tạo dòng gen mã hóa glucanase từ trichoderma asperellum

Endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside Shallom

MỞ ĐẦU

Cellulose được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và tảo để phục vụ cho quátrình sinh trưởng và phát triển của chúng Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấncellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽtích tụ lại và gây hại cho hệ sinh thái Cellulose là polysaccharide cấu tạo bởicác đơn phân β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glycoside (Shallom &Shoham, 2003) Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiềukhó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp

Trong tự nhiên, các loài nấm thường kết hợp với các vi khuẩn phân hủycellulose thành các đơn phân (monomer) là glucose rất dễ hấp thụ đối với cácsinh vật khác Tuy nhiên trong các hệ sinh thái nhân tạo như các vườn, trangtrại, đồn điền, ruộng lúa, các sinh vật phân hủy cellulose trên không tồn tạihoặc rất ít, do đó sẽ không diễn ra quá trình phân hủy cellulose (cũng như cácchất cao phân tử khác) một cách dễ dàng và nhanh chóng như trong các hệsinh thái rừng tự nhiên

Endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệenzyme thủy phân cellulose (cellulase) Enzyme này tham gia phân cắt ngẫunhiên các liên kết β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một sốloại polysaccharide tương tự khác tạo thành các oligosaccharide

Nhiều chủng nấm tiết enzyme cellulase với lượng lớn hơn các chủng vi

khuẩn và Trichoderma được biết như chi nấm có khả năng tiết cellulase nhiều nhất (Amouri và cs, 2006) Cellulose "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng các loài nấm Trichoderma lại có khả năng phân hủy

hoàn toàn cellulose Hầu hết các cellulase thương mại là được sản xuất bởi

nấm T reesei và Aspergillus niger Điều này phản ảnh một thực tế rằng nấm

mốc là một nguồn tự nhiên tiết enzyme mạnh (Bergquist và cs, 2002) và cóthể nghiên cứu để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp

Một ứng dụng tiềm năng của cellulase là sản xuất ethanol nhiên liệu từsinh khối lignocellulose (Duff và cs, 1996), dùng để thay thế cho xăng trongđộng cơ đốt trong Công nghệ triển vọng nhất cho sự chuyển đổi sinh khốilignocellulose thành ethanol nhiên liệu là dựa trên sự phân giải cellulose nhờenzyme cellulase (Holker và cs, 2004; Ahamed & Vermette, 2008)

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về visinh vật phân hủy cellulose (Đặng Minh Hằng, 1999; Tăng Thị Chính và cs,1999; Hoàng Quốc Khánh và cs, 2003; Nguyễn Văn Tuân, 2009) Nhữngnghiên cứu này chủ yếu dừng lại ở vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật vàđánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợpcellulase

Công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật là cơ sở đểsản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone, enzyme Việccải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợpDNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi, trong đó có tạo dòng và sản xuấtglucanase Điều này đã mở ra một hướng đi mới trong việc tăng cường khảnăng phân hủy các phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose nhưng vẫn an toànđối với môi trường

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng gen mã

hóa glucanase từ Trichoderma asperellum” nhằm tạo cơ sở bước đầu cho

việc sản xuất glucanase ứng dụng trong công -D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & nông nghiệp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ GLUCANASE

Dựa vào hoạt tính của enzyme đối với cơ chất, người ta phân chiaglucanase thành nhiều loại khác nhau như β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase,β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase Jesus và cs (1995) đã mô tả các cơ chất khác nhau và loạiliên kết chính của chúng Các cơ chất khác nhau được sử dụng làm nguồncarbon trong môi trường nuôi cấy một số loài nấm, trong đó liên kết glycosidehiện diện trong cơ chất quyết định sự biểu hiện của enzyme glucanase cụ thể

1.1.1 β-1,3-Glucanase

β -D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan là một trong những thành phần cấu trúc chính của thành tếbào nấm, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase đã được chứng minh là enzyme quan trọng trong sựphân giải thành tế bào của nấm gây bệnh ở thực vật (Elad và cs, 1983)

