PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ ( CP) CỦA Cymbidium mosaic virus ( CyMV )

Đề tài “Phân lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ CP của Cymbidium mosaic virus CyMV” được thực hiện nhằm góp phần vào việc kiểm soát hiệu quả bệnh do virus CyMV gây ra trên lan.. Nghiê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA Cymbidium mosaic virus (CyMV)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA Cymbidium mosaic virus (CyMV)

KS NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

Tháng 07/2011

LỜI CẢM ƠN

 Thực hiện khoá luận tốt nghiệp là cơ hội giúp tôi ôn lại những kiến thức đã có

và học hỏi nhiều điều mới Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã được sự giúp đỡ

từ gia đình, rất nhiều thầy cô, anh chị và bạn bè

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 Đầu tiên con xin thành kính ghi ơn ba mẹ đã sinh thành, luôn bên con để con cóđược ngày hôm nay, cảm ơn anh chị em và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trongsuốt thời gian qua

 Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủnhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thứccho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

 Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã tạođiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

 Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Xuân Dũng và KS NguyễnThị Ngọc Thảo đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập và thực hiệnkhoá luận tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

 Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất các anh chị làm việc tại phòng thí nghiệm Sinhhọc Phân tử và phòng Công nghệ Sinh học Thực vật đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốtthời gian qua

 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH07SH đã gắn bó, động viên, giúp đỡtôi trong suốt 4 năm qua.

Xin Chân thành cảm ơn!

Cymbidium mosaic virus là loài virus chính gây hại trên các dòng phong lan, có

tên gọi khác là virus khảm vàng Cây lan khi đã nhiễm loại virus này sức sống, phẩmchất hoa,… giảm đáng kể; làm kìm hãm ngành công nghiệp trồng lan Việc nghiên cứucác biện pháp kiểm soát bệnh virus là một vấn đề đang được quan tâm hiện nay

Đề tài “Phân lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ (CP) của Cymbidium mosaic virus (CyMV)” được thực hiện nhằm góp phần vào việc kiểm soát hiệu quả bệnh do

virus CyMV gây ra trên lan

Nghiên cứu được bắt đầu với việc kiểm tra tình trạng nhiễm virus của lá lan vớicặp mồi phát hiện bằng kỹ thuật RT–PCR từ các mẫu nhiễm virus, đồng thời thiết kếmồi đặc hiệu cho trình tự gen CP và chèn đoạn gen khuếch đại được vào vector

pJet1.2/blunt Sau cùng tiến hành hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α, sàng lọc và thu nhận dòng E coli DH5α mang plasmid chứa gen quan tâm.

Một số kết quả thu nhận được như sau: Đề tài đã phân lập được gen CP của

virus CyMV và thu nhận được dòng vi khuẩn E coli DH5α chứa plasmid nhân dòng

mang trình tự gen CP của virus CyMV Xác định được trình tự gen CP của virusCyMV tại Việt Nam

Cymbidium mosaic virus also known as yellow mosaic virus is major pathogen

causes yellow mosaic disease in different orchid genera The quality of orchids andflower orchids which are infected this virus, will be decreased Especially, it alsoaffect the orchid industry

This study was made to effective control diseases caused by Cymbidium mosaic viru

Fristly, Cymbidium mosaic virus was detected by RT-PCR method.

Simultaneously, designing the CP cloning primers from the CyMV genomessequences in NCBI Secondly, the CP gene sequence was amplified by RT-PCR andthese primers Then, the CP gene was inserted into the vector pJet1.2/blunt to create

the recombinant vectors And, they were transformed into E coli DH5α Finally, isolating the E coli DH5α contained the recombinant vectors.

Some results: We have set up process successfully and have isolated the E coli

DH5α contained the recombinant vectors We have also analyzed sequence therecombinant vector and confirmed the target sequence

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN……… i

TÓM TẮT……… ii

SUMMARY……… iii

MỤC LỤC……… iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT……… vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG……….viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH……….ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về Cymbidium mosaic virus (CyMV) 3

2.2 Các phương pháp phát hiện virus trên lan 5

2.2.1 Phương pháp ELISA 5

2.2.2 Phương pháp RT-PCR 6

2.3 Tổng quan về mồi sử dụng trong phản ứng PCR 7

2.3.1 Các yêu cầu cần đảm bảo khi thiết kế mồi 7

2.3.2 Các bước thiết kế mồi 8

2.4 Sơ lược về phương pháp PCR và kỹ thuật tạo dòng gen 9

2.4.1 Phương pháp PCR 9

2.4.2 Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen 10

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nuớc 11

2.5.1.Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 11

2.5.1.1 Các nghiên cứu về phát hiện virus 11

2.5.1.2 Các nghiên cứu về phân lập, tạo dòng gen của CyMV 12

2.5.2 Tình hình trong nước 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Địa điểm và thời gian 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.3 Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm 16

3.3.1 Hóa chất 16

3.3.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm 17

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Nội dung 18

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.2.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus CyMV của mẫu lá địa lan 18

3.4.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP của virus CyMV 20

3.4.2.3 Khuếch đại gen CP bằng kỹ thuật RT–PCR 20

3.4.2.4 Tạo dòng gen CP vào vi khuẩn E coli DH5α 21

3.4.2.5 Giải trình tự đoạn gen đã được nhân dòng 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus CyMV của mẫu địa lan .25

