Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH HỌC VI SINH

Nhóm sinh viên thực hiện : NHÓM 3, T6, Tiết 7

Năm học : 2022 – 2023

Tháng 10-2022

MỤC LỤC

I TIẾN HÀNH TẬP GÓI ĐĨA……… 1

II CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH…….2 III NHUỘM GRAM VÀ QUAN SÁT NẤM……… 13

TIẾN HÀNH TẬP GÓI ĐĨA

1 Nguyên liệu:

- Giấy báo

- Đĩa (từ 8-10 đĩa)

2 Quy trình thực hiện:

Sau khi đĩa được rửa sạch, để khô tiến hành gói đĩa đem hấp khử trùng

Bước 1: Lựa chọn giấy báo có kích thước phù hợp Xếp đĩa thành một chồng

khoảng mười bộ đĩa, đặt trên mặt phẳng sạch

Bước 2: Đặt chồng đĩa nằm ngang dọc mép ngang tờ giấy báo, quấn giấy báo

quanh 2/3 chồng đĩa nằm ngang, gấp hai mép giấy vuông góc mặt phẳng

Bước 3: Một tay cầm chặt, làm trước một phía, đẩy nhẹ về trước sử dụng ba ngón

tay gấp mép giấy theo hướng xéo 1/3 đĩa ép sát vào vành đĩa, đẩy nhẹ về trước gấp thêm một nếp gấp nữa, chuyển tay gấp bên còn lại

Bước 4: Tiếp tục cuộn về phía trước, gấp đến hết mép giấy ở hai đầu, gấp mép

giấy cuối cùng song song với mép giấy đầu tiên giữ 1/2 mép giấy cuối gấp vuông góc với mép giấy đầu tiên để giữa chặt, tiến hành làm bên còn lại

Mục đích cần gói đĩa: Hạn chế nhiễm vi sinh vật hiếu khí vào đĩa, dễ dàng di

chuyển vào ra nồi hấp

Lưu ý: Cần gói chặt tay, tránh lỏng lẻo, gấp mép giấy thứ hai trở đi xéo 1/3 đĩa tránh gấp vuông góc vào tâm

Hình 1 Hình 1 a,b) Một chồng gói mười bộ đĩa được chụp các mặt

CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH

Thực hành những công việc sau: tập xoay đĩa, chuẩn bị môi trường dịch trích giá đậu, đổ đĩa môi trường và luyện tập các thao tác cấy

I Cách pha chế môi trường, cần chính xác:

1 Gồm các bước sau:

- Cân các thành phần môi trường

- Nếu là môi trường lỏng: pha các thành phần vào nước, chú ý thứ tự pha chế

- Nếu là môi trường đặc: hòa tan thành phần vào nước rồi thêm 1,5-2% agar và đun đến khi agar tan chảy

- Lọc: thường lọc môi trường qua vải hoặc bông

- Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật hoặc yêu cầu nghiên cứu

- Phân phối vào dụng cụ chứa: nếu là bình chứa thì cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, nếu là làm môi trường thạch đĩa thì cho vào khoảng 10-15ml/đĩa, nếu làm thạch nghiêng thì cho vào 1/4-1/5 chiều cao ống nghiệm

- Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu là nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC, 1 atm) nhằm tiêu diệt tất cả các bào tử cũng như các vi sinh vật không mong muốn có sẵn trong môi trường

2 Thực hiện pha chế môi trường dịch trích giá đậu:

trường dịch giá đậu qua vải hoặc rây lọc

Bước 3: Sử dụng ống đong đong 500ml môi trường dịch giá đậu đã được lọc cho

vào bình chứa các nguyên liệu đã cân ở bước 1, lắc đều hỗn hợp

Bước 4: Sử dụng ống đong phân phối vào 2 bình chứa mỗi bình 250ml hỗn hợp ở

bước 3, hơ miệng bình chứa hỗn hợp trên đèn cồn để khử khuẩn miệng bình chứa,

sử dụng nút bông không thấm nước để đóng chặt miệng bình chứa, bao quanh lớp báo và cố định bằng dây thun và đem tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút

Lưu ý:

- Sử dụng giấy bạc, giấy kính không thấm nước đặt lên cân để cân nguyên liệu

- Cần xoay tròn nút bông để đóng chặt miệng tránh ép vỡ bình môi trường, đóng chặt nút bông và không để môi trường chạm vào nút bông, đóng không chặt dẫn đến tình trạng một số vi sinh vật xâm nhập vào môi trường