Glucanase biểu hiện hoạt tính (in vitro) ở cấp độ micromol (~50 µg/ml) chống

lại một số lớn loại nấm, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh ở người và thựcvật (Coutos và cs, 1993) Mặc dù các enzyme phân giải glucan được phân bốtrong một số họ enzyme thủy phân glycoside, nhưng chỉ có các gen mã hóa

glucanase trong họ 5 và 55 từ các loài Trichoderma được mô tả đặc tính

(Dong-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Jinkim và cs, 2002)

β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Glucanase phân bố rộng rãi ở vi khuẩn, nấm và thực vật bậc cao,trong đó nhiều enzyme đã được tinh sạch và xác định hoạt tính (Copa-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Patino và cs, 1989; Kauffmann và cs, 1987) Chúng được phân loại như exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.58)] và endo-β-β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.58)] và endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.58)] và endo-β-β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.6 hoặc EC3.2.1.39)] Exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase giải phóng liên tục glucose từ đầu không khửcủa cơ chất, trong khi endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase có khả năng phân cắt liên kết β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glycoside ngẫu nhiên ở phía trong dọc theo chuỗi polysaccharide, giải

phóng các đoạn oligosaccharide ngắn Các chức năng sinh lý của β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng Ở thực vật, các enzyme nàyđược xem như là hệ thống phòng thủ chống lại các loại nấm gâybệnh (Grenier và cs, 1993) Trong nấm, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase dường như có nhiềuchức năng khác nhau Đầu tiên, có vai trò phát sinh hình thái trong suốt quátrình phát triển và phân hóa của nấm (Peberdy và cs, 1990) Thứ hai, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase có liên quan đến sự huy động β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan trong điều kiện nguồncarbon và năng lượng bị cạn kiệt, lúc này chức năng của chúng giống như cácenzyme tự phân (Rapp P., 1992) β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase cũng có tác động đến nấmgây bệnh ở thực vật bằng cách phân giải callose (β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan) trong mômạch của vật chủ trong quá trình tấn công của mầm bệnh (Shaeffer và

cs, 1994) Cuối cùng, vai trò dinh dưỡng trong hoại sinh và ký sinh cũng đãđược nghiên cứu (Sivan và Chet, 1989)

1.1.2 β-1,4-Glucanase

Thành tế bào thực vật là nguyên liệu có khả năng tái tạo, dồi dào nhấttrên trái đất (Himmel và cs, 1999; Saleem và cs, 2008) và là nguồn dự trữchính của carbon trong tự nhiên (Yang và cs, 2007) Thành phần chính củathành tế bào thực vật là cellulose -D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & 40% trọng lượng khô, hemicellulose -D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & 33%

và lignin -D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & 23% (Han và cs, 2003; Sa-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Pereira và cs, 2003) Sinh khối thực vật

là nguồn hóa học và nguyên liệu thay thế tự nhiên với chu kỳ tuần hoàn ngắn

đủ để đáp ứng nhu cầu của thị trường nhiên liệu trên thế giới Cellulase làenzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghiệp (Hanif

và cs 2004; Jamil và cs, 2005) và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

vì các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực như: công nghiệp dệt, chế biếntinh bột, sản xuất rượu, bia, mạch nha, chiết xuất nước ép trái cây và rau củ,(Gao và cs 2008; Zhou và cs, 2008) , sản xuất acid hữu cơ (Cheryan và cs,1997), sản xuất dung môi hữu cơ (Dũrre, 1988), sản xuất thức ăn gia súc,

công nghiệp sản xuất giấy và trong công nghệ xử lý môi trường (Tăng ThịChính và cs, 1999)

Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose Do

đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốcthực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ Tuy nhiên,nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn có khả năng phânhủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase Ngoài ra,endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loàiđộng vật không xương sống khác Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ cócấu trúc khác nhau Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác vàđiều kiện phản ứng tối ưu của các enzyme

