PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ ( CP )CỦA Odontoglossum ringspot virus ( ORSV )

TÓM TẮTOdontoglossum Ringspot virus ORSV là một trong những loại vi rút gây ra thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế cho người trồng lan.Việc nghiêncứu tìm ra biện pháp kỹ thuật thích hợ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA Odontoglossum ringspot virus (ORSV)

Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ BÍCH THÚY

Niên khóa : 2007 – 2011

Tháng 07/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA Odontoglossum ringspot virus(ORSV)

ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG TRẦN THỊ BÍCH THÚY

KS NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

Tháng 07/2011

LỜI CẢM ƠN

Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ cùng những người thân trong gia đìnhluôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.Thực hiện luận văn tốt nghiệp là cơ hội giúp tôi ôn lại những kiến thức

đã có và học hỏi nhiều điều mới Trong quá trình thực hiện luận văn tôi đãđược sự giúp đỡ rất nhiều từ Thầy Cô, gia đình và bạn bè

Tôi xin chân thành cảm ơn:

ThS Nguyễn Xuân Dũng và KS Nguyễn Thị Ngọc Thảo đã giúp đỡ tôi

từ những ngày đầu thực tập đến khi hoàn thành luận văn tại Trung tâm.Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiêp này

Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, BanChủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyềnđạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Các anh chị làm việc tại phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử và phòngCông nghệ Sinh học Thực vật đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian qua.Tập thể lớp DH07SH, đặc biệt là các bạn phòng 17F đã gắn bó, độngviên, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua.

Xin chân thành cảm ơn!Trần Thị Bích Thuý

TÓM TẮT

Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) là một trong những loại vi rút

gây ra thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế cho người trồng lan.Việc nghiêncứu tìm ra biện pháp kỹ thuật thích hợp để góp phần làm giảm chi phí pháthiện vi rút ORSV trên lan là một việc làm cần thiết hiện nay Đề tài “Phân

lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ (CP) của Odondoglossum ringspot

virus (ORSV)” được thực hiện nhằm tạo ra cơ sở cho những nghiên cứu tiếp

theo trong việc kiểm soát vi rút này một cách hiệu quả

Đề tài được bắt đầu với việc kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV củamẫu lá lan và thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP của vi rút ORSV.Các mẫu lá có chứa vi rút được sử dụng để ly trích RNA vi rút và khuếch đạigen mã hóa cho protein vỏ (CP) bằng phương pháp RT-PCR Đoạn gen CPsau khi phân lập được chèn vào vectơ pJET 1.2/blunt và sau đó vectơ mang

gen được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp hóa biến

nạp Tiến hành kiểm tra hiệu quả chèn và biến nạp bằng cách sàng lọc cácdòng vi khuẩn trên môi trường kháng sinh chọn lọc và kiểm tra sự hiện diệncủa đoạn gen

Một số kết quả đạt được trong nghiên cứu này là phân lập được gen CP

của vi rút ORSV, thu nhận được dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α mang

plasmid nhân dòng chứa trình tự gen mã hóa protein vỏ CP của vi rút ORSV

và xác định được trình tự gen CP của vi rút ORSV tại Việt Nam

Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) is one of the virus that causes

severe damage to economically for orchid growers Nowaday, researching tofind appropriate technical measures to help reduce the cost of detecting thevirus ORSV is a necessary target Project "Isolation and cloning theOdondoglossum CP ringspot virus (ORSV) coat protein (CP) gene" wasdone to create the basis for further research to control this virus effectively.This project has begun with checking the status of the sample wasinfected with virus by using RT-PCR method with specific primers, and thendesigning primers which amplify the CP gene of the ORSV virus The CPgene sequence was amplified by RT-PCR with the designed primers Theamplified CP gene was inserted into pJet1.2/blunt vector to create the

recombinant vectors Before, they were transformed into E.coli DH5α.

Finally, isolation of E.coli DH5α containing the recombinant vectors wasperformed by using antibiotic selection The presence of the target gene in

transformed E.coli DH5α was checked by using clony PCR.

Some achievements: we have isolated the ORSV CP gene, haveobtained the DH5α E coli cells which containing the recombinant vector.And, we have also analyzed the sequence of this recombinant vector

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Ảnh hưởng của vi rút đối với cây trồng 2

2.2 Các loại vi rút gây bệnh cho lan và các triệu chứng của nó 2

2.3 Giới thiệu về Odontoglossum ringspot virus 3

2.4 Các phương pháp phát hiện vi rút trên lan 6

2.4.1 Phương pháp ELISA 6

2.4.2 Phương pháp RT-PCR 7

2.5 Sơ lược về phương pháp PCR và kỹ thuật tạo dòng gen 8

2.5.1 Phương pháp PCR 8

2.5.2 Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen 9

2.5.2.1 Những bước căn bản trong việc tạo dòng gen 9

2.5.2.2 Tầm quan trọng của tạo dòng gen 10

2.6 Một số yêu cầu của mồi trong thiết kế mồi 10

2.7 Tình hình nghiên cứu về phát hiện Odontoglossum ringspot virus trên lan 11

2.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu nghiên cứu 14

3.2.1 Mẫu 14

3.2.2 Hóa chất 14

3.2.3 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan 16

3.3.2 Thiết kế mồi đặc để khuếch đại gen CP 17

3.3.3 Phân lập gen CP 18

3.3.4 Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng 19

3.3.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn và sàng lọc 19

3.3.6 Kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen nhân dòng 20

3.3.6.1 Kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 20

3.3.6.2 Kiểm tra bằng enzym cắt hạn chế 21

3.3.7 Kiểm tra trình tự gen CP bằng phương pháp giải trình tự 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan 23

4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP 23

4.3 Phân lập gen CP 23

4.4 Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng và biến nạp plasmid tái tổ hợp 24

