Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa pectinase từ aspergillus niger

Trong đó, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp tạo ra nhiều sản phẩm có chất lượng và giá thành hạ.. Nhu cầu ứng dụng pectinase ngày càng tăng trong khi việc thu nhận enzyme này thường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

THÁI HỒNG CHUYÊN

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA

PECTINASE TỪ Aspergillus niger

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRẦN QUỐC DUNG

Huế, 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Những tài liệu tham khảo cho luận văn này có nguồn gốc rõ ràng

Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Người cam đoan

Thái Hồng Chuyên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới:

Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học Trường ĐH Khoa học Huế Toàn thể quý Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Huế, đã giảng dạy tận tình chu đáo đã giúp tôi tiếp thu được nhiều kiến thức mới

PGS TS Trần Quốc Dung, người Thầy đã chỉ bảo tận tình, hướng dẫn chu đáo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Ban lãnh đạo, phòng Kỹ thuật gen Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã tạo điều kiện tốt nhất khi tôi tiến hành nghiên cứu tại Viện

Trung tâm Huyết học Truyền máu - Bệnh viện Trung ương Huế, nơi tôi đang công tác, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được theo học Cao học và tiến hành nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ chia sẽ, động viên để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Hồng Chuyên

MỤC LỤC

- Trang phụ bìa

- Lời cam đoan

- Lời cảm ơn

- Mục lục

- Danh mục các chữ viết tắt

- Danh mục hình ảnh

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Aspergillus niger 3

1.2 PECTIN 4

1.2.1 Nguồn gốc pectin 4

1.2.2 Cấu tạo phân tử pectin 5

1.1.3 Tính chất của pectin 7

1.3 PECTINASE 8

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của pectinase 8

1.3.1.1 Pectinesterase 8

1.3.1.2 Polygalacturonase 9

1.3.2.3 Transeliminase 11

1.3.2 Nguồn nguyên liệu để thu nhận pectinase 12

1.3.3 Tính chất của pectinase từ Aspergillus niger 12

1.3.4 Ứng dụng của pectinase 13

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chế phẩm từ trái cây 14

1.3.4.2 Ứng dụng trong chăn nuôi 14

1.3.4.3 Ứng dụng trong ngành công nghiệp bông sợi 15

1.3.4.4 Ứng dụng trong lên men chè và cà phê 16

1.4 TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 20

2.3 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Nguyên liệu 20

2.3.2 Hóa chất 21

2.3.3 Môi trường 22

2.3.4 Trang thiết bị 22

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.4.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus niger 23

2.4.1.1 Phân lập Aspergillus niger 23

2.4.1.2 Tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả năng sinh pectinase tốt 23

2.4.1.3 Định danh loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử 24

2.4.2 Phương pháp tạo dòng gen 24

2.4.2.1 Tách chiết RNA tổng số của Aspergillus niger 24

2.4.2.2 Thiết kế primers 25

2.4.2.3 Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA 25

2.4.2.4 Tinh sạch cDNA từ sản phẩm phản ứng RT-PCR 26

2.4.2.5 PCR 26

2.4.2.6 Gắn sản phẩm cDNA vào vector 27

2.4.2.7 Chuẩn bị tế bào E coli khả biến 27

2.4.2.8 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 28

2.4.2.9 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 29

2.4.2.10 Kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector 29

2.4.3 Giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 TUYỂN CHỌN CHỦNG Aspergillus niger CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE TỐT 30

3.1.1 Phân lập Aspergillus niger 30

3.1.2 Tuyển chọn chủng A niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase tốt bằng phương pháp đo vòng phân giải 32

3.1.3 Định danh Aspergillus niger bằng kỹ thuật sinh học phân tử 33

3.2 TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger 34

3.2.1 Tách chiết RNA tổng số 34

3.2.2 Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA 35

3.2.3 Tinh sạch sản phẩm cDNA từ phản ứng RT-PCR 36 3.2.4 Tạo dòng sản phẩm cDNA vào vector và kiểm tra sự hiện diện của nó trong vector 37 3.3 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE SẢN PHẨM cDNA ĐƯỢC TẠO DÒNG 40 3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN POLYGALACTURONASE I ĐƯỢC TẠO DÒNG TỪ

