Nghiên cứu cây Hedyotis Dichotoma keon

Nghiên cứu cây Hedyotis Dichotoma keon

Chương 2

NGHIÊN CỨU

VÀ KẾT QUẢ

2.1 THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU

Cây An điền lưỡng phân được thu hái ở tỉnh Bình Phước Cây đã được nhận

danh tên khoa học là Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth bởi PGS TS Trần Hợp,

Khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Cây được lưu trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu số US-C020, giữ tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

15 kg cây tươi An điền lưỡng phân được rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu được bột cây khô 1,64 kg

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây khô được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc, cô quay, thu hồi dung môi, thu được cao etanol thô 100,92 g Cao etanol thô được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat và metanol Quy trình điều chế và thu suất các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 và bảng 2.1 Các cao được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng được trình bày trong hình 2.1

Bảng 2.1: Khối lượng và thu suất các loại cao thu được từ cao etanol ban đầu

Eter dầu hỏa E 3,21 3,18

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao từ cây An điền lưỡng phân bằng phương

pháp trích pha rắn trên silica gel

Ngâm trích với etanol Lọc, cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng cloroform

Cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng eter dầu hỏa

Cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng metanol

Cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng etyl acetat

Cô quay thu hồi dung môi

Cao cloroform A (3,91 g)

Cao cloroform B (5,49 g)

Cao etyl acetat A (5,98 g) Cao etyl acetat B (112 mg) Cao etyl acetat C (8,96 g)

(a) (b)

Hình 2.1: Sắc kí lớp mỏng các loại cao điều chế theo sơ đồ 2.1

CA: cao cloroform A

CB: cao cloroform B BM: cao metanol

AA: cao etyl acetat A

AB: cao etyl acetat B (Hợp chất Dichoto-Ace1)

AC: cao etyl acetat C

Hệ dung môi giải ly: (a) cloroform : metanol (8:2)

(b) cloroform : metanol : nước (14:6:1) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50%

2.3 TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY AN ĐIỀN LƯỠNG PHÂN

2.3.1 Sắc kí cột silica gel trên cao cloroform A của sơ đồ 2.1

Cao cloroform A (3,91 g) được sắc kí cột silica gel, giải ly bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ benzen đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ (mỗi lọ 100 ml), cô quay Chấm sắc kí lớp mỏng, các lọ có sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao cloroform A của sơ đồ 2.1

Phân

Khối lượng (mg)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

Có một vết tròn đen, khảo sát thu được Dichoto-Clo1

2 B:C (99:1), B:C (98:2) 409,5 Nhiều vết Không khảo sát

3 B:C (95:5), B:C (90:10),

B:C (80:20), B:C (50:50) 616,7 Nhiều vết Không khảo sát

4 C, C:M (90:10),

Ghi chú: B: benzen C: cloroform M: metanol

Cao ở phân đoạn 1 của bảng 2.2 có dạng sáp màu vàng xanh, sắc kí lớp mỏng

có một vết tròn màu đen nên được chọn khảo sát Tiến hành sắc kí điều chế nhiều lần, kết tinh lại trong cloroform thu được chất rắn màu trắng, dạng bột Hợp chất này được ký hiệu là Dichoto-Clo1 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2

2.3.2 Sắc kí cột silica gel trên cao cloroform B của sơ đồ 2.1

Cao cloroform B (5,49 g) được nạp vào đầu cột sắc kí, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ benzen, cloroform đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.3

(a) (b)

Hình 2.2: Sắc kí lớp mỏng của các hợp chất

Dichoto-Clo1, Dichoto-Clo2, Dichoto-Clo3

Ghi chú: CA: cao cloroform A

C1: Hợp chất Dichoto-Clo1

C2: Hợp chất Dichoto-Clo2 C3: Hợp chất Dichoto-Clo3 (a) Hệ dung môi giải ly: cloroform : etyl acetat (8:2) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50%

(b) Hệ dung môi giải ly: etyl acetat Thuốc thử hiện hình: dung dịch FeCl3/EtOH

2.3.2.1 Khảo sát phân đoạn 2 của bảng 2.3

Phân đoạn 2 của bảng 2.3 được sắc kí cột nhiều lần, sắc kí điều chế và kết tinh lại trong cloroform thu được tinh thể hình kim, màu vàng Hợp chất này được ký

hiệu là Dichoto-Clo2 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2

Bảng 2.3: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao cloroform B của sơ đồ 2.1