4.5 Kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen nhân dòng 26

4.5.1 Kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 26

4.5.2 Kiểm tra bằng phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế 28

4.6 Giải trình tự plasmid có chứa đoạn gen CP 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

cDNA: Complementary Deoxyribonucleotic Acid

CyMV: Cymbidium mosaic virus

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA: Deoxyribonucleotide acid

ELISA: Enzym-linked immunosorbent assay

MCS: Multiple cloning site

NCBI: National Center for Biotechnology information

ORSV: Odontoglossum ringspot virus

PCR: Polymerase chain reaction

PMMV: Pepper mild mottle mosaic virus

RdRp: RNA-Deppendent RNA polymerase

RT-PCR: Reverse transcription Polymerase Chain ReactionSHMV: Sunn - hemp mosaic virus

Taq polymerase: Thermus aquaticus polymerase

TMV: Tobacco mosaic virus

TMGMV: Tobacco mild green mosaic virus

ToMV: Tomato mosaic virus

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT–PCR phát hiện vi rút ORSV 17

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP của vi rút ORSV 18

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cho phản ứng PCR khuẩn lạc 20

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng của ORSV 3

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của ORSV 4

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của ORSV 5

Hình 2.4 Triệu chứng của ORSV trên lá 6

Hình 3.1 Thang DNA. 15

Hình 3.2 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR phát hiện vi rút ORSV. 17

Hình 3.3 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP của ORSV 19

Hình 3.4 Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc 21

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra vi rút ORSV bằng RT-PCR. 23

Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP của ORSV. 24

Hình 4.3 Vectơ pJET 1.2/blunt. 25

Hình 4.4 Vùng trình tự MSC của vectơ pJET 1.2/blunt 25

Hình 4.5 Khuẩn lạc vi khuẩn phát triển sau 16 giờ nuôi cấy 26

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi FOCP và ROCP 27

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc mồi FpJET và RpJET 28

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm plasmid. 29

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt 29

Hình 4.10 Kết quả giải trình tự gen CP của ORSV, dòng O4.12 30

Hình 4.11 Kết quả so sánh trình tự gen CP 31

Hình 4.12 Kết quả so sánh với trình tự AB541501.1 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lan là một trong những cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao nhưng các tác nhângây bệnh như côn trùng, nấm, vi khuẩn, vi rút đã làm cho năng suất và chất lượng hoalan trong sản xuất giảm mạnh Trong đó, mức độ tác hại do vi rút gây ra là nghiêm

trọng nhất Odondoglossum ringspot virus (ORSV) là một trong những loài vi rút gây

bệnh phổ biến nhất trên nhiều giống lan Bệnh do vi rút ORSV nói riêng và vi rút nóichung gây ra đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị Biện pháp chủ yếu để kiểm soát bệnh

do vi rút này vẫn là phòng tránh thông qua việc phát hiện và loại bỏ những cây đãnhiễm Việc nghiên cứu tìm ra biện pháp kiểm soát hiệu quả bệnh do vi rút ORSV gây

ra là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay Hiện tại đã có một số nghiên cứu vềvấn đề phát hiện vi rút ORSV gây hại trên lan ở Việt Nam Tuy nhiên, các nghiên cứuchuyên sâu về phân lập, tạo dòng gen của vi rút này để làm cơ sở cho những ứng dụngtiếp theo vẫn chưa được triển khai Đề tài “Phân lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ

(CP) của Odondoglossum ringspot virus (ORSV)” được thực hiện nhằm góp phần giải

quyết vấn đề trên

1.2 Yêu cầu

- Phân lập được gen CP của vi rút ORSV

- Thu nhận được dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa

trình tự gen CP của vi rút ORSV

1.3 Nội dung thực hiện

- Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan bằng phương pháp RT-PCR

- Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại trình tự gen CP của ORSV

- Phân lập gen CP của ORSV bằng phương pháp RT-PCR

- Chèn gen CP vào plasmid nhân dòng pJET và hóa biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Ảnh hưởng của vi rút đối với cây trồng

Vi rút tạo ra rất nhiều điều bất thường có thể làm thay đổi hình thức và dáng vẻ

từ chóp rễ đến đỉnh ngọn Hai ảnh hưởng dễ thấy nhất là sự chuyển sang màu vàng và

sự chết mô Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt hoặc cùng một lúc Các vi rútchỉ gây bệnh cho một số loại cây ở điểm bị thủng, nơi nó tấn công các tế bào ở gần vếtthương Vi rút tấn công bệnh trong một cây chủ thường tồn tại ở đó suốt cuộc đời củacây Ở những cây sinh sản theo cách dinh dưỡng, sự tồn tại dai dẳng đem tới việc cácđoạn cắt bị lây lan hoặc những phần tách chiết có mang vi rút