4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP của virus CyMV 25

4.3 Khuếch đại gen CP bằng kỹ thuật RT – PCR 26

4.4 Tạo dòng gen CP vào vi khuẩn E coli DH5α 27

4.4.1 Chèn đoạn gen CP vào vector nhân dòng và hóa biến nạp plasmid 27

4.4.2 Kiểm tra đoạn gen nhân dòng 27

4.5 Giải trình tự đoạn gen đã được nhân dòng 29

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

CymRSV : Cymbidium ringspot virus

DAS-ELISA : A double antibody sandwich enzyme - linked immunosorbent assay

dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA : Enzyme - linked immunosorbent assay

FCCP : Forward Cymbidium mosaic virus coat protein

NCBI : National Center for Biotechnology Information

ORSV : Odontoglossum ringspot virus

RCCP : Reverse Cymbidium mosaic virus coat protein

RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase chain reactionSMYEaV : Strawberry mild yellow edge - Associated virus

Taq polymerase: Thermus aquaticus polymerase

WClMV : White clover mosaic virus

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thông tin cặp mồi 19

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT–PCR phát hiện virus CyMV 19

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng RT–PCR phát hiện virus CyMV 20

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 22

Bảng 4.1 Thông tin cặp mồi dùng cho khuếch đại gen CP của virus CyMV 26

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng của virus CyMV 3

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV 4

Hình 2.3 Các triệu chứng bệnh trên lá và hoa lan 5

Hình 3.1 Các loại thang dùng trong nghiên cứu .17

Hình 3.2 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR phát hiện virus CyMV .19

Hình 3.3 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP 21

Hình 3.4 Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc 23

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT–PCR phát hiện CyMV trên mẫu lá lan 25

Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT–PCR 26

Hình 4.3 Vector pJet 1.2/blunt 27

Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn DH5α mọc trên môi trường LB 27

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 28

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 28

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid 29

Hình 4.8 Kết quả giải trình tự đoạn gen CP .30

Hình 4.9 Kết quả so sánh trên ngân hàng gen .31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lan được biết đến như một loại hoa có hiệu quả cao về kinh tế bởi vì màu sắc

và hương thơm đặc biệt của nó Hiện nay, trên thế giới có khoảng 900 giống với trên20.000 loài, là họ lớn nhất của lớp một lá mầm (Stewart và Griffiths, 1995) Tuy nhiên,các nhà trồng lan phải đối diện với nhiều tác nhân gây hại ảnh hưởng tới giá trị kinh tế

mà loại cây này đem lại Có nhiều tác nhân khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của cây như: thời tiết, dinh dưỡng, sâu bệnh, vi khuẩn, nấm, virus…Trong

đó, virus là một tác nhân gây hại nghiêm trọng nhất do sự lây lan nhanh chóng, khóphát hiện, và hiện vẫn chưa có biện pháp kiểm soát hiệu quả

Cymbidium mosaic virus (CyMV) là loài virus gây hại nghiêm trọng trên các

loài phong lan và có sự phân bố rất rộng khắp thế giới (Navalinskiene và cs, 2005).Nghiên cứu các biện pháp hiệu quả để kiểm soát virus này đang là vấn đề được quantâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước

Đã có nhiều nghiên cứu về xây dựng quy trình phát hiện virus CyMV cũng nhưphân lập và tạo dòng các gen quan trọng trong bộ gen của virus này trên thế giới Tuynhiên các nghiên cứu ở Việt Nam chỉ mới gói gọn trong vấn đề phát hiện bệnh, chưa

có nhiều nghiên cứu về phân lập và tạo dòng gen nhằm làm nền tảng cho những nghiêncứu tiếp theo trong việc kiểm soát loại virus này

Đề tài “Phân lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ CP) của Cymbidium mosaic virus (CyMV)” được thực hiện nhằm góp phần vào việc kiểm soát hiệu quả bệnh do

virus CyMV gây ra trên lan

1.2 Mục tiêu

Đề tài thực hiện với mục tiêu:

- Phân lập gen CP của CyMV từ mẫu địa lan được cung cấp bởi nhóm sinh học phân tửthực vật của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

- Tạo dòng gen CP của CyMV trong hệ thống tế bào E coli DH5α.

1.3 Yêu cầu

- Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP của CyMV

- Phân lập được gen CP từ mẫu lan nhiễm virus CyMV

- Tạo được dòng tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp chứa trình tự gen CP của

CyMV

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về Cymbidium mosaic virus (CyMV)

Cymbidium mosaic virus (CyMV) (giống Potexvirus, họ Flexiviridae) hay còn gọi là

virus khảm vàng, được mô tả lần đầu tiên bởi Jensen Đây là một trong những loại virusquan trọng và phổ biến nhất gây nhiễm các loại lan trên thế giới Phần tử virus có dạng sợi,không màng bao, dài 480 nm, rộng 13 nm (Navalinskiene và cs, 2005)

Hình 2.1 Hình dạng của virus CyMV (Navalinskiene và cs, 2005).

