PHẦN THỰC NGHIỆM VỀ CÂY TRINH NỮ

PHẦN THỰC NGHIỆM VỀ CÂY TRINH NỮ

PHAN THUC NGHIEM

-Lugn dn thae uj khoa hoe héa hoe

Thiết bị và dụng cụ :

* Soxhlet loai 1 lit, 2 lit, 10 lit

* May cé quay RE 111 Rotavapor, bếp đun cách thủy Buchi 461 Water Bath

* Binh Fiol à vide, phéu loc xốp lớn, bình lóng 1 lít

Trước khi tiến hành khảo sát sự hiện điện các cấu tử hữu cơ, cô lập, xác định một số hợp chất có trong cây Trinh nữ Mừnosa puđica L., chúng tôi thực

hiện các bước sau đây:

+ Xử lý dung môi: chưng cất, làm khan dung môi bằng Na;SO¿

+ Trích mẫu cây để định tính: Tận trích bột cây (lá, thân, rễ) mỗi lần 200g với các dung môi khác nhau (eter dầu hỏa 60-90°C, benzen, cloroform, etanol,

nước) trong soxhlet, đuổi dung môi, thu được các loại cao tương ứng

+ Điều chế cao eter dầu hỏa và cao acetat etyl để sắc ký cột (được trình bày

chỉ tiết trong phần sau)

+ Chuẩn bị cột sắc ký : Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột khô nhanh để cô lập các hợp chất hữu cơ trong cây

Cột dùng là phễu lọc xốp được gắn vào hệ thống hút chân không Cho từ

từ silica gel (60 H loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck) vào cột, nén nhẹ phần

silica gel trên cột sao cho thật đều (có sự trợ giúp của máy hút chân không ) đến

khi đạt đến mức yêu cầu cần thiết, đặt miếng bông gòn lên trên, bão hòa cột bằng eter hỏa

+ Thuốc thử : Ngoài các thuốc thử đặc trưng dùng để định tính, chúng tôi sử dụng H;ạSO¿ đ, acid phosphomolibdic 10% trong etanol, hơi iod trong suốt quá trình nghiên cứu

Dhiin thie nghigm

Luan an thạc dỹ Kitoa học hóa học

I, BINH TINH MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ CÓ TRONG LÁ, THÂN, RỄ CỦA CÂY TRINH NỮ

1.1 Dinh tinh sterol va triterpen

Hòa tan 0,2 g mau cao vao 30 ml dung méi cloroform, cho vao ống nghiệm thử với các thuốc thử sau:

* Thuốc thử Liebermann-Burchard: Anhydrid acetic (20 ml), H;SOxđđ (1m])

Nếu thấy xuất hiện màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ là phần ứng dương tính

* Thuốc thử Salkowski: H;ạSOx đđ

Nếu thấy xuất hiện màu đồ là phản ứng dương tính

1.2 Định tính alcaloid

* Thuốc thử Bouchardat: lạ (2,5 ø), KI g), nước cất (10 m])

Cho kết tủa nâu với dịch chứa alcaloid

* Thuốc thir Mayer: HgCl, (6,8 g), KI (2,5 g), nuéc cat (500 ml)

Cho kết tủa màu vàng nâu với dịch chứa alcaloid

* Thuốc thử Bertrand: Acid silicotungstic (5 ø), nước cất (100 ml)

Cho kết tủa màu trắng đục với dịch chứa alcaloid

* Thuốc thử Hager: Dung dịch acid picric bão hòa trong nước

Cho kết tủa màu vàng với dịch chứa alcaloid

* Thuốc thử Dragendorff:

Dung dịch A: Bi(NO¿) (0,85 g), CHạCOOH (10 mÌ), nước cất (40 m])

Dung dich B: KI (5g), nước cất (40 ml )

Khi sử dụng trộn đều dung dich A với dung dịch B Kết quả đương tính khi cho trầm hiện màu vàng cam

1.3 Định tính glycosid

Glycosid được xác định bằng phản ứng có màu

a, Dựa trên phần ng đặc trưng của phần đường:

* Phân ứng Tollens: (do có mặt các đường khử trong glycosid )

Phin the nghigm

kun dn thạo cỡ thoa hoe hda hee

Cho dich thử vào ống nghiệm, nhỏ 5 giọt pirydin, thém vao 4 giọt thuốc thử

Tollens mdi pha (0,5 ml dd AgNO; 10% + 0,5 ml dd NH,OH 10%), sau đó cho

từng giọt dung dịch NHỤOH đến khi tan tủa, nếu có bạc khổ là phản ứng dương

tinh

* Phần ting Keller-Kiliani (phan ứng đặc trưng của đường 2-đeoxy)