1.1.3 β-1,6-Glucanase

Ngoài thành phần β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, thành tế bào nấm còn chứa glucanphân nhánh với liên kết β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glycoside (Peberdy và cs, 1990 và HrmovaFincher, 1993) Bên cạnh các enzym thủy phân β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan đã được nghiêncứu rộng rãi (Benitez và cs, 1998), thì những đặc tính sinh hóa và phân tử củaβ-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan glucanohydrolases, EC 3.2.1.75) cũng đãđược mô tả (Pitson và cs, 1996)

Như các enzym thủy phân ngoại bào khác, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase có thể có mộtvai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm, bởi sự phân giải các glucan ởdạng polymer trong môi trường sống của chúng Nấm ký sinh tiết ra cácenzyme này có khả năng phân giải thành tế bào vật chủ của chúng β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &

glucanase được tiết ra bởi T harzianum được xem là một thành phần hoạt

động hổ trợ cùng với các enzyme thủy phân khác trong quá trình ký sinh củaloài này

1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI β-1,4-GLUCANASE

1.2.1 Nguồn gốc

Endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khácnhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tựnhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấmmen có khả năng sinh tổng hợp endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase

Ngoài ra, endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật

Arabidopsis , ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối , ở động vật thân mềm như Mytilus edulis

Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồncung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất vượt xa so vớienzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật Vì thế, chúng được sử dụng rộngrãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme

Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzymevới số lượng lớn Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo

ra được Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &100 giờ) Vi sinh vậtsinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trìnhsản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Hơn nữa,enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Đốivới một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồnenzyme

1.2.2 Phân loại

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc

tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân,

nhóm 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, phân nhóm 1: thủyphân liên kết O-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & và S-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glycoside (International Union of Biochemistry andMolecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &mrs.fr/pedro/CAZY/db.html).Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau Tùy theo quanđiểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thànhcác nhóm khác nhau Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhómenzyme C1 và nhóm enzyme Cx Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợicellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng Các enzyme Cx được chiathành hai loại: exo β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứtgốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase(3.2.1.4) hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tửcellulose

Hiện nay cellulase được phân thành ba loại: endoglucanase hoặccarboxymethyl cellulase (CMCase) (endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, EC 3.2.1.4),exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, EC 3.2.1.91) vàglucosidase (D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) (Gielkens và cs, 1999;Kang và cs, 1999; Parry và cs, 1983) Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiêncầu nối 1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glycoside ở trong phân tử cellulose (Siddiqui và cs, 2000) Kếtquả làm giảm nhanh chóng chiều dài của polymer và nồng độ của đường khửgia tăng chậm Exoglucanase thủy phân cellulose bằng cách loại bỏ các đơn vịcellobiose từ đầu không khử của cellulose (Han và cs, 1995; Akiba và

cs, 1995)

Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ Trướcđây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase đượcchia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A,

B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác Hiện nay, cáccellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74

1.3 ỨNG DỤNG CỦA β-1,4-GLUCANASE

1.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những hướng tiến

bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn Dịchquả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ

có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục.Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân cácpolysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình táchchiết và làm trong Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trongchế phẩm enzyme Viscozyme 120L được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡmàng tế bào đậu tương Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụngendoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn

Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường,protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose

và β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm.Người ta thường sử dụng β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase để loại bỏ những thành phần này Các

chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A niger, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong

sản xuất bia

Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất

bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng Glucanase từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ Glucanase từ T reesei, A niger được ứng dụng trong sản xuất

fructooligosaccharide Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng(prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn Prebiotic có nhiều lợiích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe Khi được bổ

sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quantrọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệcác chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh, tăngkhả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triểncủa các vi sinh vật trong khoang miệng Các phế phụ phẩm nông nghiệp nhưlõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất cácoligosaccharide Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu cónguồn gốc từ nấm mốc Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở cácnước trên thế giới là rất lớn Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về cácoligosaccharide vào khoảng 1000-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &2000 tấn/năm

