Thực nghiệm thành phần hóa học cây an điền lá dầy, họ cà phê
Trang 2
38
Trước khi khảo sát định tính và trích ly cô lập các hợp chất trong cây An
điện lá dây, chúng tôi chuẩn bị các phương tiện hóa chất và kỹ thuật sau:
© Tỉnh chế dung môi và chuẩn bị các thuấc thử
- Dung môi: eter dầu hỏa, benzen, cloroform, etil acetat, aceton, metanol déu
được làm khan bằng Na;SO,,
- Thuốc thử: để hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng, phun xịt bằng acid
sulfuric dim đặc và dùng hơi iod, Ngoài ra, các thuốc thử phục vụ cho phần khảo
sat định tính, sé được mô tả cụ thể trong từng phần ứng định tính ở phdn sau
% Thiết bị chính và kỹ thuật tiến hành:
Cột sắc ký (silica gel nhanh - khô): là những phéu lọc xốp có đường kính
khác nhau (tùy thuộc vào lượng cao sắp khảo sáp) được gắn vào hệ thống rúi khí
để tạo áp suất kém thông qua một bình tam giác có cổ ngang, nạp từ từ silica gel
(60H loai ding cho sắc ký lớp mỏng, Merck) vào cột, ép nhẹ đều tay lớp silica gel này, dưới sự trợ giúp của máy hút chân không để cho cột chặt đều Khi chiều
cao lớp silica gel trong cột đạt khoảng 4,5 - 5cm thì tiến hành bão hòa cột, bằng
cách, cho dung môi kém phân cực nhất trong số các hệ dung môi sắp dùng để giải
ly (dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để lựa chọn các hệ dung môi này), đi qua cột
đến khi nào lớp silica gel trong cột trở thành một khối đồng nhất và khi rút khô
dụng môi mà lớp silica gel này không bị nứt gấy Sau đó, các mẫu cao sẽ được
nạp lên đầu cột và tiến hành giải ly
Kỹ thuật sắc ký cột nhanh — khô nói trên, được sử dụng nhiều lần để trích
ly, cô lập các hợp chất hữu cơ
Ngoài ra, chúng tôi còn dùng một số thiết bị kỹ thuật khác đã được nêu trong phân nghiên cứu và kết quả.
Trang 3
19
4.1 ĐỊNH TÍNH SỰ HIỆN ĐIỆN CỦA CÁC CẤU TỬ HỮU Cơ U21;
Như đã được nêu ở phân nghiên cứu và kết quả: trong cây có nói chung,
thường có chứa các hợp chất hữu cơ như: sterol, triterpen, alcaloid, flavon, tanin,
glycosid, saponin và để định tính các loại hợp chất hữu cơ này chúng tôi dựa
vào những phản ứng hóa học đặc trưng cho từng loại hợp chất ở khả năng tạo mầu hoặc tạo kết tủa với các thuốc thứ,
4.1.1 Điều chế các loại cao
Từ 800g bột nguyên liệu khô ngâm trích trong etanol, lọc, cô quay thu hồi dung môi, thu được 75,7g cao etanol,
Trích pha rắn silica gel trên cao etanol bằng cách nạp cột (sắc ký cột khô
nhanh), giải ly lần lượt bằng các đơn dụng môi từ không phân cực đến phân cực: eter dau hỏa, cloroform, metanol, Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, các lọ cho sắc ký lớp móng giống nhau được gộp chung thành một phân
đoạn Thu hồi dung môi, thu được các loại cao: cao eter đầu hỏa (1,35 g), cao
cloroform A (1,35 g), cao cloroform B (3,96 g) va cao metanol (45,45 g)
4.1.2 Dinh tinh sterol va triterpen: bang phan ứng với các thuốc thử
Liebermann Burchard, Salkowski va Noller
® Tao miu thi: Lay 0,igam mdu mi loai cao hda tan trong 20ml dung môi cloroform, sau 1 giờ lọc lấy địch lọc để làm mẫu thư,
e Thuéc thd Liebermann Burchard: Anhidrid acetic (20m)), acid sulfuric dim
dac (iml)
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từ từ thuốc thử vào, nhận thấy hỗn hợp chuyển sang màu lục đậm, hồng, cam hoặc đỗ bên trong một thời gian chứng tỏ có sterol,
Trang 4
