Nghiên cứu đặc điểm thực vật và bước đầu khảo sát thành phần hóa học của cây nho rừng (vitis heyneana roem schult )

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng.. Nghiên cứu này cho thấy các chiết xuất từ hạt nho có tổng phenolic cao hơn trong vỏ, giàu flavanol oligome

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TRANG

MSV: 1201636 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH

PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NHO RỪNG

(VITIS HEYNEANA ROEM.& SCHULT.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TRANG

MSV: 1201636

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH

PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NHO RỪNG

(VITIS HEYNEANA ROEM & SCHULT.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Hà Vân Oanh

2 Ths Phùng Thanh Long

Nơi thực hiện:

1 Khoa Hóa thực vật 2 – Viện Dược Liệu

2 Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI - 2017

Lời cảm ơn

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Dược học Cổ truyền đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Thị Hà,

TS Hà Vân Oanh, Ths Phùng Thanh Long, Ths Nguyễn Thị Thúy An, những

người thầy đã luôn tận tâm hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu Khoa Hóa Thực Vật 2 – Viện Dược liệu và các thầy cô bộ môn Dược học Cổ truyền đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Nho (Vitis) 2

1.1.1 Vị trí, phân loại và phân bố của chi Vitis 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Vitis 3

1.1.3 Thành phần hóa học chính của chi Vitis 3

1.1.4 Tác dụng sinh học của một số loài chi Vitis 9

1.2 Cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.) 13

1.2.1 Đặc điểm thực vật 13

1.2.2 Thành phần hóa học 14

1.2.3 Tác dụng sinh học và công dụng của cây nho rừng (V heyneana) 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Dung môi, hóa chất 19

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật 20

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 20

2.3.2 Phương pháp định tính các nhóm chất trong dược liệu 21

2.3.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

phân lập được 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Nghiên cứu về thực vật 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của cây 27

3.1.2 Đặc điểm vi học 28

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 30

3.2 Nghiên cứu về hóa học 32

3.2.1 Chiết xuất 32

3.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng 33

3.2.3 Khảo sát và phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-hexan 35

3.3 Bàn luận 41

3.3.1 Về đặc điểm thực vật 41

3.3.2 Về hóa thực vật 42

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic

Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1H-NMR Proton Nuclear Single Quantum

Coherence

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3 Một số hợp chất đã được phân lập từ các loài thuộc chi Vitis 8

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây nho rừng 34 Bảng 3.2 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của VH01 và acid

betulinic

40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.5 CTCT một số hợp chất stilbenoid thuộc V heyneana Roem.&

Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất các cắn của V heyneana Roem.& Schult 33

và hiệu quả điều trị

Cây nho rừng, tên khoa học là Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho

(Vitaceae), còn có tên gọi khác là nho lông, nho năm góc Đây là cây mọc hoang ở vùng núi nhiều tỉnh nước ta (Lạng Sơn, Ninh Bình vào Ninh Thuận) Nho rừng có

vị hơi đắng, chua, tính bình; rễ và vỏ rễ có tác dụng điều kinh hoạt huyết, thư cân hoạt lạc, chỉ huyết; lá thanh nhiệt lợi thấp, tiêu thũng giải độc; ngoài ra còn có tác dụng an thai [5]

Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về Nho rừng, cũng như trên thế giới các nghiên cứu về loài này còn rất ít Vì vậy để góp phần xây dựng

cơ sở dữ liệu về cây Nho rừng, sử dụng cây này làm thuốc, chúng tôi thực hiện đề

tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và bước đầu khảo sát thành phần hóa học

của cây nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.)” với mục tiêu:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học, giám định tên khoa học của cây Nho rừng

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Nho (Vitis)

1.1.1 Vị trí, phân loại và phân bố của chi Vitis

Vị trí của chi Vitis trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) [43]

Chi Nho (Vitis)

Phân bố: Trên thế giới có khoảng 60 loài chủ yếu ở vùng ôn đới, mở rộng đến vùng cận nhiệt đới với sự đa dạng các loài phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và Bắc Mĩ (có 37 loài ở Trung Quốc) [18]

Ở nước ta chi này có 6 loài [5], [6] Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt

Nam được trình bày tại bảng 1.1

Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt Nam [5], [6], [53]

thường

Phân bố

1 Vitis vinifera L Nho Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận,

Bình Thuận, Lâm Đồng, TP Hồ Chí Minh

2 Vitis labrusca L Nho chồn Việt Nam

3 Vitis balansana

Planch

Nho đất, nho dại nhỏ quả

Thái Nguyên, Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Ninh Bình, Quảng Trị, Huế, Đà Nẵng, Nha Trang, Khánh Hòa

Lạng Sơn, Ninh Bình vào Ninh Thuận

6 Vitis retordii

Rom Caill ex

Planch

Nho lông hoe Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình

1.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Vitis

Dây leo, thân gỗ, thường đơn tính khác gốc, hiếm khi lưỡng tính Có tua quấn, thường chia làm đôi Lá đơn, chia thùy, đôi khi lá xẻ chân vịt, lá kèm tiêu giảm Cụm hoa mọc chùm tụ tán, hoa 5 cánh có đài hình đĩa, lá đài nguyên bản Cánh hoa liền ở phía đỉnh và tỏa ra như cái phễu Nhị hoa mọc đối diện với cánh hoa, không phát triển và rụng sớm đối với hoa cái Hoa một nhụy, mảnh, đầu nhụy

mở rộng Quả mọng hình cầu, có từ 2-4 hạt Hạt hình trứng hay elip hoặc hình quả

lê, nội nhũ hình chữ M theo mặt cắt ngang [18]