Sau khi đã chuẩn bị được môi trường, chúng ta sẽ thực hiện công việc đổ đĩa

1 Các bước khử khuẩn trước khi tiến hành công việc đổ đĩa:

dụng giấy hoặc vải sạch lau tủ cấy nhằm hạn chế vi sinh vật, lau một chiều từ trên xuống, lau hai bên thành tủ cấy, lưu ý tay không chạm vào mặt kính của tủ, tiếp theo lau mặt bàn tủ cấy, cuối cùng lau mặt kính tủ, tiến hành lau phía còn lại

Bước 2: Khử khuẩn những vật dụng cần sử dụng trước khi đem vào tủ cấy bằng

cồn 70o, lau các bề mặt vật dụng (đĩa petri, đèn cồn, bút, bật lửa ) bằng cồn 70ocần cho việc thao tác

2 Các bước tiến hành thao tác đổ đĩa:

Bước 1: Sắp xếp các vật dụng theo chiều tay thuận để thuận tiện cho người cấy

trong phạm vi làm việc trong tủ cấy Ngồi đúng vị trí thoải mái, hai tay thao tác trong phạm vi thao tác của tủ cấy

Bước 2: Tiến hành đổ đĩa, thực hiện các thao tác gần đèn cồn, hơ nút bông trên

ngọn lửa đèn cồn, tiến hành mở nút bông bình môi trường bằng cách xoay tròn nút bông, đặt nút bông tại chỗ quy định, cần khử khuẩn xung quanh miệng của bình môi trường bằng đèn cồn

Bước 3: Lấy đĩa, xoay vành đĩa trên đèn cồn nhằm khử khuẩn bề mặt xung quanh

của đĩa, khi mở đĩa để đổ môi trường cần phải giữ thăng bằng đĩa, tiến hành các thao tác gần đèn cồn

Bước 4: Tiến hành đổ đĩa, đổ môi trường 2/3 đĩa, nghiên nhẹ cho môi trường trải

đều ra đĩa, hơ qua đèn cồn vị trí vừa mở nắp để đổ đĩa và xoay vành đĩa nhằm khử khuẩn, đặt nhẹ đĩa xuống mặt bàn tủ cấy, khử khuẩn miệng bình môi trường bằng đèn cồn, tiếp tục thực hiện các thao tác đổ đĩa khi đạt yêu cầu số lượng

Bước 5: Khử khuẩn miệng bình môi trường, xoay nút bông để đóng bình môi

trường nếu không thực hiện thao tác đổ đĩa nữa, xếp chồng gọn các đĩa đã đổ môi trường, tắt đèn cồn, lặp lại các bước khử khuẩn tủ cấy và vật dụng khi kết thúc công việc

Lưu ý:

- Thao tác trong phạm vi tủ cấy và thực hiện gần đèn cồn nhằm hạn chế vi sinh vật

- Không chống tay khi thực hiện các thao tác trong tủ cấy, gây nguy hiểm khi thao tác với đèn cồn

- Khi lấy nút bông ra cần xoay tròn nút bông để có thể kéo tất cả những gì bám trên miệng bình môi trường để tránh nhiễm vi sinh vật

- Thao tác quay đĩa vừa phải, quá nhanh dẫn đến chưa khử khuẩn kịp, quá chậm dễ gây bỏng trong quá trình xoay đĩa để khử khuẩn đĩa

- Mở đĩa càng nhỏ để tỉ lệ nhiễm vi sinh vật khác càng thấp

- Đổ môi trường quá ít dẫn đến tính trạng dễ bị rách môi trường, đổ quá nhiều môi trường gây tốn môi trường và có thể dẫn đến môi trường dính lây lan lên nắp đĩa làm tỷ lệ nhiễm vi sinh vật khác nhanh hơn vì khi đổ môi trường lỏng nóng hơi nước bốc lên bám trên nắp đĩa mà kết hợp dinh dưỡng tạo môi trường cho các vi sinh vật khác phát triển nên tỷ lệ nhiễm vi sinh vật khác cao hơn

III Phương pháp cấy:

1 Các kĩ thuật cấy:

Để chuyển vi sinh vật từ môi trường rắn sang môi trường khác thì người ta chủ yếu

sử dụng que cấy vòng/thẳng hoặc que cấy móc

Khi sử dụng que cấy, thường que cấy sẽ được tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn hoặc

đèn Bunsel Khi tiệt trùng phải đảm bảo đầu que cấy hoặc bất cứ thành phần nào

của que cấy phải được tiệt trùng hoàn toàn bằng cách đốt nóng đỏ (quy tắc 3 giây)