CHỦNG Aspergillus niger CH13I 42

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

EDTA : ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr : ethidium bromide

IPTG : isopropyl -D-1- thiogalactopyranoside

kb : kilobase

LB : Luria and Bertani

NCBI : The National Center for Biotechnology Information Nxb : nhà xuất bản

OD : optical density

PDA : Potato Dextroga Agar

rpm : rotation per minute

S.O.C : Super Optimal broth with Catabolite repression

Taq : Themophilus aquaticus

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu

3.2 Thể sinh bào tử (bên trái) và sợi nấm (bên phải) của A

3.8 Kết quả so sánh trình tự bảo thủ trên gen rRNA 28S của

3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng

3.13 Khuẩn lạc trắng và xanh của chủng E coli DH5α sau 16

3.15 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp 39

3.18 Trình tự aa suy diễn của gen polygalacturonase I được tạo

3.19 Kết quả so sánh trình tự nucleotide và trình tự aa suy diễn

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử Giáo sư Paul Berg thuộc trường Đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980 là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) vào năm 1972 Kể từ đó đến nay, công nghệ DNA tái tổ hợp đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau mang lại lợi ích to lớn

Pectin là một thành phần quan trọng trong thành phần cấu tạo của mô thực vật Đó là một polymer có cấu trúc phức tạp với vai trò làm cầu nối các sợi cellulose giúp ổn định cấu trúc mô thực vật Việc phân hủy pectin bằng tác nhân hóa lý gặp nhiều khó khăn làm ảnh hưởng đến tốc độ và chất lượng của nhiều quá trình công nghiệp [16]

Pectinase là tên gọi chung của phức hợp enzyme phân giải pectin Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Pectinase có nguồn gốc khác nhau sẽ có phản ứng thủy phân các liên kết khác nhau và điều kiện tối ưu phản ứng khác nhau Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người [2], [25]

Pectinase là một trong những enzyme được ứng dụng đầu tiên trong đời sống Từ những năm 1930, enzyme này đã được ứng dụng trong sản xuất rượu và nước ép trái cây Tuy nhiên, đến thập niên 1960 bản chất hóa học và cấu trúc của mô thực vật được nghiên cứu đầy đủ thì enzyme này mới được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực hơn Hiện nay, pectinase là một trong những enzyme được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nhất; trong công nghiệp sản

xuất nước trái cây; trong chế biến thức ăn chăn nuôi; trong y học để ly trích các dược liệu đông y; trong công nghiệp chất tẩy rửa, việc bổ sung enzyme này tăng chất lượng tẩy rửa và bảo vệ môi trường Doanh thu ước tính của ngành công nghiệp enzyme trên toàn cầu năm 1995 đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó pectinase chiếm khoảng 75 triệu USD Năm 2000, ước đạt 1,5 tỷ USD trong đó pectinase chiếm khoảng 100 triệu USD Dự kiến năm 2012 doanh thu tổng số của ngành công nghiệp enzyme đạt khoảng 2,9 tỷ USD [2], [16], [25], [26]

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã áp dụng nhiều công nghệ mới về các chế phẩm sinh học Trong đó, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp tạo

ra nhiều sản phẩm có chất lượng và giá thành hạ Nhu cầu ứng dụng pectinase ngày càng tăng trong khi việc thu nhận enzyme này thường gặp nhiều khó khăn do: Các loài mang gen mã hóa thường tổng hợp một lượng enzyme không lớn và chỉ tổng hợp khi cần thiết; thời kỳ tổng hợp có thể ngắn hay chỉ tổng hợp khi trưởng thành; thời gian nuôi trồng kéo dài và thường khó sản xuất trên quy mô công nghiệp Việc sử dụng các vi sinh vật đặc biệt là

Aspergillus niger để sản xuất pectinase tuy đã đạt được nhiều thành tựu, tuy

nhiên có sự phụ thuộc nguồn cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp pectinase là pectin Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ DNA, protein tái tổ hợp đã mở ra một triển vọng lớn để tổng hợp nên enzyme này

một cách nhanh chóng thông qua một vật chủ mới như E coli hay nấm men

không có sự phụ thuộc vào nguồn cơ chất pectin, đồng thời có khả năng sản xuất trên quy mô công nghiệp với giá thành hạ [26], [35]

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tạo dòng

gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Aspergillus niger

Apergillus niger thuộc ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, bộ

Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus

Apergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phân giải chất hữu cơ phân bố

trên khắp thế giới Người ta có thể phân lập chúng từ nước, đất và thường có

nhiều trong xác thực vật đang phân hủy Aspergillus niger có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng 6-47°C với nhiệt độ tối ưu ở 30-37°C Aspergillus

niger chịu được hạn cao so với các loài khác thuộc chi Aspergillus Aspergillus niger có thể phát triển trên một phạm vi pH rất rộng từ 1,4-9,8 với

pH tối ưu 4-6, đây cũng là pH tối ưu cho các enzyme do chúng sản xuất ra

hoạt động Aspergillus niger có khả năng sinh bào tử mạnh và phát tán chúng

thông qua không khí, đảm bảo sự xuất hiện phổ biến với mật độ cao, đặc biệt

là ở những vùng ấm và ẩm ướt [41]