Cho vào ống nghiệm lượng mẫu như trên, nhỏ hỗn hợp mới pha gồm 1ml

FeSO, va 99 mi acid acetic băng, sau đó thêm 1-2 giọt H;ạSO,đ Nếu có màu xanh xuất hiện trong vòng 1-2 phút là phan ứng dương tính

b, Dựa trên phản ứng màu của phần không đường:

* Phần ứng Balet:

Cho mẫu thử vào ống nghiệm, nhỏ 3-4 giọt hỗn bợp (dd acid picric 1% trong alcol 20% + dd NaOH 10% với thể tích như nhau) vào, nếu thấy mầu vàng cam

hoặc hồng sẩm là phản ứng dương tính

* Phản ứng Molish: Thimöol xanh 2%, 1-2 giọt HạSỐx¿ ãä

Nếu thấy xuất hiện mầu đồ là phản ứng đương tính ,

1.4 Dinh tinh tanin

Dun s6i 1g cao trong 20 ml nuéc cất khoảng 10 phút, lọc, lấy dịch lọc thử với các thuốc thử sau:

* Thuốc thử Stiasny: Dung dich formol 36% (20 ml), HCldd (10 mb)

* Dung dich gelatin man: Gelatin (2 g), dung dich NaCi bao hoa (100 g)

* Dung dich FeCl1%

1.5, Định tính favon

Elavon được xác định bởi phần ứng Shibata còn gọi là phần ứng Cianidin

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1-2 ml dung dịch mẫu thi

- Ống 1: Làm đối chứng

(TMuâu thực nghiện

Ludn dn thae sg khoa hoe hia hee

- Ống 2: Thêm 0,5 ml HCl dd và 1-2 hạt Mg, để yên đến hết sủi bọt, thêm từ từ

alcol iso-amy] theo thành ống nghiệm, đun nhẹ, một vòng màu hồng xuất hiện rồi chuyển sang màu đỏ tím, chứng tổ có flavon

1.6 Dinh tinh saponin

Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của saponin, chúng tôi căn cứ vào tính

tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin |

_ Dược điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: chỉ số tạo bọt là độ pha

loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao 1 cm, sau khi lắc ống nghiệm tiến hành trong điều kiện quy định

* Thưc nghiêm :

Dun séi lg bột nguyên liệu trong 100 ml nước cất khoảng 30 phút Lọc,

để nguội, thêm nước cất vào cho đủ trổ lại 100 ml

Lấy 10 ống nghiệm có chiểu cao 16 cm đường kính 16 mm, cho vào ống

nghiệm lần lượt 1, 2, 3, , 10 ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ

10 m1 Bịt miệng ống nghiệm, lắc theo chiều dọc của ống nghiệm trong 15 giây, mỗi giây lắc hai lần Để yên 15 phút, đo chiều cao các cột bọt .Nếu cột bọt trong tất cả các ống dưới lcm, chỉ số bọt dưới 100, tức là không có saponin

Ví dụ: Nếu ống thứ 4 có cột bọt cao 1 cm thì chỉ số tạo bọt được tính như sau :

10* 1

Chi s6 bot = —————_ * 100

0,01* 4 Nếu ống số 1 và ống số 2 có cột bọt cao 1 cm thì cần pha loãng để có chỉ

số chính xác Nếu cột bọt trong tất cả ống nghiệm đều lớn hơn 1 cm, trường hợp này cần pha loãng và làm lai thí nghiệm

Trong phần thí nghiệm trên các bộ phận cây trinh nữ đều có cột bọt nhỏ hơn 1 cm Vậy toàn cây không có saponin

Phan thige aghigm

Luan an thae yj khoa hoe héa hoe

Il TRICH LY CO LẬP MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ CÓ TRONG CÂY

TRINH NỮ

1I.1 Điều chế cao eter dầu hóa và cao acetat etyl

II.1.1 Điều chế cao eter dầu hôa phân không xà phòng hóa

Lá tươi phơi héo ở nhiệt độ phòng, sấy ở 80°C đến khô Tận trích 1 kg lá

khô với 10 lit eter dầu hỏa (60-90°C) Cô cạn dung môi ở áp suất thấp, đặt lên

bếp cách thủy, làm khô cao trong bình hút ẩm chân không thu được 48 g cao eter

dầu hòa

Triển khai sắc ký lớp mỏng trên cao eter dâu hỏa với hệ cloroform; metanol 9,5: 0.5; phun thuốc hiện hình H;SO¿ đđ; sấy bảng ở 150°C Các vết không rõ, có đường kéo dài từ điểm xuất phát đến vạch tiền tuyến dung môi,

