Thực nghiệm thành phần hóa học của cây quả nổ , họ ô rô

Thực nghiệm thành phần hóa học của cây quả nổ , họ ô rô

Dhan thue nghiim

4.1, NGUYEN LIEU, HOA CHAT, THIET BI, SU DUNG TRONG NGHIÊN CỨU

4.1.1 Héa chat

e Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điểu chế, sắc ký bản mỏng gồm: eter dầu hỏa (60°C- 90°C), n-hexan, benzen, cloroform, acetat etyl, aceton,

metanol và etanol đều là hóa chất Trung Quốc và được làm khan bằng CaCl; nếu

sử dụng lại

s Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ trên bản mỏng, phun xịt bằng

acid sulfuric đậm đặc

4.1.2 Thiết bị

e Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tỉnh, becher)

® Máy cô quay chân không Buchi- I 1 1

e Cột sắc ký: cột khô, cột cổ điển

e Sắc ký bản mỏng 25DC — Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel Fzzs¿ Merck

Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne

Các thiết bị ghi phổ:

Phố IR: Ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IR-470 SHIMADU,

BRUKER- EQUINOX 55

- Phổ MS: Ghi trên máy 5989B-HP-MS-Engine

- Phổ !H_NMR, !C—NMR, kết hợp với phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tân số 500 MHz cho 'H-NMR và 125 MHz cho phé "°C

Tất cả phổ được ghi tại phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học - Viện

Khoa học và Công nghệ, số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

(‘Phdéa tude aghiéien

4.2 PHUONG PHAP TACH CHIET VA CO LAP CAC HOP CHAT TU LA

CÂY QUÁ NỔ

4.2.1 Điều chế cao etanol

Bột cây khô được ngâm đầm trong lọ thủy tình (đoại 20 líQ khoảng 24 giờ,

lọc, cô cạn dung môi ở 50°C, thu được cao etanol, Lập lại quá trình trên nhiều lần đến khi trích kiệt

4.2.2 Điều chế cao eter dau héa, cao cloroform, cao acetat etyl, cao metanol

Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các

đơn dụng môi từ không phân cực đến phân cực, theo đối quá trình bằng sắc ký bản mỏng rồi cô quay thu hồi dụng môi sẽ thu được các loại cao tương ứng

4.2.3 Cô lập các hợp chất có trong các loại cao,

Tiến hành sắc ký cột (nhanh cột khô, cổ điển) các loại cao, sau đó sắc ký

cột và sắc ký điều chế nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập các hợp chất Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc ký bản móng với thuốc

thử hiện hình là acid sulfuric đậm đặc

4.3 THỨ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

4.3.1 Thử nghiệm độc tinh Brine Shrimp")

Dung cu:

- Becher các loại: 250ml (2 chiếc), 500ml (2 chiéc), 1000ml (2 chiéc) ding

để ấp trứng

- Khay thứ với các ống nghiệm có vạch định mức 5ml, kính hip, dén pin nhỏ

- Ống đong 10ml (3 chiếc) có chia vạch 1ml, 5ml

- Pipettman sif dung cone 10-1001, 100- 1000 pl

(hân thie aghiém

- kọ thủy tính loại 5ml (10ml) cé ndp day kin ding dé pha mdu thi

Hóa chất:

~ Dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide) loại tính khiết, hãng Prolabo

- Nước biển (loại dùng để nuôi cá cảnh biển), nước cất,

Nguyên liêu: Trứng Artemia salina

Cách tiến hành:

e Ap trứng thành ấu thể,

- Cân 0,1 gam trứng cho mỗi lần thử (khoáng 100 ống nghiệm), cho vào

becher, ngâm với 150 ml nước cất trong 30 phút, lọc trứng trên giấy lọc và phếu thủy tinh

- Dùng ống hút bơm nước biển rửa trứng trên giấy lọc cho chảy vào một

becher có chứa sẵn 100 ml nước biển Sau đó thêm nước biển vào cho đủ 250

mi,

- Ngâm becher vào một thau nước nhỏ để giữ nhiệt độ trong khoảng 28 °C — 34°C (trên 35 °C ấu trùng sẽ chết) Không cần đậy kín, để yên becher sau 48 giờ

- Dùng đèn pin soi cho ấu thể tập trung tại vùng có ánh sáng, rồi dùng ống hút chúng thả riêng vào một becher có chứa sẵn 150 mÌ nước biển sạch (nếu

trước 48 giờ mà thấy ấu thể nở nhiều và bơi khóe thì nên hút chúng để riêng dẫn

theo cách như trên nhằm tạo điều kiện cho ấu thể hô hấp tốt) Chỉ sử dụng ấu thể

nổ trong khoảng thời gian từ 48 - 72 giờ

e Cách pha mẫu

- Pha mẫu cái: Đối với cao nên pha ở nếng độ lớn, tầy vào kết quá độc tính

mà có sự giấm hoặc tăng nồng độ cho lần thử tiếp theo Cân 30mg cao cho vào

lọ, nhỏ vào một ít dung môi DMSO hoặc dung môi trích cao để hòa tan (tổng thể

tích DMSO và dụng môi trích cao < 150 ñÙ, có thể đun cách thúy nhẹ để cao tan

Dhan thie nghigm

tốt hơn Thêm 3 ml nước biển vào lọ, đậy nắp, lắc đều

- Pha mẫu chứng :