Apergillus niger là một trong những vi sinh vật được sử dụng nhiều

trong Công nghệ sinh học Nó được dùng để sản xuất thực phẩm, dược phẩm, thức ăn chăn nuôi và các enzyme công nghiệp bằng phương pháp lên men rắn

hoặc chìm Nhiều enzyme do Apergillus niger sản xuất được cơ quan FDA

(Food and Drug Administration) của Mỹ đánh giá đạt tiêu chẩn GRAS

(generally recognized as safe) và cho phép sử dụng rộng rãi Apergillus niger

là một trong những loài được quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới

Năm 2007, genome của chủng Apergillus niger CBS 513.88 đã được công bố

trình tự đầy đủ trên GenBank của NCBI [18], [34], [41]

Apergillus niger là loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase

tốt Apergillus niger là nấm mốc có dạng bình tưới hoặc hoa cúc, có các tế

bào chân, có phần cuối phồng lên thành một bọng, trên bọng mọc các thể

bình, trên thể bình là các chuỗi bào tử Tuy nhiên, các loài khác nhau thuộc

chi này cũng có những đặc điểm khác nhau [2] Loài Apergillus niger có

những đặc điểm riêng biệt sau:

- Apergillus niger phát triển trên môi trường Czapeck, khi quan sát

bằng mắt thường có màu đen nhánh hay màu bã cà phê Chúng phát triển chậm hơn một số loài khác cùng chi trên môi trường này Đường kính khuẩn lạc đạt được 2,5-3 cm sau 10-14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (24-26oC), sợi nấm mọc rất khít

- Cuống nang thẳng đứng, dài 1,5-3 mm, đường kính 15-20 µm

- Bọng có hình gần như hình cầu, đường kính 45-75 µm

- Chúng có hai hàng thể bình Thể bình một tầng hoặc hai tầng tuỳ thuộc vào loài và độ tuổi của mũ bào tử

- Bào tử trưởng thành có hình cầu, đường kính 4-5 µm, xù xì, không đều nhau, có gai nhỏ, không sắp xếp đều đặn Mũ phát tán bào tử có đường kính 700-800 µm

1.2 PECTIN

1.2.1 Nguồn gốc pectin

Pectin là một polymer của các axít polygalacturonic và các este methyl của chúng Pectin có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào dưới dạng kết hợp với araban (polysaccharide ở thành tế bào), dạng hòa tan của pectin tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào

Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau vì thế người ta gọi chúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật Khi quả còn xanh, cement là protopectin, do protopectin chiếm tỉ lệ khá cao và không hòa tan trong nước nên giúp quả có độ cứng Khi quả chín dần, dưới tác dụng protopectinase, protopectin sẽ chuyển sang pectin hòa tan (pectin) và araban,

làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm hơn Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của axít và nhiệt độ ở 60-85oC [29], [39]

Trong thực vật, các pectin thường liên kết với cellulose ở vách tế bào dưới dạng phức hợp chưa biết rõ Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ hoặc thân của một số loài thực vật Trong cùng một loại quả nhưng ở các phần khác nhau thì hàm lượng pectin cũng khác nhau Ví dụ, trong quả bưởi pectin hòa tan là chất nhầy bao quanh vỏ hạt bưởi và trong cùi quả bưởi chín, bản chất của nó là một loại chất xơ hòa tan trong nước, làm tăng độ nhớt

Bảng 1.1 Hàm lượng pectin trong một số loại rau, quả [39]

1.2.2 Cấu tạo phân tử pectin

Pectin là các polysaccharide, mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử axít D-galacturonic (C6H10O7) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside Trong đó, một số gốc axít có chứa nhóm thế methoxyl

(-OCH3) Chiều dài của chuỗi axít polygalacturonic có thể biến đổi từ vài đơn

vị tới hàng ngàn đơn vị axít galacturonic

Hình 1.1 Axít D-galacturonic

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử pectin

Phân tử lượng của các loại pectin tách từ các nguồn quả khác nhau thay đổi trong giới hạn rộng tùy theo số phân tử axít galacturonic và thường thay đổi trong phạm vi từ 25-50 kDa Trong các hợp chất dạng glucid so về chiều dài phân tử thì pectin cao hơn tinh bột nhưng thấp hơn cellulose Ví dụ, từ nguồn lê, mận thu được pectin có phân tử lượng từ 25-35 kDa, trong khi đó pectin lấy từ cam lại có phân tử lượng đạt tới 50 kDa

Bảng 1.2 Trọng lượng phân tử pectin trong một số loại rau, quả [39]

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl (MI) biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl có trong phân tử pectin và chỉ số este hóa (DE) thể hiện mức độ este hóa của các phân

tử axít galactoronic trong phân tử pectin

Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp

Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin): DE > 50% hay MI > 7% Chúng có thể được sử dụng làm phụ gia để làm tăng độ nhớt cho sản phẩm, muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH từ 3,1-3,4 và nồng độ đường trên 60%

Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin): DE < 50% hay MI < 7% Chúng được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường và thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm

Tên gọi pectin dùng để chỉ các chuỗi polygalacturonic được methyl hóa 100% Tên gọi axít pectinic để chỉ chuỗi polygalacturonic được methyl hóa thấp hơn 100% Còn tên gọi axít pectic để chỉ chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm methoxyl Trong thực tiễn thì tên pectin dùng để chỉ

cả axít pectinic và pectin

1.1.3 Tính chất của pectin

Pectin thuộc nhóm các chất làm đông tụ Pectin được xem là một trong những phụ gia thực phẩm an toàn và được chấp nhận nhiều nhất và điều này được chứng minh bởi hàm lượng ADI (acceptable daily intake) cho phép là

“không xác định” được ban hành bởi các tổ chức JECFA (Joint Food Experts Committee), SCF (Scientific Committee for Food) ở Liên minh châu Âu, và FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ [2 ], [39]

Pectin có mã hiệu quốc tế là E440 Pectin tinh chế có dạng chất bột trắng màu xám nhạt, là một chất keo hút nước, rất dễ tan trong nước, không tan trong ethanol

Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt của axít và đường nó có khả năng tạo đông (tạo gel) Vì vậy, nó được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo

Dung dịch pectin có độ nhớt cao Do đó, nếu muốn thu dịch ép trái cây

có hàm lượng pectin cao sẽ gặp bất lợi Vì vậy, người ta thường dùng pectinase để thủy phân pectin, giảm độ nhớt Ví dụ, nước cà chua 90-92%

H2O nhưng vì hàm lượng pectin cao nên sản phẩm có dạng sền sệt Nước dứa

có ít pectin nên dễ ép, dễ lọc trong quá trình sản xuất [5]

Còn đối với pectin tan thì dưới tác dụng của pectinase sẽ biến thành axít pectinic (thường dưới dạng muối Ca2+ và Mg2+) và các chất đơn giản khác như rượu methylic, axít acetic, arabinose, galactose

1.3 PECTINASE

Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần khác nhau Trong hệ pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40 kDa Có nhiều cách phân loại pectinase: Dựa vào tính đặc hiệu có thể phân ra enzyme phân giải pectin và phân giải axít pectinic, axít pectic; Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia thành enzyme phân giải các liên kết ở giữa mạch và enzyme phân giải các liên kết ở đầu mạch; dựa và pH tối ưu có thể chia enzyme thành enzyme pH axít và pH kiềm

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của pectinase

1.3.1.1 Pectinesterase

Pectinesterase (PE) có gọi hệ thống là pectinhydrolase (mã số: EC

3.1.1.11), có trọng lượng phân tử khoảng 41 kDa Pectinesterase là nhóm

enzyme xúc tác thuỷ phân liên kết este trong phân tử pectin hoặc axít pectinic, kết quả tạo thành là axít pectinic hoặc axít pectic và rượu metanol Khi toàn

bộ các nhóm methoxyl đều bị tách khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là metanol và axít polygalacturonic Sự thuỷ phân chỉ xảy ra ở liên kết este kề liền với nhóm -COOH tự do

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có pH tối ưu khác nhau Pectinesterase của vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,5-5,5 Chế phẩm này sau khi đã loại bỏ polygalacturonase thì có pH tối ưu từ 2,0-6,5 Trong khi đó

pH tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao là 5,0-8,0

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 30-45oC và bị bất hoạt khi ở nhiệt độ 55-62oC, trái lại nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao là 55-60oC

Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Na+, K+, Ca2+ và Mg2+ Trái lại các cation hoá trị 3 và 4 như Pb4+, Al3+, Fe3+ sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase

1.3.1.2 Polygalacturonase

Polygalacturonase (PG) có tên hệ thống là poly-α1,4 galacturonic glucanohydrolase (mã số: EC 3.2.1.15) Là các enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết 1-4 glucoside trong phân tử pectin

Polygalacturonase ít gặp trong thực vật, enzyme này chủ yếu có ở các

vi sinh vật, đặc biệt ở nấm mốc và vi khuẩn, thường có trọng lượng phân tử khoảng 65 kDa Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử

và thường có tính đặc hiệu đối với cơ chất Polygalacturonase chủ yếu bền vững ở trong vùng pH từ 4,0-6,0 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng 40-45oC, ở trong khoảng nhiệt độ đó chúng thường bền vững nhưng sẽ bị bất hoạt ở 50-60oC

Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất Deuel và Stutz (1958) đã chia bốn kiểu polygalacturonase trong hai nhóm polymethy-galacturonase và polygalacturonase

