Thực nghiệm thành phần hóa học của dây cóc Tinospora crispa miers

Thực nghiệm thành phần hóa học của dây cóc Tinospora crispa miers

4 THỰC NGHIÊM 4.1 CÁC THIẾT BI DUNG BE KHAO SAT CAC HOP CHAT:

- Đo điểm nóng chảy trên khối Maquenne va méy ELECTROTHERMAL

9106 Digital

- Phổ hỗng ngoại ghi trên máy quang phé hong ngoai IR-400 Shimadzu

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân !H ghi trên hai máy BRUKER AC 200 (tần

số cộng hưởng 200 MHz cho proton, 50 MH¿z cho carbon) va JEOL INM GX -

400 (tần số cộng bưởng 400 MIH¿ cho proton, 100 MHz cho carbon) trong dung

m6i CDCh, với chất chuẩn nội TMS

- Sắc ký bản mỏng loại 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254,

Merck

- Sk dung sic ki cdt véi silica gel 70-270 mesh, Merck

- Sắc ký cột nhanh với silica gel 60 H loại dùng cho bản móng, Merck,

Luận án Thạc sỹ Khoa hạc Hóa học

Kết luận:

Thân

Trọng lượng chất khô trung bình 31,9%

4.3 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ :

Thực nghiệm

Lá 81,9%

18,1%

Để định tính sự hiện điện của các hợp chất này, chúng tôi dựa vào phản

ứng đặc trưng tạo màu hoặc tạo trầm hiện,

Sơ đồ †: Qui trình điều chế các loại cao của Dây Cóc đùng để định tính:

- Trộn với ALO; trung tinh

- Tận trích với eter dầu hỏa (60-90°C)

- Cô cạn,

Cao eter dau hóa

- Thu hổi dụng rgôi - Thu hồi dung môi

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hỏa học Thực nghiệm

4.3.1 Định tính sự hiện dién eda sterol:

+ Thuốc thử Liebermann ~ Burchard:

Dang mau thi

Liebermann - Burchard Salkowski Noler

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

4.3.2 Định tính alkaloid:

Ngâm nguyên liệu (cao chloroform, cao n-BuOh) (0,1g) trong dung dịch

H;SO¿ 3%, đun nhẹ ở 80°C trong 6 giờ Lọc lấy dịch lọc để thử với thuốc thử

Bouchardat, Mayer, Hager, Dragendorff

Dung dich acid picric bão hòa trong nước

Cho kết tủa vàng với dịch chứa alkaloid

+ Thuốc thử Dragendorff:

Bi(NOs3)2 (20 g) hoa tan vao HNO, dam dac (30 ml), loc

Hoa tan KI (68 g) trong nudéc (60 ml)

Hoà tan 2 hỗn hợp để yên 24 giờ Lọc thêm nước vừa đủ 250 ml Thuốc thử cho kết tủa có màu vàng cam với dung dịch có Alkaloid

Bảng 2: Kết quả định tính sự hiện diện của alkaloid

Luân án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Chúng tôi nhận thấy trong thân đây Cóc có chứa alkaloid, có thể cô lập được chúng từ cao chloroform và cao n-BuOH

4.3.3 Định tính glicosid :[18] [19]

Để xác định sự hiện diện của giicosid, chúng tôi sử dụng phương pháp SOOS (có sửa đổi) theo sơ đồ 2 Dich etil alcol sau cing được dùng để trắc nghiệm với các thuốc thử Tollens, Baljet và Molish

Tận trích nguyên liệu 100 gam (bột cây khô, cao n-BUOH) với eul alcol

20% trong 24 giờ Lắc thường xuyên, lọc, chế hóa địch lọc với acetat chì trong

nước đến khi không còn trầm hiện Lọc, thêm dung địch Na;SÖa bão hòa đến khi

không còn trầm hiện, Để yên 12 giờ Lọc, cô cạn dung địch Hòa tan phần cặn

trong ctil alcol 95%, dụng dịch này đùng làm mẫu thử

Với mẫu cao n-BuOH, hòa tan trong n-BUOH, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử,

Nếu thấy xuất hiện mầu đỏ là phan ứng đương tính,

Cách thử: Lấy hai ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất 2ml mẫu thử (làm đối chứng) Cho 2ml dung dịch mẫu thử vào ống nghiệm thứ nhì, cho từng giọt thuốc

thứ vào

+ Thuốc thứ Tollens:

Cho vào ống nghiệm 2-3mg glicosid va 5 giot pyridin Thém vao 4 giot

thuốc thử Tolens mới pha (hỗn hop 0,5 ml dung dich nitrat bac 10% với 0,5 ml NaOH 10% sau đó cho từng giọt NH.OH đến khi tan hết tủa Nếu có Ag khử là

phần ứng dương tính

TA 2 - cày

tận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Bảng 3: Kết quả định tính glicosid của thân đây Cóc:

Dang mau thy

Dich loc

| - Cô cạn đưới áp suất kém

| - Hòa tan can trong EtOH 95%

Dung dich để thir glicosid Dich EtOH 2

Kết luận: bột khô, cao n-BuQOH của than đây Cóc có chứa gHcosid

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

4.3.4 Định lượng alkaloid theo Stass-Otto:

Lấy 2kg Đây Cóc khô, tẩm với NHOH 10%, để yên 1 đêm, cho vào soxhlet, mỗi mẻ 200g trích với 2 li CHCh, Dịch trích này được cô cạn bớt, lắc nhiều lần với dung địch acid HạSO, 2%, mỗi lần dùng 200ml, có đùng thuốc thử Mayer dé theo đôi, Dịch acid vừa trích được cho thêm NHOH vào để chỉnh pH đến 10-12, đem lắc lại nhiều lần với CHC]; Dịch trích CHCH này rửa với nước

để loại kiểm dư, lọc, cô cạn thu được alkaloid toàn phần

tuận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

%ø đề 3: Qui trình dinh hong alkaloid theo Stass- Otto :

Hội dây Cóc

- RỨa với nước

Hiệu suất: 0.073% tính trên bột thô

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

4.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ:

Để khảo sát một số thành phần có trong Dây Cóc, chúng tôi chọn phương pháp chiết xuất cổ điển [20] Sau khi trích ly bằng các dung môi với độ phân cực tăng dân, hợp chất từ các phân đoạn được xử lý bằng cách kết tỉnh lại nhiều lần trong các hệ dung môi khác nhau,

4.4.1 Điều chế phần không xà phòng hóa của cao eter dầu hổa và cao

Cô cạn dung môi, thu được 23 ø cao eter đầu hỏa phần không bị xà phòng hóa Cao này được dùng để sắc ký cột,

Sau khi trích với eter đầu hỏa, chúng tôi thay dung môi trong soxhlet bằng

CHCH, tiếp tục trích, cô cạn, thu hổi dung môi, phần cặn còn lại là cao chloroform

Phần không xà phòng hóa cla cao eter dau héa va cao chloroform dude điểu chế theo sơ đồ 4

kuân án Thạc 3ỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Sơ đồ 4: Điều chế phần không xà phòng hóa của cao cter dầu hóa và cao chloroform được theo sơ đỗ 4

Bột dây Cóc (000g)

- Trích nguội với eter đầu hỏa (60-90°C)

- Thu hồi dung mới

- KÔH/EIOH ; Đun hoàn bya 3 giờ | - Trích với CHCI;

- Thêm HạÖ i - Thu héi dung môi

- Làm khan với Na;SO,

; ~ Thu héi dung méi

Phần không xà phòng | hóa của cao eter đầu hỏa |

4.4.2 Chuẩn bị:

4.4.2.1 Xử lý cao:

Sau khi trích ly bằng soxhlet, các dịch trích được lọc bằng giấy lọc, cô đuổi

dung môi, thu được cao Các loại cao này được cho vào bình hút ẩm, húi chân

không cho đến khi chúng khô

Tuân áa T =

4.4.2.3 Xử lý dụng môi:

- Eter dầu hóa: chưng cất, lấy ở phân đoạn 60-80°C, làm khan bằng nati

kim loại trong thời gian từ 2-3 ngày,

- Benzen: chưng cất, lấy ở S0°C, làm khan bing natri kim loại trong thời

gian từ 2-3 ngày,

- Chloroform: lắc với nước từ 2-3 lần, chưng cất, làm khan với clorur canxi

- Metanol: đun hoàn lưu với magie kim loại trong 3-4 giờ để loại nước,

chưng cất

4.4.3 Cô lập bằng phương pháp sắc ký cột:

4.4.3.1 Sắc ký cột và sắc ký bản mồng:

Chúng tôi chọn các dung môi theo độ phân cực tăng dẫn để giải ly cột sắc

ký, như sau: eter đầu hóa, benzen, chioroform, metanol,

Chúng tôi tiến hành sắc ký bản mỏng để theo đõi hệ dung ly dùng cho cội sắc ký và có nhận xét về tương quan giữa sắc ký bản mông và sắc ký cột như sau:

+ Đối với những hợp chất có AR¿ chênh lệch khoảng 0,1 sẽ tách tốt trên

cột, tuy nhiên có những phân đoạn chênh lệch ít (AR;< 0,1) vẫn có thể cô lập

được bằng phương pháp kết tĩnh phân đoạn,

+ Khi sắc ký bản mỏng có R¿ khoảng O,1 trong một hệ dung ly nào đó thì

sẽ tách được nó trên cột ở hệ dung ly đó Như vậy chúng tôi có thể tăng nhanh

hay chậm độ phân cực của dụng môi theo từng phân đoạn

4.4.3.2 Sản phẩm tách từ cột sắc ký phần không xà phòng hóa cao eter đầu hóa:

~ Trọng lượng cao : 8g

- Trọng hiong silica gel 240 g

- Chiéu cao cét silica gel: 45 cm

- Đường kính cột: 3,5 cm

Sắc ký bản mỏng dung môi CHC]; của cao có các vét: Ry = 0,85, Rp = 0,56;

Ry = 0,56; tit Rp = 0,30 - 0,45 06 nhiéu vét gan nhau, Ry = 0,22 GO hé dung ly nay

chất cuối cùng chưa lên hết Sắc ký bản móng dung môi CHCI, -MeOH (20:1) của cao có vết cuối cùng Rr= 0,05

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiêm

Dung ly dùng để giải ly cột ban đầu là eter dầu hỏa Mỗi lọ hứng 100ml, tốc độ chảy từ 60-120 gioUphút Khoảng 1 lít dung môi đầu tiên (tương ứng với 1Ô lọ), không ra chất, Đến lọ có ít sắp trắng bắt đầu đánh số thứ tự, Các lọ có các vết giống nhau gom thành phân đoạn,

Phân đoạn 1:

Từ lọ 1-21 sắc ký lớp mỏng cho thấy có một vệt rõ trong các thuốc thử

(H5, hơi l¿ bão hòa), có Rr= 0,24 trong hé dung ly benzen-chloroform(4:1)

Lượng cặn thu được 920mg Hòa tan trong CHC nóng, cho thêm từ từ vài giọt MeOH vào, khuấy Để nguội từ từ cho kết tính, thu được 24,8mng chất bột trắng

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học

£ 13

Ò

Thục nghiệm

C - NMR kết hợp với kỹ thuật DBPT (CDCH) (phụ lục 3, 4) có các

mũi cộng hướng tương ứng với loại carbon như sau :

Bang 9: Phé °C — NMR cia hop chat thu dude trong phan doan 1

Các kết quả của phổ NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT -NMR cho thấy hợp

chất này là một alcol béo dây thẳng có dạng CHạ-(CH:),-CH;QH, đo tất cả các

carbon đều là -CH;- và chỉ có một nhóm —CH, trong phân tử, dự đoán số carbon

từ 18-30, vì vậy chúng tôi so sánh điểm nóng chấy và các mũi cộng hưởng C-NMR cia hợp chất này với một số alcol béo có công bố theo tài liệu [18] được trình bầy trong bảng 1

Đối chiếu các số liệu của hợp chất này với số liệu của 1-octacosanol [25], thấy có sự trùng khớp nên chúng tôi để nghị cơ cấu của hợp chất trên là

Í-octacosanolL

Phân đoạn 2:

Từ lọ 22-50 hệ dung ly: eter dầu hỏa- benzen: 7-3, các lọ này đều có sắc

ký lớp mông với 3 vết R; = 0,72; 0,6; 0,54 không kết tính được

Phân đagn 3:

Từ lọ ã1- 68 hệ dung ly: eter dẫu hỏa- benzen: 7-3 Trên sắc kỹ lớp móng, phân đoạn này cho thấy mội vệt rõ Rr = 0,55 trong hệ dung ly benzen-acetat etil :8-2, lượng cặn thu được 11 15mg Kết tỉnh tương tự phân đoạn 1, thu được 20,Smg tinh thể trắng có điểm nóng chảy 141—142°C (hình 2)

Luận án Thạc s¥ Khoa hoc Héa hoc Thuc nghiém

Phé carbon “C - NMR (pbu luc 7a, 7b, 8a, 8b) cho biét hop chat ndy cé 30

carbon, Dựa vào phổ DEPT ta biết trong đó có 6 nhóm metil, 12 nhóm metilen,

7 nhóm methin và 5 carbon tứ cấp

Giá thuyết về sự có mặt của nối đôi đầu mạch được khẳng định khi có mũi

ở 105,6 (CH;) và 156 ( carbon tứ cấp), sự có mặt của nhóm hydroxy nhị cấp cũng được xác nhận bằng mũi ở 76,5 ppm ( bị che khuất bởi mũi dung môi CHCh trên

phổ carbon nhưng xuất hiện rõ rằng trên phố DEPT )

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Từ các thông tin trên cho thấy chất này phải là một triterpen và có khả năng là một cycloartan với công thức phân tử CzoH;¿O

Qua quá trình tim hiểu, so sánh các tài Hiệu, chúng tôi thấy có chất cycloeucalenol có cấu trúc phù hợp So sánh với các đữ liệu trên phổ °C.NMR

và ĐEPT, chúng tôi thấy các dữ liệu trên phù hợp Kết quá so sánh được trình bày trong bảng 7,

Khi so sánh phổ TH-NMR; C-NMR và DEPT -NMR của chất trên với phố

của hợp chất cycloeucalenol trong tài liệu [23], thấy có sự trùng khớp nên chúng tôi để nghị đó là cycloeucalenol với công thức như sau:

Cycloeucalenol Phân doan 4

Ti lo 69-79, hé dung ly: eter dầu hỏa-benzen: 7-3, có sắc ký lớp móng với

3 vết không kết tỉnh được

Phân đoạn 5:

Từ lọ §0-118, trên sắc ký lớp mỏng phân đoạn này thấy một vệt rõ, kết

tỉnh lại trong hệ dung môi CHCh- MeOH, thu được tỉnh thể hình kim trắng, trọng

lượng 25,6 mỹ, có điểm nóng chảy 136 - 137°C, Rp = 0,5 trong hệ dụng ly

Benzen: Acctat etil (8:2) (hinh 3)

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hảa học Thực nghiệm

Phổ hồng ngoại của chất này có các mũi hấp thu đặc trưng như sau :

Từ các dữ liệu trên, chúng tôi nhận thấy hợp chất này có một số nhóm

chức như sau: nhóm -OH có liên kết hydro V cm” (3600 - 3200) , các nhóm ~CH:

0,84 0,90

0,98 I Vach đa, H của nhóm —CH;-, -CH-

2,25

3,53 H của -CH-OH

538 H của - CH=C- Phé proton cia hdp chat nay cho thấy có mũi đôi của 3 proton ở 5,35 ppm

CH, 5,4Hz), mũi đa của carbinol proton ở 3,52 ppm (TH) và mũi của các nhóm

Luận án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Phổ °C - NMR (phụ lục 11a, 11b) kết hợp với phổ DEPT — NMR (phu

lục 12a, 12b), CDCl;, các mũi cộng hưởng ở ỗppm: 140,5; 121,4; 71,6; 56,5; 55,8;

49,9; 45,6; 42,1; 39,5; 37,0; 36,3; 35,9; 33,7; 31,7; 31,7; 31,4; 29,4; 28,0; 25,8;

24,1, 22,8; 20,9; 19,6; 19,2; 18,8; 18,6; 11,8; 11,6

Các dữ liệu trên hai phổ này cho biết hợp chất có 29 carbon, trong đó 2

carbon thuộc loại >C=C< mũi cộng hưởng có độ dịch chuyển hóa học là 121,4 và

140,5 ppm va 1 carbon thuộc loại -CH-OH ở 71,6ppm

Phổ DEPT cho biết hợp chất này có 6 nhóm CHạ, 11 nhóm CH¿, 9 nhóm

CH và 3 carbon tứ cấp

Từ những thông tin trên cho biết chất này có thể là B-sitosterol

Hợp chất này cho trắc nghiệm dương tính với hai thuốc thử đặc trưng của

sterol là thuốc thử Liebermann- Burchard và Salkowski

Kết quả so sánh điểm nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ 'H-NMR phổ '3C-NMR và phổ DEPT của chất này được trình bày trong bảng 10, 11

Bảng 10: So sánh phổ hồng ngoại với phổ B-sitosterol.[2 1]

Ludn an Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Bảng 11 : So sánh các mũi cộng hưởng ÌC-NMR của hợp chất khảo sát với phổ '*C ~NMR của B-sitosterol.[21]

Số thứ tự B-sitosterol Loaicarbon | Hợp chất khảo Tin hiệu

Tuân án Thạc sỹ Khoa học Hóa học Thực nghiệm

Kết quả so sánh cho sự trùng khớp vì thế chúng tôi để nghị (80-118) là

B-sitosterol với công thức như sau:

Từ phân đoạn 6, chúng tôi không cô lập thêm được chất nào vì chúng có

nhiễu vết, muốn cô lập thì phải dùng lượng cao nhiều hơn, thu lấy các phân đoạn này rồi chạy cột lại

Trong phần không xà phòng hóa cla cao eter dau hỏa chúng tôi thu được

3 chất

4.4.3.3 Sản phẩm từ sự sắc ký cột trên cao chloroform:

Khi chấm bản mỏng, xuất hiện nhiều vết, chúng tôi tiến hành sắc kỹ cột

nhanh, khô Dùng phếu thủy tinh xốp, đường kính 6Ö ram Hòa tan trong

chioroform 8g cao, trộn với 50g siica gel 60H , để cho dung môi bay hơi hết Nén chat vao phéu, cho từ từ dung môi vào, mỗi lần 50 ml, hút cho đến lúc trên

phễu khô Theo đõi quá trình này bằng sắc ký bản mỏng Chúng tôi thu được

3 phân đoạn

Phân đoan ¡: Hệ dung môi giải ly : eter đầu hỏa 1000 ml Cô cạn thu được

2,1g cao Từ dung dich eter dau héa thu được, theo đối trên bản mỏng chúng tôi

so sánh với cao eter đâu hỏa đã khảo sát, các vết trùng với nhau nên chúng tôi không cô lập các hợp chất này.