Phân

Khối lượng (mg)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

3 C, C:M (99:1),

Có một vết chính Khảo sát thu được Dichoto-Clo3

4 C:M (90:10), C:M (80:20),

Ghi chú: B: benzen C: cloroform M: metanol

2.3.2.2 Khảo sát phân đoạn 3 của bảng 2.3

Khi cô quay thu hồi dung môi các lọ thuộc phân đoạn 3 của bảng 2.3, thấy xuất hiện kết tủa màu trắng hơi lẫn màu xanh, khối lượng 200,3 mg Rửa tủa nhiều lần bằng cloroform, sau đó sắc kí cột thu được tinh thể hình kim, màu trắng Hợp chất này được ký hiệu là Dichoto-Clo3 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2

2.3.3 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat A của sơ đồ 2.1

Cao etyl acetat A (5,98 g) được nạp vào đầu cột sắc kí, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cloroform, etyl acetat đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.4

Bảng 2.4: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat A của sơ đồ 2.1

Phân

Khối lượng (mg)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

2 C:A (99:1), C:A (98:2),

3 C:A (90:10), C:A (80:20) 490,6 Nhiều vết Không khảo sát

4 C:A (50:50) 1331,1 Có một vết màu hồng Khảo sát thu được Dichoto-Ace1

5

A, A:M (98:2),

A:M (95:5), A:M (90:10)

A:M (80:20), M

1918,0 Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: A: etyl acetat C: cloroform M: metanol

Phân đoạn 4 khi sắc kí lớp mỏng cho vết màu hồng rõ ràng nên được chọn khảo sát tiếp Tiến hành sắc kí cột nhiều lần phân đoạn 4, sau đó sắc kí điều chế thu được chất rắn màu trắng dạng bột, ký hiệu là Dichoto-Ace1 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3

2.3.4 Khảo sát cao etyl acetat B của sơ đồ 2.1

Cao etyl acetat (112 mg) thu được từ sơ đồ 2.1 là chất bột khô màu trắng Sắc

kí lớp mỏng, hiện hình với thuốc thử H2SO4 50%, cao cho thấy có một vết tròn, màu hồng nhưng vết còn hơi bẩn

Tiến hành sắc kí điều chế, giải ly bằng metanol, thu được chất rắn màu trắng (20 mg), hợp chất này được đặt tên là Dichoto-Ace2 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3

(a) (b) (c)

Hình 2.3: Sắc kí lớp mỏng hợp chất Dichoto-Ace1,

Dichoto-Ace2, Dichoto-Ace3, Dichoto-Ace4, Dichoto-Me1

A2: Hợp chất Dichoto-Ace2 A3: Hợp chất Dichoto-Ace3

A4: Hợp chất Dichoto-Ace4 T: Tủa bảng 2.6

M1: Hợp chất Dichoto-Me1

Hệ dung môi giải ly: (a) cloroform : metanol (8:2)

(b) cloroform : metanol : nước (80:18:2) (c) cloroform : metanol : nước (14:6:1) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50%

2.3.5 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat C của sơ đồ 2.1

Cao etyl acetat C (8,96 g) của sơ đồ 2.1 được sắc kí cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cloroform, etyl acetat đến

metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.5

Bảng 2.5: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat C của sơ đồ 2.1

Phân

Khối lượng (mg)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

1 C, C:M (99:1),

C:M (98:2), C:M (95:5) 130,0 Nhiều vết Không khảo sát

2 C:M (90:10), C:M (80:20) 189,7 Nhiều vết Không khảo sát

Ghi chú: C: cloroform M: metanol

2.3.5.1 Khảo sát phân đoạn 4 của bảng 2.5

Sắc kí cột nhiều lần phân đoạn 4 của bảng 2.5 thu được kết tủa màu vàng Sắc

kí lớp mỏng kết tủa này, với dung môi giải ly (cloroform:metanol:nước) (80:18:2), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, thấy một vết màu đen nhưng còn hơi dơ Do

đó, kết tủa này được sắc kí cột silica gel pha đảo, giải ly bằng dung môi có độ phân cực giảm dần từ hỗn hợp metanol: nước (1:3) đến metanol, thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Ace3 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3