Polymethygalacturonase

Polymethylgalacturonase có tên gọi hệ thống là poly α1,4-galacturonic methylesteglucanohydrolase (mã số EC 3.2.1.11) Polymethylgalacturonase là enzyme song tác lên axít polygalacturonic đã được methoxy hóa Tuỳ theo vị trí liên kết glucoside bị chúng cắt đứt ở đầu mạch hay giữa mạch mà các enzyme này được chia thành 2 nhóm nhỏ:

Endo-polymethylgalacturonase I

Endo-polymethylgalacturonase I còn gọi là enzyme dịch hoá Đây là enzyme xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α1,4-glucoside giữa mạch của các phân tử axít polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao

Hoạt tính của enzyme này bị giảm khi có mặt của pectinesterase trong môi trường Endo-polymethylgalacturonase I rất phổ biến ở trong các vi sinh

vật, đặc biệt là ở nấm mốc Aspergillus niger, Botrylis cinerea, Aspergillus

awamori

Exo-polymethylgalacturonase III

Exo-polymethylgalacturonase III còn là enzyme đường hoá Đây là enzyme xúc tác sự thuỷ phân các kiên kết α1,4-glucoside ở đầu mạch để tách dần từng gốc axít galacturonic ra khỏi phân tử pectin hay axít pectinic, bắt đầu từ đầu không khử Exo-polymethylgalacturonase III có ái lực với gốc axít galacturonic đã methyl hoá, nghĩa là phân cắt các liên kết α1,4- ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc axít galacturonic có nhóm -COOCH3

Polygalacturonase

Là enzyme tác dụng chủ yếu lên các axít pectic và axít pectinic Đối với nhóm enzyme này sự có mặt của pectinesterase có tác dụng thúc đẩy sự xúc

tác của chúng Các enzyme này cũng được chia thành 2 nhóm theo vị trí liên kết glucoside bị chúng cắt đứt là: Exo-polymethylgalacturonase II và Exo-polymethylgalacturonase IV

Pectin-transeliminase: là những enzyme tác dụng trên phân tử pectin

và axít pectinic Các enzyme này có tên hệ thống là poly-α1,4 galacturonic

methylesteglucanase Chúng có hai loại là endo-pectin transeliminase I và exo-pectin transeliminase III

Polygalacturonic-transeliminase: Là những enzyme tác dụng trên axít

pectinic và axít pectic Những enzyme này có tên hệ thống là poly-α1,4 galacturonicglucanase Chúng có hai loại là endo-polygalacturonic-transeliminase II và exo-polygalacturonic-transeliminase IV

D-Transeliminase từ những nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc tính khác nhau Transeliminase từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH là 5,2 Còn transeliminase từ vi khuẩn hoạt động tối ưu ở pH từ 7,0-8,5

1.3.2 Nguồn nguyên liệu để thu nhận pectinase

Pectinase có thể được sinh tổng hợp từ nấm mốc, vi khuẩn và nấm men Phần lớn các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được những vi sinh vật vốn là yếm khí bắt buộc nhưng lại có khả năng sinh tổng hợp pectinase [31]

Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinase thì nấm mốc

có khả năng sinh tổng hợp cao nhất Các loài thuộc chi Aspergillus, đặc biệt là

Aspergillus niger, Aspergillus awamori đã được ứng dụng nhiều trong sản

xuất pectinase Pectinase có thể thu nhận được từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc nuôi cấy chìm sục khí Tuy nhiên, dù nuôi cấy trên môi trường lỏng hay đặc, ngoài các thành phần dinh dưỡng chủ yếu như C, N, P thì chất cảm ứng pectin là một thành phần không thể thiếu trong môi trường

để nấm mốc tổng hợp định hướng pectinase với số lượng và hoạt độ lớn [10], [12], [31], [42]

1.3.3 Tính chất của pectinase từ Aspergillus niger

Pectinase được sản xuất từ nấm mốc Apergillus niger là một chế phẩm

enzyme thương mại Dịch enzyme thô sau khi tách chiết bằng cách kết tủa với (NH4)2SO4 và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột sẽ thu được enzyme

đồng nhất Chế phẩm enzyme này hoạt động ở pH tối ưu là 5, nhiệt độ tối ưu

là 36oC, ổn định dưới 35oC Kết quả phân tích trình tự aa cho thấy có 19 loại

aa trong phân tử endo-polygalacturonase Trọng lượng phân tử của enzyme này khoảng 40,4 kDa Đây là enzyme dịch hoá, xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α1,4-glucoside giữa mạch của các phân tử axít polygalacturonic [1], [2], [12]