Bộ gen virus là RNA mạch đơn, sợi dương, có mũ chụp ở đầu 5’ và đuôi polyA ởđầu 3’ Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao và bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA - dependentRNA polymerase – RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB (triple – gene-block – bộ bagen ức chế) và CP (coat protein – protein vỏ) RNA bộ gen có chiều dài 6.227 nucleotidekhông tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’ Tương tự như các virus khác trong nhóm

potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung đọc mở (ORFs 1 - 5) mã hóa cho ba loại protein

khác nhau: RdRp (RNA - deppendent RNA polymerase - trọng lượng phân tử 160 KDa),TBG (triple – gene – block - trọng lượng phân tử 26 KDa/ 13 KDa/ 10 KDa) mã hóa cho

bộ ba protein ức chế giúp virus chống lại đáp ứng tự vệ (các chất tiết) của cơ thể vật chủchống lại nó Và CP (protein vỏ - trọng lượng phân tử 24 KDa) Ngoại trừ khung đọc mở

ORF4, tất cả các khung đọc mở của các protein mã hóa ở giống Potexvirus đều chứa các

motif phổ quát Các protein được mã hóa bởi CyMV có mức độ tương đồng cao với các

protein tương ứng của các thành viên khác trong nhóm potexvirus Trình tự nucleotide

vùng 5’ không mã hóa (noncoding region - NCR) của CyMV và tất cả các thành viên kháccủa nhóm đều khởi đầu bằng GAAAA và CyMV là virus có vùng 5’ NCR ngắn nhất trongtất cả các potexvirus Dựa trên sự so sánh về phát sinh loài của RdRp và protein vỏ chothấy CyMV có mối liên hệ gần với các virus như PAMV, NMV, WClMV và SMYEaV(Wong và cộng sự, 1997)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV (Ajjikuttira và cs, 2003).

 Dấu hiệu bệnh lý trên lan do virus CyMV gây ra

CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm với sự hóa đen và chết của nhữngvùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999) Sự hoại tử lá gây ra bởi CyMV có lẽ

là bệnh virus phổ biến nhất trên nhiều loại lan Cây bị nhiễm virus có các đốm và vệt môchết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên cả 2 mặt của các lá già Các lá có triệuchứng này thường lão hóa nhanh và khô (University of Illinois, 1990) Ở các giống lan

Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác, virus gây ra các đốm hoại tử

đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống trên lá (Marais, 2002) Triệu chứngtrên hoa thường ít biểu hiện nhưng hoa có thể nở với hình dạng kém phát triển Nếu lá chếttrước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ và số lượng hoa ít (University ofIllinois, 1990) Trong trường hợp có triệu chứng, trên hoa có thể xuất hiện các vệt hoại tửtrong một vài ngày khi hoa đang nở Tuy nhiên, các triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu

hiện sau khoảng 2 tuần và đặc biệt dễ dàng nhận thấy trên hoa Cattleya trắng (Marais

2002) Ngoài ra, virus này còn tạo ra mảng màu (thường đậm hay nhạt hơn màu hoa) trên

hoa Cattleya (Moran và Knoxfield, 1999).

Hình 2.3 Các triệu chứng bệnh trên lá và hoa lan a/ Triệu chứng khảm vàng trên lá lan

Hồ Điệp; b/ Sự khảm màu trên hoa lan Hồ Điệp (McMillian và Vendrame, 2005).

Nói chung, virus gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các triệuchứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại virus Cáctriệu chứng nổi bật nhất là vàng lá (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử) cũng như sự cằn cỗicây Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp với nhau hoặc hoàn toàn khôngbiểu hiện do điều kiện nuôi trồng tốt làm giảm sự biểu hiện của triệu chứng Các cây ởtrong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện triệu chứng nghiêm trọng khi bịnhiễm virus (Marais, 2002)

Sự thay đổi của các triệu chứng virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng virus,loài thực vật bị nhiễm và các điều kiện môi trường như cường độ sáng, nhiệt độ, dinh

dưỡng và sự ngộ độc ure (biểu hiện triệu chứng giống với nhiễm Cymbidium mosaic virus trên lá Cymbidium) (Marais, 2002) Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ độc muối, cường độ

sáng cao, côn trùng, bệnh do nấm hay sự rối loạn di truyền có thể gây ra các triệu chứngtương tự như bệnh virus (Flynn, 1996)

2.2 Các phương pháp phát hiện virus trên lan

Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được dùng cho việc phát hiện virus trênlan Tuy nhiên, 2 phương pháp thường được sử dụng phổ biến đó là ELISA và RT-PCR

2.2.1 Phương pháp ELISA

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên

và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi có sự hiện diện của cơchất (thường là nitrophenol phosphate) trong phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành

(b) (a)

một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với khángnguyên đã xảy ra Dựa vào cường độ màu để xác định nồng độ kháng nguyên hay khángthể cần phát hiện Hiện có 2 kỹ thuật ELISA được sử dụng phổ biến là ELISA trực tiếp(Direct double antibody Sandwich-ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) (VũTriệu Mân, 2003).