1.3.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam.Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nôngnghiệp Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt,sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngànhtrồng trọt Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo,nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam Tuy nhiên, ngành nông nghiệpnói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn Một trongnhững vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năngsuất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môitrường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người

Trước tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã được đưa ra và một trongnhững giải pháp được nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức

ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học như sản xuất và bổsung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi Bổ sung chế phẩmenzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và

hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trưởng phát triển, nângcao chất lượng vật nuôi Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đượctiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lượng vốn có, tiết kiệm chi phíchăn nuôi, đồng thời làm giảm lượng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọngtrong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc có chứanhiều cellulose và glucan Những thành phần này thường không được tiêu hóatriệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thụcác chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật Bổ sung β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giảiphóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấpthụ và chuyển hóa thức ăn Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sungglucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôilàm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi

Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase

và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử

lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa sovới đối chứng (là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme) như sau: khả năngtiêu hóa tinh bột tăng 87-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &94%, các polysaccharide khác tăng 10-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &18%, phytatetăng 59-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &70%

Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sựquan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm Một số chếphẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến như: Rovazyme G2(DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme(cellulase, β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional ProductsLtd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease,amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF,

Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &CF(Rampart-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase,amylase, protease, lipase, pectinase) Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tạithị trường Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, phytase, α-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &amylase, pectinase, protease và xylanase

Ở Việt Nam đã có nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi ChuThị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm mentrong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc

1.3.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trước khi lênmen đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5% Nhiều chếphẩm enzyme đã được sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase0,5L có chứa β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol Đồng

thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp

glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ,acetic acid , sản xuất acetone, butanol và isopropanol

1.3.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu đượcnghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhauchuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn Trong quy trình sản xuất giấycần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì được giữ lại Phương phápthông thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide Đây là mộtphương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlortồn dư trong nước thải Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mớiđược đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống, đó là sử dụng các chếphẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy

Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làmthay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệmkhoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Đồng thời xử lýglucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ,tăng hiệu quả khử lignin Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanaseđược sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy Kỹ thuật này đã mở ra triển vọngđầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh

1.3.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa

Cellulase và hemicellulase cùng với protease, lipase, amylase được ứngdụng để sản xuất chất tẩy rửa Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải lànơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo Tính đến năm

2002 đã có nhiều cellulase được sản xuất dùng cho bột giặt như:

endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous

1.3.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

Trong công tác bảo vệ môi trường, enzyme được sử dụng trong xử lýchất thải, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các chất thảithành sản phẩm có ích Trong nhiều năm qua, các chủng vi sinh vật sinh tổnghợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rácthải sinh hoạt

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cs đã phân lập và tuyển chọn đượccác chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể

ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &7 ngày Nhiềuchủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệuquả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam

Nhiều chế phẩm vi sinh có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã

được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải Trong đó, chế phẩm Micromix

3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảmmột nửa thời gian lên men so với đối chứng Đồng thời, lượng mùn tạo thànhkhi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinhdưỡng cao hơn 10% so với đối chứng Sản phẩm của quá trình xử lý rác thảiđược phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật cố định đạm có ích tạothành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phầnnâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễmmôi trường

Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây

bệnh cây trồng như cellulase của T harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc

Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể

sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài Cóloài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòihỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau.Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phứctạp như glucan, tinh bột, cellulose

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon

thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩnchịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC Nguồn carbon thíchhợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩnCD6-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &9 là tinh bột, chủng CD9-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &9 là CMC và saccharose, chủng CD5-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &12 là

lactose; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa Nguồn

carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưa ấm là vỏ lạc hoặc rơm

Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinhtổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên,đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp Theo Acharya và cs (2008), nguồn

carbon thích hợp nhất cho các chủng A niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử

dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa đượcxem là nguồn cơ chất tối ưu

Các loài Penicillium pinophilum , P persicinum, P brasilianum sinh

tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối vớinguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích

hợp nhất cho chủng Penicillium sp DTQ-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &HK1 là rơm

Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau

đối với nguồn nitrogen Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cảnguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài.Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhấttrong môi trường chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men

Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh

tổng hợp cellulase của chủng A niger NRRL-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &363 với hoạt tính cellulase từ 46 đến 76 U/g Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho thấy, các chủng A niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: urea, peptone,

ammonium nitrate Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năngsinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này

Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các

loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài

ưa ấm và các loài chịu nhiệt Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trongđiều kiện dưới 15oC, các loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ởkhoảng nhiệt độ 20-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &37oC; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng vàphát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50oC

Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ

bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ởđiều kiện nhiệt độ 45-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &55oC và có thể chịu được nhiệt độ 65-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &80oC Nghiên cứucủa Nguyễn Lan Hương và cs(2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạkhuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC Acharya và

cs (2008) cho rằng, các chủng A niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên

men trong điều kiện 28oC, pH 4,0-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &4,5

Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợpcác loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tốkhác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vàoban đầu

1.5 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA β-1,4-GLUCANASE

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạtmạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức

độ chịu ảnh hưởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loạicũng có sự khác nhau

Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng

lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấutrúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt

độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &50oC Ở nhiệt độ cao, enzyme

bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấpdưới 0oC, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa

về nhiệt độ thích hợp

Cellulase từ A niger NRRL-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &363 hoạt động mạnh nhất ở 50oC , trong khi

đó cellulase từ A niger Z10 là 40oC , hoạt tính xúc tác của endoglucanase III

từ T reesei đạt tối đa ở 55oC Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs

(1996), các endoglucanase từ chủng A oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất

trong dải nhiệt độ 45-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &550 C

Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc

vào pH môi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pHthích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo các

nghiên cứu cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ A niger NRRL-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &363 là 5,5 ; của cellulase từ A niger Z10 là 4,5 ; của endoglucanase III

từ T reesei là 4,0-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &5,0 ; của endoglucanase từ A oryzae KBN616 là 4,0 Khi

nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ưa

acid A terreus M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt

động trong dải pH 2-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &5, trong đó pH 2 là tốt nhất

Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc

hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhấtđịnh có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme Sharma và

cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp.

D04 lên 40% so với đối chứng; Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và

Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với

đối chứng) Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với

Cu2+ (2 mM)

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh

mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũngnhư bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt độngcủa enzyme là khác nhau Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng

Penicillium sp DTQ-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol,

isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &63% Các chất tẩyrửa tween 20, tween 80 và SDS đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độkhác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &34%

1.6 CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP TRONG SẢN XUẤT ENZYME

Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sựphát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trìnhsinh học ở mức độ phân tử Đây là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định

vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợpđược dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn

xa nhau Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, côngnghệ gen hay kỹ thuật gen…) bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tửđược dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA

Kỹ thuật tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấpnhững hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động củagen Mục đích của việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sảnphẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Sựbiểu hiện của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cácvector biểu hiện thích hợp đã được thiết kế cho phép gen ngoại lai biểu hiện ởmức độ cao hơn

Vào những năm 1990, nhiều enzyme đã được sản xuất bởi công nghệDNA tái tổ hợp Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chủ động vềnguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu; nâng cao hiệu suất sản xuất, chấtlượng của enzyme; dễ dàng công nghệ hóa quá trình sản xuất và nhờ đó làmgiảm giá thành sản phẩm Để sản xuất enzyme tái tổ hợp, các nhà nghiên cứuphải tạo dòng được gen mã hóa cho enzyme quan tâm, thiết lập hệ thống biểuhiện và tiếp theo là cải tiến hệ thống biểu hiện để enzyme được sản xuất nhiềuhơn theo một cơ chế điều hòa đơn giản

Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sảnphẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Năm

