Tạo chủng vi khuẩn agrobacterium tumefaciensn mang gen mã hoá chitinase từ theobroma cacao l (LV00778)

Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp để biến đổi vi sinh vật, cây trồng hoặc vật nuôi bằng cách đưa các gen có giá trị vào bộ gen của sinh vật nhận và nhanh ch

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Thị Thu Hiền, Phó Viện trưởng,

Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn tận tình, chu đáo để tôi hoàn thành

luận văn tốt nghiệp

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Nông Văn Hải, Viện trưởng Viện

Nghiên cứu hệ gen, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện

giúp tôi được thực tập tại Viện và tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận

văn tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo, giảng viên trường Đại

học sư phạm Hà Nội 2 đã hết sức giúp đỡ và chỉ dạy tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiên đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên

cứu hệ gen, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là NCS Hà

Hồng Hạnh, HVCH Nguyễn Văn Phòng đã luôn nhiệt tình hướng dẫn và cho

tôi những lời khuyên và kinh nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Luận văn được hoàn thành trong khuôn khổ nhiệm vụ hợp tác quốc tế

“Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển

gen” thuộc “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh

học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”

Hà Nội ,, 24 tháng 12 năm

2012 Học viên cao học

Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

Formatted: Font: Not Bold

Formatted: Centered

Nguyễn Lệ Thủy Formatted: Left, Indent: Left: 0", First line:

0"

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả đạt được qua

quá trình cộng tác với các đồng nghiệp khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho

phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Hà Nội, tháng năm 2012 Học viên cao học

Nguyễn Lệ Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN 3

1.1.1 Giới thiệu chung về cây ca cao 3

1.1.2 Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam 6

1.2 THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO 87

1.2.1 Chuyển gen vào cây trồng 87

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ca cao sử dụng vi khuẩn A tumefaciens 1110

1.3 PROTEIN VÀ GEN MÃ HÓA CHITINASE 1312

1.3.1 Giới thiệu về protein và gen mã hóa chitinase 1312

1.3.2 Các nguồn gen mã hóa chitinase 1413

1.3.3 Phân loại chitinase 1514

1.3.4 Vai trò của gen mã hóa chitinase trong công nghệ gen 1716

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1918

2.1 NGUYÊN LIỆU 1918

2.1.1 Nguyên liệu sinh học 1918

2.1.2 Hóa chất 2120

2.1.3 Thiết bị 2221

2.2 PHƯƠNG PHÁP 2321

Formatted [3]

Formatted [5]

Field Code Changed [6]

Formatted [7]

Field Code Changed [8]

Formatted [9]

Formatted [10]

Formatted [11]

Formatted [12]

Formatted [13]

Formatted [14]

Formatted [15]

Formatted [16]

Formatted [17]

Formatted [18]

Formatted [19]

Formatted [20]

Formatted [21]

Formatted [22]

Formatted [23]

Formatted [24]

Formatted [25]

Formatted [26]

Formatted [27]

Formatted [28]

Formatted [29]

Formatted [30]

Formatted [31]

Formatted [32]

Formatted [33]

Field Code Changed [34]

Formatted [35]

Field Code Changed [36]

Formatted [37]

Formatted [38]

Formatted [39]

Formatted [40]

Formatted [41]

Formatted [42]

Formatted [43]

Formatted [44]

Formatted [45]

Formatted [46]

2.2.2 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 2422

2.2.3 Tách và tinh sạch đoạn gen từ gel agarose 2523

2.2.4 Phản ứng ghép nối gen với vector 2624

2.2.5 Biến nạp DNA vào vi khuẩn E coli 2725

2.2.6 Biến nạp DNA vào A tumefaciens 2826

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid 3028

2.2.8 Phân tích bằng enzyme hạn chế 3331

2.2.9 Xác định trình tự 3331

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3533

3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ HÓA CHITINASE (TcChi1) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pCB 301 3533

3.1.1 Sơ đồ thí nghiệm 3634

3.1.2 Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR 3735

3.1.3 Tạo vector trung gian pRTRA + TcChi1 tái tổ hợp 3836

3.1.4 Thiết kế vào tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase 4240

3.1.5 Tạo chủng A tumefaciens mang Ti-plasmid pCB301+TcChi1 tái tổ hợp bằng phương pháp xung điện 4744

3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ HÓA CHITINASE (TcChi1-U) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pPIPRA 5148

3.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 5148

3.2.2 Kết quả nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1-U từ dòng pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR 5350

3.2.3 Thiết kế vector trung gian pPIPRA522 mang gen mã hóa TcChi1-U 5451 3.2.4 Thiết kế vector biểu hiện thực vật pPIPRA558 với cấu trúc gen GUS được loại bỏ và thay thế bằng cấu trúc gen mã hóa TcChi1-U 5653

Formatted [52]

Formatted [53]

Formatted [54]

Formatted [55]

Formatted [56]

Formatted [57]

Formatted [58]

Formatted [59]

Formatted [60]

Formatted [61]

Formatted [62]

Formatted [63]

Formatted [64]

Formatted [65]

Formatted [66]

Field Code Changed [67]

Field Code Changed [68]

Formatted [69]

Formatted [70]

Formatted [71]

Formatted [72]

Formatted [73]

Formatted [74]

Formatted [75]

Formatted [76]

Formatted [77]

Formatted [78]

Formatted [79]

Formatted [80]

Formatted [81]

Formatted [82]

Formatted [83]

Formatted [84]

Formatted [85]

Formatted [86]

Formatted [87]

Formatted [88]

Formatted [89]

Formatted [90]

Formatted [91]

Formatted [92]

Formatted [93]

Formatted [94]

KIẾN NGHỊ 5855

TÀI LIỆU THAM KHẢO 6056

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 33

1.1 CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN …33

1.1.1 Giới thiệu chung về cây ca cao 33

1.1.2 Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam 66

1.2 THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO 88

1.2.1 Chuyển gen vào cây trồng 88

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ca cao sử dụng vi khuẩn A tumefaciens 1111

1.3 PROTEIN VÀ GEN MÃ HÓA CHITINASE 1313

1.3.1 Giới thiệu về protein và gen mã hóa chitinase 1313

1.3.2.Các nguồn gen mã hóa chitinase 1313

1.3.3 Phân loại chitinase 1515

1.3.4 Vai trò của gen mã hóa chitinase trong công nghệ gen 1616

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 181819

2.1.NGUYÊN LIỆU 181819

2.1.1 Nguyên liệu sinh học 181819

2.1.2 Hóa chất 202021

Formatted: Tab stops: 6.02", Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:

… Field Code Changed Formatted: Font: 14 pt

Field Code Changed Field Code Changed Formatted: Font: 14 pt

Field Code Changed Field Code Changed Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.02", Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

2.2.1 Điện di DNA trên gel agarose [36] 212122

2.2.2 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction- PCR) 222223

2.2.3 Tách và tinh sạch đoạn gen từ gel agarose 232324

2.2.4 Phản ứng ghép nối gen với vector 242425

2.2.5 Biến nạp DNA vào vi khuẩn E coli 252526

2.2.6 Biến nạp DNA vào A tumefaciens 262627

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid 282829

2.2.8 Phân tích bằng enzyme hạn chế 3131

2.2.9 Xác định trình tự 313132

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 333334

3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ HÓA CHITINASE (TcChi1) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pCB 301 333334

3.1.1 Sơ đồ thí nghiệm 343435

3.1.2 Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR 3535

3.1.3 Tạo vector tái tổ hợp trung gian pRTRA + TcChi1 3636

3.1.4 Thiết kế vào tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase 4040

3.1.5 Tạo chủng A tumefaciens mang Ti-plasmid pCB + CaMV35S + TcChi1 tái tổ hợp bằng phương pháp xung điện 4444

3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ HÓA CHITINASE SỬ DỤNG HỆ VECTOR pPIPRA 4848

3.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 4848

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.02", Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: Italic Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… + Not at 6.1"

Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Font: 14 pt

3.2.2 Kết quả nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1-U từ dòng

pJET+TcChi1-W/1 bằng kỹ thuật PCR 5050 Formatted: Font: 14 pt

3.2.4 Thiết kế vector biểu hiện thực vật pPIPRA558 với cấu trúc gen

GUS được loại bỏ và thay thế bằng cấu trúc gen mã hóa TcChi1-U 535354

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 555556

TÀI LIỆU THAM KHẢO 565657

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Tab stops: 6.02", Centered,Leader: … + 6.1", Centered,Leader:

… Formatted: Tab stops: 6.1", Centered,Leader:

…

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Amp

Formatted: Left

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Một số vector tạo dòng và biểu hiện thực vật sử

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen

Hình 3.2

Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và

sản phẩm xử lý enzyme hạn chế BglII và NotI các

plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose

0,8%

35

Hình 3.3 Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI 37

Hình 3.4 Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector

Hình 3.7 Các vị trí nhận biết của enzyme HindIII 41

Hình 3.8 Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector

Hình 3.9

Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid tái tổ hợp

pCB301 mang gen mã hóa TcChi1 43

Formatted: Font: Bold Formatted: Centered

Formatted: Font color: Auto

Formatted: Font color: Auto

Formatted: Font color: Auto

Formatted Table

Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa

Hình 3.12 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện

Hình 3.13 Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1-U

Hình 3.14 Các vi trí nhận biết của enzyme BamHI và BglII 51

Hình 3.15 Điện di sản phẩm tinh sạch vector pPIPRA522 và

Hình 3.16 Kiểm tra pPIPRA522 tái tổ hợp bằng BamHI 53

Hình 3.17 Sản phẩm tinh sạch pPIPRA558/PacI đã loại bỏ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi được sử dụng 20

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật 21

Bảng 2.3 Thông tin về các chủng vi khuẩn A tumefacien tái

tổ hợp mang vector pCB+TcChi1

46

Formatted: Font: Bold Formatted: Centered Formatted: Font: Bold Formatted: Centered

DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate EGFP Enhanced greenflorescent protein EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtOH Cồn (Ethanol) GlcNAC N-acetylglucosamine GMOs Genetically modified organisms

GUS ß-Glucuronidase Kan Kanamycin

Kb Kilo base (1kb = 1000bp)

LB Luria broth PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)

RNA Ribonucleic acid RIP Ribosome inactivating protein rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate T-DNA Transfer-DNA TAE Tris-acetate-EDTA

Tm Nhiệt độ nóng chảy ISAAA International service for the acquisition of agribiotech aplications

v/p Vòng/phút

Formatted: Indent: Left: 0.5" Formatted: Font: 15 pt Formatted: Centered, Indent: Left: 0"

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Theobroma cacao L 336

Hình 2.1: Một số vector tạo dòng và biểu hiện thực vật sử dụng trong nghiên

cứu 19230

Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa TcChi134384

Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và sản phẩm xử lý enzyme

hạn chế BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%

35395

Hình 3.3: Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI 374037

Hình 3.4: Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA-TcChi13841Hình 3.4: Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA

Hình 3.5: Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp 0.8%.3942Hình 3.5: Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp 0.8%

Hình 3.6: Điện di kết quả tạo pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%.4043Hình 3.6: Hình ảnh điện di kết quả tạo pRTRA+

Hình 3.7: Các vị trí nhận biết của enzyme HindIII 41431

Hình 3.8: Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1 42452

Hình 3.9 : Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid tái tổ hợp pCB301 mang

gen mã hóa TcChi1 43463

Hình 3.10: Điện di sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel

agarose 0,8% M Thang DNA chuẩn 1 kb; 44474

Hình 3.11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1-U trên gel

agarose 0.8% 46496

Hình 3.12: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pPIPRA558+TcChi1-U 494953