Mẫu chứng dung môi trích cây: cân 30 mg dung môi trích cây cho vào lọ, nhỏ thêm vài giọt DMSO để giúp dung môi dễ phân tán trong nước (thể tích

DMSO < 150 yl), rồi thêm 3 ml nước biển, đậy nắp, lắc đều

Mẫu chứng DMSO: hòa tan 150 pl DMSO bang 3 ml nước biển trong lọ

Cách tính:

e Tinh néng dé

- Mau cdi: 30 mg/ 3ml twong dong 5mg/500 yl Nhu vay, néu hut 500 pl

sẽ có chứa 5mg mẫu chất Sau khi thêm nước biển cho đủ 5 ml thi néng dé khi đó

sẽ là 1000 ng/ nI, tính tương tự cho các nồng độ khác

- Mẫu chứng dung môi trích cây: nếu pha mẫu cái ở nổng độ nào thì mẫu

chứng dung môi trích cây cũng phải được pha ở nồng độ đó

- Mẫu chứng DMSO: có thé không cần tính nồng độ nhưng với 150 pl

DMSO/3ml nước biển (sử dụng lượng bằng với lượng hòa tan cao), cũng hút 500

ul, 250 pl, 50 pl cho vào mẫu thử

e Tính toán liều LCsg

Liều LCsạ là liều mà mẫu thử được pha với nồng độ xác định có thể giết

chết 50% ấu thể Artemia salina trong vong 24 gid Néu số lượng ấu thể chết ít hơn 50% ở một nồng x nào đó và chết 100% ở nồng độ lớn hơn 10x, thì phải thử

nghiệm lại ở những nồng độ loãng hơn trong khoảng x đến 10x để xác định chính xác liều LCao

Cách thử:

Từ becher chứa ấu thể, ding pipette pasteur hut 10 con Artemia salina cho

vào mỗi ống nghiệm, sao cho thể tích nước biển trong ống đạt ống đạt khoảng 4

tôm thuge “uy mm

ml Bơm mẫu chất vào ống thử rồi thêm nước biển cho đủ 5ml/ ống nghiệm

Khay thử được che đậy, để yên sau 24 giờ Dùng kính lúp đếm số lượng ấu thể

chết ở mỗi ống nghiệm, suy ra tỷ lệ con chết do dung dịch thử nghiệm ở mỗi nông độ

4.3.2 Thứ boạt tính của các loại cao trên 1 số chúng vi khuẩn

Các thử nghiệm hoạt tính sinh học được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh li Động vật, khoa Sinh, trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hễ Chí Minh

Dung cụ: - Đĩa petri vô trùng, ống nghiệm, kẹp vô khuẩn

- Đĩa giấy đường kính 6mm

- Nỗi hấp vô trùng autoclave

Héa chat: Thach MHA (Mueller Hinton Agar), thạch dinh dudng Nutrient agar Nguyên liêu: Các chúng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus

Cách tiến hành:

- Cấy các chủng vi khuẩn lên mặt thạch định dưỡng Nutrient agar rỗi ú các hộp

thạch ở 37 ?C qua đêm

- Khi các khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản mọc thành khóm) xuất hiện, chọn 3 ~ 5

khuẩn lạc riêng lẻ, giống nhau để làm huyển dịch vi khuẩn trong ống nghiệm

chứa 5 ml nước muối sinh lí,

- Cho 38 g môi trường MHA vào Ì lít nước cất, đun cách thủy đến tan hoàn toàn

Khử trùng bằng nổi hấp autoclave ở 12Í °C trong 30 phút Để thạch nguội đến 50

°C thì cho ra đĩa Petri, độ dày thạch 4 mm Ú qua đêm ở 37 °C để kiểm tra độ vô

trùng Loại bó hộp nhiễm

(Dhan thate aghiéiae

- Ding bông vô trùng nhúng vào huyền dịch vị khuẩn rỗi trải trên mặt thạch

- Dùng kẹp vô khuẩn kẹp địa giấy đã tẩm cao cân thử hoạt tính đặt lên mặt thạch,

Lam tương tự với đĩa giấy tẩm nước cất để làm mẫu chứng Lật ngược hộp thạch

ủ ở 37C Sau 18 giờ đọc đường kính vòng vô khuẩn

Chiu Thi Dhuteng Thao trang 59