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến cho việc phát hiện virus trên lan Một

số công trình tiêu biểu của các tác giả trên thế giới liên quan đến ELISA đã được công bốnhư: Hu và cs, 1993; Wong và cs, 1994; Khentry và cs, 2006…

2.2.2 Phương pháp RT-PCR

RT-PCR là một ứng dụng của PCR (polymerase chain reaction) dùng để khuếch đại

các phân tử RNA Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử dụng kỹ

thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) Trước hết, RNA được chuyển thànhcDNA (Complementary Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngược từ Mo -

MLV (Murine leukemia virus) hoặc AMV (Avian myeloblastosis virus) Mồi sử dụng trong

giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau (Antisense primer), có thể làOligonucleotic dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể làcác hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn

trên RNA Sau đó, cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase Sự hiện diện của sản phẩm được nhận biết qua điện di trên gel agarose Người ta cũng có thể sử dụng Tth DNA polymerase cho cả 2 giai đoạn Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại

với hàm lượng thấp, RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phương pháp khác như

Northern blot Ngoài ra, với kỹ thuật in-situ RT-PCR người ta có thể thực hiện việc khuếch

đại các RNA ngay trên mô và tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên, được tiến hànhtrên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyêncho lame (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Đây là phương pháp nhạy nhất cho việc phát hiện RNA (Dharmaraj, 2008) nênthường được dùng để phát hiện các loại virus RNA Phương pháp này cho phép phát hiệnnhanh, chính xác virus với lượng mẫu nhỏ (Seoh và cs, 1998) Nhìn chung phương phápnày khắc phục được những nhược điểm của ELISA và có tính chuyên biệt cao

Ngoài ra, một ứng dụng khác của RT-PCR nhằm cho phép định lượng chính xác sốbản sao (copy) virus có trong mẫu phát hiện là kỹ thuật Real-time RT-PCR Phương phápnày dựa trên nguyên tắc sự bắt cặp và phát sáng của chất phát huỳnh quang (thường làSYBR Green) với DNA mạch đôi được tạo ra trong phản ứng khuếch đại Sự xuất hiện củasản phẩm khuếch đại sẽ được thể hiện thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra Dựa vào tínhiệu này, người ta có thể nhận biết có hay không sự xuất hiện của sản phẩm Việc địnhlượng virus sẽ được thực hiện thông qua một đường chuẩn (được thiết lập dựa trên mốiquan hệ tuyến tính giữa số chu kỳ ngưỡng và độ pha loãng của mẫu có số bản sao viruscho trước theo hệ số bậc 10) Độ đặc hiệu của sản phẩm tạo thành được phân tích qua quátrình melt - curve (gia nhiệt) Quá trình gia nhiệt làm 2 mạch của DNA mạch đôi (sảnphẩm khuếch đại) tách ra Khi DNA tách mạch hoàn toàn, tín hiệu huỳnh quang tương ứngcũng sẽ giảm đến mức tối thiểu (do chất phát huỳnh quang không bắt cặp với DNA mạchđơn) Mỗi đoạn DNA sẽ có một nhiệt độ tách mạch khác nhau mà ở đó tín hiệu huỳnhquang sẽ giảm xuống Điều này cho phép phân biệt giữa các sản phẩm khác nhau được tạo

ra trong phản ứng Real-time (Phạm Hùng Vân, 2009)

Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng RT-PCR và RT-Real-time PCR để phát hiện 2 loạivirus CyMV và ORSV trên lan được công bố ở nhiều nơi trên thế giới như Lim và cs,1993; Ryu và Park, 1995a; Ryu và cs, 1995; Seoh và cs, 1998; Liu và cs, 2009…

2.3 Tổng quan về mồi sử dụng trong phản ứng PCR

2.3.1 Các yêu cầu cần đảm bảo khi thiết kế mồi:

- Tính duy nhất: mỗi mồi chỉ có một trình tự bổ sung duy nhất trên sợi DNAđích và không bắt cặp trên các trình tự DNA khác

- Độ nhạy: cho tín hiệu mạnh, không có cấu trúc bậc hai bên trong có thể bắtcặp với trình tự bổ sung ở trình tự đích

- Độ đặc hiệu: cho tín hiệu cực yếu khi không bổ sung DNA đích, không có sựbắt cặp chéo giữa hai mồi trong cùng một cặp

- Tính đẳng nhiệt của cặp mồi: hoạt động ổn định dưới các điều kiện bắt cặpnhư nhau

- Chiều dài của mồi: chiều dài ảnh hưởng đến tính duy nhất và nhiệt độ nóngchảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó Mồi càng dài thì tính duy nhất, nhiệt độ nóng

chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp càng cao Chiều dài của mồi không thấp hơn 14 bases

để đảm bảo tính duy nhất của mồi thích hợp Chiều dài phù hợp là 18 - 28 bases

- Thành phần base: ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của quá trình bắt cặp, nhiệt độnóng chảy và sự ổn định cấu trúc của mồi Các trình tự ngẫu nhiên sẽ tốt hơn trình tựchứa những vùng giàu (A-T) hoặc (G-C) Tỷ lệ trung bình của G-C là 50 - 60% sẽ chonhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho phản ứng PCR thường

- Trình tự đầu 3’:

 Gốc base liên kết mạnh G hoặc C ở cuối

 Không nên có nhiều hơn 3 gốc G hoặc C ở cuối

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm): là nhiệt độ mà tại đó một nửa sợi DNA là sợi đơn vàmột nửa còn lại là sợi đôi Tmtùy thuộc vào thành phần bases Tỷ lệ G-C cao trong sợiDNA sẽ dẫn tới nhiệt độ nóng chảy cao vì chứa nhiều liên kết hydro Tm phù hợp là 55

