Thực nghiệm về cây Hedyotis Dichotoma keon

Thực nghiệm về cây Hedyotis Dichotoma keon

Chương 4 THỰC NGHIỆM

4.1 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

4.1.1 Hóa chất

• Dung môi dùng trong sắc kí cột, sắc kí điều chế và bản mỏng gồm: eter dầu hỏa (60 – 90 oC), cloroform, etyl acetat, aceton, metanol, etanol là hóa chất Trung Quốc (Xilong), Việt Nam (Chemsol) và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại

• Thuốc thử để hiện hình các chất trên sắc kí bản mỏng: dung dịch H2SO4 50%, dung dịch FeCl3/EtOH, đèn UV

• Silica gel 60G F254 loại dùng cho sắc kí lớp mỏng, Merck

Silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), Merck

Sắc kí lớp mỏng, sắc kí điều chế 25DC - Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254 Merck

4.1.2 Thiết bị

• Lọ thủy tinh, becher, cột sắc kí, phễu xốp thủy tinh, fiol, hệ thống máy hút chân không

• Máy cô quay chân không Buchi-111, RE 111 Rotavapor và bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

• Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy: khối Maquenne và máy Polytherma-Wagner and munz (Phòng Thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược)

• Thiết bị đo năng lực triền quang: triền quang kế KRUSS-Germany, Phòng Thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

• Các thiết bị ghi phổ:

Phổ MS: ghi trên máy 5989B Serie II và máy AGILENT 1100 LC-MSD trap spectrometer

Phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT- NMR 90 và 135, HSQC, HMBC, COSY: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 Tất cả phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa Học Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

4.1.3 Điều chế các loại cao

Cây An điền lưỡng phân được thu hái ở tỉnh Bình Phước, rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu được bột cây khô 1,64 kg Bột cây được cho vào bình thủy tinh, ngâm với etanol 95o Sau một ngày dung môi trích được rót ra, lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi, bột cây còn lại được rót dung môi mới vào Tiếp tục quá trình trích thu được cao etanol

Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol Sau khi cô quay thu hồi dung môi, thu được các loại cao eter dầu hỏa, cloroform A, cloroform B, etyl acetat A, etyl acetat B, etyl acetat C, metanol

4.1.4 Cô lập một số hợp chất hữu cơ

Tiến hành sắc kí cột cổ điển, sắc kí điều chế các loại cao trên thu được các hợp chất Dichoto-Clo1 (từ cao cloroform A), Dichoto-Clo2, Dichoto-Clo3 (từ cloroform B), Dichoto-Ace1 (từ cao etyl acetat A), Dichoto-Ace2 (từ cao etyl acetat B), Dichoto-Ace3, Dichoto-Ace4 (từ cao etyl acetat C), Dichoto-Me1 (từ cao metanol) Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng, thuốc thử hiện hình dung dịch H2SO4 50%, dung dịch FeCl3/EtOH, đèn UV

4.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

4.2.1 Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp

Thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên

• Dụng cụ và hóa chất

- Trứng Brine Shrimp

- DMSO, nước biển

- Becher 500 ml dùng để ấp trứng, becher 250 ml dùng để chứa ấu trùng

- Pipet pasteur để bắt ấu trùng

- Pipetteman sử dụng cone 10 – 100 μl, 100 – 1000 μl

- Đèn pin

- Giá đỡ và ống nghiệm có dung tích lớn hơn 5 ml

• Cách thử

Thử nghiệm trên các loại cao điều chế được, mỗi loại được thử nghiệm với nhiều nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thử ba lần Mỗi ống nghiệm thử chứa 10 ấu

thể Artemia salina

Từ dung dịch mẫu cái 20 (mg/ml) hút lấy 500, 250, 125, 75, 50, 25 μl cho vào các ống thử (sau này mỗi ống có thể tích dung dịch tổng cộng là 5 ml tương ứng với nồng độ 1000, 500, 250, 150, 100, 50 μg/ml