Các triệu chứng về vi rút biến thiên nhiều và không những tùy thuộc vào loại câychủ mà còn tùy thuộc vào nòi vi rút và điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ vàdinh dưỡng Thời gian giữa sự nhiễm bệnh và sự phát hiện triệu chứng cũng tùy thuộcnòi vi rút và điều kiện môi trường

2.2 Các loại vi rút gây bệnh cho lan và các triệu chứng của nó

Hơn 25 loại vi rút được biết đã nhiễm vào lan (Moran J., Knoxfield) Có 2 loài vi rút thông thường nhất nhiễm vào cây lan là Cymbidium mosaic virus (CymMV)

và Odontoglossum ringspot virus (ORSV) Nhiều giống vi rút không những làm đổi

màu trong mô cây chủ mà còn hạn chế sự phát triển của cây và làm cho cây cằn cỗimất sinh lực Hầu hết các loại vi rút không thể sống sót trong một thời gian dài bênngoài tế bào thực vật sống Đó là nguyên nhân tại sao vi rút hiếm nếu chúng ta tiêuhuỷ cây bị nhiễm Hầu hết các triệu chứng do vi rút gây ra đều giảm năng suất và chấtlượng hoa của cây lan

Một vài loại cây trồng như khoai tây, rau diếp hay hoa cúc, sản lượng giảm cóthể thấy chỉ trong một vụ Và thông thường thì sự giảm sản lượng này đủ để chứngminh được có sự hiện diện của vi rút Tuy nhiên, lan là loài phát triển chậm, nên khó

có thể xác định được sự có mặt của vi rút chỉ trong một mùa vụ Hơn nữa, sản lượngcao hay thấp dựa vào chất lượng hoa, và khả năng ra hoa (một sự đo lường chủ quan)hơn là số lượng Triệu chứng gây ra bởi vi rút thì rất nhiều Chúng có thể không biểuhiện, mặc dù tồn tại trong cây, và gây ra các triệu chứng không nhìn thấy được, hoặcnhững triệu chứng này có thể biểu hiện rất ít, không rõ, và có khi bị hoại tử Vì tính đa

dạng của các loài lan, nên các triệu chứng này cũng rất khác nhau, thậm chí khác nhautrên từng cây Như vậy, rất khó có thể dự đoán chính xác vi rút có nhiễm và biểu hiệntrên cây hay không Các triệu chứng bệnh gây ra bởi bệnh vi rút có thể tương tự vớicác triệu chứng bệnh do các tác nhân khác và các triệu chứng rối loạn sinh lý khác nhưbệnh úa vàng, bệnh đốm hay vệt hoại tử Bệnh nấm và vi khuẩn, các vấn đề sinh lýnhư cường độ ánh sáng, chế độ phân bón và chế độ nước cũng gây nên các triệu chứngtương tự Với kinh nghiệm trồng trọt có thể phân biệt được các dấu hiệu đó với cáctriệu chứng được gây ra từ vi rút, tuy nhiên, vẫn có thể nhầm lẫn Các nhà nghiên cứuvẫn chưa tìm ra nguyên nhân tại sao một vài loài biểu hiện những triệu chứng nghiêmtrọng, trong khi một vài loài khác bị nhiễm vẫn khỏe mạnh Điều này cho thấy sự cầnthiết để thiết lập nên một quy trình chuẩn đoán bệnh vi rút chính xác hơn để bảo đảmđược bộ sưu tập lan sạch bệnh vi rút (Phan Chỉnh Nguyên, 2009).

2.3 Giới thiệu về Odontoglossum ringspot virus

Odontoglossum ringspot virus (ORSV) là một thành viên của nhóm tobamo virus

(TOV) Cùng với CyMV, ORSV cũng là một trong những vi rút gây hại nghiêm trọng

và phổ biến nhất trên hoa lan (Zetter và cs, 1990) Phần tử vi rút có dạng hình que, dài290-300 nm (Navalinskiene và cs 2005)

Hình 2.1 Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005).

Cấu trúc bộ gen của ORSV tương tự với các vi rút khác thuộc nhóm potex virus với

vùng 5’ và 3’ không mã hóa đặc trưng và ít nhất 4 khung đọc mở (ORFs).ORSV có RNA

bộ gen sợi dương, bao gồm 6618 nucleotide, chứa 5 khung đọc mở (ORFs 1-5), mã hóacho các loại protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 126 KDa, 181 KDa, 34 KDa,

18 KDa và 52 KDa (Ryu và Park, 1995b) Tuy nhiên, theo Cheng và cs (1996) thì cấutrúc bộ gen của ORSV bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-deppendent RNA polymerase –RNA polymerase phụ thuộc RNA), MP (movement protein – protein vận động) và CP(coat protein - protein vỏ) (Hình 2.2) Bộ gen RNA gồm 6609 nucleotide, có 4 khungđọc mở (ORFs 1-4), mã hóa cho 3 loại protein khác nhau: RdRp (126 kDa/183 kDa),

MP (33 KDa) và CP (18 KDa) Đây là một trong những vi rút có RNA dài nhất trong

số các vi rút được biết của nhóm tobamo virus Trình tự của các protein được mã hóa

bởi RNA của ORSV biểu hiện sự tương đồng cao với các protein của các thành viên

khác trong nhóm tobamo virus Phân tích trình tự và cấu trúc bộ gen cho thấy ORSV

có mối liên hệ gần với các loại vi rút như TMGMV (tobacco mild green mosaic virus – vi rút khảm xanh thuốc lá), PMMV (pepper mild mottle mosaic virus – vi rút khảm đốm tiêu), ToMV (tomato mosaic virus - vi rút khảm cà chua) và TMV hơn các loại vi rút như CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus – vi rút khảm đốm xanh dưa chuột) và SHMV (sunn - hemp mosaic virus – vi rút khảm cây lục lạc) (Ryu và Park,

1995)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của ORSV (Cheng và cs, 1996)

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của ORSV (Ajjikuttira và cs, 2003)

ORSV được biết đến trước tiên với việc gây ra các đốm vòng vàng trên lá lan

Odontoglossum grande Lindl Tuy nhiên, nó được biết phổ biến hơn với triệu chứng

vàng lá dạng hình thoi đặc trưng trên lá lan Cymbidium Các đốm hình thoi này cũng

đi kèm với các vệt vàng ở Cymbidium (Moran và Knoxfield, 1999) Trên hoa, ORSV

tạo ra sự khảm màu (đậm hay nhạt hơn màu hoa) (Marais, 2000; McMillian và cs2005) Các vệt màu đen thường được nhận thấy trong phần lớn các cây lan có hoa từmàu hồng đến xanh nhạt pha đỏ (lavender) Tuy nhiên, không nên nhầm lẫn sự khảm

màu với các vệt màu trắng trên các cây Cattleya có hoa màu xanh nhạt pha đỏ do biến

dị di truyền gây ra Sự khảm màu trên hoa lan, trước đây được cho là chỉ xảy ra ở

Cattleya, đã được thông báo hiện diện ở các giống lan như Odontoglossum, Cymbidium, Vanilla, Epidendrum, Encyclia, Oncidium, Phalaenopsis và nhiều giống

lan khác Ở cùng một thời điểm, sự khảm màu hoa được cho là gây ra bởi 2 chủng virút riêng biệt đó là chủng nhẹ và nặng Triệu chứng khảm màu nhẹ (chủng nhẹ) phổ

biến ở Cattleya hơn triệu chứng khảm màu nặng (chủng nặng) Các cây bị nhiễm

chủng nhẹ có ít đốm trên hoa hơn các cây bị nhiễm chủng nặng, hoa không bị biếndạng và lá chỉ có triệu chứng khảm nhẹ Sự khảm màu nặng được thể hiện đặc trưngbởi nhiều đốm màu khác nhau trên hoa, ở đó màu sắc bình thường của đài và cánh hoađược thay bởi các mảng mô không đều có màu đậm hay nhạt hơn màu hoa bình

thường Không có sự biến dạng hay méo mó hoa ở trường hợp chủng nhẹ ORSV cũng

gây ra vệt hoại tử nâu trên hoa Cattleya (McMillian và cs 2005).

Hình 2.4 Triệu chứng của ORSV trên lá lan (Ảnh: PocketdiagnosticTM)

Nói chung, vi rút gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các triệuchứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại vi rút.Các triệu chứng nổi bật nhất là vàng lá (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử) cũng như sựcằn cỗi cây Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp với nhau hoặc hoàntoàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng tốt ngăn cản sự phát triển của triệuchứng Các cây ở trong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện triệu chứngnghiêm trọng khi bị nhiễm vi rút (Marais, 2002)

Sự thay đổi của các triệu chứng vi rút phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng virút, loài thực vật bị nhiễm và các điều kiện môi trường như cường độ sáng, nhiệt độ,

dinh dưỡng và sự ngộ độc Ure (biểu hiện triệu chứng giống với nhiễm Cymbidium

mosaic virus trên lá Cymbidium) (Marais, 2002) Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ

độc muối, cường độ sáng cao, côn trùng, bệnh do nấm hay sự rối loạn di truyền có thểgây ra các triệu chứng tương tự như bệnh vi rút (Flynn, 1996)

2.4 Các phương pháp phát hiện vi rút trên lan

Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được dùng cho việc phát hiện vi rút trên lan.Tuy nhiên, 2 phương pháp thường được sử dụng phổ biến đó là ELISA và RT-PCR

2.4.1 Phương pháp ELISA

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên vàkháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym Khi có sự hiện diện của cơ chất(thường là nitrophenol photphat) trong phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một

chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên

đã xảy ra Nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Hiện có 2 kỹ thuật ELISAđược xác định dựa vào cường độ màu sử dụng phổ biến là ELISA trực tiếp (direct DoubleAntibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) (Vũ Triệu Mân, 2003).Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến cho việc phát hiện vi rút trên lan Một sốcông trình tiêu biểu của các tác giả trên thế giới liên quan đến ELISA đã được công bốnhư: Hu và cs, 1993; Wong và cs, 1994; Khentry và cs, 2006