1993, hơn 50% thị trường enzyme công nghiệp được cung cấp bởi các quátrình tái tổ hợp , với doanh thu đạt 140 triệu USD Năm 2002, có khoảng 140protein được dùng để chữa bệnh có nguồn gốc từ các quá trình tạo dòng vàbiểu hiện gen được thừa nhận ở Mỹ và Châu Âu, trong đó chủ yếu là cácenzyme Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng trong các ngành côngnghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm và tinh bột là các sản phẩm tái tổ hợp Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp mà việc sản xuất phytase, được sử dụng như

một loại thức ăn cho khoảng 50% tổng số lợn ở Hà Lan trong nấm A niger,

đã gia tăng 1000 lần so với phương pháp sản xuất truyền thống

1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GLUCANASE TÁI TỔ HỢP

Glucanase được phân bố rộng rãi trong số các loài vi khuẩn, nấm và thựcvật bậc cao, nhiều trong số chúng đã được tinh sạch và mô tả đặc tính Trênthế giới, việc tạo dòng và biểu hiện các gen này trong một đối tượng khácnhằm khai thác tối đa hiệu suất của gen glucanase đã được quan tâm nghiêncứu Các vật chủ thường được chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có

khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh như E coli, nấm men Tuy nhiên,

ở Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện genglucanase được công bố

Hai gen mã hóa endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,4-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase, egl1 và egl3, từ nấm T reesei đã được Penttila biểu hiện trong nấm men Saccharomyces cerevisiae từ năm

1987 dưới sự điều khiển của promoter gen mã hóa phosphoglycerate kinase

De la Cruz và cs (1995) đã phân lập và tạo dòng gen mã hóa endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &

glucanase, BGN13.1, từ chủng T harzianum CECT 2413 trong S cerevisiae.

Enzyme này có trọng lượng phân tử 77,927 Da Fuglsang và cs (2000) đã

phân lập và tạo dòng gen mã hóa α-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (mutanase) từ hai chủng T harzianum CBS 243.71 và P purpurogenum CBS 238.95 trong A oryzae

JaL142 và JaL125 Trong khi đó, tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &α-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &

1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (AGN13.2) từ T asperellum T32 cũng đã được mô tả (Luis S.

và cs, 2004)

Ganiger và cs (2008) đã tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa

endoglucanase từ những loài Trichoderma trong S cerevisiae INVSc1 sử dụng

vector tạo dòng pTZ57R/T và vector biểu hiện pYES2/CT Kết quả cho thấy

hoạt tính của β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,6 endoglucanase của dòng tái tổ hợp từ T reesei tăng ba lần,

từ T harzianum và T virens tăng hai lần so với đối chứng Gen mã hóa

enzyme ngoại bào exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase (tag83) được sản xuất bởi T viride

(Kulminskaya và cs, 2001) , và từ T asperellum (Marcello và cs, 2010) cũng

đã được nghiên cứu Hoạt tính của enzyme này được phát hiện trong tất cảcác nguồn carbon, nhưng hoạt tính cao nhất được tìm thấy khi sử dụng tinh

bột và thành tế bào của R solani Khi điện di không biến tính đã cho thấy có

sự xuất hiện một băng đậm của enzyme này Các thí nghiệm sử dụng RT-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &PCR

cho thấy exo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &1,3-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase cảm ứng trong T asperellum xảy ra ở mức độ

dịch mã và sự biểu hiện của gen tag83 tăng lên có ý nghĩa khi có sự hiện diện

của R solani

Zhou và cs (2010) đã sử dụng Bombyx mori (tằm) để sản xuất endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & glucanase II tái tổ hợp (rEGII) Gen mã hóa EGII (egl2) được tạo dòng từ T reesei và chèn vào genome của B mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) sử

dụng vector biểu hiện BmNPV/Bac-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &to-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Bac Để biểu hiện rEGII, tế bào BmN

và ấu trùng của B mori được cho nhiễm với virus tái tổ hợp, sản lượng rEGII

thu được là 386 µg/ấu trùng và hoạt tính của rEGII tinh sạch khoảng 352U/mg Hoạt tính tối ưu của enzyme này đạt được ở 55oC và pH 4

Huang và cs (2010) đã tạo dòng và biểu hiện cDNA của gen egVIII từ T viride AS3.3711trong S cerevisiae sử dụng vector IpYEMα-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &xegVIII cDNA

này có kích thước 1,317 bp, mã hóa 438 amino acid với trọng lượng phân tử

46,86kDa và Pi 4,32 Sự dịch mã của gen egVIII trong T viride AS3.3711 có

thể được cảm ứng bởi CMC-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Na, sucrose, cellulose tinh thể và bị ức chế bởiglucose, fructose Endoglucanase EGVIII tái tổ hợp có hoạt tính tối ưu tạinhiệt độ 60oC, pH 6,0 và vẫn duy trì hoạt độ khi ủ ở 35oC đến 70oC trong 1giờ (h) Hoạt tính của EGVIII tái tổ hợp đạt cao nhất khi được kích hoạt bởi

75 mM Zn2+ Chủng nấm men chuyển gen IpYEMα-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &xegVIII có thể được sửdụng trong ngành công nghiệp nhiên liệu tái tạo

Sử dụng phương pháp PCR-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &based exon splicing, Li và cs đã tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa EGI, EGIII, EGIV và EGV từ T viride trong B mori sử

dụng hệ thống biểu hiện baculovirus đột biến Bac-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &to-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &Bac/BmNPV có cải tiến,

vector này thiếu gen chiA và v-cath Sau 84h gây nhiễm ấu trùng tằm với

baculovirus tái tổ hợp mBacmid/BmNPV/EGIII, kết quả thu được proteinenzyme EGI có trọng lượng 49 kDa, hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 50oC và pH7,0 Glucanase EGIII thu được sau 48h gây nhiễm tế bào BmN vớibaculovirus tái tổ hợp mBacmid/BmNPV/EGIII, kết quả thu được proteinenzyme EGIII có trọng lượng 45 kDa, hoạt tính đạt cao nhất tại nhiệt độ 50oC

và pH 8,0 Trong khi đó trọng lượng phân tử của endoglucanase EGIV là42kDa, EGV là 36 kDa và các enzyme này có khả năng duy trì hoạt độ ở pH5,0-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &10,0

Ngoài các chủng Trichoderma sp., các gen mã hóa glucanase từ các loài khác cũng đã được nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện Bacillus sp D04 sản

xuất cellulase với trọng lượng phân tử 35 kDa, enzyme này có khả năng phân

giải CMC, cellotetraose, cellopentaose, p-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &nitrophenyl-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &D-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &cellobioside và avicel PH101 Gen mã hóa cellulase (cel) có kích thước 1461 bp của Bacillus sp.D04 đã được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli BL21(DE)pLysS

Tan và cs (2008) đã phân lập cDNA của gen mã hóa endo-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &glucanase II (EGII) từ chủng nấm Humicola insolens H31-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &3 bằng phương pháp RT-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &PCR,

sau đó tạo dòng trong vector biểu hiện pGAPZαA Plasmid tái tổ hợp này

được đưa vào Pichia pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp, khi

phân tích SDS-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &PAGE cho thấy protein biểu hiện có trọng lượng khoảng 55kDa

1.8 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG E coli

Theo Baneyx (1999), E coli là một trong những vật chủ được sử dụng

rộng rãi để biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh vật khác

Hiện nay, việc tạo dòng và biểu hiện gen trong E coli được rất nhiều nhà

khoa học trên thế giới thực hiện, Trình tự cDNA mã hóa cho quinonereductase của chuột bị viêm gan được phân lập, tạo dòng trong vector pKK

233.2 và biến nạp vào chủng E coli JM109 Sau đó, enzyme này được Shiuan

và cs (1994) phân tích trình tự amino acid, kết quả cho thấy đây là mộtprotein dài 273 amino acid, nó có trình tự tương đồng với protein có chứcnăng tương tự ở người