- 80oC Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi nên tương tự nhau, cách nhau không quá 5oC

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy:

Tm= [59,9 + 0,41*(%GC) - 600]/chiều dài

Với những mồi <= 20 bases, Tm= 2(A + T) + 4(G + C)

Ngoài ra còn có những phương pháp khác với độ chính xác cao hơn

- Nhiệt độ bắt cặp (Ta): là nhiệt độ mà tại đó mồi bắt cặp với DNA mục tiêu Ta

có thể được tính toán từ Tm

Công thức tính: Ta= Tm-mồi– 4oC

- Để đảm bảo mồi bắt cặp vào DNA mạch khuôn trước khi hai sợi của DNAmạch khuôn hồi tính, cần đảm bảo yêu cầu Tm-sản phẩm –Ta >= 30oC (Trung tâm Côngnghệ Sinh học Tp HCM, 2009)

2.3.2 Các bước thiết kế mồi:

- Tìm các trình tự muốn khuếch đại trên ngân hàng gen

- So sánh nhóm các trình tự muốn khuếch đại

- Tìm vùng bảo tồn nhất ở đầu 5’ và 3’

- Thiết kế mồi xuôi ở vùng 5’ bảo tồn.

- Thiết kế mồi ngược ở vùng 3’ bảo tồn

- Chọn cặp mồi xuôi và ngược tương thích nhất

- Đảm bảo tính duy nhất trong tất cả các trình tự DNA khuôn

- Đảm bảo tính duy nhất trong các nguồn chất gây nhiễm tiềm năng (Trungtâm Công nghệ Sinh học Tp HCM, 2009)

2.4 Sơ lược về phương pháp PCR và kỹ thuật tạo dòng gen

2.4.1 Phương pháp PCR

Kỹ thuật khuếch đại DNA đặc hiệu, còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹthuật PCR (polymerase chain reaction) được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa nhữngnăm 80 và đã mang lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử (Lê ĐìnhLương, 2001)

Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA DNApolymerase dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổsung với nó Các sợi DNA khuôn mạch đơn này có thể được tạo ra theo cách đơn giản

là đun nóng dung dịch DNA mạch kép tới gần nhiệt độ sôi

DNA polymerase cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn DNA mạch kép (đoạnmồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cầncung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ 6 – 30 nucleotide), đoạn này gắn kếtvới DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của kỹthuật PCR vì DNA polymerase được điều khiển để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù

Cả hai sợi DNA đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu cácđoạn mồi oligonucleotide được cung cấp cho cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạnmồi được chọn để chặng hai đầu của đoạn DNA được nhân lên, sao cho các đoạn DNAtổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi còn lại Nhưvậy, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lýthuyết, ta sẽ có 2nbản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi Đó làđặc điểm quan trọng thứ hai trong kỹ thuật PCR (Lê Đình Lương, 2001)

 Các bước tiến hành phản ứng PCR

PCR là kỹ thuật phòng thí nghiệm tương đối dễ làm, vật liệu khởi đầu cho PCR

là DNA có chứa đoạn cần nhân lên, hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổnghợp DNA, DNA polymerase, dNTP, và một số thành phần cần thiết khác

Bước đầu tiên của quá trình là làm nóng hỗn hợp phản ứng đến khoảng 94oC.Tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép tách nhau ra hoàn toàn tạo nên các sợiđơn để dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNA polymerase Sau đó nhiệt độ được

hạ xuống khoảng 30 – 65oC để các đoạn mồi gắn với các trình tự tương ứng trên cácphân tử DNA làm khuôn

Tiếp theo nhiệt độ được nâng lên 72oC, nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA

polymerase bền nhiệt hoạt động Nhiệt độ được duy trì ở 72oC trong khoảng 5 phút đểDNA được tổng hợp

Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94oC, nhưng lầnnày chỉ trong vòng 20 giây để cho các mẫu ngắn của DNA mạch kép tách nhau ra, Cácsợi đơn này trở thành khuôn cho một chu kỳ tổng hợp DNA khác Như vậy, một chu

kỳ gồm: đun nóng để tách các sợi DNA kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết cácđoạn mồi vào sợi khuôn và tổng hợp DNA bằng DNA polymerase, được lặp lại từ 30 –

60 lần (Lê Đình Lương, 2001)

2.4.2 Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen

Kỹ thuật tạo dòng là kỹ thuật chuyển một đoạn gen được nhân lên thành dònggồm vô số bản sao giống nhau Đoạn gen tạo dòng được gọi là đoạn DNA mục tiêuđược chèn vào vector khi đó vector này trở thành vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợpnày sẽ được chuyển vào tế bào chủ và tồn tại trong tế bào chủ với lượng xác định Khi

tế bào chủ phân chia, vector tái tổ hợp sẽ phân chia và tiếp tục nhân lên theo quá trìnhphân chia của tế bào chủ Các khuẩn lạc sau khi sàng lọc trên môi trường có kháng

sinh sẽ được đánh giá là các dòng mong muốn (Brown, 1997).