2.4.2 Phương pháp RT-PCR

RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch đại

các phân tử RNA Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử dụng kỹ

thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) Trước hết, RNA được chuyểnthành cDNA (Complementả Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzym phiên mã ngược từ Mo

- MLV (Murine leukemia virus) hoặc AMV (Avian myeloblastosis virus) Mồi sử dụng

trong giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau (Antisense mồi), có thể làOligonucleotid dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể làcác hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên

RNA Sau đó, cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase Sự hiện diện của sản phẩm được nhận biết qua điện di trên gel agarose Người ta cũng có thể sử dụng Tth DNA

polymerase cho cả 2 giai đoạn Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại

với hàm lượng thấp, hoặc RNA của vi rút, không thể phát hiện bằng các phương pháp

khác như Northern blot Ngoài ra, với kỹ thuật in - situ RT-PCR người ta có thể thực hiện

việc khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên,được tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạonhiệt chuyên cho lame (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Ngoài ra, một ứng dụng khác của RT-PCR nhằm cho phép định lượng chính xác sốbản sao vi rút có trong mẫu phát hiện Real-time RT-PCR Phương pháp này dựa trênnguyên tắc sự bắt cặp và phát sáng của chất phát huỳnh quang (thường là SYBR Green)với DNA mạch đôi được tạo ra trong phản ứng khuếch đại Sự xuất hiện của sản phẩmkhuếch đại sẽ được thể hiện thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra Dựa vào tín hiệu này,người ta có thể nhận biết có hay không sự xuất hiện của sản phẩm Việc định lượng vi rút

sẽ được thực hiện thông qua một đường chuẩn (được thiết lập dựa trên mối quan hệ tuyếntính giữa số chu kỳ ngưỡng và độ pha loãng của mẫu có số bản sao vi rút cho trước theo hệ

số bậc 10) Độ đặc hiệu của sản phẩm tạo thành được phân tích qua quá trình melt - curve(gia nhiệt) Quá trình gia nhiệt làm 2 mạch của DNA mạch đôi (sản phẩm khuếch đại) tách

ra Khi DNA tách mạch hoàn toàn, tín hiệu huỳnh quang tương ứng cũng sẽ giảm đến mứctối thiểu (do chất phát huỳnh quang không bắt cặp với DNA mạch đơn) Mỗi đoạn DNA sẽ

có một nhiệt độ tách mạch khác nhau mà ở đó tín hiệu huỳnh quang sẽ giảm xuống Điềunày cho phép phân biệt giữa các sản phẩm khác nhau được tạo ra trong phản ứng Real-time (Phạm Hùng Vân, 2009); đã có nhiều nghiên cứu sử dụng RT-PCR và RT-Real-timePCR để phát hiện 2 loại vi rút CyMV và ORSV trên lan được công bố ở nhiều nơi trên thếgiới như Lim và cs, 1993; Ryu và Park, 1995a; Ryu và cs, 1995; Seoh và cs, 1998; Liu và

có một đoạn ngắn DNA mạch kép (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp Vì vậy, đểkhởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 –

30 nucleotid), đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép Đó là đặcđiểm quan trọng đầu tiên của kỹ thuật PCR vì DNA polymerase được điều khiển để tổnghợp một đoạn DNA đặc thù Cả hai sợi DNA đều được dùng để làm khuôn cho quá trìnhtổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi Trong kỹ thuậtPCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn DNA được nhân lên, sao cho cácđoạn DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi cònlại Như vậy, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lýthuyết, ta sẽ có 2nbản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi Đó là đặcđiểm quan trọng thứ hai trong kỹ thuật PCR (Lê Đình Lương, 2001)

Các bước tiến hành phản ứng PCR: bước đầu tiên của quá trình là làm nóng hỗnhợp phản ứng đến khoảng 94oC Tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép táchnhau ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNApolymerase; sau đó nhiệt độ được hạ xuống khoảng 30 - 65oC để các đoạn mồi gắn vớicác trình tự tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn; tiếp theo nhiệt độ được nânglên 72oC, nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase bền nhiệt hoạt động Nhiệt độ

được duy trì ở 72oC trong khoảng 5 phút để DNA được tổng hợp; vào cuối giai đoạnnày, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94oC, nhưng lần này chỉ trong vòng 20 giây

để cho các mẫu ngắn của DNA mạch kép tách nhau ra, Các sợi đơn này trở thànhkhuôn cho một chu kỳ tổng hợp DNA khác Như vậy, một chu kỳ gồm: đun nóng đểtách các sợi DNA kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợikhuôn và tổng hợp DNA bằng DNA polymerase, được lặp lại từ 30 - 60 lần (Lê ĐìnhLương, 2001)

2.5.2 Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen

Kỹ thuật tạo dòng là kỹ thuật chuyển một đoạn gen vào vectơ và nhân lên thànhdòng gồm vô số bản sao giống nhau Đoạn gen tạo dòng được gọi là đoạn DNA mụctiêu được chèn vào vectơ khi đó vectơ này trở thành vectơ tái tổ hợp Vectơ tái tổ hợpnày sẽ được chuyển vào tế bào chủ và tồn tại trong tế bào chủ với lượng xác định Khi

tế bào chủ phân chia, vectơ tái tổ hợp sẽ phân chia và tiếp tục nhân lên theo quá trìnhphân chia của tế bào chủ Các khuẩn lạc sau khi sàng lọc trên môi trường có kháng

sinh sẽ được đánh giá là các dòng có mang đoạn gen được tạo dòng (Brown, 1997).