2.3.5.2 Khảo sát phân đoạn 5 của bảng 2.5

Cô quay phân đoạn 5 của bảng 2.5 thấy xuất hiện kết tủa màu trắng Rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này, giải ly bằng metanol thu

được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Ace4 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3

2.3.6 Sắc kí cột silica gel trên cao metanol của sơ đồ 2.1

Tiến hành sắc kí cột silica gel trên cao metanol (50,83 g) của sơ đồ 2.1, giải ly lần lượt bằng các hỗn hợp dung môi (cloroform: metanol: nước) có độ phân cực tăng dần lần lượt theo tỉ lệ (80:18:2), (70:27:3), (14:6:1), (6:4:1) Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 200 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.6

Phân đoạn 4 của bảng 2.6 xuất hiện kết tủa màu trắng Lọc tủa ra khỏi dịch trích, rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này Sắc kí lớp mỏng pha đảo trên tủa này thấy có nhiều vết, trong đó có một vết tròn màu hồng rõ

Vì vậy, tiến hành sắc kí cột pha đảo trên tủa này, giải ly bằng dung môi có độ phân cực giảm dần từ hỗn hợp metanol: nước (1:3) đến metanol, thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Me1

Bảng 2.6: Kết quả sắc cột silicagel trên cao metanol của sơ đồ 2.1

Phân

Khối lượng (g)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

Ghi chú: C: cloroform M: metanol H: nước

2.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo1

Hợp chất Dichoto-Clo1 thu được từ cao cloroform A có các đặc điểm sau:

• Chất bột màu trắng

• Nhiệt độ nóng chảy: 138 oC (kết tinh trong cloroform)

• Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi cloroform : etyl acetat (8:2), thuốc thử hiện hình là dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản cho một vết màu đen với giá trị Rf = 0,41 (hình 2.2)

• Phổ MS (phụ lục 1.1): phổ đồ cho mũi ion phân tử với m/z = 412 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C29H48O (M = 412)

• Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 1.2) và so sánh với tài liệu tham khảo [26], (δ ppm): 5,16 (1H, dd, J = 15,0 Hz, J = 8,5 Hz, H22); 5,16 (1H, brs, H7);

Biện luận cấu trúc

• Phổ 1H-NMR: hợp chất có 3 proton vinyl H7, H22 và H23 Trong đó H22 và

H23 ở ghép trans với nhau với hằng số ghép J trans = 15,0 Hz

• Phổ 13C-NMR và DEPT có bốn mũi cộng hưởng với độ dịch chuyển hóa học lần lượt là (δ ppm): 139,6 (>C=); 138,2 (=CH-); 129,5 (=CH-); 117,5 (=CH-) Vậy hợp chất Dichoto-Clo1 chứa hai nối đôi trong phân tử

H và

H

H

Bảng 2.7: So sánh phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo1 với hợp chất

(22E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol)

• So sánh các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo1 với hợp

chất (22E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol) [26] trình bày trong bảng 2.7 thấy có sự tương đồng

Do vậy, Dichoto-Clo1 được đề nghị là 22(E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol)

HO

H

1 2 3

4

5

6 7 8 9 10

11 12

13

16 17 18

27

28 29

(22E)-5α-Stigmasta-7,22-dien-3β-ol

(Dichoto-Clo1)

2.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo2

Hợp chất Dichoto-Clo2 thu được từ cao cloroform B có các đặc điểm sau:

• Tinh thể hình kim màu vàng

• Nhiệt độ nóng chảy: 148 oC (kết tinh trong cloroform)

• Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng dung môi etyl acetat, thuốc thử hiện hình là dung dịch FeCl3/EtOH, sấy bản cho một vết màu xanh với giá trị Rf = 0,55 (hình 2.2)

• Phổ MS (phụ lục 2.1): phổ đồ cho mũi ion phân tử với m/z = 168 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C8H8O4 (M = 168)

• Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 2.2), (δ ppm): 5,85 (2H, s, H3 và H6); 3,82 (2x3H, s, 2 nhóm -OCH3)

• Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3, 2.4), (δ ppm): 186,9 (>C=O, C1 và C4); 157,4 (=C-O-, C2 và C5); 107,4 (=CH-, C3 và C6); 56,5 (2 nhóm -OCH3)

