác định cấu trúc chất phân lập được

+ Dựa vào tính chất vật lý của các chất phân lập được

+ Tiến hành đo phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C, HMBC và HSQ) tại Viện Hóa học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

=> Biện luận dữ liệu phổ thu được xác định cấu trúc chất phân lập được

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

2.3.3.1 Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro

- Địa điểm: Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học và các Hợp chất thiên

nhiên

- Phương pháp nghiên cứu: dựa trên nguyên tắc 1,1 – diphenyl – 2 – picryldrazyl

(DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 515 nm [18], [41], [48], [51]

- Mẫu nghiên cứu: Cắn dịch chiết methanol RCCh, và 4 cắn dịch chiết phân đoạn

(n- hexan, ethyl acetat, dicloromethan và nước) của RCCh pha trong dimethyl

sulfoxid (DMSO 100%), nồng độ 2 mg /ml

- Mẫu đối chứng dương: dung dịch acid ascobic nồng độ 44 x 10-3 mg /ml

- Mẫu chứng âm: DPPH/ EtOH + DMSO

- Tiến hành nghiên cứu: Chất thử chứng dương được pha trong dimethyl sulfoxid

(DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96% Sự hấp thụ của DPPH ở bước sóng 515 nm được xác định bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng

- Kết quả nghiên cứu: thể hiện giá trị trung bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ

lệch chuẩn (SD) (p ≤ 0,05)

+ Khả năng trung hòa gốc tự do (Scavenging capacity, SC%)

Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình

xử lý Excel theo công thức:

SC% = 100 - x 100 ± SD OD (mẫu thử) – OD (mẫu trắng)

Độ lệch chuẩn (SD) tính theo công thức của Ducan như sau:

=> Mẫu cho tác dụng dọn gốc tự do DPPH cao nhất, sẽ là mẫu đem đi tiến

hành thử tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vivo

2.3.3.2 Thử tác dụng chống oxy hóa in vivo

- Địa điểm: Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu

- Phương pháp thử: nghiên cứu tác dụng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột

bị gây độc gan bằng paracetamol có tham khảo các tài liệu hướng dẫn [18], [36], [44], [54], [61] và được điều chỉnh phù hợp với môi trường nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

- Mẫu thử: cắn dịch chiết methanol của RCCh cho tác dụng dọn gốc tự do DPPH

trên mô hình in vitro cao nhất

- Liều thử: tham khảo liều của các thử nghiệm trước đó [59], [26], [47], [46] Đồng

thời có tiền hành làm thí nghiệm thăm dò, kết quả chọn 02 liều nghiên cứu là:

• Liều 1: 600 mg cắn dịch chiết methanol RCCh trên kilogram cân nặng chuột, tương đương với khoảng 40 g RCCh / kgtt chuột, tương đương với liều dùng trên người là khoảng 200 g RCCh

• Liều 2: 800 mg cắn dịch chiết methanol RCCh /kgtt chuột, tương đương với khoảng 54 g RCCh/ kgtt chuột, và tương đương với liều trên người khoảng 270

g RCCh

- Phân chia lô thí nghiệm: Chuột nhắt trắng 23 ± 2,0 g, được chia ngẫu nhiên thành

5 lô, mỗi lô 10 con:

Lô 1 (chứng sinh lý) : Uống nước cất

Lô 2 (chứng bệnh lý) : Uống nước cất + uống paracetamol liều 400 mg /kgtt

Lô 3 ( thuốc nghiên cứu) : Uống cắn dịch chiết methanol của RCCh liều 600 mg

/kgtt + uống paracetamol liều 400 mg /kgtt

Lô 4 (thuốc nghiên cứu) : Uống cắn dịch chiết methanol của RCCh liều 800 mg

/kgtt + uống paracetamol liều 400 mg /kgtt

22

Lô 5 (chứng dương) : Uống Silymarin 150 mg /kgtt /ngày + uống

paracetamol liều 400 mg /kgtt

- Tiến hành thí nghiệm: Chuột trong các lô được uống nước cất hoặc mẫu thử hoặc

silymarin liên tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào buổi sáng Ngày thứ 7, sau uống nước cất hoặc mẫu thử hoặc silymarin 1 giờ và nhịn đói 16 - 18 giờ trước đó, gây viêm gan cấp cho chuột ở lô 2 đến lô 5 (trừ lô chứng sinh lý) bằng uống paracetamol liều 400 mg /kg với thể tích 0,2 ml /10 g Chuột ở lô 1 được uống nước cất với cùng thể tích (0,2 ml /10 g)

- Phương pháp đánh giá: Ngày thứ 8, sau khi cho chuột uống (nước hoặc mẫu thử)

1 giờ, lấy máu động mạch cảnh của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt

cổ, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng enzym ALT, AST Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng gan, định lượng MDA dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử

Sơ đồ thời gian làm thực nghiệm

Uống thuốc hoặc uống nước cất

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ngày

Uống paracetamol Lấy máu chuột

- Nguyên lý phương pháp xác đinh MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl

dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethin có màu hồng

và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530-532 nm

Hình 2.2 Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan

Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng 1,1,3,3 - tetra ethoxypropan làm chất chuẩn

- Nguyên tắc định lượng MDA: Định lượng MDA theo phương pháp Wasowich và

Balahoroglu [61]

Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M Hút 200 μl dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25% pha, trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100oC trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl

HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml n - butanol, ly tâm 3000v /phút x 10 phút, hút phần n - butanol đo quang ở bước sóng 532 nm Song song tiến hành xây dựng

đường chuẩn với chất chuẩn là 1,1,3,3- tetra ethoxypropan Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA Định lượng protein trong dịch đồng thể bằng kít định lượng protein toàn phần Tính lượng MDA theo (g) protein gan Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của mẫu thử

2.4 Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết

Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo thuật toán thống kê t – test Student, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn ( )

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái ngoài

Rong mọc thành bụi hay thành thảm dày, cao 10-20 cm, mầu đỏ tím hay đỏ nâu Thân rong dạng trụ tròn, đường kính thân 1,5-2 mm, phân nhánh 1-3 lần theo kiểu chuyền nhau Gốc nhánh chỉ hơi thắt lại, hoặc không thắt

Căn cứ vào mẫu nghiên cứu, có sự so sánh, đối chiếu với khóa phân loại và bản

mô tả trong các tài liệu tham khảo [5], [9], [45], [55], [58] cùng với sự giúp đỡ của

TS Đàm Đức Tiến (Viện Tài Nguyên và Môi Trường Biển), chúng tôi đã giám định được tên khoa học của loài nghiên cứu như sau:

Tên khoa học: Gracilaria tenuistipitata Zhang et Xia

Tên tiếng Việt phổ thông: rong Câu Chỉ

Họ thực vật: Họ rong Câu (Gracilariaceae)

Hình ảnh toàn thân cây rong Câu Chỉ được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Toàn thân rong Câu

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu

Đặc điểm giải phẫu được quan sát qua các lát cắt ngang thân, cơ quan sinh sản dưới kính hiển vi Trên lắt cắt, các tế bào có hình dạng không nhất định, thường

có hình gần tròn, thoi, bán nguyệt hay đa giác, kích thước: 12 - 20 µm: lớp trong gồm 4 - 5 lớp tế bào hình tròn, kích thước 100 - 125 x 150 - 200 µm, vách dày 6 -

10 µ; lớp ngoài gồm 2 - 3 lớp tế bào hình tròn hoặc hơi dài, đường kính 30 - 50 µm; lớp vỏ gồm 1 - 2 lớp tế bào hình bầu dục đứng kích thước 10 - 12 x 7 - 8 mm, chứa sắc tố Sự thay đổi kích thước từ vỏ vào lõi khá đột ngột (hình 3.2), (hình 3.3)

Hình ảnh mặt cắt ngang thân RCCh qua kính hiển vi phóng đại 10 và 40 lần được trình bày ở hình 3.2 và hình 3.3

Hình 3.2 Mặt cắt ngang thân (10x) Hình 3.3 Mặt cắt ngang thân (40x)

Ghi chú: 1: Lớp vỏ 2: Lớp ngoài

3: Lớp trong 4: Tế bào lõi

Túi tứ bào tử phân bố khắp bề mặt của thân rong, kích thước 35 - 37 x 20 -

25 µm, không có vách tế bào kéo dài bao quanh (Hình 3.4) Túi tinh tử hình chén, kích thước 30 - 33 x 18 - 23 µm, ngăn cách nhau bằng hai lớp tế bào vỏ kéo dài

Tảo quả hình cầu, thắt gốc, có mũi, đường kính 0,8 - 1,6 mm, thường bằng hoặc lớn hơn đường kính của nhánh mang tảo quả (Hình 3.5) Vỏ tảo quả dày 100 -

125 µm gồm 7 - 8 lớp tế bào nhỏ, lớp tế bào ngoài cùng hình trụ, ở trong chỉ có một loại tế bào hình tròn, kích thước lớn dần vào trong và xếp không thẳng hàng Nội chất co lại nhưng không nối nhau thành hình sao, mép không có tế bào nhỏ nối nhau thành hàng Sợi sản bào gồm những tế bào tròn hoặc đa giác kích thước 20 - 25 x 30

- 35 µm, vách dày 5 - 6 µm Không có sợi dinh dưỡng trên nối với vỏ tảo quả, chỉ

có nhiều sợi gốc ở đáy tảo quả Quả bào tử hình cầu đường kính 15 - 17 µm (Hình 3.6)

Hình 3.4 Mặt cắt dọc qua túi tứ bào tử

Hình 3.5 Nhánh rong Câu mang

tảo quả Hình 3.6 Mặt cắt dọc qua tảo quả 3.1.3 Đặc điểm sinh sản

Phương thức sinh sản của rong Câu rất phong phú bao gồm sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vô tính và hữu tính

+ Sinh sản dinh dưỡng

Rong Câu có khả năng sinh trưởng ở đỉnh (Hình 3.7) và hình thành các nhánh bên từ tế bào vỏ và hấp thu dinh dưỡng qua tế bào vỏ Vì thế rong Câu có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh từ một đoạn thân hoặc từ một nhánh Đặc điểm này được sử dụng rộng rãi trong việc nuôi trồng rong Câu hiện nay Đó là phương pháp trồng rong Câu có hiệu quả kinh tế cao

200 µm

20 µm

Tảo quả

Hình ảnh sinh sản dinh dưỡng của rong Câu và hình ảnh bào tử của rong Câu được trình bày ở Hình 3.7 và Hình 3.8

Hình 3.7 Sinh sản dinh dưỡng

+ Sinh sản hữu tính

Rong Câu sinh sản theo kiểu noãn phối, cây giao tử đực và cái khác gốc Cây giao tử đực trưởng thành, một số tế bào vỏ phân hóa thành các tế bào tinh tử mẹ Tế bào tinh tử mẹ thường phân cắt một đến nhiều lần thành nhiều tế bào con, mỗi tế bào con lại phân cắt làm hai theo mặt cắt ngang hình thành một túi tinh tử ở trên, trong mỗi túi chỉ chứa một tinh tử Tinh tử thuộc loại bất động

Ở cây giao tử cái, ở phần đỉnh nhánh, một số tế bào vỏ trong phân hóa thành thể quả bào Nhánh quả bào gồm hai tế bào, tế bào trên của nhánh hình thành bầu gọi là quả bao, phần dưới chứa noãn cầu và phân trên kéo dài ra đến bề mặt của

Bào tử (n)

28

thân gọi là ống noãn và tế bào cuống Tinh tử và noãn cầu thụ tinh thành hợp tử, sau

đó hợp tử hòa với nội chất của các tế bào dinh dưỡng xung quanh thành một tế bào hòa lớn [31]

Sự hình thành quả bào tử: tế bào phân cắt theo kiểu phóng xạ hình thành các nhánh sản bào Nhánh sản bào cắt ngang ở phần đỉnh hình thành quả bào tử Như vậy số lượng tế bào ở chỗ thụ tinh đã tăng lên gấp bội và lồi lên khỏi bề mặt cây giao tử cái Đó gọi là tảo quả (Hình 3.5) Những sợi sản bào và quả bào tử gọi là quả bào tử thực vật ở thể lưỡng bội, ký sinh trên cây giao tử cái Quả bào tử trưởng thành sẽ phóng thích qua lỗ mở ở đỉnh túi Quả bào tử không có tiên mao, trôi lơ lững trong nước một thời gian ngắn rồi bám vào vật bám phát sinh thành cây tứ bào

tử thực vật cũng lưỡng bội (Hình 3.6)

Như vậy chu trình phát triển này có 2 giai đoạn: giai đoạn đơn bội là cây giao tử thực vật; giai đoạn lưỡng bội gồm quả bào tử thực vật sống ký sinh trên cây giao tử cái và tứ bào tử thực vật sống tự do Chu trình sống của rong Câu Chỉ được trình bày tóm tắt như hình 3.9