1.3.4 Ứng dụng của pectinase

Hầu hết các chế phẩm pectinase đều gồm các phức hệ enzyme giống nhau Chúng chỉ khác nhau ở mức độ hoạt động và tỷ lệ các loại enzyme Chính vì điều này, người ta sẽ có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau tuỳ theo mục đích công nghệ và tính chất của loại pectin Các loại enzyme có mặt trong chế phẩm pectinase phụ thuộc vai trò của chúng mà được chia thành các nhóm như sau:

- Enzyme quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm

- Enzyme có mặt trong chế phẩm nhưng không bắt buộc

- Enzyme không cần thiết nhưng có thể cho phép có mặt một lượng không đáng kể trong chế phẩm

Vì vậy, đối với mỗi quá trình công nghệ có thể sử dụng các nhóm pectinase khác nhau Kashyap và cs (2001) đã có bài viết về ứng dụng của pectinase trong lĩnh vực thương mại Tác giả đã chỉ ra những ứng dụng của enzyme này trong công nghiệp chế biến nước trái cây, dệt sợi, sản xuất giấy, lên men thịt quả cà phê, chiết tinh dầu và xử lý nước thải [25]

Theo công bố mới đây, Bai và cs (2004) đã đề cập đến một ứng dụng rất mới của pectinase Sử dụng dịch chiết của enzyme này trong xử lý nước thải và kháng bệnh ở thực vật cho cây khoai tây non và dưa chuột Củ cải đường được sử dụng như nguồn C, nước thải từ việc sản xuất glutamate được

sử dụng làm nguồn N và H2O cho quá trình lên men sinh tổng hợp pectinase

bằng chủng Apergillus niger [17]

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chế phẩm từ trái cây

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau:

- Sản xuất rượu vang

- Sản xuất các mặt hàng từ trái cây: nước trái cây cô đặc, mứt

- Sản xuất nước ép trái cây và đồ uống không cồn

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê

Ví dụ: Những loại rượu được sản xuất từ lên men trái cây việc dụng pectinase có thể rút ngắn quá trình sản xuất 10-12 ngày, tăng tốc độ lọc, hiệu suất thu hồi tăng 10-15% và làm cho rượu thành phẩm còn có mùi thơm hơn, trong và ánh hơn

Ngoài các ngành nói trên, pectinase còn được dùng trong việc sản xuất các loại gel khác nhau từ quả, cà phê đặc hoặc pectin có hàm lượng methoxy thấp [1], [16], [25]

1.3.4.2 Ứng dụng trong chăn nuôi

Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, cellulose

và hemicellulose cao Trong khi đó, động vật lại chỉ có khả năng tổng hợp rất hạn chế các enzyme nhóm cacbonhydrolase phân giải được tinh bột và disaccharide Trong dịch tiêu hoá động vật không có hemicellulase phân giải xilan (một loại hemicellulose), pectinase phân giải pectin, ligninase phân giải lignin và các hợp chất phức tạp khác Vì vậy để giúp cho động vật sử dụng triệt để thức ăn, người ta thêm vào khẩu phần của chúng liều lượng thích hợp các chế phẩm enzyme nguồn gốc vi sinh vật có hoạt tính pectinase cao cùng với cellulase và hemicellulase [2], [25]

1.3.4.3 Ứng dụng trong ngành công nghiệp bông sợi

Trong ngành công nghiệp bông sợi, việc sử dụng enzyme có tác động

rất lớn đến công nghiệp dệt cả về chất lượng sản phẩm và bảo vệ môi trường

Trước khi sợi được mắc vào khung để dệt thành vải nó sẽ được bôi một lớp tác nhân làm trơn để chống xơ xước trong quá trình dệt Tác nhân thường được sử dụng là tinh bột bởi vì nó có khả năng tạo ra lớp màng mỏng rất tốt

mà lại có giá thành rẻ Tuy nhiên, việc loại bỏ những thành phần không phải

là cellulose để nhuộm vải là việc bắt buộc phải làm Trước khi tìm ra amylase, người ta chỉ có con đường duy nhất để loại bỏ các chất này là sử dụng dung dịch soda (Na2CO3) nóng Xử lý hoá học không có hiệu quả cao trong việc loại bỏ tinh bột (chúng ảnh hưởng tới sự bắt màu than chì) và tất nhiên kết quả là ở một số sợi vải bị mất đi tính xốp tự nhiên của nó Việc sử dụng pectinase kết hợp với amylase, cellulase hay các enzyme nhóm hemicellulase khác sẽ loại bỏ các tác nhân trên một cách hiệu quả và làm giảm đáng kể việc

sử dụng chất hoá học trong công nghiệp dệt Kết quả là làm giảm lượng nước thải vào môi trường, giảm công lao động và tăng chất lượng sản phẩm