1.1.3 Thành phần hóa học chính của chi Vitis

Hiện nay cũng có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài

thuộc chi Vitis Các kết quả nghiên cứu chủ yếu trên các loài: V vinifera, V

amurensis, V balansana, V quinquangularis cho thấy chúng có chứa các hợp chất

thuộc nhóm polyphenol (flavonoid, stilbenoid, tannin), polysaccharid, acid amin và steroid

1.1.3.1 Nhóm chất stilbenoid và oligostibenoid

 Nhóm chất stilbenoid

Từ dịch chiết ethanol của lá và thân V amurensis đã phân lập và xác định

được 3 stilbenoid (Piceatannol, Resveratrol, Piceid) [11] Resveratrol cũng được tìm

thấy ở V thunbergii [26]

Ngoài ra, nghiên cứu chiết với ethyl acetat từ 900 g bột V vinifera đã phân lập được 9 hợp chất stilbenoid gồm: (E)-astringin (12 mg); (E)-resvertrolosid (8 mg); (E)-piceid (67 mg); (E)-piceatannol; (E)-resveratrol; (Z)-astringin (7 mg); (Z)- resvertrolosid (7 mg); (Z)-piceid (52 mg); (Z)-resveratrol [35]

R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3

(E)-astringin GlcO OH OH (Z)-astringin

(Z)-resvertrolosid (Z)-piceid

(Z)-resveratrol

GlcO OH OH

(E)-resvertrolosid OH H GlcO OH GlcO H

(E)-piceid GlcO H OH GlcO OH H

B, (+)-vitisin A [26] Các nhà nghiên cứu Thụy Điển xác định được 5 oligostibenoid

trong dịch chiết methanol V vinifera (ampelopsin A, hopeaphenol, ampelopsin H,

ε-viniferin, E-vitisin B) [42]

Từ dịch chiết ethanol của lá và thân V amurensis đã phân lập và xác định

được 7 oligostibenoid gồm: r-2-Viniferin (1), Amurensin G (2), trans-ε-Viniferin (3), (+)-Ampelopsin A (4), (+)-Ampelopsin F (5), trans-Amuresin B (6), Gnetin H

(7) [11]

Hình 1.2: CTCT một số hợp chất oligostilbenoid thuộc chi Vitis

1.1.3.2 Nhóm chất flavonoid và acid phenolic

Theo các nhà nghiên cứu đã phân lập và xác định được 16 hợp chất từ bã nho bằng quang phổ NMR [48] Đó là 7 chất thuộc acid phenolic (hợp chất 1→6); hydroxy phenol (hợp chất 7)

2-Hình 1.3: CTCT một số hợp chất phenolic thuộc chi Vitis

Và 9 hợp chất thuộc nhóm flavonoid gồm flavan-3-ol (hợp chất 8→10); flavonol (11→14), flavanonol (15, 16) [48]

8 catechin 9 epicatechin 10 procyanidin B1

11 R 1 =OH, R 2 =Glu, quercetin 3-glycosid

12 R 1 =OH, R 2 =Glucu, quercetin 3-glycuronid

13 R 1 =H, R 2 =Glu, kaempferol 3-glycosid

14 R 1 =H, R 2 =Gal, kaempferol 3-galactosid

15 R 1 =OH, R 2 =Rha, astilbin

16 R 1 =H, R 2 =Rha, engeletin

Hình 1.4: CTCT một số hợp chất flavonoid thuộc chi Vitis

Các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã phân tích về cấu trúc của các anthocyanin trên vỏ quả của 110 giống nho bằng phương pháp HPLC-MS Kết quả phát hiện 33 đỉnh thì 29 đỉnh xác định là anthocyanin và 4 thành phần chưa rõ do thiếu thông tin Tất cả gồm monoglucosid anthocyanin hoặc dẫn xuất diglucosid của

5 anthocyanin (delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin); các dẫn xuất bao gồm 6-O-acetyl, 6-O-coumaryl và thêm malvidin 3-O- (6-O-caffeoyl)-

glucosid [51] Hàm lượng anthocyanin trong nho lai giữa V labrusca với V vinifera

dao động từ 0,1-97,5 mg/100g (trong đó nho ở Black Olympia cao nhất 97,5 mg/100g) Các giống Super Hamburg, Beihong, Beimei cũng có hàm lượng anthocyanin cao (79,7; 33,1 và 114,4 mg/100g) [51]

1.1.3.3 Nhóm chất Tannin

Nghiên cứu thành phần hóa học từ thân nho V vinifera cho hàm lượng tannin

là 15,9% bao gồm chủ yếu là procyanidin và prodelphinidin Hàm lượng procynidin nhiều hơn prodelphinidin [40]

Một nghiên cứu khác khảo sát thành phần tanin của 5 giống nho V vinifera

(Touriga Nacional, Trincadeira, Castelão, Syrah và Cabernet Sauvignon) và rượu vang đỏ từ năm 2004 và 2005 Kết quả cho thấy proanthocyanidin trong hạt (77-85%) và trong da (91-99%), phân tử proanthocyanidin dao động 2,8-12,8 cho hạt và 3,8-81,0 cho da Đối với trong rượu vang thì hàm lượng proanthocyanidin 77-91% (năm 2004), 82-95% (năm 2005) và phân tử proanthocyanidin là 2,1-9,6 [13]

1.1.3.4 Sterol

Các nhà nghiên cứu đã chọn các giống nho đỏ ở nhiều vùng, và sau đó tách lấy hạt nho điều chế ra dầu hạt nho Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng cũng như là các loại acid béo và sterol trong hạt nho [23] Các acid béo và hàm lượng được trình bày tại bảng 1.2

Bảng 1.2: Các acid béo và hàm lượng của chúng trong dầu hạt nho

clerosterol; β-sitosterol; sitostanol; ∆5-avenasterol; ∆5,24-stigmastadienol;

∆7-stigmasterol; ∆7-avenasterol Trong đó hàm lượng của cholesterol thấp nhất (chỉ

khoảng 0,5%), sterol chính là β-sitosterol (hàm lượng lớn khoảng >60%) và tổng

sterol có trong hạt nho từ 2700-3000mg/kg [23]

1.1.3.5 Polysaccharid và protein

Các nhà nghiên cứu đã xác định được các polysaccharid trong thân cây nho

V vinifera chủ yếu là cellulose, heteroxylan và glucan, trong đó cellulose chiếm

30,3%, heteroxylan chiếm 12% và glucan chiếm khoảng 15% Các loại đường có trong cây nho gồm: các monosaccharid ( Rhamnose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucose) [41]

Cùng với nghiên cứu đó, họ đã xác định được hàm lượng protein trong bã nho vào khoảng 6,1% [41], ở một nghiên cứu khác hàm lượng protein trong hạt nho

là từ 10-13% [44]

Danh sách một số hợp chất đã được phân lập từ các loài thuộc chi Vitis được

trình bày tại bảng 1.3

Bảng 1.3: Một số hợp chất đã được phân lập từ các loài thuộc chi Vitis

[TLTK]

(E)-astringin; (E)-resvertrolosid; (E)-piceid;

(E)-piceatannol; (E)-resveratrol; astringin; (Z)-resvertrolosid; (Z)-piceid; (Z)-

(Z)-resveratrol

V vinifera [35]

Oligostilbenoid r-2-Viniferin; trans-Amuresin B;

trans-ε-Viniferin; Gnetin H; Amurensin G; Ampelopsin F; (+)-Ampelopsin A

Flavonoid Catechin; epicatechin; procyanidin B1;

quercetin 3-glycosid; quercetin

kaempferol 3-galactosid, astilbin, engeletin

V vinifera [48]

peonidin; malvidin; các dẫn xuất bao gồm 6-O-acetyl, 6-O-coumaryl và thêm malvidin 3-O- (6-O-caffeoyl)-glucosid

V vinifera, V labrusca [51]

Acid phenolic Acid gallic; acid 4-glucosid gallic; acid

3-glucosid gallic; acid caftaric; acid coutaric; cis-acid coutaric; 2-hydroxy-

trans-5-(2-hydroxy-ethyl)phenylglucosid

V vinifera [48]

[40]

cholesterol; campesterol; campestanol;

stigmasterol; ∆7-campesterol;

∆5,23-stigmastadienol; clerosterol; β-sitosterol;

∆5,24-V vinifera [23]

Polysaccharid Cellulose; heteroxylan; glucan; Rhamnose;

Arabinose; Xylose; Mannose; Galactose;

Glucose

V vinifera [41]

1.1.4 Tác dụng sinh học của một số loài chi Vitis

Hiện nay các nghiên cứu dược lí chủ yếu trên V vinifera, một số ít nghiên cứu tiến hành trên các loài V amurensis, V thunbergii

1.1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa

Các nhà nghiên cứu Ấn Độ đã tiến hành chiết từ hạt nho (V vinifera) bằng 6

loại dung môi: aceton, methanol, EtOAc, EtOAc:H2O (9:1), EtOAc:H2O (17:3), EtOAc:H2O (4:1) Tổng flavonoid từ các dung môi chiết khá cao, trong đó có EtOAc:H2O (17:3) thu được nhiều flavonoid nhất (54±4,86 % / 100g dịch chiết) Sau đó tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của các chất chiết xuất qua hệ

thống mô hình β-caroten-linoleat và phương pháp acid peroxy linoleic ở các liều

khác nhau (từ 10ppm- 200ppm) của các dịch chiết 6 loại dung môi Kết quả cho thấy dịch chiết từ hạt nho có tác dụng chống oxi hóa, phụ thuộc liều, tại nồng độ 100pm thì dịch chiết khác nhau đều có hoạt tính chống oxi hóa từ 65-90%; hỗn hợp dịch chiết EtOAc:H2O có hoạt tính chống oxi hóa hơn các dịch chiết khác (ở tỷ lệ 17:3 cao nhất từ 15,7±1,85% - 89,3±2,36% / 10ppm – 100ppm) [15]