2 Luyện tập các thao tác cấy:

2.1 Nhiệm vụ:

Thực hiện các thao tác cấy sử dụng các que cấy vòng, que cấy trãi, que cấy móc

trên 2 môi trường dịch trích giá đậu (GD) và môi trường Potato Dextrose Agar

(PDA)

Mỗi nhóm 18 đĩa, mỗi thành viên sẽ thực hiện đổ 3 đĩa cho 3 thao tác cấy trên 2

loại môi trường

2.2 Tiến hành các thao tác cấy:

2.2.1 Các bước khử khuẩn trước khi thực hiện các thao tác cấy trong tủ cấy:

Tương tự như việc đổ đĩa, trước khi cấy cần khử khuẩn tay, tủ cấy và dụng cụ

trước khi cho vào tủ cấy

dụng giấy hoặc vải sạch lau tủ cấy nhằm hạn chế vi sinh vật, lau một chiều từ trên

xuống, lau hai bên thành tủ cấy, lưu ý tay không chạm vào mặt kính của tủ, tiếp

theo lau mặt bàn tủ cấy, cuối cùng lau mặt kính tủ, tiến hành lau phía còn lại

Bước 2: Khử khuẩn những vật dụng (đĩa petri, đèn cồn, bút, bật lửa, lọ cồn chứa

que cấy, mẫu cấy…) cần sử dụng trước khi đem vào tủ cấy bằng cồn 70o, lau các

bề mặt vật dụng cần cho việc thao tác, sắp xếp gọn gàng thuận với chiều tay thao

tác

2.2.2 Cấy trên đĩa môi trường thạch khoai tây (PDA) bằng que cấy móc:

2.2.2.1 Các bước tiến hành:

Bật đèn cồn, thực hiện thao tác gần đèn cồn, ghi chú thông tin trên nắp đĩa cấy,

điều chỉnh lại vị trí ngồi

Bước 2: Lấy que cấy móc hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đỏ đầu que cấy, xoay

theo phương ngang hơ dần dần đến tay cầm của que cấy móc, xoay tròn que cấy để

tiệt trùng hết que cấy, đốt đầu que cấy đỏ lần nữa

Bước 3: Tiến hành lấy mẫu đĩa có nấm, khuẩn (kiểm tra độ nóng bằng cách chạm

vào môi trường không có nấm, khuẩn), thực hiện thao tác trên hai tay, một tay cầm

que cấy, 1 tay cầm đĩa, xoay vành đĩa có nấm, khuẩn trên lửa đèn cồn, tiến hành

lấy mẫu, ngón cái mở nhỏ đĩa chứa mẫu sử dụng que cấy đã tiệt trùng cào nhẹ lên

vùng có nấm, khuẩn, lấy mẫu ra, đậy nắp đĩa sau đó tiếp tục xoay đĩa chứa mẫu

trên ngọn lửa đèn cồn để tránh vi sinh vật xâm nhập

Bước 4: Tiếp đến lấy 1 đĩa môi trường mới, tiến hành xoay đĩa trên ngọn lửa đèn

cồn sau đó mở nhỏ nắp đĩa ra thực hiện thao tác cấy móc chấm 1 điểm (3 điểm tam

giác, 2 điểm đối xứng), kết thúc cấy móc, tiếp tục xoay vành đĩa trên ngọn lửa đèn

cồn để hạn chế vi sinh vật khác xâm nhập, cuối cùng khử khuẩn que cấy móc trên

ngọn lửa đèn cồn, úp ngược đĩa cấy khi hoàn thành, đem đĩa đi bảo quản

Lưu ý:

- Thực hiện các thao tác gần đèn cồn, trong phạm vi tủ cấy

- Tiệt trùng kĩ que cấy tránh nhiễm vi sinh vật khác

- Khử khuẩn vành đĩa cẩn thận

2.2.2.2 Tiến hành đánh giá kết quả:

Hình 3 a,b: Cấy nấm trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy móc

Nhận xét: Hình 3 a) Tình trạng bị nhiễm vi sinh vật khác xung quanh vành đĩa

Hình 3 b) Tình trạng nấm cấy không lên, không phát triển

2.2.2.3 Đánh giá nguyên nhân, mục đích và hướng khắc phụ:

a Nguyên nhân:

- Khi lấy mẫu nấm, que cấy còn quá nóng chưa kiểm tra độ nóng bằng cách chạm vào môi trường không có nấm, khuẩn lấy mẫu trực tiếp gây tình trạng làm chết nấm, tiến hành cấy không nhận được kết quả (Hình 3 b)