Hình 3.9 Chu trình sống của rong Câu Chỉ

Cây giao tử đực (n)

Noãn cầu ( ) Tảo quả thực vật ký sinh trên giao

tử cái (2n)

Giao tử Thực Vật

(2n)

Quả bào tử (2n)

Cây tứ bào tử

(2n)

Giảm nhiễm

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong rong Câu Chỉ bằng phản ứng hóa học

Tiến hành phản ứng định tính các nhóm chất trong rong Câu Chỉ khô theo phương pháp ghi ở tài liệu [2], [3] Tiến hành phản ứng với 5 g rong Câu Chỉ phản ứng định tính polysaccharid cho phản dương tính rõ Với 20 g RCCh phản ứng định tính chất béo và acid amin dương tính Và với 30 g RCCh phản ứng định tính saponin, flavonoid, tannin, sterol cho kết quả dương tính

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ của rong Câu Chỉ bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết

quả Nhận xét

1 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Có

2 Alcaloid TT Mayer - Không có

5 Flavonoid

Pư với Cyanidin +

Có

Pư với hơi NH3 +

Pư với NaOH 10% +

Pư với FeCl3 +

6 Coumarin

Pư đóng mở vòng lacton +

Không Phát hiện huỳnh quang dưới ánh

sáng tử ngoại -

7 Tanin Pư với FeCl3 5% + Có

Pư với gelatin 1% +

30

Pư với chì acetat 10% +

8 Acid hữu cơ Pư với Na2CO3 - Không có

9 Acid amin Pư với thuốc thử Ninhydrin ++ Có

10 Protein Pư Biuret - Không có

11 Đường khử Pư với thuốc thử Fehling - Không có

Pư với thuốc thử Tollen -

12 Polysacharid Pư với thuốc thử Lugol +++ Có

14 Sterol Pư với H2SO4/ anhydrid acetic + Có

15 Carotenoid Pư với H2SO4 - Không có Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ

* Nhận xét: Qua bảng 3.1 cho thấy: Tiến hành định tính 15 nhóm chất hữu cơ của

rong Câu Chỉ có 7 nhóm chất phản ứng dương tính, sơ bộ kết luận trong rong Câu Chỉ thu mẫu ở Hải phòng có nhóm hợp chất polysaccharid, saponin, flavonoid, tanin, acid amin, chất béo, và sterol

3.2.2 Định lượng một số nhóm chất có trong rong Câu Chỉ

3.2.2.1 Định lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ

Hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ thu ở Hải Phòng được trình bày tại bảng 3.2

Bảng 3.2 Hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ

TT Khối lượng rong

m 0 (g)

Khối lượng polysacharid m (g)

Hàm lượng polysachharid (%)

1 30,0 15,7 60,9

2 30,0 16,0 62,0

3 30,0 16,0 62,0

* Nhận xét: rong Câu Chỉ thu mẫu ở Hải Phòng có hàm lượng polysaccharid là 61,6

% trọng lượng rong khô

3.2.2.2 Định lượng lipid của rong Câu Chỉ

Hàm lượng lipid của rong Câu Chỉ thu mẫu ở Hải Phòng được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Hàm lượng lipid của rong Câu Chỉ

TT Khối lượng rong m

0 (g) Khối lượng lipid m (g) % Hàm lượng

2 30,10 0,10 2,37

3 30,10 0,10 2,37

* Nhận xét: Rong Câu Chỉ thu mẫu ở Hải Phòng có hàm lượng lipid là 2,29% trọng

lượng rong khô

3.2.3 Phân lập chất trong rong Câu Chỉ

3.2.3.1 Phân tích các thành phần trong lipid

Kết quả phân tích các thành phần các acid béo trong lipid của rong Câu Chỉ

thu mẫu ở Hải Phòng được trình bày ở bảng 3.4 và phụ lục (3)

Bảng 3.4 Thành phần các acid béo của rong Câu Chỉ

1 10,649 acid myristic (acid tetradecanoic) 6,62

2 16,822 acid palmitoleic (acid 9-hexadecenoic) 2,04

3 17,608 acid palmitic (acid hexadecanoic) 54,70

4 24,496 acid rumenic 3,47

5 24,725 acid oleic (acid 9-octadecenoic) 16,12

6 24,962 acid palmitoleic (acid 9-hexadecenoic) 3,77

7 25,802 acid stearic (acid octadecanoic) 2,53

32