Thực nghiệm thành phần hóa học từ vỏ trái bồ kết

Thực nghiệm thành phần hóa học từ vỏ trái bồ kết

Ludn an Thac si Khoa hoc Hoa học Nguyễn Thị Mỹ Phượng

5.1 NGUYEN LIEU , HOA CHAT VA THIET BI:

5.1.1 Nguyén liéu:

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là vỏ trái Bồ Kết thu hái ở huyện Long

Khánh, tính Đồng Nai vào tháng 12 Nhận danh cây có tên khoa hoc 12 Gletditschia australis Hemsley, họ Vang, Cacsalpiniaceae bởi PGS Lê Công Kiệt, Bộ môn Thực

Vật, Khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phế Hồ Chí Minh

5.1.2 Hóa chất:

- Hóa chất dùng trong quá trình chiết xuất : eter dầu hỏa (60 - 90°C), alcol metil, cloroform, benzen

- Héa chat ding trong qué trinh thiy phdn saponin thanh sapogenin : eter etil, alcol metil, H.SO, 5%, KOH 4%, HCI 10%

- Hóa chất dùng trong quá trình sắc ký cột : alumin trung tính hiệu Merck, eter dau hỏa (60-90°C), benzen, cloroform, acctat etil va alcol metil

- Hóa chất dùng trong quá trình sắc ký lớp mỏng : lớp mong silicagel loai TLC plastic roll 0,2mm- silicagel 60 Fys4 , cloroform, acetat etil, aleol metil, H,S0,d4m dic va acid phosphomolibdic

Tinh ché và xử lý các hóa chất trước khi làm thi nghiém: [35] [36]

Eter đầu hỏa (60-902C) : sứ dụng chưng cất phẩm ở phân đoạn 60-90C, làm khan bằng sợi Na kim loại

Benzen : làm khan sơ bộ bằng CaCl; khan, sau đó lọc để loại CaCl;, Chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn Ở 80-81°C Ngâm dung môi với sợi Na

Cloroform : cloroform thương phẩm thường chứa trên 1% alcol eũl Để loại lượng alcol, lắc cloroform với lượng nước bằng vA ludng cloroform ( thuc hién 3-6 lần) Dùng bình lóng tách bổ phần nước Làm khan dung môi với CaC]; khan; để yên 24 giờ Lọc, chưng cất phân đoạn Lấy sắn phẩm ở phan doan 61°C Bao quan

dung môi tỉnh chế trong bóng tối

Chưng cất phân đoạn các dung méi: alcol metil ( 64-65°C) , alcol etil ( 78°C) ,

acetat etil (77°C)

Alumin : rửa alumin với dung dịch HCI 5% ; sau đó, rửa lại với nước cất đến khi đạt pH = 7, tiếp đó rửa với alcol cũl 25% Sấy khô ở 150°C Trước khi sử dung , sấy alunun lại Ở 150°C, trong 2 giờ

5.1.3 Thiết bị:

- Dụng cụ dùng để ly trích là thiết bị Soxblet loại 2 lít và 10 lit

Luận dn Thac st Khea hoc Héa hoc Nguyẫn 'Dhị Mỹ Thượng

- Dung cy ding để thu hổi dụng môi đưới áp suất kém là máy cô quay hiệu BUCHI 461,

- Cột sắc ký có đường kính lcm, 1,5cm và 2cm,

- Dụng cụ dùng để đo nhiệt độ nóng chảy là khối Maquenne

- Phổ khối lượng được thực hiện trên máy 5989 MS của phòng Khối Phổ,

Viện Hóa , Nghĩa Đô, Từ Liêm, Hà Nội

- Phổ hồng ngoại được thực hiện trên máy quang phổ hồng ngoại IR - 470

SHIMADZU cia Khoa Héa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh và BRUKER-IFS48 * CARLO ERBA-GC6130 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm, số 2, Nguyễn Văn Thủ, quận I, thành phố Hồ Chí Minh

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân !H- NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng

từ hạt nhân 200 MH¿z hiệu BRUKER- AC2000 của Trung Tâm Dịch Vụ Phần Tích

và Thí Nghiệm

- Phổ cộng hướng từ hạt nhân Be NMR dude thuc hién trén may cộng hướng

tw hat nhin 50 MHz hiéu BRUKER- AC2000 cia Trung Tam Dich Vụ Phan Tich va Thí Nghiệm

5.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ TRONG

VỎ TRÁI BỒ KẾT:

52.1, Điều chế cao eter đầu hóa, cao cloroform và cao alcol metil

từ vó trái Bê Kết:

Nguyên liệu thô ( vỏ trái Bê Kết) được tận trích với các dung môi eter dầu nda, cloroform và alcol metil ( 2 HỘ trong Soxhlet Lọc, cô cạn đụng môi ở 40°C thu được các loại cao Cho các cao nầy vào bình hút Ẩm chân không đến khi trọng lượng không thay đối, thu được các loại cao: cao eter đầu hỏa, cao cloroform và cao alcol metil (so dé 1, trang 12)

5.2.2 Dinh tinh:

5.2.2.1 Saponin:

Đun sôi lgam bột nguyên liệu trong 100mi nước cất trong 30 phút Lọc, để

nguội, thêm nước cất vào cho đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm,

đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, lÔml nước sắc.Thêm

nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml Lắc mỗi ống nghiệm theo chiều dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt,

oS

Chí số bọt được tính theo công thức:

_“—————-

Luan an Thac st Khoa hoc Héa hoc Nouyén Thi My Phuong

CSB =10x a

e

CSB : chỉ số bot

d: chiều cao cột bọt, cm,

€ : lượng mẫu trong ống nghiệm, gam

Nêu chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm dưới lcm, chỉ số bọt đưới

109, nghĩa là không có saponin,

5.2.2.2 Sterol:

3.2.2.2.1 Điều chế dung dịch thử:

- Hòa tan mẫu khô ( 1 gam) trong cloroform ( 20 mb); loc

- Héa tan mau cao (0,1 gam) trong cloroform ( 30 ml); loc

5.3.2.2.2 Thuấc thit:

a Thuéc thy LIEBERMANN- BURCHARD :

- Anhidrid acetic 20ml

- HạSÖx đậm đặc idm,

Phan ứng dương tính khi xuất hiện mầu xanh nhạt, lục, hổng hoặc đỏ

b Thuốc thứ SALKOWSKIT:

H;SO¿ đậm đặc

Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu đó

5.2.2.3 Fiavon:

Nấu mẫu (5gam) với nước cất (100m) trong 20 phút Để nguội, lọc

5.2.2.3.2 Phân ứng kiểm chúng:

Phần ứng SHIBATA:

- Ống nghiệm kiểm chứng: 2ml dung dịch thử

- Ống nghiệm phần ứng: 2ml dung dịch thứ, thêm HCI đậm đặc (5ml) và bột

Mg Để yên đến lúc hết súi bọt; thêm từ từ alcol iso-arml theo thành ống

nghiém.Dun néng nhe

Phần ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu hồng chuyển sang mầu dé tim

_——

Ludn dn Thac st Khoa hoc Héa hoc Nguyén Thi My Phuong

5.2.2.4, Alcaloid:

5.2.2.4.1 Diéu ché dung dich thit theo 2 phương pháp

Trích mẫu (5gam) với dung dich Prollius ( eter etil, cloroform, alcol etil 95%

va NH,OH, ti 1é 25:8:8:1) 6 nhiét d6 phong trong 24 gid, lac thudng xuyén Lay lớp hifu co; cô cạn dung môi cho cặn Hòa tan cặn trong HCI 1% trong HạO ở 80°C, trong

1 gid Lay dich loc

Hòa tan mẫu (5gam) trong dung dich HCI 1%, đun nhẹ ở 80°C trong 1 gid Loc

5.2.2.4.2 Thuốc thử:

a Thuốc thử BOUCHARDAT :

Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện vàng nâu

b Thuốc thử MAYER :

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu nâu

c Thuốc thử BERTRAND :

Acid silicotungstic 5 gam

Phan ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu trắng đục

d Thuốc thử HAGER:

Acid picric bão hòa trong nước

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu vàng

e Thuốc thử DRAGENDORFF :

Dung dich A: Bi(NO3)2 0,85gam

Nước cất 40 ml

Luận án Thạc sĩ Khoa học toa hoe Nguyẫn Thi My Phuong

Nước cất 40 mi

Tron 2 dung dich A vA B Khi sử dụng, lấy 20ml dung dich hén hop (A+B); thêm vào CH;COOH (20 mi) va nude cat (100ml)

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu đồ

5.2.2.4 Glicosid :

5.2.2.41, Diéu ché dung dich thi:

Trích mẫu (5gam) với alcol eul 60% (20ml) trong 24 gid Loc; ché héa dich lọc với dung dịch acetat chì 20% (20 ml) Lọc; chế hóa dịch lọc với dung dịch

Na;SO;¿ bão hòa (10ml) Lọc; cô cạn dung dịch ở 40C, thu được cặn Hòa tan cặn nầy trong alcol etil 95% và lọc

5.2.2.4.2 Thuốc thử:

a Thuốc thử MOLISH :

Thimol xanh 2% {— 2 giọt

H;SO¿ đậm đặc i mi,

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu đó

b Thuốc thứ BALIET:

Acid picric 1% trong alcol etil 95% 20ml

Phần ứng dương tính khi xuất biện mầu vàng cam hay mầu hồng xấm

5.2.2 5 Tanin:

$3.2.5.2 Thuốc thử:

a Thuốc thử STIASNY:

HCI đậm đặc l1Ôml

_—_————~

Tuận án Thac si Khoa hoc Héa hoc Nguyén Thi My Phuong

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ

b Thuốc thử gelatin mặn:

Gelatin 2gam

Dung dịch HCI bão hòa 100ml

Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện vàng nhạt để lâu hóa nâu

c Dung dich FeCl, 1% trong nuéc:

Phan ting dương tính khi dung dịch hóa xanh với 2 giọt thuốc thử

53, KHẢO SÁT SAPONIN TÁCH CHIẾT VÀ CO LAP TU VO TRAIBO KẾT:

5.3.1 Qui trình ly trích saponin thô từ vô trái Bồ Kết:

Qui trình 1

Bột nguyên liệu (1,5 kí) được tận trích với eter dầu hỏa (60-90°C) (10 lít)

trong dụng cụ Soxhlet với thời gian là 3 ngày Phơi khô phần bã; bã vỏ được tận trích tiếp với alcol metil 50% (10 lít) trong dung cu Soxhlet, trong 3 ngay Cô cạn dung môi ở 40°C thu được cặn alcol (825gam) Trộn cặn alcol với alumin (2 kí) Sấy khô hỗn hợp và tận trích hỗn hợp với alcol metil: alcol n- butil (1: 9) (10 lít) trong dụng cụ Soxhlet, trong 3 ngày, lấy dịch trích alcol, thu hổi dung môi ở 40°C cho saponin thé màu vàng nâu (5i§gam) Qui trình được trình bày trong sơ đỗ 5 (trang 22)

Qui trình 2

Tận trích bột nguyên liệu (600gam) với alcol etil 50% (3lí) trong dụng cụ

Soxhlet, trong 3 ngày Lấy dịch trích alcol, thu hổi dung môi ở 40°C thu được cao

alcol (275gam) Tận trích cao alcol với eter dau hỏa (60- 90C) thu được 2 phần

Tận trích phần không tan trong eter dầu hỏa với eter etil, thu được 2 phần là phần

tan và phần không tan trong eter etil Hda tan phan không tan trong eter etil với alcol metil; thém eter etil cho trầm hiện saponin thô (155gam) Qui trình được trình bày trong sơ đồ 6 (trang 23)

5.3.2 Thủy phân saponin thành sapogenin:

Saponin thô (25gam) được đun hoàn lưu với H;SO¿ 5% (300 m]) trong 3 giờ

Lọc thu lấy trầm hiện Đun hoàn lưu trầm hiện với KOH 4% trong MeOH (300 ml)

Để nguội trung hòa bằng HCI 5% đến pH = 7 Pha loãng với nước cất (1,8 lí) Trích dung dịch nước nhiều lần với eter etil

Luận án Thạc sĩ Khoa học tlóa học Nguyén Thi My Phuong

Cé can dich eter etil cho sapogenin B (2gam) Acid hóa dung dịch nước với HCl 5% đến pH = 2-3; lọc thu lấy trầm hiện sapogenin Tan trích trầm hiện sapogenin với eter etil Cô cạn dung môi cho sapogenin A (1,7gam)

Qui trình được thực hiện theo sơ đồ 7 (trang 25)

5.3.3 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính:

5.3.3.1 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính trên sapogenin B:

Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điều kiện như sau:

- Kích thước cột: 2cm x 30 cm

- Khối lượng alumin sử dụng: 80 gam

- Khối lượng sapogenin để nạp cột: 1,7 gam

- Hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tang dan: eter dầu hỏa, eter dâu

hỏa- benzen, benzen, benzen- cloroform, cloroform, cloroform- acetat etil, acetat etil, metanol

- Hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí : 50 ml

5.3.3.2 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính thực hiện trên phân đoạn J của bảng 8:

Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điều kiện như sau:

- Kích thước cột : lem x 15 em

- Khối lượng alumin sử dụng: 30 gam

- Khối lượng sản phẩm thô ( phân doan J) nạp cột: 0,4 gam

- Hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần: benzen, benzen-

cloroform, cloroform, cloroform- acetat etil, acetat etil, metanol

- Hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí: 30 ml

5.3.3.3 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính thực hiện trên phân

đoạn M của bang 8:

Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điều kiện như sau:

- Kích thước cột : lem x 15cm

- Khối lượng alumin sử dụng : 40gam

- Khối lượng sản phẩm thô (phân đoạn M) nạp cột : 0,3gam

- Hệ thống dung môi giải ly : cloroform, acetat etil, metanol

5, PHAN THUC NGHIEM Trang 63

Luận án "Thạc sĩ Khoa học tlóa học Nguyén Thi My Phuong

- Hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí : 15ml

5.3.3.4 Phương pháp sắc kí lớp mồng silicagel:

Thực hiện sắc kí lớp mỏng silicagel với điều kiện như sau:

- Loại lớp mỏng sử dung : TLC plastic roll 0,2mm-silica gel 60 Fos4

- Hệ dung ly triển khai sắc kí lớp mỏng : cloroform: metanol 9:1

- Thuốc thử làm hiện vết là H;SOx đậm đặc, acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95% Phun thuốc thử (sau khi chấm mẫu), sấy bán ở 110°C trong 2 phit

- Sản phẩm thô được hòa tan trong metanol

5, PHAN THUC NGHIEM Trang 64