Một nghiên cứu khác ở Brazil tiến hành trên bột của hạt và vỏ quả nho đỏ (V

vinifera và V labrusca) của các giống nho khác nhau cũng về hoạt tính chống oxi

hóa của nhóm chất phenol Lượng các hợp chất phenolic tập trung khá lớn trong hạt (2128-16518mg tương đương CE (catechin) /100g) so với trong vỏ (660-1839mg tương đương CE /100g) Hoạt tính chống oxi hóa về khả năng dọn gốc tự do DPPH

và khử sắt III- chất chống oxy hóa FRAP đã cho thấy những hạt nho của giống Pinot Noir (16925µmol TE /100g và 21492µmol Fe2+/100g) và các chất chiết xuất

vỏ của giống Isabel (3640µmol TE/100g và 4362µmol Fe2+/100g) là cao nhất Vỏ của giống nho Cabernet Sauvignon và Primitivo có hàm lượng anthocyanin cao nhất

(935 và 832mg/ 100g) Nghiên cứu này cho thấy các chiết xuất từ hạt nho có tổng phenolic cao hơn trong vỏ, giàu flavanol (oligomeric và hợp chất cao phân tử ) với hoạt tính chống oxi hóa và xác nhận vỏ nho là một tiềm năng cho việc khai thác các anthocyanin [20]

1.1.4.2 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 1999, Shoko đã báo cáo hoạt động kháng khuẩn của cao chiết methanol

từ hạt nho V vinifera Hợp chất ức chế hoạt động của E coli và Salmonella

enteritidis được xác định là acid gallic Các chất chiết xuất với methanol: nước: acid

acetic (90: 9,5: 0,5) ở nồng độ 900ppm thì kháng B cereus, B subtilis và B

coagulans và 1000ppm cho S aureus, E coli là 1250 ppm và P aeruginosa là

1500ppm Mặt khác chiết với dung môi aceton: nước: acid acetic (90: 9,5: 0,5) thì

với nồng độ 850ppm có tác dụng với B cereus, B subtilis và B coagulans còn các

vi khuẩn khác thì nồng độ có tác dụng giống chiết với methanol: nước: acid acetic (90: 9,5: 0,5) [16]

Kết quả nghiên cứu của Nilgun Gokturk Baydar và cộng sự cho thấy cao chiết với aceton: nước: acid acetic (90:9,5:0,5) ở nồng độ 20% thì ức chế tất cả các

vi khuẩn trừ B amyloliquefaciens; còn ở nồng độ 4% không chống lại được

A.hydrophila, B amyloliquefaciens, B megaterium và B subtilis [33]

Các nhà nghiên cứu Hàn Quốc năm 2009 xác định được 9 hợp chất phân lập

từ lá và thân V amurensis có hoạt tính kháng khuẩn đối với 2 tác nhân gây bệnh răng miệng Streptococcus mutans và Streptococcus sanguis Trong các hợp chất có

ε-viniferin có hoạt tính mạnh nhất chống lại S mutans và S sanguis với các giá trị

MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) tương ứng 25 và 12,5 mg/ml [32]

1.1.4.3 Tác dụng chống nấm

Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Thụy Sĩ cho thấy các chất chiết từ

methanol và ethanol của V vinifera có hoạt tính kháng nấm đáng kể đối với 3 loại nấm Plasmopara viticola, Erysiphe Necator và Botrytis cinerea Có 6 hợp chất được phân lập (ampelopsin A, hopeaphenol, trans-resveratrol, ampelopsin H, ε-

viniferin, E-vitisin B) có tác dụng chống lại P viticola, còn ε-viniferin kháng nấm thấp đối với B cinerea [42]

Một nghiên cứu khác năm 2014 cho thấy cao chiết methanol của là V

vinifera có tác dụng kháng Aspergillus niger và Candida albicans [22]

1.1.4.4 Tác dụng chống viêm

Kết quả nghiên cứu của Min-Ji Bak và cộng sự đã chứng minh procyanidin

từ hạt loài V amurensis có tác dụng chống viêm mạnh thông qua ức chế iNOS và

COX-2, ức chế phosphoryl LPS gây ra của p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) [30]

Một nhóm nghiên cứu khác năm 2005 tiến hành thí nghiệm cho những con

chuột ăn một khẩu phần ăn chứa 5% vỏ nho V rotundifolia trong 14 ngày và sau đó

được tiêm carrageenan vào chân thì sau 3h phù nề chân được đo cho kết quả chuột

có chế độ ăn vỏ nho có phù nề ít khoảng 50% so với chuột không ăn, điều này

chứng tỏ vỏ nho thể hiện tính kháng viêm in vivo [34]

Nghiên cứu năm 2011 về resveratrol và oligostilbenoid từ V thunbergii đã

được chứng minh về tác dụng chống viêm mạnh Tác dụng ức chế PGE2 từ các cao

chiết methanol của phần thân, cành, lá, rễ của V thunbergii thì thấy phần thân có tác dụng ức chế tốt hơn các bộ phận khác trong cả LPS và IL-1β (lần lượt là

71,29±7.08% và 22,50±6,20%) mà không gây độc Tác dụng ức chế PGE2 của 6 oligostilbenoid phân lập từ thân cho kết quả resveratrol và ampelopsin C ức chế mạnh nhất (giá trị IC50 là 73,32±1,74 và 15,52±2,69 µM) Mặt khác resvertrol ức chế hoạt động COX-2 khá đáng kể với IC50 = 27,01±1,11µM [26]