chứng tỏ trong cao chứa rất nhiều chất béo, nhầy nhựa

Cho hỗn hợp gồm 36,5 g KOH rắn và 250 ml EtOH 95% vào 48 g cao eter dầu hỏa trong bình cầu Đun hoàn lưu trên bếp cách thủy trong 3 giờ, để nguội,

thêm 250 ml nước cất vào hỗn hợp Trích hỗn hợp với eter etyl trong bình lóng, rửa dịch eter etyl bằng nước cất đến pH = 7, làm khan bằng Na;SOa Lọc, đuổi

dung môi, đặt vào bình hút ẩm đến trọng lượng không đổi, thu được 10 g

1.1.2 Điều chế cao cao acetat eÐl

Bột lá khô (2 kg) trích nguội với alcol etyl 95° ở nhiệt độ phòng Cô cạn dung môi ở áp suất thấp, tiếp tục đuổi dung môi trên bếp cách thủy, để nguội,

đặt trong bình hút ẩm chân không Trộn cao với alumin, sấy trong tủ sấy chân không, tán mịn, cho vào Soxhlet Tận trích bằng eter dầu hỏa (60-90°C), thu hồi

dung môi Tiếp tục trích bã bằng acetat etyl, cô cạn dung môi đến khi cao có trọng lượng không đổi (12 8)

Triển khai sắc ký lớp mỏng cao acetat etyl với hệ dung ly acetat etyl: metanol 9,5: 0,5; thuốc hiện hình H;SO,đđ; say bang 6 150°C

hugn dn thee 1G khoa hoe hia hee

H.2 Cô lập các hợp chất hữu cơ từ cao eter đầu hỏa phần không xà phòng hoa

Hoà tan 10 g cao eter ddu hóa phần không xà phòng hóa vào một lượng

vừa đủ dung môi cloroform, cho vào đó lượng sHica gel cổ hạt lớn thích hợp, trộn đều, sấy khô, tán nhuyễn, nạp lên đầu cột đã được bão hòa bằng eter dau hod Giải ly cột bắt đầu từ eter dầu hỏa, sau đó tăng dẫn độ phân cực Mỗi lọ hứng 50

mi, những lọ có sắc ký lớp móng giống nhau gom thành một phân đoạn Toàn

bộ quá trình sắc ký cột trên cao cter đầu hóa theo đõi bằng thuốc thử H;ạSO,đđ

va acid phosphomolibdic 10% trong EtOH, thu được 9 phan doan Trong đó chúng tôi chọn phân đoạn 2, 3 để khảo sát; các phân đoạn khác tạm để lại chưa

khảo sát

1.2.1, Cé lập hợp chất TÌ

Căn phân đoạn 2 (bảng 6) dạng tỉnh thể lẫn ít dầu Sắc ký lớp mông cho

nhiều vết, trong đó có một vết đậm Rửa cặn nhiều lần bằng n-hexan lạnh, thu

được tỉnh thể màu trắng đục, đánh bột than, kết tỉnh lại trong metanol cho tính thể bột không màu đặi tên TI (trong lugng 0,34 g) Sắc ký lơó mồng của T1 cho

một vết R; = 0,34; hệ dung ly benzen : cloroform 1:1; thuốc hiện hình H,SO,dd; sấy bang & 150°C

I1.2.2 Cô lập hợp chất T2 và T3

Cặn phân đoạn 3 (bảng 6) ở dạng đầu lẫn tính thể Sắc ký lớp mồng cho hai vết chính gần nhau Tiến hành sắc ký điều chế phân đoạn này với hệ dung ly

eloroform : metanol 9,9:0,1 Kết quả chúng tôi thu được hai hợp chất, đặt tên T2 và T13

- Hợp chất T2 ở dang đầu sánh, màu vàng (trọng lượng 0,3 8) Sắc ký lớp mỏng T2 cho một vết có R;= 0,62; hệ dung ly benzen : acetat etyl 8:2; thuốc hiện hình