Hình 3.13: Điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1-U trên gel

agarose 0,8% 50540

Hình 3.14: Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và BglII 51551

Field Code Changed Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto

Formatted: No underline, Font color: Auto

Hình 3.16: Kiểm tra pPIPRA522 tái tổ hợp bằng BamHI 5356

Hình 3.17: Sản phẩm cắt pPIPRA558/PacI Error! Bookmark not defined.57

để loại bỏ cấu trúc FMV34S+GUS+E9 Error! Bookmark not defined.57

Hình 3.178: Sản phẩm tinh sạch pPIPRA558/PacI đã loại bỏ cấu trúc

Field Code Changed Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto Formatted: No underline, Font color: Auto

MỞ ĐẦU

Từ những năm 1970, với sự can thiệp của con người, quá trình chọn tạo

giống có thể vượt qua các rào cản tự nhiên Công nghệ sinh học hiện đại sử

dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp để biến đổi vi sinh vật, cây trồng hoặc vật

nuôi bằng cách đưa các gen có giá trị vào bộ gen của sinh vật nhận và nhanh

chóng tạo ra các sinh vật biến đổi gen (Genetically modofied organisms –

GMOs), mang những tính trạng mong muốn

Phát triển cây trồng công nghệ sinh học dựa trên nền tảng khoa học kỹ

thuật DNA tái tổ hợp là một trong những hướng trọng tâm của công nghệ sinh

học nói chung và nông nghiệp nói riêng Cây trồng công nghệ sinh học không

chỉ có khả năng kháng các bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, kháng chất diệt cỏ,

chống chịu điều kiện bất lợi, góp phần tạo nền nông nghiệp sạch, ít dùng hóa

chất mà cây trồng công nghệ sinh học còn cải thiện chất lượng sản phẩm nông

nghiệp theo hướng gia tăng chất lượng dinh dưỡng, tăng giá trị thương mại

[1] Trên thế giới, diện tích canh tác cây trồng công nghệ sinh học ngày càng

tăng Theo số liệu của ISAAA (International service for the acquisition of

agribiotech aplications), trong năm 2011 diện tích trồng cây công nghệ sinh

học trên toàn thế giới đạt 160 triệu ha so với 148 triệu ha của năm 2010 (tăng

8%) Các quốc gia đã và đang tham gia mạnh mẽ vào lĩnh vực nghiên cứu và

thương mại cây trồng công nghệ sinh học trải khắp sáu lục địa: Bắc Mỹ, Mỹ

Latinh, châu Á, châu Đại Dương, châu Âu và châu phi, trong đó dẫn đầu là

Mỹ, Brazil, Argentina, Ấn Độ và Canada Các giống cây trồng chính được

thương mại hóa bao gồm đậu tương, ngô, bông, cải dầu… Các tính trạng được

ưu tiên phát triển và ứng dụng là tính trạng kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn

trùng gây hại

Formatted

Cùng với một số cây nông nghiệp và cây công nghiệp chính, ca cao

(Theobroma cacao L.) đang là đối tượng được quan tâm trong cải biến di

truyền nhằm tăng hơn nữa năng suất, chất lượng và tạo khả năng chống chịu bệnh, thích nghi với các điều kiện sinh thái Việc chuyển các gen kháng sâu, kháng nấm để tạo giống ca cao kháng bệnh là vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca cao, trong đó có Việt Nam

Với mục đích tạo các vật liệu phục vụ việc chuyển gen kháng nấm có nguồn gốc thực vật vào cây ca cao nói riêng và các cây trồng khác nói chung,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens mang gen mã hóa chitinase từ Theobroma cacao L.” với

những nội dung chính sau:

1 Nhân gen mã hóa chitinase có nguồn gốc từ hệ gen cây ca cao bằng

kỹ thuật PCR;

2 Tạo dòng gen mã hóa chitinase trong vector tạo dòng;

3 Thiết kế và tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase;

4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu hiện thực

vật đã tạo được

Đề tài luận văn được tiến hành tại Phòng Công nghệ DNA Ứng dụng

và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học; Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen (thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Đây là các phòng thí nghiệm có đầy đủ các trang thiết bị kỹ thuật hiện đại, đã và đang tiến hành các nghiên cứu phân lập gen, thiết kế vector và chuyển gen vào nhiều đối tượng cây trồng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY CA CAO VÀ TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về cây ca cao

 Hình thái giải phẫu, phân loại học và phân bố của cây ca cao

 Hình thái giải phẫu

Ca cao là cây thường xanh tầng trung, cao 4 - 8 m (15 - 26 ft) Cây

thích hợp với những vùng có nhiệt độ trung bình 25 - 28 độ, độ ẩm trung bình

85%, lượng mưa hàng năm 1.500 - 2.000 mm Cây có ưu điểm 1 năm thu 2

vụ, nhu cầu nước không lớn, ít phải tưới, không kén đất nhưng cũng không

chịu được các vùng quá khô hạn như đất cát hoàn toàn

 Phân loại học

Từ năm 1882, loài T cacao L đã được Morris phân loại ra 2 loài phụ:

Criollo và Forastero Criollo có hạt dạng tròn, nội nhũ trắng, có hương vị nhẹ

Formatted: Font: 15 pt

và tương đối dễ nhiễm bệnh Criollo gồm 2 dòng chính là Criollo Mexico và

Criollo Lagarto Mặc dù có nhiều đặc tính tốt nhưng ngày nay Criollo gần

như không được trồng do cây không khỏe và rất dễ nhiễm bệnh, thời gian cho

quả lâu, 4-5 năm Forastero gồm nhiều dòng ca cao thuần, nửa hoang dại và

hoang dại Quả Forastero màu xanh lá cây tươi sáng, khi chín thì vàng, dáng

hình bầu dục, không có rãnh sâu, vỏ dày và cứng, rất khó cắt vì chứa nhiều

chất gỗ Hạt ít nhiều dẹp, lá mầm chưa ủ màu tím đậm như nếp than, hạt nhỏ

hơn Criollo nhưng hương vị đậm hơn Có 3 dòng Forastero chính gồm:

Angoleta, Cundeamor và Amelonado Trong đó dòng ca cao Amelonado được

trồng mạnh nhất, cung cấp hầu hết số ca cao thông thường trên thế giới

Ngoài ra, còn 2 giống loài hoang dại thường gặp là T bicolor và T

grandiflorum [29][30]

 Phân bố cây ca cao

Nguồn gốc của cây ca cao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những

người Aztec và Maya bản xứ khám phá Chúng tồn tại dưới tầng đặc hữu của

khu rừng nhiệt đới ẩm thấp Amazon Từ đây, ca cao phát triển rộng sang

nhiều quốc gia khác trên thế giới, tập trung ở khu vực Nam Mỹ và Tây Phi

Ca cao đặc biệt thích hợp ở những quốc gia có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm

Những khu vực trồng ca cao phần lớn tập trung ở những điểm nóng đa dạng

sinh học quan trọng trên thế giới, trong đó có đến 13 vùng được coi là đa dạng

gia dẫn đầu về sản lượng ca cao hiện nay là Bờ Biển Ngà (Côte d’Ivoire) và

cao được phát triển khá mạnh, tiến tới trở thành vùng trồng ca cao lớn không

kém Nam Mỹ và châu Phi Các quốc gia sản xuất ca cao hàng đầu ở khu vực

này là Indonesia và Malaysia Việt Nam cũng nằm trong cùng vĩ độ “ca cao”

Field Code Changed

với Ghana, Bờ Biển Ngà, Indonesia, Malaysia với khí hậu nhiệt đới mưa nhiều, đất đai màu mỡ, rất thích hợp với cây ca cao

 Giá trị kinh tế của cây ca cao trong nền kinh tế quốc dân

Cây ca cao là cây kinh tế quan trọng đem lại lợi nhuận rất cao nhờ xuất khẩu cho một số quốc gia trên thế giới Hạt ca cao, được xem là “Thực phẩm

từ Thượng đế”, là nguồn cung cấp thực phẩm giàu dinh dưỡng không thể thiếu của con người Ca cao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng cho ngành công nghiệp thực phẩm để sản xuất các sản phẩm cao cấp như chocolate Ngành công nghiệp sản xuất chocolate với vật liệu chính là hạt ca cao trị giá nhiều tỷ dollar Tại Mỹ, việc sử dụng ca cao và bơ ca cao trong sản xuất chocolate, mỹ

Bên cạnh đó, gần đây ca cao còn được chứng minh về tác dụng phòng các bệnh tim mạch Các flavanol và procyanidin có trong hạt ca cao đã thể hiện

khả năng chống oxi hóa mạnh trong các thử nghiệm in vitro [20] Các ứng

dụng của hạt ca cao đã một lần nữa khẳng định giá trị quan trọng của loài cây công nghiệp này

Ngoài ra, trồng ca cao còn mang lại những lợi ích về môi trường Do ca cao là loại cây ưa bóng với thời gian thu hoạch trên 50 năm, có thể trồng dưới tán những cây lâu năm khác, chúng mang lại các lợi ích như tăng cường đa dạng sinh học, bảo vệ hành lang đầu nguồn, đất, nguồn nước và các vùng đệm của những khu rừng nhiệt đới [31][33] Các tổ chức quốc tế như USAID, Conservation International, The World Wildlife Federation và The World Cocoa Foundation đã nhận thức được vai trò của ca cao trong việc ổn định nền kinh tế địa phương và môi trường nên đã khuyến khích nông dân trồng ca cao trong những khu vực này [16]

Trên toàn thế giới, nhìn chung việc trồng, chế biến, tiêu thụ các sản phẩm của cây ca cao đang có xu hướng tăng rất cao và nhanh nhờ sự phát triển kinh tế năng động với mức sống của hàng tỷ người được nâng cao và các sản phẩm ca cao, trước đây coi như mặt hàng của những người giàu, nay dần dần sẽ được tiêu thụ phổ biến hơn Sản lượng ca cao sản xuất hàng năm rất bấp bênh, không đủ đáp ứng nhu cầu… do bị ảnh hưởng bởi sâu bệnh, giống

bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng khác, kỹ thuật canh tác kém Trong đó, bệnh thường gặp ở ca cao do nấm hoặc côn trùng gây ra Một số bệnh hại chính do nấm bao gồm: Bệnh thối trái, loét thân, cháy lá (do

nấm Phytophthora palmivora); Bệnh khô vỏ thân (do nấm Colletotrichum

gloeosporioides); Bệnh vết sọc đen (do nấm Oncobasidium theobromae);

Bệnh nấm hồng (do nấm Corticium salmonicolor)… Để phòng trị các bệnh

trên cây ca cao, bên cạnh các biện pháp canh tác và xử lý như tỉa cành hợp lý tạo thông thoáng, tiêu hủy cành, lá và trái bị bệnh, nhổ bỏ cây con… thì đều cần phun, tiêm các loại thuốc hóa học – tác nhân gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của người dân Vì vậy, việc phát triển ca cao bền vững, chuyển dịch cơ cấu cây trồng, nâng cao chất lượng giống, hạt ca cao là những vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca cao

1.1.2 Tình hình phát triển cây ca cao ở Việt Nam

Nhận thức rõ vai trò quan trọng của cây công nghiệp này đối với sự phát triển kinh tế – xã hội của đất nước, Ban Điều phối Phát triển Ca cao Việt Nam đã được thành lập theo Quyết định số 803/QĐ-BNN do Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn ký ngày 11 tháng 4 năm 2005 Sau đó, ngày 14 tháng

9 năm 2007, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã phê duyệt Đề án phát triển ca cao đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 (Kèm theo

2015, dự kiến diện tích cây ca cao đạt 60.000 ha, trong đó có 35.000 ha kinh doanh, năng suất bình quân 15 tạ/ ha, sản lượng hạt khô đạt 52.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 50 – 60 triệu USD ”