1.1.4.5 Tác dụng chống dị ứng

Nghiên cứu của Sang-Hyun Kim và cộng sự khảo sát ảnh hưởng của dịch

chiết methanol của quả V amurensis (Meva) về cơ chế tác dụng dị ứng Meva ức

chế hợp chất 48/80 gây ra phản ứng dị ứng toàn thân và histamin sinh từ tế bào

mast; làm giảm immunoglobulin E (IgE) Thí nghiệm chứng tỏ V amurensis có thể

dùng làm thuốc điều trị bệnh dị ứng, nhất là dị ứng da [38]

1.1.4.6 Tác dụng giảm đau, hạ sốt

Nghiên cứu của Bakhta Aouey và cộng sự năm 2016 cho thấy cao chiết

ethanol của lá V vinifera có tác dụng giảm đau Trong nghiên cứu này chuột được chia làm 5 nhóm, nhóm 1 uống 10 ml/kg nước cất, nhóm 2-4 dùng dịch chiết lá V

vinifera với hàm lượng 100, 200 và 400 mg/kg và nhóm 5 dùng indomethacin 10

mg/kg Sau 30 phút thì tiêm vào phúc mạc chuột acid acetic 0,6% (10 ml/kg), kết quả cho thấy các dịch chiết có hiệu lực giảm đau đáng kể ( hàm lượng 200, 400 mg/kg thì hiệu lực 60,5% và 65,5%) so với của indomethacin là 75,07% [8]

Cũng trong nghiên cứu của Bakhta Aouey và cộng sự cho thấy cao chiết

ethanol của lá V vinifera có tác dụng hạ sốt trên mô hình chuột thí nghiệm sử dụng

nấm men Tại 18h sau khi tiêm men thì thân nhiệt tất cả chuột tăng, tiến hành nghiên cứu cho một nhóm điều trị với paracetamol 100 mg/kg từ 22h đến 23h so với 19h và nhóm được điều trị với 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg của các dịch chiết Kết quả cho thấy ở liều 200 mg/kg và 400 mg/kg thì có tác dụng hạ sốt chiết xuất tại 23h ( t° còn 36,84°C và 36,76°C) [8]

Một nghiên cứu khác của tạp chí nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng Quốc tế

xác định hiệu lực chống loét dạ dày của vỏ và hạt V vinifera Tất cả chuột được

uống liều 200 mg/kg aspirin (1 lần/ngày trong 3 ngày) chia làm 6 nhóm Nhóm 1 được dùng 1ml nước cất, nhóm 2 dùng 50 mg/kg ranitidin, nhóm 3 và 4 dùng 100 mg/kg dịch chiết hạt và vỏ nho, nhóm 5 và 6 dùng 200 mg/kg dịch chiết hạt và vỏ nho Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch chiết hạt và vỏ nho có tác dụng giảm đáng

kể tỷ lệ loét, thể tích dạ dày, acid tự do so với nhóm đối chứng; trong đó nhóm dùng

200 mg/kg dịch chiết hạt nho có hiệu quả tốt nhất (thể tích dạ dày giảm 2,16±0,19ml; acid tự do còn 46,66±0,98 mEq/l/100g; ức chế loét 68,38%) [19] 1.1.4.8 Tác dụng chống ung thư

Trong y học thảo dược phương Đông Trung Quốc thì V amuresis từ lâu đã

được sử dụng để điều trị ung thư Trong nghiên cứu này các nhà khoa học đã phân lập được heyneanol và resveratrol rồi đem tiêm hàng ngày dưới da 6 con chuột bị ung thư phổi Lewis Kết quả thì heyneanol làm giảm sự phát triển của khối u mạnh hơn resvertrol mà không ảnh hưởng đến khối lượng cơ thể, ngoài ra cả heyneanol

và resvertrol đều ức chế yếu tố tăng trưởng nguyên bào cơ bản (bFGF), ức chế sự gắn kết bFGF với thụ thể của nó [12]

Một nghiên cứu khác về cao chiết cành nho V vinifera cho thấy khả năng ức

chế sự tăng trưởng tế bào ung thư và HepG2 HeLa với IC50 là 50±12 và 32±16 mg/ml [7]

Một số tác dụng sinh học của các loài chi Vitis được tóm tắt tại bảng 1.4

Bảng 1.4: Một số tác dụng sinh học của chi Vitis

1.2 Cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.)

Tên đồng nghĩa: V kelungensis Momiy; V lanata Roxb; V pentagona Diel

& Gilg; V quinquangularis Rehder [53]

Tên địa phương: nho lông, nho năm góc [5]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây nhỡ leo [5], đơn tính khác gốc Cành cây hình trụ với đường cong chạy dọc, có lông màu xám hoặc nâu, tua chia làm đôi [39] Lá đơn; lá kèm màu nâu hình

trứng hay hình mác dài 3-5 mm, rộng 2-3 mm, đỉnh nhọn hiếm khi tù; cuống lá dài 2,5-6 cm với lớp lông tơ dày đặc; phiến lá thỉnh thoảng chia 3 thùy dài 4-12 cm, rộng 3-8 cm, lớp lông tơ xám hoặc nâu thưa dần, lông gân lá xa trục đôi khi có lông, gần trục với lớp lông tơ thưa thớt khi còn non sau đó thì không có lông, gân xa trục thì nhẵn đôi khi có vài lông tơ, gân chính có từ 3-5, gân bên có 4-6 cặp, hình tim đến gần hình tim, khe tù hiếm khi sắc nhọn, mép từ 9-19 răng cưa mỗi bên, sắc nhọn [39] Cụm lá đối dài 4-14 cm, phân nhánh phát triển; cuống dài 1-2 cm với lông màu xám hoặc nâu Cuống nhỏ 1-3 mm, nhẵn Nụ hình trứng hoặc elip, 1,5-2

cm, đỉnh tròn [39] Đài hoa 0,1mm Chỉ nhị hình sợi, 1-1,2 mm, bao phấn màu vàng hình elip; nhụy hoa bầu dục, ngắn Quả mọng, màu tím đen khi chín, hình cầu đường kính 1-1,3 cm [39] Hạt 2-4 [5], hình trứng, đỉnh tròn, rốn ở giữa có lỗ hướng lên [39]

Sinh thái: trong rừng, cây bụi, sườn đồi, thung lũng [39], ra hoa tháng 5-6, có quả tháng 10-11 [5]

Phân bố: Lạng Sơn, Ninh Bình vào Bình Thuận; còn có ở Trung Quốc, Lào, Campuchia [5]

1.2.2 Thành phần hóa học

Hiện nay có rất ít nghiên cứu về cây nho rừng (Vitis heyneana Roem &

Schult.), một số hợp chất đã được phân lập từ cây này thuộc nhóm stilbenoid, acid phenolic, terpen [46], [49]

1.2.2.1 Nhóm chất stilbenoid

Cho đến nay, người ta đã phân lập được 7 stilbenoid trong đó có 3 monostilbenoid (Vitisinols A; Piceid; Hopeaphenol) [49] và 4 oligostilbenoid gồm một tetrastilbenoid (heyneanol A), một tristilbenoid (ampelopsin C) và hai

distilbenoid (amelopsin A; (+)-ε-viniferin) [46]

Từ dịch chiết aceton 70% lá cây V quinquangularis (tên đồng nghĩa của

Vitis heyneana) phân lập được 5 megastigman glycosid trong đó có một

megastigman glycosid mới (1) và 4 megastigman glycosid đã được xác định: actinidioionsid (2); (6S, 9R)-roseosid (3), Icarisid B5 (4), Icarisid B1 (5) [17]

Hình 1.6: CTCT một số hợp chất nhóm megastigman glycosid thuộc V

quinquangularis Rehder

1.2.2.3 Một số thành phần khác

Các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã tách ra được 5 hợp chất từ rễ cây V

heyneana, gồm một lignan glycosid (1); một triterpen (2), một benzyl diglycosid

(3); một acid phenolic (4) và một sterid (5) Đó là: Aviculin (1); Acid betulinic (2);

Benzyl O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (3); Methyl rosmarinat (4); β-sitosterol (5) [49] Từ dịch chiết lá cây V quinquangularis đã phân lập và xác

định được 2 triterpenoid: cycloartan nortriterpenoid (6) và cyclo-23-en-3b, 25-diol (7) [17]

Hình 1.7: CTCT một số hợp chất khác thuộc V heyneana Roem.& Schult 1.2.3 Tác dụng sinh học và công dụng của cây nho rừng

(V heyneana Roem & Schult.)

1.2.3.1 Tác dụng sinh học

Kết quả nghiên cứu của MO Qian và cộng sự năm 2008 cho thấy procyanidin

từ hạt giống của V quinquangularis (hàm lượng 0,04%) có tác dụng chống oxi hóa

và kéo dài tuổi thọ của dầu camellia [36]

Một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy dịch chiết V quinquangularis ức

chế đáng kể huyết khối gây ra bởi FeCl3 trên động mạch cảnh của chuột và giảm khối lượng huyết khối [52]

Ngoài ra thì dịch chiết nước lá V quinquangularis làm giảm đáng kể lượng

cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL ở gan nên có thể kết luận dịch chiết nước

có tác dụng làm giảm lipid máu [50]

1.2.3.2 Công dụng

Theo y học cổ truyền bộ phận dùng: Rễ, vỏ rễ, toàn cây, lá [5]

Nho rừng vị hơi đắng, chua, tính bình Rễ, vỏ rễ có tác dụng điều kinh hoạt huyết, thư cân hoạt lạc, chỉ huyết Toàn cây chỉ huyết, khư phong thấp, an thai, giải nhiệt Lá thanh nhiệt lợi thấp, tiêu thũng giải độc [5]

Ở Campuchia, rễ được dùng để ăn với trầu và dùng trị viêm phế quản; cũng dùng làm thuốc lợi tiểu và phối hợp với rễ dứa hãm hoặc sắc uống trị bệnh lậu [5]

Ở Thiên Tây (Trung Quốc), vỏ rễ được dùng trị kinh nguyệt không đều và bạch đới Ở Vân Nam, rễ, vỏ cây, toàn cây và lá được sử dụng Rễ và vỏ dùng trị kinh nguyệt không đều và bạch đới, dùng ngoài trị đòn ngã tổn thương, gân cốt tê đau; toàn cây thì dùng trị bệnh sởi; lá dùng trị bệnh lỵ và mụn nhọt sưng lở [5]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất

2.1.2 Dung môi, hóa chất

Hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: cloramin, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

Hóa chất, dung môi dùng trong định tính thành phần hóa học: ethanol (EtOH), nước cất, Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussiat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, (CH3CO)2O, dung dịch gelatin 1%, CHCl3, HCl đặc, ammoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5% đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

Dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol

(MeOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM) đều đạt tiêu chuẩn

công nghiệp và được cất lại trước khi dùng

Máy cô quay Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ), bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, máy siêu âm Power sonic 450 (Hwashin, Hàn Quốc), cột thủy tinh