Sợi cotton có các thành phần như chất béo, sáp, protein, chất màu tự nhiên Các chất này làm giảm mạnh sự hấp thụ nước của sợi làm giảm độ trắng của sợi Trong đó, pectin đóng vai trò như một loại keo sinh học, phần lớn nước bao quanh muối của pectin liên kết với sáp, protein tạo ra một màng chắn bảo vệ sợi cotton

Màng chắn này sẽ làm cho sợi bắt màu đồng bộ nhưng lại phải dùng một lượng nước lớn để rửa, tốn năng lượng và tạo ra lượng lớn các chất thải

đe doạ môi trường sống Do vậy, người ta rất quan tâm đến việc giảm giá thành sản phẩm và giảm tác động đến môi trường Thuỷ phân bằng pectinase phân cắt các chất bám vào làm cho sợi được rửa sạch bằng nước mà không làm vỡ hệ sợi cellulose Quá trình này gọi là “con đường sinh học” Con

đường sinh học là một con đường mới dựa trên loại bỏ các chất bẩn bằng cách

sử dụng các enzyme Ví dụ như pectinase cắt các liên kết pectin, protease phân cắt protein và một số chất màu cũng sẽ được giải phóng ra Quá trình này tốn ít năng lượng và ít gây ô nhiễm môi trường Enzyme trên không làm ảnh hưởng đến sức bền của sợi do hệ sợi không bị phá vỡ Pectinase sử dụng trong con đường sinh học dựa trên sự lựa chọn về pH, nhiệt độ, nhu cầu năng lượng và thời gian xử lý [25], [36]

1.3.4.4 Ứng dụng trong lên men chè và cà phê

Sử dụng pectinase trong quá trình chế biến chè sẽ làm tăng tốc độ lên men của chè và pectinase cũng làm phá bọt trong bột chè vì nó có khả năng phân huỷ pectin Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo trên bề mặt của hạt cà phê Trước đây, người ta dùng ngay vi sinh vật để làm công việc này nhưng quá trình thường xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra Hiện nay, người ta thường dùng các chế phẩm pectinase để cải thiện chất lượng cà phê [24]

1.4. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger

Pectinase từ Aspergillus niger được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh

vực nên gen mã hóa pectinase rất được quan tâm nghiên cứu Gen pectinase

của Aspergillus niger là một họ gen, gồm nhiều gen mã hóa các loại pectinase

thực hiện các chức năng khác nhau Nhiều nghiên cứu khác nhau trên khắp thế giới, đặc biệt là thành tựu trong việc giải toàn bộ genome năm 2007 đã

xác định được rất nhiều gen khác nhau trong genome của Aspergillus niger

Tuy nhiên, rất nhiều trình tự trong genome chỉ mới tạm thời dự đoán chức năng và cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để làm rõ chức năng cũng như điều kiện biểu hiện của chúng

Gysler và cs (1990) đã tạo dòng gen pectin lyase D (pelD GenBank: M55657) từ chủng Aspergillus niger N756 bằng cách sàng lọc thư viện

genome của chúng với probe là gen pectin lyase I được xác định trong nghiên cứu của Houdenhoven và cs (1975) Kết quả xác định được gen pectin lyase

D dài 2716 bp có 4 đoạn intron ngắn 57-65 bp, mã hóa cho 373 aa có 19 aa peptide tín hiệu [21]

Harmsen và cs (1990), Margo và cs (1991) đã nghiên cứu tạo dòng và

biểu hiện gen pectin lyase (pelA GenBank: X60724) của chủng Aspergillus

niger N400 bằng cách sàng lọc thư viện genome chúng với probe dựa trên gen

pectin lyase D (pelD) trong nghiên của Gysler và cs (1990) Kết quả xác định được trình tự mã hóa gen pelA gồm 1355 bp trong đó khung đọc mở (ORF) dài 1137 bp mã hóa cho 379 aa có 20 aa peptide tín hiệu Trình tự aa của pelA được xác định là giống 69% với gen pelD trong nghiên cứu của Gysler [22],

[28]

Ruttkowski và cs (1990) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase từ

chủng Aspergillus niger RH5344 Kết quả xác định được một cDNA dài 1319

bp có chứa một khung đọc mở duy nhất 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn peptide tín hiệu đầu tận cùng NH2- gồm 27 aa Việc giải trình tự các aa

từ enzyme này được tiến hành và xác định trình tự aa suy diễn từ trình tự mã hóa của gen polygalacturonase là chính xác [38]

Hendrik và cs (1992) đã tạo dòng xác định trình tự gen polygalacturonase II bằng cách sử dụng probe đặc hiệu sàng lọc thư viện

genome của chủng Aspergillus nige N400 Kết quả xác định được trình tự gen

polygalacturonase II gồm 1141 bp trong đó có một đoạn intron 55 bp, khung đọc mở (ORF) gồm 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn petide tín hiệu gồm 27 aa [23]