tac của câu cên điện tá dâu 60
se “Thuốc thử Salkowski: Anhidrid acebe đậm đặc
Tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu nâu đất hay màu xanh chuyển dẫn sang nâu chứng tỏ trắc nghiệm đương tính
© Thuốc thử Noiler: Clorur tionil (1ml), Sn (0,58)
Cũng tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu đó thẫm chứng
tỏ trắc nghiệm đương tính
4.1.3 Định tính flavonoid: bing phan tng Shibata (phan tng Cianidin), phan
ứng với HạSOa đậm đặc
® Tạo mẫu thử: Lấy 0,5gam cao mỗi loại, cho 20ml nước vào một becher, đun cách thủy trong 5 phút, để nguội, lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử
œ© “Thực hiện phản ứng Shibata (hay còn gọi là phản ứng Cianidin) với thuốc
thử gồm HCI dam đặc, bột Mg kim loại và alcol isoamil
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm 5 giọt dung dịch HƠI đậm
đặc và 3 đến 5 hạt Mg kim loại (khoảng 0,1 g), để yên cho đến khi dụng dịch hết
sii bot Dun nóng và nhỏ từ từ alcol isoamil đọc theo thành ống nghiệm, sẽ thấy
xuất hiện một vòng tròn trên bể mặt dung dịch, lúc đầu màu hổng nhạt từ từ đối
màu đó tĩm, chứng tỏ có sự hiện điện của flavonoid
e Thực hiện phản ứng thử với HạSQ, đậm đặc
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm đùng làm ống chuẩn,
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt H;SO¿ đậm đặc Hỗn hợp từ vàng đậm đổi sang đa cam chứng tô có sự hiện điện của favonoid, 4.1.4 Định tính tanim: băng các thuốc thử cho phần ứng mầu và trầm hiện như:
Stiasny, acetat chi hofic FeCl, 1%
Trang 5
B1
Tạo mẫu thử: Lấy O,5sam cao mỗi loại, đun với 30ml nước trong thời gian khoảng 5 phút Lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử,
ø “Thuốc thử Stiasny: 20ml dung địch formol 36%, 10ml HCI đậm đặc
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm Imil thuốc thứ, đun nóng, thấy xuất hiện khối vô định hình mầu nâu xám chứng tỏ trắc nghiệm đương tính
© Thuốc thử acetat chi: Dung dich acetat chì bão hòa trong nước
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm đùng làm ống chuẩn,
- Cho 2ml mẫu thứ vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt acetat chì, nhận thấy xuất hiện trầm hiện vàng nâu dạng bột chứng tỏ trắc nghiệm dương tinh
øsThuốc thử FeCl, 1%:
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giot FeCl, 1%, nhận thấy dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang mâu xanh đen hoặc xanh lục
chứng tỏ trắc nghiệm dương tính
4.1.5, Định tinh glicosid
- Phân đường của giicosid được định tính dựa vào thuốc thử Tollens,
- Phan aglicol được định tính dựa vào các thuốc thử Baljet va Molish
® Tạo mẫu thử: có hai cách để tạo mẫu thử
- Đối với cao eter đầu hỗa: ngâm cao với alcol edil, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
- Đối với mẫu cây khô: cân 10 gam bột khô, tận trích bằng alcol etil Lọc lấy dịch trích và thêm vào đó dung dịch acetat chì 10%, lắc đều, để yên Sau đó, thêm
dung dich Na,SO, vao để loại trừ lượng chì thừa Lọc trầm hiện PbSO,, lấy dịch
lọc này hòa thêm alcol ebl 95% và lọc lại để lấy phần dịch làm mẫu thử,
(Qui trình thực hiện được trình bày trong sơ đồ 2 - sơ đồ SOOS)
Trang 6
62
® “Thuốc thử Tollens: AgNO: trong dung dịch amoniac
: Cách pha thuốc thứ Tollens: Thêm dung dich NH,OH dam đặc vào IOml dụng dịch AgNO; 5% đến khi có trầm hiện AgOH vừa xuất hiện bị tan Tiếp tục thêm