Dùng pipet pasteur hút 10 ấu trùng cho vào mỗi ống thử

Thêm dung dịch nước biển cho đủ 5ml/ống

Khay được che sơ lại và ủ ở nhiệt độ phòng

Sau 24 giờ, đếm số lượng ấu trùng chết, suy ra tỷ lệ ấu trùng chết do dung dịch thử nghiệm ở mỗi nồng độ

• Kết quả

Kết quả được trình bày ở liều LC50 là liều mà cao trích pha ở nồng độ xác định

có thể giết chết ấu trùng Brine Shrimp trong vòng 24 giờ

4.2.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Chuyển hóa Sinh học, Khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên

• Chuẩn bị

Mẫu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: cao eter dầu hỏa, cloroform, etil acetat, metanol Tẩm mẫu lên đĩa giấy vô khuẩn, để thu được các đĩa giấy có nồng

độ nhất định, để khô ở nhiệt độ phòng

Chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus spp (gram dương) và Escherichia coli (gram âm) Các chủng vi khuẩn được giữ trong

môi trường BHI +5% glycerol, giữ trong những ống eppendort, ở nhiệt độ -26oC; được cấy chuyền 2 tháng một lần

Môi trường kháng sinh đồ: sử dụng môi trường Mueller Hinton Agar ( MHA) của hãng Biolife, và môi trường canh thang cao thịt – peptone

Các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng trong 30 phút trong nồi hấp autoclave ở 121 oC và sấy khô an toàn Các hộp petri vô trùng, bằng thủy tinh, có đường kính 90 mm Que thuỷ tinh vô trùng để trải vi khuẩn

• Cách tiến hành

Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: từ các ống eppendorf giữ chủng vi khuẩn được cấy chuyền ra trên mặt thạch dinh dưỡng (nutrient agar) Các hộp thạch đã có vi khuẩn được ủ qua đêm ở 37 oC Sau khi thấy trên mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản mọc thành từng cụm) chọn 3 - 5 khuẩn lạc riêng lẻ , giống nhau, cho vào ống nghiệm có 5 ml nước muối sinh lý, để làm thành một dung dịch huyền phù vi khuẩn, sao cho đạt độ đục 0.5McF (tương đương với 108 CFU/ml) Mỗi chủng vi khuẩn chuẩn bị trong những ống nghiệm riêng

Chuẩn bị hộp thạch thử nghiệm: cân 38g môi trường MHA cho vào 1 lít nước cất, đun cách thuỷ đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 121 oC trong 30 phút Sau khi để nguội đến 50 oC , bắt đầu phân phối ra các đĩa petri vô trùng Mỗi đĩa petri có 22 ml thạch với độ dày lớp thạch là 4 mm Các hộp thạch này được ủ qua đêm ở 37 oC để kiểm tra sự vô trùng Loại bỏ các hộp thạch bị nhiễm

Dùng que thuỷ tinh vô trùng nhúng vào dung dịch huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên, rồi trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm lên mặt thạch của môi trường MHA

Làm kháng sinh đồ: sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch Mỗi khoanh giấy tẩm loại dung dịch thử nghiệm khác nhau (mỗi khoanh giấy được tẩm 20 μl dung dịch chất thử nghiệm); để bay hơi hết dung môi Dùng kẹp vô khuẩn để kẹp khoanh giấy có tẩm dung dịch thử nghiệm, đặt lên mặt thạch thử nghiệm Một đĩa thạch có thể đặt 5 khoanh giấy

Thực hiện với mẫu trắng là đĩa giấy chứa dung môi (loại đã dùng để trích cao) Lật ngược lớp vỏ thạch và ủ ở 37oC để vi khuẩn phát triển Chất thử nghiệm ở khoanh giấy sẽ khuyếch tán ra môi trường thạch Sau 18 - 24 giờ, đọc kết quả

Mỗi chủng vi khuẩn thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình

• Kết quả

Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm) Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giấy đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu