Thực nghiệm Nghiên cứu tách chiết cô lập Amyrin và Brassicaterol từ cây ké đầu ngựa

Thực nghiệm Nghiên cứu tách chiết cô lập Amyrin và Brassicaterol từ cây ké đầu ngựa

PHAN THUC NGHIEM

y6 nghiên cứu trên cây Ké Đầu Ngựa được thực hiện với nguyên

liệu, hóa chất, thiết bị, phương pháp cụ thể như sau:

3.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng trong

nghién citu:

3.1.1 Nguyên liệu:

Nguyên liệu dàng để nghiên cứu là cây Ké Đầu Ngựa thu bái tại

xã Mỹ Đức, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang vào tháng 2, tháng 6 năm

1998 và tháng 2 năm 1999,

Sau khi thu hái mẫu cây, nhặt lấy phần lá Rửa sạch lá khỏi đất cát; phơi lá dưới ánh nắng mặt trời và sấy ở nhiệt đệ 40-50°C cho đến khi trọng lượng của lá không đổi Nghiễn lá khô thành bột

Đã thu hái 30 kí cầy tươi để có 14,2 kí lá tươi Lá tươi sau khi xữ lý cho 1,8 kí bội lá cây khô dùng cho nghiên cứu,

3.1.2 Hóa chất:

Dung môi để trích ly triterpen và sterol:

se Eter dầu hóa: chưng cất phần đoạn eter dẫu hỏa Lấy phần đoạn sói

từ 60-90°C,

® Aceton: chưng cất phân đoạn, lấy phan doan si 6 56°C

® Eter etil: chung cAt phan doan, lay phan doan sdi 6 34,5°C

Hóa chất dùng trong sắc ký cột và sắc ký trên bản móng:

®_ Erer dầu hảa: chưng cất phân đoạn eter dầu hỏa, lấy phân đoạn sôi 6

60-90°C Lam khan dung môi với kim loại Na

® Benzen chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn sôi ở 80°C Lam khan dụng môi với kim loại Na

#8 Erer etil: chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn sôi ở 34,5°C, Làm khan dụng môi vơi CaC]; khan Lọc Tiếp tục lầm khan với kim loại Na

Chloroform: Ac chloroform với nước 3 lần để loại alcol thường có

trong chloroform Chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn sôi ở 61°C, sau

đó làm khan dung môi với CaCl, khan

Metanol: chưng cất phân đoạn, lấy phần đoạn sôi ở 64°C

Alumin: rửa alumin với dung dich HC] 5%, sau đó với nước cất cho đến

khi nước rửa có pH = 7 Rữa tiếp với etanol 95%, Sấy khô ở 150°C cho

đến khi trọng lượng không đổi Trước khi sử dụng, sấy alumin 2 giờ ở

200°C để làm tăng hoạt tinh

Thuốc th làm hiện vết trên bản mỏng: hòa tan 10g acid

phosphomolibdic trong 100ml EtOH 95%

3.1.3 Thiét bi:

Máy cô quay RE 111-ROTAVAPOR kém bếp đun cách thủy BUCHI

461 WATER BATH

Bép dun c4ch thiy LW-8 WATER BATH

Soxhlet cdc loai: 1 lit, 2 lit, 10 lit

Thiết bị để đo điểm nóng chảy: khối MAQUENNE và máy MODEL

WRS-1, digital melting point apparatus

Thiết bị lấy phổ hồng ngoại IR: máy quang phổ hồng ngoại IR-470

SHIMADZU

Thiết bị lấy phổ 'H-NMR: máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER-

AC 200, tần số cộng hưởng 50 MHz

Thiết bị lấy phổ '“C-NMR và phổ DEPT: máy cộng hưởng từ hạt nhân

BRUCKER-AC 200, tần số cộng hưởng 200 MHz

3.2 Dinh tính một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân,

rề của cây Ké Đầu Ngựa

3.2.1 Điều chế cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao

chloroform và cao metanol của các bộ phận lá, thân, rễ

Nguyên liệu khô (lá, thân, rễ) được tận trích với các loại dung mồikhác nhau: eter dầu hỏa, benzen, chloroform và metanol trong dụng

cụ Soxhlet Lọc Cô cạn dung mồi trong máy cô quay Ở 40°C Đuổi dung

môi trên bếp cách thủy Cho phần cặn vào bình hút ẩm chân không, thu

được các loại cao: eter dầu hỏa, benzen, chloroform và metanol của các

bộ phận lá, thân, rễ

Định tính các cấu tử hữu cơ trong các loại cao trên

3.2.2 Định tính sterol và triterpen

Hòa tan 0,1 g cao trong 30ml CHC]; Lọc; lấy dịch lọc để trắc nghiệm với các thuốc thử Liebermann-Burchard, Salkowski và Noller

% Thuốc thủ Liebermann-Burchard:

Anhidric acetic 20ml

H,SO, dam dac 1ml

s* Thuốc th Salkowski:

H;SO¿ đậm đặc

s* Thuốc thử Noller:

Clorur tionil Iml

3.2.3 Định tính flavon:

Nấu sôi 0,1 ø cao trong 100m1 nước cất trong 10 phút Để nguội; lọc Lấy dịch lọc thử với thuốc thử Shibata

s* Thuốc thứ Shibata:

HCl dam diac

Bột Mg kim loại

Acol isoamil

5 ml

7 hat

5 giot

3.2.4 Dinh tinh alcaloid:

Ngâm 0,1 gø nguyên liệu trong dung dịch HạSO¿ 3%, đun nhẹ ở 80°C trong 6 giờ Lọc; lấy dịch lọc để thử với các thuốc thử: Bouchardat, Mayer, Hager, Bertrand, Dragendorff

I,

KI

Nước cất

Thuốc thử Mayer:

HẹgCl; khô

KI

Nước cất

Thuốc thử Bertrand:

Thuốc thủ Bouchardat:

Acid silicotungstic

Nước cất

Dung dich A:

Dung dich B:

Thuốc thử Dragendorƒƒ:

Bi(NO3)2

CH:COOH

Nước cất

KI

2,5 2

Sỹ

10ml

6,8 g

2,5 2 500ml

5g

100ml

0,858 10ml

40ml

Nước cất 20ml Khi dùng ,trộn đều dung dịch A với dung dịch B

** Thuốc thử Hager:

Dung dich acid Picric bao héa trong nước

3.2.5 Dinh tinh tanin:

Nấu sôi 3g cao trong 100ml nước cất trong 10 phút Lọc; thực hiện các phản ứng trên dịch lọc với các thuốc thử Stiasny, dung dich gelatin man, dung dich acetat chi béo hoa, dung dich FeCl; 1%

“ Thudc tht Stiasny

Dung dịch formol 36% 20m]

“* Dung dich gelatin man:

Dung dich NaCl bao hoa 100g

3.2.6 Dinh tinh glicosid:

Tận trích 5g cao với 20ml EtOH 20% trong 24 giờ Lọc; chế hóa dich lọc với 20ml dung dịch acetat chi 20% Loc; lấy dịch lọc chế hóa với 10ml dung dịch Na;SO¿ bảo hòa Lọc Cô can dịch lọc dưới áp suất thấp

ở 40°C, thu được cặn Hòa tan cặn này trong EtOH 95% Lọc Lấy dịch

lọc thử với các thuốc thử Baljet va Molish

s%* Thuốc thuử Baljet:

Dung dich acid picric 1%

Dung dịch NaOH 5%,

** Thuốc thử Molish:

Dung dịch thimol xanh 2%,

H;SO, đậm đặc: 1-2 giọt,

3.2.7 Định tính saponin:

Đun sôi lg bột nguyên liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc; để nguội và thêm nước cất vào cho đúng 100ml

Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính lómm Cho vào

các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3 10ml nước sắc Thềm nước cất vào

mỗi ống cho đử 10ml Lắc các ống nghiệm theo chiều dọc trong 15 giây

Để yên 15 phút Đo chiều cao các cột bot,

3.3 Chiết xuất triterpen từ lá cây Ké Đầu Ngựa:

Việc chiết xuất triterpen từ lá cây Ké Đầu Ngựa được thực hiện

qua các g1a1 đoan sau đây:

3.3.1 Ly trích lá cây véi eter dầu hỏa:

Tận trích 600g bột lá khô với 6 lít eter dầu hỏa (60-90°C) trong dung cu Soxhlet Lọc dịch trích eter dầu hỏa; cổ cạn dung mồi ở 40°C trong máy cô quay; đuổi dung môi trên bếp cách thủy Làm khô phần cao trong bình hút ẩm chân không cho đến khi trọng lượng không đổi, thu được 18,3g cao eter dầu hỏa

3.3.2 Điều chế phần không xà phòng hóa của cao eter

dầu hỏa:

Hòa tan 18,3g cao eter dầu hóa trong dung dịch gồm 16,7g KOH và

85ml EtOH 95% Đun hoàn lưu hỗn hợp trên bếp cách thủy trong 2 giờ

Để nguội; thêm 110ml nước cất vào hỗn hợp Tận trích phần không xà

phòng hóa với 4 lít eter etil Rữa dịch trích eter eUl nhiều lần với 5 lít nước cất Làm khan dung môi với Na;SO¿, Lọc; cô cạn dịch trích eter etil, Cho phần cặn không xà phòng hóa vào bình hút ẩm chân không cho đến

khi trọng lượng không đổi, thu được 8,lg cặn

3.3.3 Cô lập triferpen từ phần không xà phòng hóa:

a) Sdc ký trên cột alumin:

Hòa tan 8,lg cặn không xà phòng hóa trong eter dầu hỏa Thực hiện phép sắc ký trên cột 3x35cm, vdi chat h&p phuAl,O; (Merck) trung

tính đã được hoạt hóa Dung môi giải ly được sữ dụng là eter dầu

hỏa(1900 ml), eter dầu hỏa-C¿H, 9:1(2600 ml) eter dầu hỏa - C¿Hạ 3:1 (8100 ml), ) eter dầu hỏa ~- C¿Hạ.1:1 (2500 ml), ) eter dầu hỏa — C¿Hạ 1:3 (4300 ml), và benzen (2600 ml) Mỗi phân đoạn dung môi giải ly được hứng từng phân đoạn 100ml và được cô cạn

Cả 3 phân đoạn eter dầu hỏa - CạHạ tỉ lệ 3:1cho phản ứng dương

tính với các thuốc thử: Liebermann - Burchard, Salkowski va Noller

b) Sốc ký trên bản mỏng silicagel :

Sắc ký trên bản móng được thực hiện trền bản mỏng silicagel 60 F¿s¿ với dung môi giải ly là chloroform-acetat etil tỉ lệ 3:1, thuốc hiện hình là dung dịch acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%

3.3.4 Điều chế dán xudt acetat cua triterpen

Hòa tan 100g triterpen 7 trong 2ml piridin Thêm từ từ 2ml anhidric acetic vào hỗn hợp ĐÐun hoàn lưu hỗn hợp trong 2 gid Để nguội Thềm

nước cất vào hỗn hợp cho đến khi trầm hiện hoàn toàn Làm lanh, Lọc; kết tỉnh trầm hiện trong MeOH thu được 74g tỉnh thể trắng

3.4 Chiết xuất sterol từ lá cây Ké Đầu Ngựa:

3.4.1 Ly trích lá cây với aceton, kế tiếp với eter etil:

Loại chất béo trong lá khô cây Ké Đầu Ngựa (1,2 kí) bằng eter dâu

hỏa 60-90°C Phơi khô bã lá, thu được 1,15 kí bã Tận trích bã với 12 lít

aceton ở nhiệt độ phòng với lắc thường xuyên Lọc; cô cạn dung môi ở 40°C trong máy cô quay, thu được 30,5g cao aceton Trích phần cao aceton với 5 lít eter etil, chia làm nhiều lần Làm khan dung môi với Na;SO¿ Lọc; cô cạn dung môi, cho phân cặn vào bình hút ẩm chân không đến trọng lượng không đổi, thu được 19,2g cao eter etil

3.4.2 Cé lép sterol tw cao eter etil:

a) Sếc kí cột alumin:

Hòa tan 19,2g cao etll trong hỗn hợp eter etil và chloroform Thực hiện sắc ký trên cột 3,5x60cm với 450g chất hấp phuAl,O3 (Merck) trung tính đã được hoạt hóa Dung môi giải ly được sử dụng là : benzen

(7200 ml), C¿H-eter etil 9:l (5200 ml), CeHe -eter etil 3:1(2000ml), CeHe- eter etil 1:1 (1000ml), eter etil (600ml), eter etil — chloroform 9:1 (1000ml), eter etil — chloroform 3:1 (1000ml), eter etil - chloroform 1:1 (1000m!), chloroform (1000ml) Mỗi phân đoạn dung môi giải ly được hứng từng phân đoạn 100ml và được cô cạn

Phân đoạn dung môi CạHạ — €t€r eul tỉ lệ 9:1 cho phản ứng dương tính với 2 thuốc thử: Liebermann - Burchard và Salkwoski, âm tính với thuốc thử Noller

PHAN THUC NGHIEM Trang

b) Sdc ky trén ban méng silicagel:

Sắc ký trên bản mỏng được thực hiện với bẩn móng silicagel

60F¿s¿ với dung môi giải ly là chloroform, thuốc hiện hình là dung dịch acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%

3.4.3 Điều chế dẫn xuất acetat của sterol:

Hòa tan 100mg sterol § trong 2ml piridin Thêm từ từ 2ml anhidric

acetic vào hỗn hợp Đun hoàn lưu hỗn hợp trong 2 giờ Để nguội Thêm

nước cất vào hỗn hợp cho đến khi trầm hiện hoàn toàn Làm lạnh; lọc Kết tinh trầm hiện trong MeOH thu được 69mg tinh thé 6 dang vay trang