- Trong quá trình cấy que cấy chưa được khử khuẩn kĩ dẫn đến tình trạng nhiễm các

vi sinh vật khác (Hình 3 a,b)

- Tay chưa sát khuẩn, vành đĩa chưa được khử khuẩn cẩn thận, gây tình trạng nhiễm

vi sinh vật quanh vành đĩa (Hình 3 a,b)

- Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc quá đông người, quá trình thao tác thực hiện tiệt trùng không kĩ gây tình trạng nhiễm các vi sinh vật xung quanh (Hình 3 a,b)

- Khi thao tác xong úp ngược đĩa

- Kiểm tra độ nóng que cấy trước khi lấy mẫu để cấy

- Luyện tập nâng cao kỹ năng

2.2.3 Thực hiện kỹ thuật cấy ria chữ T, cấy trên đĩa môi trường giá đậu bằng que cấy vòng:

2.2.3.1 Các bước tiến hành:

đèn cồn, thực hiện thao tác gần đèn cồn, ghi chú thông tin trên nắp đĩa cấy, điều chỉnh lại vị trí ngồi

Bước 2: Lấy que cấy vòng hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đỏ đầu que cấy, xoay

theo phương ngang hơ dần dần đến tay cầm của que cấy vòng, xoay tròn que cấy để tiệt trùng hết que cấy, đốt đầu que cấy đến khi đỏ thêm một lần nữa

Bước 3: Tiến hành lấy mẫu đĩa có nấm, khuẩn (kiểm tra độ nóng bằng cách chạm

que cấy, 1 tay cầm đĩa, xoay vành đĩa có nấm, khuẩn trên lửa đèn cồn, tiến hành lấy mẫu, ngón cái mở nhỏ đĩa chứa mẫu sử dụng que cấy vòng đã tiệt trùng cào nhẹ lên vùng có nấm, khuẩn, lấy mẫu ra, đậy nắp đĩa sau đó tiếp tục xoay đĩa chứa mẫu trên ngọn lửa đèn cồn để tránh vi sinh vật xâm nhập

Bước 4: Tiếp đến lấy 1 đĩa môi trường giá đỗ, tiến hành xoay đĩa trên ngọn lửa đèn

cồn sau đó mở nhỏ nắp đĩa ta thực hiện thao tác cấy ria chữ T, đặt que cấy vào góc

xa nhất của đĩa thạch, áp que cấy xuống đĩa thạch bắt đầu ria theo đường Z dày (tạo sinh khối dày) sát vào nhau đến khoảng 1/3 đĩa thạch ta dừng lại, đậy nắp quay 90o

hơ trên ngọn lửa đèn cồn, kéo 1 đường từ vùng thứ nhất sang vùng thứ 2 rồi tiếp tục ria cấy các đường Z (tạo sinh khối thưa hơn vùng thứ nhất) sát vào nhau không chạm vào vùng thứ nhất nữa, đến một nữa thạch còn lại ta xoay 90o khử khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn, ta kéo 1 đường vùng thứ 2 sang vùng thứ 3 rồi ria theo đường Z (thưa hơn vùng thứ 2), đậy nắp và hơ trên ngọn lửa đèn cồn, tiệt trùng que cấy vòng,úp ngược đĩa cấy khi hoàn thành, đem đĩa đi bảo quản

Hình minh họa Bước 4

Lưu ý:

- Cẩn thận khoảng cách khi tạo sinh khối các vùng

- Thực hiện các thao tác gần đèn cồn, trong phạm vi tủ cấy

- Tiệt trùng kĩ que cấy vòng tránh nhiễm vi sinh vật khác

- Khử khuẩn vành đĩa cẩn thận

- Tránh cấy đường cấy thứ 3 quá sát

2.2.3.2 Tiến hành đánh giá kết quả:

Hình 4 a,b: Kỹ thuật cấy ria, cấy bằng que cấy vòng

Nhận xét:

Hình 4 a: Chưa cấy đều hết khung đĩa, những đường cấy sau chạm vùng cấy trước

tạo vùng sinh khối

Hình 4 b: Chưa cấy đều hết khung đĩa, những đường cấy sau chạm vùng khác tạo

vùng sinh khối và bị nhiễm vi sinh vật khác, đường sinh khối thứ 3 chưa bắt ngang

- Tay, vành đĩa chưa được khử khuẩn cẩn thận, gây tình trạng nhiễm vi sinh vật

quanh vành đĩa ( Hình 4 a,b)

- Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc quá đông

người, quá trình thao tác thực hiện khử trùng không kỹ gây tình trạng nhiễm các vi

sinh vật xung quanh (Hình 4 a,b)

- Kỹ năng cấy chưa tốt ( Hình 4 a,b)

b Mục đích:

- Được sử dụng cấy chuyền đều nhằm mục đích chuyển vi sinh vật từ môi trường

cũ sang một môi trường mới

c Hướng khắc phục:

- Cấy đều hết khung đĩa

- Khử khuẩn cẩn thận, cấy tròn vành đĩa hết khung đĩa

- Cấy đúng các đường sinh khối, cấy thưa đường thứ 3 tạo khuẩn lạc

- Luyện tập nâng cao kỹ năng

- Hạn chế người làm việc xung quanh tủ cấy

2.2.4 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy trãi, trên môi trường giá đậu (GD):

2.2.4.1 Các bước tiến hành:

Bước 1: Thực hiện tất cả các bước khử khuẩn trước khi cấy đã được nêu ở trên

Bật đèn cồn, thực hiện thao tác gần đèn cồn, lấy đĩa cấy dùng bút đánh dấu thông tin, điều chỉnh lại vị trí ngồi

Bước 2: Xoay tròn tháo nút bông đậy ống nghiệm, đặt nút bông tại vị trí thích hợp,

lấy ống nghiệm đựng dung dịch mẫu pha loãng, hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, lắc ống nghiệm trộn mẫu Sử dụng micropipet hút 100 µL mẫu, bơm mẫu vào đĩa môi trường đã được khử khuẩn vành đĩa trên ngọn lửa đèn cồn Khử khuẩn que cấy trãi trên ngọn lửa đèn cồn, mở đĩa (dùng que cấy trãi quét nhẹ lớp hơi nước trên nắp đĩa (nếu có) hoặc chờ từ 10-15 giây để que cấy trãi giảm độ nóng)

Bước 3: Cấy trãi cấy đều tay, tốc độ cấy nhanh, cấy tròn vành đĩa, cấy tới khi mặt

môi trường đĩa cấy khô (nhận diện nhờ ánh sáng đèn tủ cấy), kiểm tra xung quanh vành đĩa, đến khi khô hoàn toàn, đóng nắp, tiến hành khử khuẩn lại que cấy trãi và vành đĩa hơ trên ngọn lửa đèn cồn, úp ngược đĩa cấy khi hoàn thành, đem đĩa đi bảo quản

Lưu ý: - Trong quá trình thao tác sử dụng micropipet, tay cố định không dốc ngược micropipet

- Dùng que cấy trãi quét nhẹ lớp hơi nước trên nắp đĩa (nếu có) để tránh nhỏ xuống

bề mặt môi trường dẫn đến kết quả đĩa cấy bị vết loang

- Cấy đều tay, nhẹ nhàng, tròn vành đĩa và cấy đến khi mặt đĩa khô hoàn toàn

2.2.4.2 Tiến hành đánh giá kết quả:

Hình 5 a, b, c: Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que trãi

2.2.4.3 Đánh giá nguyên nhân, mục đích và hướng khắc phục:

a Đánh giá nguyên nhân:

- Thao tác quá mạnh tay dẫn đến rách môi trường (Hình 5a)

- Cấy không đều tay, cấy trãi chưa khô dẫn tới sai kết quả, sinh khối xếp chồng lên nhau và không tạo được khuẩn lạc đơn (Hình 5a, b)

- Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc quá đông người, quá trình thao tác thực hiện khử trùng (que cấy) không kỹ gây tình trạng nhiễm các vi sinh vật xung quanh (Hình 5a, b, c)

- Bị đọng nước trên nắp đĩa

- Mật độ nấm men trong lúc pha loãng thấp

- Que cấy trãi khi khử khuẩn hơ trên ngọn lửa đèn cồn chưa nguội đã trãi đều lên

bề mặt môi trường dẫn đến mật độ nấm bị giảm hoặc chết

b Mục đích:

- Phân lập nấm, khuẩn, vi sinh vật

- Đếm mật độ

c Hướng khắc phục:

- Lắc đều ống nghiệm thủy tinh chứa mẫu, mật độ ổn định hơn

- Cấy khô, đều tay và cấy đều ra vành đĩa

- Hạn chế người làm việc xung quanh tủ cấy

- Thao tác thực hiện khử trùng (que cấy) kĩ

- Luyện tập nâng cao kỹ năng