Bảng 2.8: Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo2

2,5-Dimetoxybenzoquinon Ngoài ra, ở vùng từ trường cao của phổ NMR xuất hiện những tín hiệu của tạp chất, và từ các số liệu dưới đây chúng tôi đề nghị tạp chất đó là octacosan

• MS: tín hiệu tại m/z = 394 tương ứng với khối lượng phân tử của C28H58, octacosan

• 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), (δ ppm): 1,6 – 0,8: proton của nhóm -CH2-, -CH3

của alcan

• 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), (δ ppm): 14,1 (-CH3, C1, C28); 10 – 35 (các carbon CH2)

2.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo3

Hợp chất Dichoto-Clo3 thu được từ cao cloroform B có các đặc điểm sau:

• Tinh thể hình kim màu trắng

• Nhiệt độ nóng chảy: 210 oC (kết tinh trong cloroform : metanol 1:1)

• Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng dung môi etyl acetat, thuốc thử hiện hình là dung dịch FeCl3/EtOH, sấy bản cho một vết màu xanh đậm với giá trị Rf = 0,49 (hình 2.2)

• Phổ MS (phụ lục 3.1): phổ đồ cho thấy mũi ion phân tử với m/z = 168 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C8H8O4 (M = 168)

Biện luận cấu trúc

• Phổ 1H-NMR có 3 tín hiệu của proton vòng thơm 7,60 (1H, dd, J = 8,5 Hz, J = 1,5 Hz, H6); 7,57 (1H, d, J = 1,5 Hz, H2); 6,87 (1H, d, J =8,5 Hz, H5) Từ giá trị hằng số ghép J = 1,5 Hz = J meta , J = 8,5 Hz = J orto suy ra: proton H6 ghép orto với H5 và ghép meta với H2 Vì vậy, chúng tôi đề nghị Dichoto-Clo3 là dẫn xuất của

benzen mang 3 nhóm thế

H

1 2 3 4 5 6

• Phổ 13C-NMR có tín hiệu tại 169,7 ppm là carbon carboxyl của acid carboxylic hoặc ester; tín hiệu tại 151,5 và 147,7 ppm là carbon olefin mang oxygen

Ngoài ra, phổ HMBC cho tương quan giữa proton –OCH3 và carbon 147,7 ppm nên nhóm metoxy gắn vào carbon này Như vậy, nhóm –OH gắn vào carbon

151,5 ppm, tín hiệu tại 169,7 ppm là của –COOH và còn một carbon olefin tứ cấp

122,6 ppm sẽ mang nhóm -COOH Vậy Dichoto-Clo3 là dẫn xuất của benzen mang

3 nhóm thế -COOH, -OCH3 và –OH

• Phổ 1H-NMR cho thấy proton H2 và H6 có độ dịch chuyển hóa học cao hơn

proton H5 nên nhóm –COOH ở vị trí orto so với H2 và H6 Kết hợp với phổ

HMBC, proton H6 và H2 cùng cho tương quan với carbon 169,7 ppm (-COOH),

carbon 151,5 ppm nên suy ra carbon 122,6 ppm (mang nhóm –COOH) là C1 và carbon 151,5 ppm là C4 Vậy carbon 147,7 ppm là C3

6

5

4 3 2

1

H

COOH H

OH H

6

5 4 3 2

1

H

COOH H

OH H

6

5 4 3 2

1

H

COOH H

OH H

Hình 2.4: Các tương quan HMBC của Dichoto-Clo3

• Từ các dữ liệu trên, hợp chất Dichoto-Clo3 được đề nghị là acid metoxybenzoic Các tương quan khác của phổ HMBC cũng thỏa cấu trúc này

4-hydroxy-3-Vậy hợp chất Dichoto-Clo3 được đề nghị là acid 4-hydroxy-3-metoxybenzoic

COOH

OH

1 2

3 4 5 6

Acid 4-hydroxy-3-metoxybenzoic

2.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Ace1 và Dichoto-Ace2

Hợp chất Dichoto-Ace1 cô lập từ cao etyl acetat A và hợp chất Dichoto-Ace2

cô lập từ cao etyl acetat B có các đặc điểm được trình bày ở bảng 2.10

Bảng 2.10: So sánh dữ liệu phổ của hợp chất Dichoto-Ace1 và Dichoto-Ace2