Tủ sấy Memmert (Đức), tủ sấy Binder-FD115 (Binder, Đức) Máy đo độ nóng chảy Kofler micro-hotstage

2 bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện chất

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Nho rừng thu hái ở Lào Cai

Giám định tên khoa học của cây Nho rừng

Mô tả đặc điểm vi học của mẫu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong phần trên mặt đất của cây Nho rừng bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

Bước đầu khảo sát, phân lập thành phần có trong phân đoạn n-hexan của

phần trên mặt đất của cây Nho rừng bằng phương pháp sắc kí cột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và trong phòng thí nghiệm, mô tả đặc điểm theo hướng dẫn [3]

Giám định tên khoa học của mẫu: thu mẫu Nho rừng ở Lào Cai, sau đó được

xử lý và làm tiêu bản và đối chiếu với các mô tả trong các tài liệu thực vật chuyên sâu [5], [39] Tiêu bản mẫu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật: nhờ chuyên

gia giám định tên khoa học của cây, các tiêu bản sau khi giám định tên khoa học được đưa vào lưu trữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu: thân, lá được cắt, tẩy, nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép Quan sát cấu tạo vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột thân, bột lá bằng kính hiển vi, chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh theo phương pháp trong các tài liệu [1], [2]

2.3.2 Phương pháp định tính các nhóm chất trong dược liệu

Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng các phản ứng đặc trưng của từng nhóm chất trong tài liệu [1], [2]

2.3.2.1 Định tính alkaloid

Cho 5g bột dược liệu vào bình cầu dung tích 50 ml Thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 1N Đun cách thủy tới sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích

100 ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH= 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alkaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml) Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng Na2SO4

khan Lắc dịch chiết chloroform với acid H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ (mỗi ống 1ml) để làm các phản ứng sau:

 Phản ứng với thuốc thử Mayer: thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer vào ống nghiệm, nếu thấy tủa màu từ trắng đến vàng thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat vào ống nghiệm, nếu thấy xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff vào ống nghiệm, nếu xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ thì dương tính

2.3.2.2 Định tính glycosid tim

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm vào

100 ml ethanol 25% rồi đun cách thủy 30 phút Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml, thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ khác Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat 30% vào Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, cho thêm

1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy và lọc lại Tiếp tục thử cho đến khi không còn tủa với chì acetat nữa

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kĩ với chloroform (2 lần, mỗi lần 8ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch Gộp dịch chiết chloroform và loại nước bằng Na2SO4 khan Chia dịch chiết vào các ống nghiệm và bốc hơi cách thủy đến cắn để thực hiện các phản ứng sau:

 Phản ứng Liebermann- Burchardt: hòa cắn trong ống nghiệm 1 với 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết Nghiêng ống 45°, cho từ từ theo thành ống

1 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Quan sát nếu ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có một vòng màu tím đỏ xuất hiện, lớp chất lỏng phía trên màu hồng, lớp chất lỏng phía dưới màu xanh lá thì phản ứng dương tính

 Phản ứng Baljet: hòa cắn trong ống nghiệm 2 với 1 ml ethanol 90%, lắc đều cho đến tan hết Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha ( acid picric 1%: NaOH 10%= 1:9) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

 Phản ứng Legal: hòa tan cắn ống nghiệm 2 với 0,5 ml ethanol 90%, lắc kĩ cho tan hết Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

2.3.2.3 Định tính saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống ngiệm lớn 0,1g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, bịt tay bằng ngón tay cái, lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc, để yên và quan sát nếu thấy cột bọt bền vững sau 15 phút thì dương tính

Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm 10

ml H2SO4 loãng Đun sôi cách thủy vài phút Để nguội, chiết với chloroform rồi cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, quan sát nếu thấy giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu xanh lá thì phản ứng dương tính

Phản ứng Liebermann- Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết chloroform ở trên cho vào 1 ống nghiệm rồi cô cách thủy tới cắn Cho vào cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 45° rồi thêm 0,5 ml acid H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm để

dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng trong ống nghiệm có màu đỏ thì phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1 ml dịch chiết ethanol vào một ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3 5% nếu thấy xuất hiện tủa xanh đen thì phản ứng dương tính

Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10% nếu thấy xuất hiện tủa màu vàng, thêm nước tủa tan và màu dung dịch tăng lên thì phản ứng dương tính

2.3.2.5 Định tính coumarin

Chiết xuất: Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml ethanol 90% vào quấy đều Đun sôi cách thủy khoảng 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc tiến hành phản ứng:

 Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2: để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội rồi quan sát: ống 1: có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính, ống 2: trong

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát

- Ống 1: trong suốt thì phản ứng dương tính

- Ống 2: có tủa đục

 Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào 2 ml NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi rồi để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha, nếu xuất hiện màu đỏ gạch thì phản ứng dương tính

 Phản ứng chuyển dạng cis-trans: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp

thêm 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong 2 phút Bỏ miếng kim loại

ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che sáng dần lên, sau vài phút cả hai đều sáng như nhau thì phản ứng dương tính

2.3.2.6 Định tính anthranoid

Chiết xuất: cho 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml H2SO4 1N Đun sôi trực tiếp đến sôi, lọc nóng dịch chiết vào bình gạn dung tích 50 ml Để nguội dịch lọc, chiết với chloroform (5 ml)