 Những bước căn bản trong việc tạo dòng gen

Một đoạn DNA (gen cần tạo dòng) được chèn vào DNA mạch vòng (gọi làvector) để tạo thể khảm hoặc phân tử DNA tái tổ hợp

Vector này hoạt động như một phương tiện vận chuyển gen vào tế bào chủ(thường là vi khuẩn).

Trong tế bào chủ, những vector này tự sao chép để có số lượng lớn các bản saochứa DNA của vector và gen nó mang

Khi tế bào chủ phân chia, những bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp cũng đượcphân chia cho các thế hệ tế bào sau và quá trình tạo bản sao sẽ tiếp tục diễn ra

Khi có một lượng lớn tế bào phân chia, một khuẩn lạc hay gọi là một dòng vôtính của những tế bào giống y hệt nhau được tạo thành Mỗi tế bào trong dòng vô tínhchứa một hoặc nhiều bản sao chép của phân tử DNA tái tổ hợp Điều này có nghĩa làgen chứa trong phân tử DNA tái tổ hợp cũng được tạo dòng (Brown, 1997)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nuớc

2.5.1.Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

2.5.1.1 Các nghiên cứu về phát hiện virus

Năm 1993, Lim và cs đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện virus CyMV, với

cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào vùng tương đồng của CyMV và potexviruses Kết

quả đã khuếch đại được 1 đoạn 313 bp và 1 đoạn 227 bp ít đặc hiệu hơn sau 30 chu kỳ Sảnphẩm khuếch đại dễ dàng nhìn thấy trên gel agarose khi nhuộm với ethidium bromide

Cùng năm, Hu và cs (1993) sử dụng ELISA phát hiện virus trên 44 giống lan ởHawaii Kết quả cho thấy có 61% mẫu nhiễm CyMV, 25% mẫu nhiễm ORSV và 20% mẫunhiễm cùng lúc 2 loại CyMV và ORSV

Năm 1994, Wong và cs đã khảo sát tình hình nhiễm virus CyMV trên các giống lantrồng ở Singapore Kết quả có 54,6% cây từ 12 loài ở 4 vườn lan thương mại bị nhiễmCyMV, 34,5% cậy từ 29 loài ở vườn ươm lan của Botanic Gardens nhiễm CyMV, 50,5%cây từ 13 giống lan nuôi cấy trong phòng thí nghiệm ở Botanic Gardens bị nhiễm CyMV

Ryu và cs (1995) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện CyMV với ngưỡng pháthiện thấp nhất đạt được ở nồng độ 10 fg RNA virus Trong cùng năm, Ryu và Park (a)(1995), tiếp tục sử dụng RT-PCR phát hiện ORSV với ngưỡng phát hiện đạt được ở mứctương tự như trường hợp CyMV (10 fg RNA)

Năm 1997, Tanaka và cs sử dụng hệ thống RIPA (rapid immunofilter paper assay),một dạng giấy thử phát hiện nhanh được thiết lập dựa trên phản ứng ELISA, để phát hiệnvirus trên các giống lan trồng ở Thái Lan Kết quả cho thấy có 17 giống nhiễm CyMV và 4giống nhiễm ORSV trong tổng số 24 giống được kiểm tra Kết quả nghiên cứu này cũngcho thấy CyMV là virus phổ biến hơn ORSV Năm 1998, Hu và cs sử dụng các mẫu dò(probe) cDNA đánh dấu DIG (được tổng hợp từ cDNA virus) để phát hiện CyMV vàORSV Kết quả có thể phát hiện virus ở mức 50 pg và 250 pg RNA tinh sạch, tương ứngcho 2 loại virus CyMV và ORSV.

Cùng năm, Seoh và cs (1998) đã sử dụng RT-PCR phát hiện đồng thời 2 loại virusCyMV và ORSV nhưng chỉ sử dụng duy nhất 1 cặp mồi Đây là thành công đầu tiên vềviệc sử dụng 1 cặp mồi chung để phát hiện đồng thời hai 2 virus thuộc 2 nhóm phân loạikhác nhau

Năm 2006, Khentry và cộng sự đã dung phuơng pháp ELISA để kiểm tra virus lan ởThái Lan Kết quả có 65,4% số cây bị nhiễm virus CyMV trong 280 cây được kiểm tra,18,6% và 8,7% cây nhiễm virus CyMV từ 29 mẫu cấy mô lan cắt cành và 19 mẫu cấy mô

lan trồng chậu (Dendrobium) Không có sự nhiễm CyMV trong 21 giống nuôi cấy in-vitro của Dendrobium địa phương ở Thái Lan Những số liệu này cho thấy CyMV là loài virus phổ biến ở giống Dendrobium nhưng không có trong cây nuôi cấy in-vitro ở Thái Lan.

Năm 2007, Lee và cs đã tạo ra được huyết thanh chứa kháng thể chống lại CP củaCyMV từ protein vỏ tái tổ hợp của chính nó, và được ứng dụng để kiểm tra việc nhiễmCyMV trên lan

Năm 2009, Liu và cs sử dụng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng CyMV vàORSV Kết quả cho thấy phương pháp này có thể xác định được hàm lượng virus có trongmẫu và ngưỡng phát hiện tối thiểu đạt được ở mức 2 bản sao/l mẫu RNA virus

2.5.1.2 Các nghiên cứu về phân lập, tạo dòng gen trên CyMV

Năm 1977, J.A.Frowd và J.H Tremaine đã phân lập được Cymbidium mosaic virus (CyMV) từ Cattleya sp tại Columbia (Anh).