1 giọt NaOH 10%, nếu có trầm hiện thì thêm NH,OH cho tan tram hién
- Cách thử: Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch mẫu
thử, lắc nhẹ vài giây rồi để yên, thấy có một lớp gương sáng bạc bám lên thành ống nghiệm Nếu không thấy phản ứng ở nhiệt độ thường thì nhúng ống nghiệm
vào nước nóng, Đôi khi lớp gương không hình thành được do ống nghiệm không sạch hoặc phản ứng chưa đủ thì vẫn có bạc kim loại màu xám đen kết tủa cho
thấy trắc nghiệm đương tính
e© Thuốc thử Baljet (định tính vòng lacton 5 cạnh): Acid picric trong alcol etil
20% (20ml), NaOH 5% (10m)
- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, rồi thêm 2mi mẫu thử, đun nhẹ,
hỗn hợp chuyển dẫn sang màu đa cam, có xuất hiện mội ít kết tủa chứng tổ trắc
nghiệm đương tính,
® “Thuốc thử Molish: Thimol xanh 2% (1- 2 giọÐ, 1ml HạSO¿ đậm đặc
- Cho 2ml thuốc thứ vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, cho từ từ mẫu thử vào, hỗn hợp
từ tím hồng đối sang màu đỏ, có kết tủa, chứng tổ trắc nghiệm dương tính
4.1.6 Định tính alcaloid: dựa trên các phản ứng tạo thành trầm hiện với các
thuốc thử: Bouchardat, Mayer, Hager, Dragendorff và Bertrand
Có ba phương pháp xác định sự hiện diện của alcaloid
- Phương pháp Harold - St John (1959) dùng bội cây khó
- Phương pháp Debray (1961) dùng mẫu cây tươi
Trang 7
ba câu cên điện (á dài 63
Sơ đồ 2: Qui trình điều chế cao alcol để định tính
gicosid theo phương pháp SOOS (có sửa đổi)
-Ngâm, tận trích bằng
etanol
- Lọc, cô quay, thu hổi dụng
- Chế hóa với dung
địch acetat chì 10%
| - Loc
Trâm hiện
- Chế hóa với dung
địch Na;SO¿ bão hòa
- Loc
can dung dich
- Hòa tan cặn trong
¿ etanol 95%
(
Trang 8
64
- Phương pháp Scheuer (1962) dùng cao alcol
Ở đây chúng tôi áp dụng phương pháp Scheuer,
® Tạo mẫu thử:
Cân 2 gam mẫu thử bột cây khô, trích bằng 150ml dung môi alcol etil 95% sau 2 gid Loc lay địch alcol, cô cạn dung môi dưới áp suất kém thu được cao
alcol, hòa tan cao này trong hỗn hợp eter etil: cloroform (1:1) và HCI 1% Lấy
địch acid này làm mẫu thử
® Thuốc thử Bouchardat: I, (2,5g); KI (5g); nước cất (100ml)
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rổi nhỏ từ từ thuếc thử vào, nhận thấy có kết tủa nâu sậm hay vàng đậm rõ rệt ngay tức khắc, kết tủa bền, không tan trong thuốc thử dư, chứng tô trắc nghiệm dương tính
e Thuốc thử Mayer: HgCI; (1,3óg); KI (5g); nước cất (100ml)
- Hòa tan HgCl; trong 6Ôml nước, hòa tan KĨ trong 4Öml nước
- Trộn đều hỗn hợp, để yên, lọc Lấy dịch lọc này làm thuốc thử
Tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất
hiện kết tủa màu trắng chuyển sang vàng nâu, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính
ø Thuốc thử Hager: Dung dịch acid picric bão hòa trong nước,
Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất hiện nhiều kết tủa vàng, chứng tỏ trắc nghiệm đương tính
e Thuốc thử Dragendorf: Bi(NO¿); (8g); HNO; 30% (20 - 25m); KI (28g);
HCI 6N (khoảng 10ml); NaOH 6N (5ml) và nước cất (100ml)
- Hòa tan 8g BIỚŒNO¿); trong 20 - 25 mi dung dịch HNO:; 20%
- Hòa tan 28g KI bằng imi dung dich HCI 6N, sau đó thêm 5 mi nước cất vào
Cho từ từ dung dịch BIƠNO;); pha trong acid HNO: nói trên vào, rỗi thêm nước
cất cho đủ 100ml (dung dich D)
Trang 9