HạSO,đở; sấy bảng 150C

- Hợp chất T3 đạng tính thể hình kim, đánh bột than tỉnh thể này trong dung môi

> s2 $1

Dhiée thye aghigm

Ludn an thae sỹ khoa học khóa học

cloroform, sau đó kết tinh nhiều lần trong metanol, thu được tinh thể không màu (trọng lượng 0,35 g) Sắc ký lớp mỏng T3 cho một vết có R;= 0,37 với điều kiện

tiến hành như trên

II.3 Cô lập một số cấu tử hữu cơ có trong cao acetat etyl

Trộn cao acetat etyl với alumin, sấy, tán mịn, nạp lên đầu cột đã bão hòa bằng eter dẫu hỏa Giải ly cột bắt đầu từ eter dầu hỏa sau đó tăng dần độ phân cực Mỗi lọ hứng 50 ml, những lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau gom thành một

phân đoạn Tòan bộ quá trình sắc ký cột trên cao acetat etyl thu được 9 phân đoạn Chọn phân đoạn 1, 7, § khảo sát; các phân đoạn khác tạm để lại chưa

khảo sát

11.3.1 Cé lap hop chất T4

Sắc ký lớp mỏng phân đoạn 1 (bang 7), dung môi giải ly benzen, thuốc hiện hình HạSO¿ đđ, sấy bảng ở 150°C Kết quả cho nhiều vết, trong đó có 1 vết

màu vàng tự nhiên Chúng tôi tiến hành sắc ký điều chế 2 lần, thu được tinh thể

bột màu vàng bị mất màu ngoài ánh sáng đặt tên T4 Sắc ký lớp mỏng của sản phẩm T4 cho 1 vết có R¿= 0,45 ở điều kiện tiến hành như trên

II.3.2 Cô lập hợp chất T5

Sắc ký cột lần 2 đối với phân đoạn 7 bảng 7, trong phân đoạn benzen thu được cặn dạng dầu Sắc ký lớp mỏng cho thấy còn vệt dơ dưới vết chính Chúng tôi tiến hành sắc ký điều chế (bản silica gel tự tráng), dung môi giải ly cloroform

thu được chất đầu vàng nhạt, tỉnh chế có sử dụng bột than, thu được chất tỉnh

khiết đặt tên T5 (MIMO-ACE-BENZEN) Sắc ký lớp mỏng trên sản phẩm TS

cho 1 vết có R¿= 0,5 trong dung môi cloroform, thuốc hiện hình H;ạSO,đđ, sấy

bang ở 150C

II.3.3 Cô lập hợp chất T6

Tiếp tục sắc ký cột trên phân đoạn 7 (bang 7) Trong phân đoạn CHCI;:

AcOEt S4c ký lớp móng cho thấy có một vết chính đậm, dung môi giải ly

Phin thie nghigm

Lugnan thạc tý khoa học hóa hoe

cloroform : metanol 9:1, thuéc hién hinh H,SO,dd, sấy bảng ở 150°C Dich thu được có màu xanh, thu hổi dung môi, thu được cặn màu xanh có lẫn tỉnh thể Rửa cặn nhiều lần bằng aceton được tỉnh thể bột không màu đặt tên Tố (trọng lượng 0,04 g) Sắc ký lớp mỏng trên T6 cho một vết với Rf= 0,4; hệ dung ly

aCetat etyl : metanol 8:2; thuốc hiện hình H;ạSO„đđ; sấy bảng ở 150%C

* Thủy giải hợp chất T6 2;

Hoà tan 5 mg hợp chất T6 vào hệ dung môi cloroform : metanol, cho vào

d6 5 ml dung dich HCl 15% Dun hoàn lưu hỗn hợp trong 5 giờ, đuổi dung môi,

thêm lml nước vào phần còn lại Trích với acetat etyl, trung hòa lớp nước bằng Na;CO;, lọc Lấy dịch lọc chấm sắc ký lớp mỏng, so sánh với đường D-

galactose va D-glucose, hé dung ly n-BuOH : ¡-Pr : AcOEt : AcOH: HạO 1,7 : 3:

5 :1,7 : 1,5; thuốc hiện hình 2,4- dinitro phenylhyhrazin, HạSOuđđ; sấy bang ở

150°C

11.3.4 Cé lap hợp chất T7

Cặn phân đoạn 8 bảng 7 được hòa tan trong hệ cloroform : metanol 1:1, cho qua cột dài chứa silica gel (hiệu Florisil, 60-100 Mesh, Jassen Chimica) nhằm loại bớt một số chất nhây nhựa Thu hồi dung môi, thu được cặn, hòa cặn vào dung môi cloroform, nhỏ từ từ metanol vào đến khi có tủa xuất hiện Ly tâm

lấy tủa, rửa nhiều lần bing cloroform réi metanol thu được tính thể màu vàng

lục, đặt tên T7 (trọng lượng 0,08 g) Tình thể này không tan trong dung môi hữu

cơ thông thường, tan trong DMSO, baz loãng hoặc acid loãng

Dhan thie nghigm