2.5.2.1 Những bước căn bản trong việc tạo dòng gen

Việc tạo dòng gen gồm các bước căn bản sau: Một đoạn DNA (gen cần tạo dòng)được chèn vào DNA mạch vòng (gọi là vectơ) để tạo thể khảm hoặc phân tử DNA tái tổhợp; tế bào giống y hệt nhau được tạo thành Mỗi tế bào trong dòng vô tính chứa mộthoặc nhiều bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp Điều này có nghĩa là gen được mang bởiphân tử DNA tái tổ hợp cũng được Vectơ này hoạt động như một vật mang chuyển genvào tế bào chủ (thường là vi khuẩn); trong tế bào chủ, những vectơ này tự sao chép đểtạo số lượng lớn các bản sao chứa DNA của vectơ và gen nó mang; khi tế bào chủ phânchia, những bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp cũng được phân chia cho thế hệ tế bàosau và quá trình tạo bản sao sẽ tiếp tục diễn ra; khi có một lượng lớn tế bào phân chia,một khuẩn lạc hay gọi là một dòng vô tính của những tạo dòng (Brown, 1997)

2.5.2.2 Tầm quan trọng của tạo dòng gen

Một gen được tạo dòng cung cấp cho ta đầy đủ thông tin về cấu trúc phân tửcũng như sự biểu hiện của gen đó Tính hữu dụng của những vật liệu được tạo dòngthúc đẩy các phương pháp phân tích phát triển phục vụ cho nghiên cứu gen với nhiều

kỹ thuật mới được đưa vào sử dụng trong suốt thời gian qua Các nghiên cứu trongngành dược và ngành nông nghiệp cũng nhận được những bước tiến quan trọng từ kỹthuật tạo dòng gen Một vài loại vacxin mới cung cấp khả năng kháng nhiều bệnh màviệc tiêm chủng trước đây không ngăn ngừa được Ngày nay, những bệnh di truyền cóthể chẩn đoán trước khi đứa bé ra đời Các nghiên cứu gần đây mở ra tia hy vọng cóthể chữa trị sớm chứng xơ nang, ung thư vú, hở van tim Đối với nông nghiệp, tạodòng gen cũng cung cấp tâm quan trọng không kém là phát triển những cây trồng biếnđổi di truyền nhằm chống lại sự phá hoại của sâu bệnh, cải thiện chất lượng cây trồng,tạo cây chịu hạn, chịu mặn; tạo protein tái tổ hợp trong cây (Brown, 1997)

2.6 Một số yêu cầu của mồi trong khuếch đại gen

Mỗi mồi chỉ bắt cặp với một trình tự trên sợi DNA đích và không bắt cặp trên cáctrình tự DNA khác.Chiều dài của mồi ảnh hưởng tới tính duy nhất và nhiệt độ nóngchảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó Nói cách khác, mồi càng dài thì tính duy nhất

và nhiệt độ nóng chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó càng cao Chiều dài của mồikhông được thấp hơn 14 nucleotid để đảm bảo tính duy nhất của mồi thích hợp Chiềudài mồi phù hợp là từ 18 - 28 nucleotid; thành phần nucleotide ảnh hưởng đến tính đặchiệu của quá trình bắt cặp, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp và sự ổn định cấu trúcphân tử của mồi Các trình tự được sắp xếp ngẫu nhiên sẽ tốt hơn trình tự chứa nhữngvùng giàu (A + T) hoặc (G + C), để đảm bảo cho việc bắt cặp đặc hiệu Tỷ lệ (G + C)trung bình là 50 - 60% sẽ cho nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp phù hợp chophản ứng PCR thông thường (Có thể được phép thay đổi trong một số trường hợp).Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nữa sợi DNA là sợi đơn vàmột nửa còn lại là sợi đôi Tmtùy thuộc vào thành phần nucleotid Tỷ lệ (G + C) cao sẽdẫn đến nhiệt độ nóng chảy cao

- Công thức tính nhiệt độ nóng chảy:

Tm = [59.9 + 0.41 * (%GC) - 600]/chiều dài (Với những mồi ≤ 20 nucleotid, thì

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C))

Nhiệt độ bắt cặp (Ta) là nhiệt độ mà tại đó mồi bắt cặp với DNA mục tiêu Có thểtính toán theo Tm Công thức tính: Ta = Tm-mồi – 4oC Để đảm bảo mồi bắt cặp vàoDNA mạch khuôn trước khi hai sợi của DNA đích hồi tính, cần đảm bảo yêu cầu:

Tm-sản phẩm– Ta ≥ 30oC; Ta là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tính nghiêm ngặtcủa sự bắt cặp hoặc tính đặc hiệu của quá trình khuếch đại đoạn DNA (Taquá thấp →tính nghiêm ngặt thấp → có sản phẩm phụ → không đặc hiệu; Ta quá cao → tínhnghiêm ngặt cao → mồi có thể không bắt cặp được → không có sản phẩm khuếchđại) Vì luôn có một cặp mồi, mồi xuôi và mồi ngược trong một phản ứng PCR, nên điềukiện phản ứng cần phải đảm bảo thích hợp cho cả hai, một đặc tính quan trọng là nhiệt độbắt cặp của chúng Nên có sự tương ứng giữa hai mồi về Ta Khác biệt giữa chúng tối đa

là 3 - 5oC (Tacàng gần thì kết quả PCR càng tốt); Nếu mồi có thể tạo thành cấu trúc bậchai (cấu trúc kẹp tóc), tự bắt cặp, hoặc bắt cặp chéo thì hiệu suất của phản ứng PCR sẽ

bị giảm rõ rệt (trong một số trường hợp những cấu trúc thứ cấp này không ảnh hưởngđến kết quả của phản ứng PCR khi nhiệt độ bắt cặp không cho phép hình thành cấutrúc thứ cấp) (Nguyễn Quốc Bình, 2009)

Mồi với đầu 5’ổn định sẽ cho kết quả khuếch đại tốt nhất: giảm thiểu sự bắt cặpsai trên các đoạn đích chưa được biết đến; tính ổn định thấp của đầu 3’ngăn chặn sựhình thành sợi đôi → khởi đầu sự tổng hợp DNA Trong khi đó, đầu 5’phải có khảnăng hình thành sợi đôi bền vững (Nguyễn Quốc Bình, 2009)

2.7 Tình hình nghiên cứu về phát hiện Odontoglossum ringspot virus trên lan

trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hu và cộng sự (1993), đã sử dụng ELISA phát hiện vi rút trên 44 giống lan ởHawaii Kết quả cho thấy có 61% mẫu nhiễm CyMV, 25% mẫu nhiễm ORSV và 20%mẫu nhiễm cùng lúc 2 loại CyMV và ORSV; năm 1994, Wong và cộng sự đã sử dụngELISA gián tiếp phát hiện 2 loại vi rút CyMV và ORSV trên các giống lan trồng ởSingapore Kết quả cho thấy có 54% mẫu nhiễm CyMV, 4% mẫu nhiễm ORSV và14,2% mẫu nhiễm cùng lúc 2 loại CyMV và ORSV trong số 12 giống lan được kiểm

tra; năm 1995, Ryu và cộng sự sử dụng RT-PCR phát hiện CyMV với ngưỡng phát

hiện thấp nhất đạt được ở nồng độ 10 fg RNA vi rút Ryu và Park cũng sử dụng PCR phát hiện ORSV với ngưỡng phát hiện đạt được ở mức tương tự như trường hợpCyMV (10 fg RNA); năm 1997 Hu và cộng sự, đã sử dụng các mẫu dò cDNA đánh

RT-dấu DIG (được tổng hợp từ cDNA vi rút) để phát hiện CyMV và ORSV Kết quả chothấy có thể phát hiện RNA tinh sạch của CyMV và ORSV lần lượt ở mức 50 pg và 250

pg Cũng trong năm 1997, Tanaka và cộng sự, sử dụng hệ thống RIPA (immunofilterPaper Assay), một dạng giấy thử phát hiện nhanh được thiết lập dựa trên phản ứngELISA, để phát hiện vi rút trên các giống lan trồng ở Thái Lan Kết quả cho thấy có 17giống nhiễm CyMV và 4 giống nhiễm ORSV trong tổng số 24 giống được kiểm tra.Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy CyMV là vi rút phổ biến hơn ORSV

Năm 1998 Seoh và cộng sự, sử dụng RT-PCR phát hiện đồng thời 2 loại vi rútCyMV và ORSV nhưng chỉ sử dụng duy nhất 1 cặp mồi Đây là kết quả đầu tiên vềviệc sử dụng 1 cặp mồi chung để phát hiện đồng thời hai 2 vi rút thuộc 2 nhóm phânloại khác nhau; Liu và cộng sự (2009), sử dụng Real-time RT-PCR phát hiện và địnhlượng CyMV và ORSV Kết quả cho thấy phương pháp này có thể xác định được hàmlượng vi rút có trong mẫu và ngưỡng phát hiện tối thiểu đạt được ở mức 2 bản sao/lmẫu RNA vi rút

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1999, Lê Thị Ánh Hồng và cộng sự, sử dụng phương pháp DAS-ELISAnghiên cứu tình hình nhiễm CyMV và ORSV trên các vùng trồng lan ở Việt Nam vàmối liên hệ giữa triệu chứng biểu hiện và khả năng nhiễm vi rút Kết quả cho thấy tất

cả các giống lan được kiểm tra đều nhiễm 2 loại vi rút CyMV và ORSV, đặc biệt tỷ lệbệnh khá cao tại các vùng có tiềm năng sản xuất hoa lan như Thành phố Hồ Chí Minh,

Đà Lạt Trong các triệu chứng được kiểm tra, triệu chứng cây sinh trưởng kém, khó rahoa cho tỷ lệ nhiễm vi rút cao nhất Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành cảitiến độ nhạy cho phản ứng ELISA bằng việc gắn thêm hệ thống Avidine-Biotine, kếtquả đã làm tăng độ nhạy của phản ứng lên từ 5-75 lần tùy theo từng trường hợp cụ thể.Năm 2007, Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự, sử dụng Real-time RT-PCR để pháthiện vi rút trên lan Kết quả của nhóm này cho thấy các mẫu lan trưởng thành trồng tạicác vườn sản xuất có tỉ lệ nhiễm cao với 2 loại vi rút CyMV (100%) và ORSV (43%);

và toàn bộ các mẫu lan cấy mô (100%) đều nhiễm với 2 loại vi rút CyMV và ORSVtrong nghiên cứu này Tuy nhiên, mặc dù sử dụng Real-time RT-PCR nhưng kết quảnghiên cứu của nhóm này chỉ dừng lại ở mức định tính, chưa xây dựng được quy trìnhđịnh lượng vi rút; ngoài ra nhóm tác giả còn sử dụng CTAB, một phương pháp ly trích

phức tạp nhưng không phù hợp cho ly trích RNA, để ly trích RNA vi rút Cóthể nói đây là một trong những hạn chế của nghiên cứu này.

Năm 2009, trong một đề tài nghiên cứu cấp Trung tâm tại Trung tâmCông nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự

đã sử dụng RT-PCR và Real-time RT-PCR để phát hiện vi rút trên lan Mộttrong những điểm nổi trội của nghiên cứu này là sử dụng phương pháp lytrích vi rút sucrose (Berendzen và cs, 2005) đơn giản cùng với quy trình RT-PCR một bước đã giảm đáng kể về thời gian và chi phí Kết quả nghiên cứu

của nhóm cho thấy cả 3 giống lan được kiểm tra (Dendrobium, Mokara và

Cymbidium) đều bị nhiễm vi rút với một tỉ lệ nhất định Dendrobium là giống

có tỉ lệ nhiễm vi rút cao nhất trong 3 giống Vi rút CyMV gây nhiễm trên cả 3

giống, trong khi vi rút ORSV chỉ nhiễm trên 2 giống Cymbidium và Mokara Trường hợp cá biệt, trên 2 giống Cymbidium và Mokara, cả 2 loại vi rút cùng

nhiễm trên một cây Kết quả cũng cho thấy CyMV là vi rút gây hại phổ biếnhơn ORSV Nhóm cũng đã xây dựng thành công quy trình phát hiện địnhlượng 2 loại vi rút này với ngưỡng phát hiện tối thiểu từ 1-10 bản sao/l Kếtquả phát hiện định lượng bằng Real-time RT-PCR cho thấy số lượng vi rútkhoảng từ 101 – 104 bản sao/μl cho Mokara, và từ 104 – 106 bản sao/μl cho

Cymbidium.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ ngày 1/12/2010 - 20/07/2011

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử - Trung Tâm Công

nghệ Sinh học – Thành phố Hồ Chí Minh.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Mẫu

Mẫu lá lan Cymbidium nhiễm vi rút ORSV được cung cấp bởi nhóm Sinh học

Phân tử Cây trồng, phòng Công nghệ Sinh học Thực vật - Trung Tâm Công nghệ Sinh

học - Tp Hồ Chí Minh.

3.2.2 Hóa chất

- Vectơ pJET1.2/blunt

- Mồi FpJET1.2 : 5’CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC - 3’

- Mồi RpJET1.2: 5’AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG - 3’

- Mồi để phát hiện vi rút ORSV:

Mồi xuôi: 5’- CATTAACGATTTGGCTCAGAGACG - 3’, vị trí khuếch đại từnucleotid 66 – 89

Mồi ngược 5’- TTCTCTCGAGCCTAGCCAGATAAG - 3’, vị trí khuếch đại từnucleotid 440 - 483

- Môi trường LB ( Luria - Bertain)

-Thành phần PCR:MgSO4,Pfu DNA polymerase, dNTP, MgCl2, DNA pfu buffer(Fermentas)

- Kit tách plasmid (Qiagen)

- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR (INtRON)

- Bộ kít tách chiết từ gel (INtRON)

- Bộ kít tách chiết Plasmid từ tế bào (INtRON)

- Enzym EcoRI (Biolab)

- Enzym BamHI (Biolab)

- Enzym Hind III (Biolab)

- T4 DNA ligase (Biolab)

- Vi khuẩn E.coli DH5α

- Một số hóa chất khác dùng trong sinh học phân tử

- Thang DNA được cung cấp bởi Fermentas bao gồm:

Thang DNA 100 bp

Thang DNA 1 kb

Thang DNA 1 kb plus

o

Hình 3.1 Thang DNA.(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1kb;

(c): Thang DNA 1kb plus.

3.2.3 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm

- Máy PCR

- Máy Gel doc (Biorad)

- Máy ủ Heat block techne (Dri - block DB-2D)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (eppendorf)

- Máy Vortex (Vortex - 2genie, Jencons-PLS)

- Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)