ĐỂ tạo thuốc thử, lấy 2ml dung địch D và thêm lần lượt 20ml nuớc cất, 5ml
dụng dịch HCI 6N và 5ml dung dịch NaOH 6N (nếu thấy xuất hiện kết tủa thì có
thể thêm vài giọt dung dịch HCI 6N vào) Thuốc thử này phải được bảo quần
trong bóng tối ở 4°C,
Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thứ Bouchardat, nhận thấy xuất hiện ngay tức khắc nhiều kết tủa màu vàng cam trong dung dich mau dé gạch, chứng tỏ trắc nghiệm đương tính,
® Thuốc thử Bertrand: Acid silicotungstic (5g); nước cất (100ml),
- Cho 2ml mẫu thứ vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn
- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rồi nhỏ từ từ thuốc thứ vào, nhận
thấy có kết tủa màu vàng, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính
4.1.7 Định tinh iridoid
se Tạo mẫu thử: Lay 0,5g cao cho vio 10ml alcol etil, đun hoàn lưu, lọc Sau
đó, thêm vào dịch lọc 1Ômil nước cất, 2ml dụng dịch acetat chì 2%, lọc lại lần
2 Cho H;SOx vào dịch lọc lần 2 để loại bổ chì thừa bằng kết tủa PbSO,, lọc
bỏ kết tủa Dịch sau cùng này trong một ít alcol etil đùng làm mẫu thử
se Thuốc thử Trim HIH: CH;COOH (10m); CuSO, 2% (1ml); HCI đặc (0,5m),
Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm rồi thêm l - 2 giọt thuốc thử, đun nhẹ, nhận thấy dung dịch chuyển sang xanh lục, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính 4.1.8, Dinh tinh saponin
Saponin là một nhóm chất glycosid có đặc tính chung là khi hòa tan vào
nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bê mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện của saponin
Dược điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọi là đệ pha
loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bet cao Icm, sau khi lắc trong ống nghiệm tiến hành trong điêu kiện qui định
Trang 10
66
Đun sôi 1 gam bột nguyên liệu khô trong 100ml nước cất thời gian 30 phút Lọc, để nguội, thêm nước vào cho đủ 100ml, Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao
lócm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ral, bịt miệng ống nghiệm
và lẮc từng ống theo chiều đọc trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần, Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt
Nếu chiêu cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm đêểu dưới lcm, chỉ số
bọt dưới 100 nghĩa là không có saponin
Nếu ống nghiệm thứ n có cột bọt cao lem thi chỉ số tạo bọt được tính như
sau: chỉ số tạo bọt = 10x1
9,01 xm
Nếu ống số 1 và ống số 2 có cột bọt cao Ì em hoặc cả 10 ống đều có cột
bọt cao hơn 1 cm thì cần pha loãng để có chỉ số chính xác
Kết quả định tính sự hiện điện một số hợp chất hữu cơ trong cây An điển lá
đầy được trình bày trong bắng 5 ở phần nghiên cứu và kết quả
4.2 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ
4.2.1 Xử lý cao cloroform A của sơ dé 1
Pha bột Á trong hệ dung môi cloroform-metanol, dùng bột than lầm sạch,
kết tỉnh lại , được CRAS-I
4.2.2 Sắc ký côt trên cao cloroform B của sơ đề 1
Cao cloroform B (2,96 g) được nạp vào đầu cột silica gel, lần lượi giải ly
bằng các hệ dung môi tăng dần tính phân cực, khởi đầu từ benzen, dung dịch giải
ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 5Oml, các lọ cho sắc ký lớp móng giống nhau gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 6,