Các chính sách, chương trình ưu tiên phát triển chiến lược của Chính phủ cũng như sự hợp tác nhiều mặt của các tổ chức quốc tế, cùng với những thế mạnh rõ rệt về khí hậu, thổ nhưỡng, nguồn nhân lực, là cơ sở đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao quốc tế, trở thành quốc gia giàu tiềm năng cung cấp

ca cao Một số dự án liên quan đến phát triển ca cao ở các vùng miền có khí hậu, thổ nhưỡng thích hợp đã được triển khai, trong đó đặc biệt đáng chú ý là Chương trình phát triển ca cao do nhóm nghiên cứu đứng đầu bởi TS Phạm Hồng Đức Phước, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Chương trình đã đạt được thành công rực rỡ Kết quả đạt được của các dự án là nhiều giống ca cao mới như TD1, TD2, TD3, TD5, TD6, TD8, TD10, TD14 đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho phép phát triển ở các vùng trồng ca cao thuộc các tỉnh phía Nam Tổng diện tích canh tác ca cao ở nước ta tăng nhanh mỗi năm, đạt hơn 20.600 ha (năm 2012) Theo quy hoạch, diện tích ca cao của nước ta đến năm 2015 là 35.000 ha, trong đó diện tích thu hoạch khoảng 7.000 ha và năng suất bình quân 0,7 tấn/ ha Đến năm 2020, diện tích canh tác

ca cao dự kiến đạt 50.000 ha, tập trung tại các tỉnh: Bình Phước, Bến Tre, Đăk

1.2 THỰC TRẠNG VÀ TRIỂN VỌNG CHUYỂN GEN CÓ GIÁ TRỊ VÀO CÂY TRỒNG VÀ CÂY CA CAO

1.2.1 Chuyển gen vào cây trồng

Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải biến di truyền cây trồng, vật nuôi nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác Tuy nhiên, phép lai chéo này bị hạn chế bởi chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài Nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống Cây trồng công nghệ sinh học là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây Những gen được đưa vào cây nhận có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn Nhìn chung, việc ứng dụng cây trồng công nghệ sinh học đã có những lợi ích rõ rệt như tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nông nghiệp, cải thiện môi trường Nhiều cây trồng công nghệ sinh học quan trọng ra đời như lúa, ngô, lúa mỳ, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng

côn trùng gây hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những

loại protein mới, gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt cỏ [4]

Trên thế giới, quốc gia dẫn đầu lĩnh vực nghiên cứu và thương mại cây

trồng công nghệ sinh học là Hoa Kỳ (69 triệu ha), Brazil (30,3 triệu ha),

Argentina (23,7 triệu ha); Ấn Độ (10,6 triệu ha) và Canada (10,4 triệu ha)

Trong 16 năm (1996 - 2010), diện tích đất canh tác cây trồng công nghệ sinh

học trên toàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 80 lần (từ 1,7 triệu ha vào năm 1996

lên 160 triệu ha trong năm 2010) Năm 2011, cây trồng công nghệ sinh học đã

được gieo trồng ở 29 quốc gia với sự tham gia của 16,7 triệu nông dân, lên

1,3 triệu so với năm 2010 – đáng chú ý là 15 triệu hoặc 90% là nông dân

nghèo từ các nước đang phát triển Các loại cây trồng công nghệ sinh học

được trồng nhiều nhất hiện nay là đậu tương, bông, ngô và cải dầu với hai

tính trạng được sử dụng phổ biến là tính trạng kháng thuốc diệt cỏ và kháng

côn trùng [17][18]

Ở nước ta, trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu chọn tạo giống

bằng công nghệ gen và công nghệ tế bào được đặc biệt quan tâm Trên quy

mô cả nước, một số phòng thí nghiệm công nghệ gen và công nghệ tế bào

thực vật đã và đang được nhà nước đầu tư trang thiết bị, có thể triển khai các

kỹ thuật hiện đại Chính phủ đã và đang ưu tiên đầu tư cho một số dự án tạo

cây trồng công nghệ sinh học như: (1) Phân lập các gen có giá trị kinh tế của

cây trồng nông lâm nghiệp Việt Nam, thiết kế vector, tạo các chủng

Agrobacterium phục vụ cho tạo giống cây trồng chuyển gen; (2) Phân lập và

thiết kế các vector mang gen điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo

giống cây chuyển gen; (3) Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng

thuốc diệt cỏ; (4) Nghiên cứu tạo giống bưởi và cam không hạt bằng công

nghệ sinh học; (5) Nghiên cứu tạo giống bèo tấm và nấm men tái tổ hợp mang

kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm… Bước đầu, một số kết

Formatted: Not Highlight Field Code Changed

quả nhất định đã thu được Đối với các nghiên cứu chuyển gen thực vật, nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp bắn gen, phương pháp

sử dụng A tumefaciens đã được áp dụng trên hàng loạt đối tượng cây trồng

quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, bông, thuốc lá, khoai

lang [2] Đối với cây lưu niên, việc chuyển gen sử dụng vi khuẩn A

tumefaciens hoặc súng bắn gen cũng thu được kết quả trên đối tượng cây hồng

[2], [6], cây hồ tiêu [5] Có thể nói, phương pháp chuyển gen vào cây trồng

thông qua A tumefaciens có hiệu quả cao nên được triển khai ở nhiều phòng thí

nghiệm trong cả nước Trong đó, các gen chọn lọc và sàng lọc như gen kháng kanamycin, hygromycin, gen mã hoá β-glucuronidase (GUS) thường được sử dụng Bên cạnh nhiều nghiên cứu nhằm xây dựng mô hình thí nghiệm và sử dụng các Ti-plasmid vector do nước ngoài thiết kế, một số nhóm nghiên cứu đã chủ động tiến hành thiết kế các vector mang gen có giá trị thích ứng cho từng đối tượng cây trồng [5]