Năm 1992, Chia và cs đã nghiên cứu về cấu trúc gen của virus CyMV Kết quả chothấy: CyMV là virus RNA sợi dương, có khung đọc mở mã hóa cho protein vỏ (CP) đượctìm thấy ở đầu tận cùng 3’ Khung đọc này mã hoá chuỗi polypeptide dài khoảng 220

amino acid với trọng lượng phân tử là 23.600 Da Trình tự này được so sánh với trình tự

gen CP của potato virus X (PVX) và white clover mosaic (WClMV) cho thấy sự tương

đồng cao ở vùng giữa của trình tự CP

Năm 1996, Srifah P và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trong tạo dòng gen

mã hóa protein vỏ của virus CyMV Kết quả cho thấy, gen CP dài 669 nucleotide, mã hoá

protein vỏ có trọng lượng phân tử là 23.761 Da Trình tự gen CP của CyMV trên Mokara

có độ tuơng đồng tới 97% với trình tự gen CP của CyMV trên Cattleya và Oncidium, nhưng độ tương đồng chỉ có 88% so với CyMV trên lan Oncidium phân lập ở Singapore.

Năm 1997, Wong và cs đã hoàn thành việc giải trình tự bộ gen của CyMV và đã xácđịnh chiều dài bộ gen là 6.227 nucleotides không tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’

Tương tự như các virus khác trong nhóm potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung đọc mở

(ORFs 1 - 5) mã hóa cho ba loại protein khác nhau: RdRp (RNA - deppendent RNApolymerase - trọng lượng phân tử 160 KDa), TBG (triple – gene – block - trọng lượng phân

tử 26 KDa/ 13 KDa/ 10 KDa) mã hóa cho bộ ba protein ức chế giúp virus chống lại đápứng tự vệ (các chất tiết) của cơ thể vật chủ chống lại nó, và CP (protein vỏ - trọng lượngphân tử 24 KDa)

Năm 2002, Ajjikuttira P và cs đã so sánh các trình tự CP của CyMV nhiễm trên lanđược thu nhận ở nhiều nơi trên thế giới như: Hàn Quốc, Singapore, Đài Loan Kết quả chothấy có sự tương đồng từ 89,1 - 99,7% ở mức độ nucleotide và 93,2 – 100% ở mức độamino acid

Năm 2005, Chang và cs đã phân lập đuợc một dòng CyMV ở Đài Loan từ

Cymbidium sinesis Willd bị nhiễm bệnh Đoạn cDNA của gen CP được tổng hợp và giải

trình tự và so sánh với các dòng CyMV khác cho thấy sự tương đồng là 92 - 98% ở mức độnucleotide và 98 - 99% ở mức độ amino acid

Năm 2007, Sherpa và cs, giải trình tự bộ gen của một dòng CyMV ở Ấn Độ và so

sánh với các potexviruses khác Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự amino acid của

RdRp, triple gene block protein, CP của CyMV cho thấy virus này có quan hệ với

Narcissus mosaic virus NMV), Scallion virus X (SVX), Pepino mosaic virus (PMV), Patato aucuba mosaic virus (PAMV)

2.5.2 Tình hình trong nước

Năm 1999, Lê Thị Ánh Hồng và cs sử dụng phương pháp DAS-ELISA nghiên cứutình hình nhiễm CyMV và ORSV trên các vùng trồng lan ở Việt Nam và mối liên hệ giữatriệu chứng biểu hiện và khả năng nhiễm virus Kết quả cho thấy tất cả các giống lan đượckiểm tra đều nhiễm 2 loại virus CyMV và ORSV Tỷ lệ bệnh đặc biệt khá cao tại các vùng

có tiềm năng sản xuất hoa lan như thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt Trong các triệu chứngđược kiểm tra, triệu chứng cây sinh trưởng kém, khó ra hoa cho tỷ lệ nhiễm virus cao nhất.Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành cải tiến độ nhạy cho phản ứng ELISA bằngviệc gắn thêm hệ thống Avidine - Biotine, kết quả đã làm tăng độ nhạy của phản ứng lên từ

5 - 75 lần tùy theo từng trường hợp cụ thể

Năm 2006, Đỗ Thanh Lâm đã điều tra về bệnh do virus Cymbidium mosaic virus gây

ra trên địa lan tại thành phố Đà Lạt 50 vườn lan được chọn ngẫu nhiên để điều tra kỹ thuật

trồng và chăm sóc Các giống lan Cymbidium được điều tra gồm: xanh thơm, tím hột, xanh

chiểu, vàng ba râu Kết quả điều tra cho thấy bệnh do virus CyMV có ở trên tất cả cácgiống lan đang được trồng tại thành phố Đà Lạt và huyện Lạc Dương Số lượng cây con từ

3 - 12 tháng tuổi trong 50 vườn điều tra là 77.000 cây (chiếm 70%) Số cây con nhiễm virus

là khá cao, cây có độ tuổi từ 3 - 6 tháng nhiễm 21,5%, tỷ lệ nhiễm ở cây 6 - 12 tháng là19,26% Trong đó các giống địa lan bị nhiễm nặng nhất là xanh thơm 29%, tím hột 24%,những giống còn lại có tỉ lệ nhiễm thấp hơn

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Quỳnh và cs sử dụng Real-time RT-PCR để phát hiệnvirus trên lan Kết quả của nhóm này cho thấy các mẫu lan trưởng thành trồng tại các vườnsản xuất có tỉ lệ nhiễm cao với 2 loại virus CyMV (100%) và ORSV (43%); và toàn bộ cácmẫu lan cấy mô (100%) đều nhiễm với 2 loại virus CyMV và ORSV trong nghiên cứu này.Tuy nhiên, mặc dù sử dụng Real-time RT-PCR nhưng kết quả nghiên cứu của nhóm nàychỉ dừng lại ở mức định tính, chưa xây dựng được quy trình định lượng virus; ngoài ranhóm tác giả còn sử dụng CTAB, một phương pháp ly trích phức tạp nhưng không phù hợpcho ly trích RNA, để ly trích RNA virus Có thể nói đây là một trong những hạn chế củanghiên cứu này

Năm 2009, trong một đề tài nghiên cứu cấp Trung tâm tại Trung tâm Công nghệSinh học thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Xuân Dũng và cs đã sử dụng RT-PCR và Real-time RT-PCR để phát hiện virus trên lan Một trong những điểm nổi trội của nghiên cứu

này là sử dụng phương pháp ly trích virus sucrose đơn giản cùng với quy trình RT-PCRmột bước đã giảm đáng kể về thời gian và chi phí Kết quả nghiên cứu của nhóm cho thấy

cả 3 giống lan được kiểm tra (Dendrobium, Mokara và Cymbidium) đều bị nhiễm virus với một tỉ lệ nhất định Dendrobium là giống có tỉ lệ nhiễm virus cao nhất trong 3 giống Virus

CyMV gây nhiễm trên cả 3 giống, trong khi virus ORSV chỉ nhiễm trên 2 giống

Cymbidium và Mokara Trường hợp cá biệt, trên 2 giống Cymbidium và Mokara, cả 2 loại

virus cùng nhiễm trên một cây Kết quả cũng cho thấy CyMV là virus gây hại phổ biến hơnORSV Nhóm cũng đã xây dựng thành công quy trình phát hiện định lượng 2 loại virus nàyvới ngưỡng phát hiện tối thiều từ 1 - 10 bản sao/l mẫu RNA của virus Kết quả phát hiệnđịnh lượng bằng Real-time RT-PCR cho thấy số lượng virus khoảng từ 101– 104bản sao/μl

cho Mokara, và từ 104– 106bản sao/μl cho Cymbidium.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

- Đề tài được thực hiện từ ngày 01/12/2010 - 15/07/2011 tại Phòng Công nghệSinh học Thực vật - Trung Tâm Công nghệ Sinh học - Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu địa lan (Cymbidium) dùng kiểm tra CyMV đuợc cung cấp bởi nhóm Sinh

học phân tử cây trồng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật - Trung Tâm Công nghệSinh học - Tp Hồ Chí Minh

3.3 Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm

3.3.1 Hóa chất

- Hoá chất dùng trong pha môi trường LB: Yeast extract, agar, trypton, muối NaCl,nước cất vô trùng

- Hoá chất dùng trong tạo dòng: Glycerol, CaCl21M, BSA, enzyme BamHI (Biolab),

ampicillin, enzyme EcoRI (Biolab), T4 DNA ligase (Biolab), E coli DH5α, plasmid

Jet1.2/blunt

+ Mồi ngược: 5’ - AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG - 3’

- Bộ kít DNA - SpinTMPlasmid DNA Purification Kit (Intron)

- Bộ kít CloneJETTMPCR Cloning Kit (Fermentas)

- Và các hoá chất cần thiết khác

- Thang DNA (Fermentas)

- Thang DNA 100 bp: Gene Ruler 100 bp DNA ladder

- Thang DNA 1 kb: Gene Ruler 1kb DNA ladder

- Thang DNA 1 kb plus: Gene Ruler 1kb plus DNA ladder

Hình 3.1 Các loại thang dùng trong nghiên cứu.(a): thang DNA 100 bp; (b): thang

DNA 1kb; (c): thang DNA 1 kb plus.

3.3.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ và thiết bị dùng trong kiểm tra virus CyMV và tạo dòng gen CP của CyMV:máy PCR Gradient (Takara), máy gel doc (Biorad), bộ điện di DNA Power Pac 200(Biorad), tủ đông sâu - 80oC, eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml,…

- Dụng cụ dùng trong tạo dòng gen CP của virus CyMV: máy ly tâm lạnh (Eppendorf),máy ủ (Dri - block DB - 2D), máy ly tâm lạnh (Eppendorf) 13200 max, máy đo quangphổ, tủ ủ 37oC, tủ ủ lắc, tủ lạnh - 20oC, bể điều nhiệt, tủ mát 4oC, cân phân tích, cuvette

2 ml; 0,2 ml,… Và các dụng cụ chuyên dùng khác