Phản ứng Borntraeger: Lấy 1 ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml NaOH 10% Lắc kỹ, quan sát nếu thấy lớp NaOH có màu đỏ sim thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với dung dịch Pb(CH3COO)2 10%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt Pb(CH3COO)2 10%, nếu xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt gelatin 1%, nếu xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với dung dịch Cu(CH3COO)2: Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 2 giọt Cu(CH3COO)2, nếu xuất hiện tủa bông màu nâu thì phản ứng dương tính

2.3.2.8 Định tính acid amin

Lấy 3 ml dịch chiết ethanol cho vào ống nghiệm Thêm 2 giọt dung dịch ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy thấy dung dịch chuyển sang màu tím thì phản ứng dương tính

2.3.2.9 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm dịch chiết nước một ít tinh thể Na2CO3, nếu thấy xuất hiện bọt khí thì phản ứng dương tính

2.3.2.10 Định tính đường khử

Cho 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling

A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính

2.3.2.11 Định tính polysaccharid

Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống

 Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

 Ống 2: 4 ml dịch chiết nước dược liệu và 5 giọt thuốc tử Lugol

Nếu thấy ống 2 xuất hiện màu nâu đỏ đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính

2.3.2.12 Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung

môi thấy để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính

2.3.2.13 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến khô

Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kĩ Để nghiêng ống nghiệm 45° nhỏ

từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Quan sát nếu thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ thì phản ứng dương tính

2.3.2.14 Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi cách thủy đến cắn,

thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh thì phản ứng dương tính

2.3.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân

lập được

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là ethanol tuyệt đối Dịch chiết ethanol được cất thu hồi dung môi thu được cao ethanol toàn phần Cao ethanol được phân tán trong nước nóng, chiết lỏng – lỏng

với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat Dịch chiết của

từng phân đoạn được cất thu hồi dung môi, thu được các cao phân đoạn tương ứng:

cao n-hexan, cao ethyl acetat, cao nước

Phân lập các thành phần có trong cao phân đoạn n-hexan bằng phương pháp

sắc kí cột [1], [4]

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng cách đo nhiệt độ nóng chảy, phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của cây

Dây leo, thân và nhánh non có lông tơ như tơ nhện màu vàng- trắng, sau đó nhẵn; cuống, mặt dưới lá và cụm quả có lông tơ như tơ nhện màu vàng nhạt; tua cuốn đối diện với lá, xẻ đôi ở đỉnh, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc lúc non, sau nhẵn Lá đơn, mọc so le; lá kèm rụng sớm, có vết lá kèm ở gốc cuống lá; cuống 2-6 cm, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc, ngắn hơn rất nhiều so với phiến lá; phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, kích thước 4-10x3-7 cm, nguyên hoặc có 3 thùy nông; gốc lá hình tim hoặc cụt, mép lá có 19-22 đôi răng cưa nhọn, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn; gân lá hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 5-7 cặp, gân cấp 3 song song, nổi rõ ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên; mặt dưới lá phủ lông tơ màu nâu xám, mặt trên có lông tơ dạng mạng nhện lúc non, sau nhẵn Cụm quả chùm kép, đối diện lá, dài 10-15cm, cuống cụm quả dài 3-4 cm, chia nhiều nhánh, các nhánh phía dưới dài hơn các nhánh phía trên Quả mọng hình cầu, kích thước không đều trong cùng một cụm, đường kính 0.9-1.4 cm, khi chín màu tím đen, nhẵn, vị rất chua Hạt 3-4 trong một quả, hình trứng ngược, đỉnh tròn, gốc thuôn nhọn, hơi xẻ 2, kích thước khoảng 6x4 mm; vỏ hạt nhẵn, mặt lưng có một đốm màu nâu ở giữa với đường sọc màu vàng nâu kéo dài qua đỉnh sang hết mặt bụng đến gốc hạt, mặt bụng

có hai rãnh dọc xuất phát từ đỉnh hạt đến gần đỉnh, khía sâu vào hạt

Dựa vào quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu, đối chiếu với tài liệu tham khảo cùng sự giúp đỡ của TS Nguyễn Thế Cường- Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, cây Nho rừng dùng để nghiên cứu đã được giám định tên khoa

học là Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho (Vitaceae) Tiêu bản mẫu sau khi

giám định được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với số hiệu TL07

Đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng

(Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: a Cành mang lá, cụm quả; b Thân già; c Thân non; d Tua cuốn; e Lá;

f Gốc lá; g Ngọn lá; h Cụm quả; i Quả; j Quả cắt ngang; k Hạt (mặt bụng);

l Hạt (mặt lưng); m Hạt cắt ngang; n Hạt cắt dọc

3.1.2 Đặc điểm vi học

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân

Vi phẫu thân có thiết diện tròn Từ ngoài vào trong gồm: biểu bì cấu tạo bởi

1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau, màng ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng (1) Tiếp

theo là mô dày tập trung thành từng đám (2) cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành dày

lên ở các góc (2) Mô mềm rất mỏng gồm các tế bào hình đa giác, hình tròn, kích

thước lớn sắp xếp lộn xộn nhau tạo thành các khoảng gian bào (3) Mô cứng gồm

các tế bào dày hóa gỗ tạo thành hình cung phía trên bó libe gỗ (4) Libe gỗ tạo thành