Khanh và cs (1991) tạo dòng gen pectin methyl esterase (PME) từ chủng Aspergillus niger RH5344 Kết quả xác định được trình tự 1747 bp có

7 đoạn exon và 6 đoạn intron, mã hóa cho 314 aa [27]

Bussink và cs (1991) đã mô tả và so sánh hai gen polygalacturonase I

(pgaI GenBank: X58892) và polygalacturonase II (pgaII GenBank: X58893) được tạo dòng từ chủng Aspergillus niger N400 Trong đó, gen pgaI có hộp

TATA nằm vị trí -152 và hộp CAAT giả định nằm ở vị trí -218 so với codon

mở đầu, có hai đoạn intron ngắn 52 bp và 62 bp, mã hóa cho 368 aa Gen

pgaII có một đoạn intron ngắn 52 bp, mã hóa cho 362 aa [19]

Ruttkowski và cs (1991) đã tạo dòng gen mã hóa polygalacturonase

(PG) từ chủng Aspergillus niger RH5344 Cấu trúc gen bao gồm 1141 bp mã

hóa cho 362 aa, khung đọc mở bị gián đoạn bởi một đoạn intron 52 bp Trình

tự aa của PG này được so sánh với PG từ cà chua (Lycopesium esculentum)

và Erwinia carotovora Kết quả so sánh ba loại enzyme cho thấy có một vùng

bảo tồn cao ở đầu tận cùng, có thể đó là vùng hình thành trung tâm xúc tác [37]

Bussink và cs (1992) đã tạo dòng gen polygalacturonases C Kết quả

xác định được gen polygalacturonases C (pgaC GenBank: X64356) dài 2034

bp, gồm 4 đoạn exon và 3 đoạn intron mã hóa cho 383 aa [20]

Suykerbuyk và cs (1997) đã tạo dòng 2 gen rhamnogalacturonan

hydrolase từ thư viện genome của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sử dụng gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus làm probe

Kết quả xác định được 2 gen là rhamnogalacturonan hydrolase A (rhgA GenBank: X94220) và B (rhgB GenBank: X94221) Hai gen này giống với gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus lần lượt là 78%

và 72% Hai gen rhgA, rhgB đều có 3 đoạn intron và 3 đoạn exon, trong đó gen rhgA mã hóa cho 446 aa và rhgB mã hóa cho 558 aa [43]

Parenicova và cs (2000) tạo dòng gen mã hóa 2 endo-polygalacturonase

là polygalacturonase A (pgaA GenBank: Y18804) và polygalacturonase B (pgaB GenBank: Y18805) Kết quả xác định được gen

endo-pgaA dài 1167 bp trong đó có một đoạn intron và mã hóa cho 370 aa, gen pgaB dài 1234 bp có 2 đoạn intron và mã hóa cho 362 aa [32 ]

Mukadam và cs (2009) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: GQ251519) từ chủng Aspergillus niger M1 Kết quả xác định được

trình tự 1101 bp gồm một khung đọc mở duy nhất mã hóa cho 367 aa [30]

Đặc biệt, với công trình giải trình tự toàn bộ genome của chủng

Aspergillus niger CBS 513.88 của Pel và cs (2007) rất nhiều gen pectinase đã

được xác định và công bố trên GenBank như polygalacturonase I (pgaI XM_001389525), polygalacturonase II (pgaII XM_001397030), endo- polygalacturonase A (pgaA XM_001397963), endo-polygalacturonases B (pgaB XM_001399591), polygalacturonase C (pgaC XM_001390775), endo- polygalacturonase D (pgaD XM_001393605), polygalacturonase E (pgaE XM_001389818), pectin lyase A (pelA XM_001401024), pectin lyase B (pelB

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là Aspergillus niger

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Luận văn được tiến hành trong thời gian 8 tháng (4-11/2010)

2.3 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nguyên liệu

-Vỏ cam, chanh, bưởi được thu thập ngoài tự nhiên tại Thành phố Huế

- Chủng E coli DH5α do Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ

sinh học, Đại học Huế cung cấp

- Primer

Cặp primer 1:

Forward primer 5' ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGCC 3'

Reverse primer 5' TTAGCAAGAAGCACCGGAAGGAACG 3'

Cặp primer 2:

Forward primer 5' ATGCACTCGTTTGCTTCTCTTCTCG 3'

Reverse primer 5' CTAACAAGAGGCCACCGAAGGGA 3'

- Vector pGEM®-T Easy (Promega)

Hình 2.1 Sơ đồ vector pGEM ® -T Easy

- Kit RT-PCR: Access RT-PCRSystem (A1250-Promega)

- Kit PCR: Green GoTaq (M7122-Promega)