Triển vọng của công nghệ chuyển gen là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên Ðối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen

sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ca cao sử dụng vi khuẩn

A tumefaciens

1.2.2.1 Agrobacterium và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật

Phương pháp chuyển gen vào cây trồng qua A tumefaciens được xem

là phương pháp hữu hiệu với nhiều thành tựu đã đạt được, đặc biệt trên đối

tượng cây hai lá mầm A tumefaciens là vi khuẩn đất được biết đến như một

tác nhân gây bệnh ở thực vật Chúng có khả năng gây nhiễm thực vật, tạo

thực vật của A tumefaciens đã được hiểu rõ khi các nhà khoa học phát hiện ra

sự tồn tại của Ti-plasmid trong vi khuẩn và việc chuyển gen từ Ti-plasmid

Ti-plasmid, các hướng nghiên cứu khai thác, sử dụng chúng làm vector để đưa các gen mong muốn vào tế bào và mô thực vật đã được thực hiện

1.2.2.2 Cấu tạo và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid là một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có kích thước khoảng 200 kb Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong

tế bào như một đơn vị sao chép độc lập Ở các chủng A tumefaciens khác nhau, Ti-plasmid đều có 4 vùng Trong đó, vùng T-DNA (DNA chuyển –

transfer-DNA) là vùng duy nhất được chuyển từ A tumefaciens sang genome

của cây bị bệnh Nghiên cứu vùng T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau, người

ta thấy rằng T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn gọi là đoạn biên (T-DNA border sequence) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật Các Ti-plasmid có kích thước quá lớn nên không thể dùng làm vector, do vậy, các

vector nhỏ hơn đã được thiết kế cho phù hợp với thao tác in vitro như cắt bỏ

các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết, chứa vùng tạo dòng đa

năng Có hai hệ thống vector Ti-plasmid chuyển gen hiệu quả: Vector liên

hợp (co-integrate vector) và vector hai nguồn (binary vector)

1.2.2.3 Thiết kế các Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen có giá trị

Các Ti-plasmid thường được sử dụng trong công nghệ gen thực vật là

những vector đơn giản mang các đặc tính chính: (i) Có khả năng sao chép độc

lập và tích cực trong tế bào chủ; (ii) Có kích thước nhỏ, dễ nhận gen ngoại lai,

dễ xâm nhập vào tế bào và dễ sao chép; (iii) Mang gen chỉ thị chọn lọc/ sàng

lọc giúp dễ dàng phát hiện các tế bào tái tổ hợp chứa plasmid ở vi khuẩn cũng

như trong thực vật; (iv) Tồn tại bền vững trong tế bào chủ; (v) Mang kết cấu

gen có giá trị Ngoài ra, các gen chỉ thị cũng như các gen quan tâm cần được

điều khiển biểu hiện bởi promoter và terminator thích hợp [3]

Cùng với một số giống cây công nghiệp chính, ca cao đang là đối tượng

được quan tâm trong cải biến di truyền nhằm tăng hơn nữa năng suất, chất

lượng và tạo khả năng chống chịu bệnh, thích nghi với các điều kiện sinh thái

Hiện nay với mục đích thiết lập và tối ưu hóa quy trình chuyển gen kết hợp hệ

thống tái sinh in vitro từ phôi soma của ca cao, đã có một số nghiên cứu sử

dụng các gen chỉ thị như gen mã hóa protein phát huỳnh quang (Enhanced

Green Fluorescent Protein - EGFP) và gen chỉ thị nhuộm màu mô tế bào

ß-Glucuronidase (GUS) chuyển vào cây ca cao thông qua vi khuẩn A

tumefaciens Từ những nghiên cứu ban đầu trên các gen chỉ thị, sau này một

số nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu chuyển một số gen đích vào

cây ca cao [25], [34] [26], [36] Các gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn

trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hóa chitinase là các gen

đích có giá trị Tương ứng với các gen này, các promoter cơ định như

CaMV35S hay promoter đặc hiệu được chọn lựa để điều khiển biểu hiện gen

ở những mô mong muốn

Field Code Changed

1.3 PROTEIN VÀ GEN MÃ HÓA CHITINASE

1.3.1 Giới thiệu về protein và gen mã hóa chitinase

Họ chitinase là các enzyme tham gia quá trình thủy phân acetylglucosamine polymer chitin Chitinase có một phổ phân bố rộng trong

N-tự nhiên, được tìm thấy ở tất cả các giới loài, từ archaea, vi khuẩn, nấm, thực vật cho đến động vật Chúng có rất nhiều chức năng khác nhau thường liên quan đến tiêu hóa, sự lột xác của động vật chân khớp và chức năng bảo vệ Gen mã hóa chitinase là đối tượng được quan tâm nghiên cứu trong vài năm trở lại đây và ngày nay, giá trị của gen mã hóa chitinase được nâng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật để giảm thiểu bệnh hại

1.3.2 Các nguồn gen mã hóa chitinase

Chitinase thực vật chủ yếu được tìm thấy ở thân cây, hạt, củ và hoa

Chúng được sản sinh khi có sự tấn công của bệnh hại, khi tiếp xúc với các

chất kích kháng bảo vệ như chitooligosaccharides hay các chất điều hòa sinh

trưởng như ethylene [15], [21] [15], [21] Dạng chitinase được nghiên cứu

rộng rãi nhất ở thực vật là endochitinase, một loại enzyme phân cắt bên trong

phân tử chitin, giải phóng N-acetylglucosamine (GlcNAC), có trọng lượng

phân tử nhỏ hơn chitinase côn trùng [10] Endochitinase thực vật là loại

enzyme có bản chất protein, khối lượng phân tử đơn phân từ 25-35 kDa, có

điểm đẳng điện cao hoặc thấp Chitinase có một khoảng pH tối ưu rất rộng

xung quanh pH 6 và có khoảng nhiệt cố định không quá 500C [9], [27] [9],

đáng kể bởi các yếu tố vô sinh như ethylene, salicylic acid, dung dịch muối,

ozone, tia UV và bởi các yếu tố hữu sinh như nấm, vi khuẩn, virus Chitinase

ức chế sự phát triển của nấm thường kết hợp với các enzyme khác như

β-1,3-glucanases, được tìm thấy ở khoai tây, thuốc lá, cam quýt, đậu, cà chua, ngô,

các loài côn trùng thuộc tất cả các loài bao gồm bộ 2 cánh, bộ cảnh vảy, bộ

cánh nửa, bộ cánh cứng và bộ cánh màng Chúng dễ dàng được tinh sạch với

nồng độ cao từ dịch lột xác của côn trùng (lớp dịch nằm giữa lớp vỏ cutin cũ

và mới) [7].Chức năng chính của chitinase côn trùng là quay vòng chitin

trong quá trình lột xác Đầu tiên endochitinase sẽ bẻ gẫy ngẫu nhiên cutin tạo

thành chitooligosaccharides, sau đó chúng sẽ được hydrolised hóa bởi các

enzyme exo thành N–acetyl glucosamine Những phân tử đơn phân này lại

được tiếp tục tái sử dụng để tổng hợp một lớp cutin mới Ngoài ra, chitinase

côn trùng còn có vai trò phòng thủ chống lại các ký sinh trùng của mình hoặc

Field Code Changed

Field Code Changed

Field Code Changed

Field Code Changed

sản xuất enzyme này được quy định bởi hormone trong quá trình chuyển đổi của ấu trùng Chitinase côn trùng có thể bị ức chế bởi allosaminidin Mặc dù chitinase côn trùng đã được nhận diện ở mức độ protein vào những năm 1970, nhưng việc tách dòng một cDNA mã hóa cho chitinase côn trùng chỉ đạt được vào 2 thập kỷ sau đó Kramer là người đầu tiên báo cáo đã phân lập được một dòng cDNA có độ dài đầy đủ từ sâu sừng thuốc lá (tobacco hornworm),

Manduca sexta [22][22] Kể từ đó, hơn 100 cDNA chitinase từ nhiều loài côn

trùng khác nhau đã được tách dòng [7]

Chitinase từ nấm cũng là một nguồn chitinase được quan tâm nghiên cứu Thành tế bào nấm là một cấu trúc phức tạp gồm chitin, glucan và một số polymer khác Cấu trúc thành tế bào rất linh động thay đổi liên tục trong quá trình tăng trưởng tế bào, phân chia và tạo hình và có những bằng chứng về sự

mở rộng liên kết ngang giữa các thành phần này Chitinase cùng một số enzyme khác có vai trò thủy phân những polymer này liên kết rất chặt chẽ với thành tế bào, có chức năng duy trì độ dẻo cũng như có vai trò trong quá trình

1.3.3 Phân loại chitinase

Căn cứ vào trình tự amino acid bảo toàn, cách gấp cuộn protein, chitinase được chia làm 2 họ là họ chitinase 18 và 19 [13] Họ chitinase 18 có một phổ phân bố rộng ở tất các các giới loài bao gồm cả vi khuẩn, thực vật và động vật Trong khi đó, họ chitinase 19 lại tìm thấy chủ yếu ở thực vật Tuy nhiên, cũng có một vài những báo cáo về họ chitinase 19 từ những nguồn được phân loại như từ vi khuẩn [19], [30] [19], [31], ve bét [38][40], một số virus [26][27] và giun tròn [37][39]

Có nhiều cách phân loại chitinase dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau Các lớp chitinase thực vật khác nhau được phân biệt bởi các tiêu chuẩn sinh

hóa, sinh phân tử và các tiêu chuẩn hóa lý Do đó, các chitinase có thể khác

nhau về cơ chất, vị trí trong tế bào và các hoạt động cụ thể Các nhà nghiên

cứu đã đưa ra 3 lớp chitinase thực vật

Chitinase lớp I là enzyme có tính bảo thủ cao với 1 miền đầu N giàu

cysteine được tạo bởi khoảng 40 amino acid Chitinase lớp II thiếu miền đầu

N giàu cysteine nhưng có trình tự amino acid có tính tương đồng cao với

chitinase lớp I Chitinase lớp III không có trình tự tương đồng nào với

chitinase lớp I hay II Chitinase lớp III có một sự tương đồng nhỏ với

chitinase vi khuẩn và vùng hoạt động được cho là chứa 4 amino acid aspartic

hoặc glutamic suy ra từ tính kị nước của vùng này Có ý kiến cho rằng tồn tại

một lớp chitinase khác là chitinase lớp IV bao gồm chitinase củ cải đường,

cây cải dầu và đậu Chúng cũng chứa vùng giàu cystein để duy trì cấu trúc cơ

bản giống như chitinase lớp I nhưng mức độ giảm đi 4 lần Chitinase IV chỉ

chứa 241-255 amino acid ở protein trưởng thành trong khi chitinase I là 300

amino acid So sánh trình tự amino acid đặc trưng giữa lớp IV và lớp I giống

nhau 41-47%, trong lớp IV thông thường là 59-63% và trên 69% đối với lớp

I Hơn nữa, chitinase lớp IV và lớp I có thể phân biệt bằng huyết thanh học

Miền đầu N giàu cystein được cho là vùng kết hợp với chitin và được tìm thấy

ở rất nhiều loại protein Những protein chứa vùng giàu cystein có khả năng

liên quan tới 1 gen dung hợp vùng chitin-binding và vùng không liên quan

[14], [39] [41], [14]

Gen mã hóa chitinase lớp I (TcChi1) được phân lập từ cây ca cao gồm

3 exon (có kích thước lần lượt là 417 bp, 153 bp, và 393 bp) và 2 intron (có

kích thước 88 bp và 104 bp) Vùng mã hóa của gen có kích thước 963 bp, mã

hóa phân tử protein TcChi1 gồm 320 amino acid Chúng tích tụ trong không

Field Code Changed

bào với một nồng độ cao để phản ứng lại với các thương tổn và các tác nhân

gây bệnh

1.3.4 Vai trò của gen mã hóa chitinase trong công nghệ gen

Nấm bệnh là những tác nhân gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới có độ ẩm cao Kỹ thuật di truyền thực vật tạo tính kháng tốt hơn với việc chuyển gen mã hóa chitinase đang là hướng đi rất triển vọng Có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành để xác định xem chitinase cây trồng có vai trò như thế nào trong việc bảo vệ cây chống lại nấm bệnh

Trong in vivo, chitinase nhanh chóng tích tụ ở mức cao (với rất nhiều các yếu

tố phát sinh bệnh học liên quan đến protein) xảy ra trong các mô kháng thể hiện tính quá mẫn cao Ngoài ra, những biểu hiện của gen chitinase ở thực vật chuyển gen đã cung cấp thêm cho các nhà khoa học những bằng chứng về vai trò của chitinase trong bảo vệ cây trồng Mức độ bảo vệ của chitinase được quan sát ở cây trồng là biến đổi và có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt động cụ thể của các enzyme, vị trí và nơi tập trung trong tế bào, các đặc tính của mầm bệnh nấm và các tính chất của mầm bệnh tương tác Việc chuyển gen mã hóa

chitinase vào cây thuốc lá đã làm tăng hoạt tính kháng nấm gây hại của cây

Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen mã hóa chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm gây hại cao hơn cây có một gen độc

lập [11] Cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hơn hẳn sau khi được

chuyển cả hai gen nói trên [8] Protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating protein - RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm tốt Cây thuốc lá cho tính kháng nấm rất cao khi cây được chuyển đồng thời gen mã hóa RIP và chitinase Như vậy, chitinase kết hợp với các protein chống nấm có tác dụng giảm sự phát triển của bệnh tốt hơn, cho thấy tính phức tạp trong tương tác tế

Mặc dù những nghiên cứu chuyên sâu về chitinase thực vật và vai trò

của enzyme này trong bảo vệ cây trồng vẫn là những vấn đề cần bàn luận

Tuy nhiên, việc chuyển gen mã hóa chitinase vào thực vật để tăng khả năng

kháng nấm đang được quan tâm và là hướng đi rất triển vọng Thuốc lá

chuyển gen mã hóa chitinase từ thực vật và vi khuẩn đã thu được những kết

quả rất khác nhau [12], [18], [23], [36] [12], [17], [23], [38] Cây thuốc lá

được chuyển gen mã hóa chitinase từ đậu tương đã có sức đề kháng cao hơn

với nấm Rhizoctonia solani [11] Trên đối tượng cây ca cao, gen mã hóa

TcChi1 đã được nghiên cứu biểu hiện thành công để kháng lại nấm

Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh khô vỏ thân cao cao, một loại bệnh

Field Code Changed

Field Code Changed

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu sinh học

Vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α và DH10b; Vi khuẩn A

tumefaciens chủng EHA105 và LBA4404

Các vector: Vector pJET1.2/blunt được mua từ Hãng Fermentas;

Vector pRTRA 7/3, pCB301 được cung cấp bởi GS TS Udo Conrad, Viện

Di truyền thực vật và Nghiên cứu cây trồng, Gatersleben, CHLB Đức Vector

pJET1.2+TcChi1-W, pPIPRA 522 và pPIPRA558 (Hình 2.1) là các vector do

Đại học California, Davis (Hoa Kỳ) cung cấp và/hoặc thiết kế tại Viện Nghiên

cứu hệ gen

Formatted: Font: 15 pt

Field Code Changed

Hình 2.1 Một số vector tạo dòng và biểu hiện thực vật

sử dụng trong nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng đều đảm bảo độ tinh khiết cho nghiên cứu sinh

học phân tử và được nhập từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck… Các

- Taq DNA polymerase, T4 ligase; thang DNA chuẩn 1kb, dNTPs;

- KIT tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJETTM Gel Extration kit;

- Các enzyme hạn chế: BamHI, NotI, HindIII, BglII…;

- Kháng sinh Ampicillin (Amp), Kanamycin (Kan);

- Các hóa chất khác: phenol, chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic

acid, EDTA, cồn tuyệt đối

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (LB, SOC) (Bảng 2.2), các dung dịch

Trypton (g)

NaCl (g)

Thạch (g)

Hóa chất khác (g)

Cân phân tích (Mettler Toledo 10-4, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh (Biofuge, Mỹ); Bể ổn nhiệt; Tủ lạnh sâu 40C, 200C -800C (Sanyo, Nhật Bản); Máy điện di; Máy chụp ảnh gel-doc (Pharmacia Biotech); Máy luân nhiệt PCR GeneAmp® PCR Systems 9700 (Applied Biosystems Mỹ); Máy Speedvax; Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc); Nồi khử trùng; Máy lắc và tủ

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc: Các phân tử DNA tích điện âm Trong gel agarose, các phân đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được phân tách khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong điện trường có điện thế và cường độ dòng điện thích hợp

Quy trình:

Bước 1 Chuẩn bị gel: cân 0,8 - 1 g agarose hòa trong 100 µl dung dịch đệm

dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp Khi gel

đã đông đặc, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di

Bước 2 Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với 1,5 µl đệm màu và được tra vào

giếng điện di Đệm màu có tác dụng kéo mẫu DNA xuống đáy

giếng, làm mẫu không khuếch tán ra môi trường xung quanh đồng

thời cho phép quan sát sự di chuyển của mẫu để biết được thời

điểm cần kết thúc quá trình điện di

Bước 3 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V

Bước 4 Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm

vào dung dịch EtBr nồng độ 10 μg/ml trong thời gian 10 - 20 phút

Bản gel sau đó được rửa sạch bằng cách ngâm nước cất 5 - 10 phút

Bước 5 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử

ngoại bước sóng 254 nm Hình ảnh được ghi lại bằng máy chụp ảnh

2.2.2 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của DNA polymerase, một mạch DNA

sẽ được tổng hợp từ mạch DNA khuôn với sự có mặt của đoạn mồi DNA

polymerase sẽ kéo dài đoạn mồi để hình thành mạch mới Quá trình này

được lặp lại nhiều lần theo chu kỳ Kết quả sau n chu kỳ, đoạn gen được

nhân lên 2n lần

Field Code Changed Field Code Changed