Protein hALR tái tổ hợp đã biểu hiện thành công trong hệ thống biểu

hiện pET28a(+) của E coli BL21, vector pET28a (+)/hALR mang đoạn

cDNA đầy đủ của hALR được khuếch đại bằng phương pháp RT-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &PCR vàchứa trình tự mã hóa cho đuôi His, quá trình tiết hALR được cảm ứng bằngIPTG 2h ở 37oC Đoạn gen mã hóa cho catalase được Yang và cs (2003)

phân lập từ Helicobacter pylori bằng PCR sau đó tạo dòng vào vector pET-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & 22b (+) và được biểu hiện trong E coli BL21 (DE3), kết quả cho thấy catalase

tái tổ hợp chiếm 24,4% hàm lượng protein tổng số sau khi cảm ứng bằngIPTG trong 3 giờ ở 37oC Như vậy, enzyme này đã có hoạt tính cao khi biểu

hiện trong E coli

Guang và cs (2004) đã tạo dòng gen B7-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &H3 vào vector pGEX-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &5X-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &3 và

biến nạp vào E coli để nghiên cứu chức năng sinh học của protein B7-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &H3

trong việc hoạt hóa tế bào lympho T Human beta-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &defensin-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &4 (hBD4) là mộtprotein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, Zhinan và cs (2006) đã

thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gen này vào E coli, sử dụng

vector biểu hiện pET32-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &smhBD4, phân tích sự biểu hiện của gen mã hóa

hBD4 cho thấy, khi nuôi E coli mang vector pET32-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &smhBD4 trong môi

trường MBL ở 34oC, cảm ứng IPTG nồng độ 0,4 mM và sau 6 giờ nuôi cấy

protein hBD4 đạt 2,68 g/l Jinshu và cs (2006) đưa được gen mã hóa GnRHvào hệ thống biểu hiện dựa trên T7 RNA polymerase trong vector pED-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &GnRH3, GnRH là hormone điều hòa quá trình tiết hormone kích thích nangtrứng (FSH) và hormone kích thích thể vàng (LH), do vậy việc biểu hiện được

gen mã hóa GnRH trong E coli có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị bệnh liên

quan đến hormone này

Ở một hướng nghiên cứu khác, trình tự RNA đối mã của rpoS với tácdụng ức chế sự biểu hiện của gen rpoS đã được Guozhu và cs (2003) tạo dòngthành công Kết quả này đã chứng minh rằng việc sử dụng một trình tự làm ứcchế sự biểu hiện của gen là hiệu quả, mở ra một hướng mới trong việc tạo racác tác nhân kháng khuẩn hiệu quả Wu và cs (2008) cũng chỉ ra rằng việc sửdụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong nghiên cứu các tác nhân để kháng bệnh

là rất có triển vọng Gen tương đồng thanatin (th1) mã hóa đoạn peptide dài

20 amino acid được biến nạp vào E coli nhờ vector pET32a-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &TH1 đã biểu

hiện protein với hàm lượng 0,416 g/L, đem đến một triển vọng lớn trong việcđiều trị bệnh bằng sản phẩm của công nghệ DNA

Protein porcine zona pellucida 3β (pZP30 β) được tạo dòng và biểu hiện

vào E coli BL21 (DE3) pLysS sử dụng vector pET-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &3c Protein tái tổ hợp

được phát hiện bằng phương pháp Western blot, sau khi phân tích hoạt tínhcho thấy nó chiếm 10% hàm lượng protein hòa tan tổng số Gen gdhA mã

hóa cho hexaneric glutamate dehydrogenase (GDH) của Pyrococcus furiosus được tạo dòng bằng vector pET11-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom &d và biểu hiện vào E coli Ở hệ thống này

enzyme biểu hiện với lượng chiếm 15% so với hàm lượng protein hòa tantổng số

Toxoplasmosis là bệnh gây ra bởi loài ký sinh trùng Toxoplasma gondii,

còn biết đến như là hiện tượng nhiễm một loại giun sán ở người nói riêng vàcác động vật máu nóng nói chung Bệnh này ảnh hưởng đến sức khỏe của con