Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng 11 năm 2022

ngày

 GV hướng dẫn: TS Trương Phước Thiên Hoàng

 Nhóm: 04

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH HỌC VI SINH

BẢNG ĐÁNH GIÁ THÀNH VIÊN NHÓM 04

21126546 Châu Nguyên Huyền Trân Làm Word 100%

21126548 Nguyễn Thị Bảo Trân Nôi dung +

Tổng hợp 100%

21126557 Nguyễn Quốc Trọng Nội dung 100%

21126559 Cao Minh Trực Nội dung 100%

21126562 Phạm Nhật Trường Nội dung 100%

21126593 Nguyễn Dương Phương Yến Nội dung 100%

Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG

THÍ NGHIỆM VI SINH

Nguyên tắc pha chế môi trường:

Nguyên tắc cơ bản nhất để pha chế môi trường là phải đảm bảo các nhu cầu cơ bản của vi sinh vật (nguồn C, N và các khoáng) Ngoài ra còn có một số nguyên tắc sau:

a Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp:

- Nếu muốn nuôi cấy vi sinh vật để quan sát hình thái thì phải nuôi cấy trên môi trường đặc

- Nếu muốn tìm hiểu sự trao đổi chất của vi sinh vật thi dùng môi trường lỏng

- Môi trường chỉ chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh

b Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt của vi sinh vật để bổ sung thành phần khác nhau nào đó:

- Cần nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi trường

- Cần nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung các hợp chất chứa N vào môitrường

- Hay bổ sung các kháng sinh vào môi trường nhằm nuôi cấy các vi sinh vật có khả năng kháng lại kháng sinh1.3 Phân loại môi trường

Dựa vào thành phần

- Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường là các hợp chất tự nhiên như: khoai tây, cám gạo,

bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữa…thành phần môi trường thường phức tạp và không

ổn định

- Môi trường tổng hợp: sử dụng các loại hóa chất hữu cơ hoặc vô cơ tinh khiết để pha chế môi trường với tỷ lệ chính xác

- Môi trường bán tổng hợp: sử dụng cả các hóa chất tinh khiết lẫn các thành phần tự nhiên

Dựa vào tính chất vật lý

- Môi trường lỏng

- Môi trường rắn: thường có từ 1,5-2% agar hoặc gelatine

- Môi trường bán lỏng: có khoảng 0,3-0,7% agar

Dựa vào công dụng:

- Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: môi trường có chứa một thành phần đặc biệt chỉ phù hợp với 1 hoặc 1 nhóm vi sinh vật nào đó Ví dụ môi trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân…

- Môi trường kiểm định: dùng để xác định một tính chất nào đó của vi sinh vật Người ta thương bổ sung một hợp chất đặc biệt có sự biến đổi có thể nhìn thấy được trong quá trình nuôi cấy

vi sinh vật như các chất chỉ thị màu

1 Cách pha chế môi trường

Pha chế môi trường là một khâu quan trọng do vậy cần phải chính xác Gồm các bước sau:

- Cân các thành phần môi trường

- Nếu là môi trường lỏng: pha các thành phần vào nước, chú ý thứ tự pha chế

- Nếu là môi trường đặc: hòa tan các thành phần vào nước rồi thêm 1,5-2% agar và đun đến khi agar tan chảy

- Lọc: thường lọc môi trường qua vải hoặc bông

- Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật hoặc yêu cầu nghiên cứu, thường điều chỉnh pH phù hợp Thường dùng các loại hóa chất như: H2SO4, H3PO4, KOH, NaOH…

- Phân phối vào dụng cụ chứa: nếu là bình chứa thì cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, nếu là làm môi trường thạch dĩa thì cho vào khoảng 10 - 15ml/dĩa, nếu làm thạch nghiêng thì cho vào 1/4

- 1/5 chiều cao ống nghiệm

- Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu là nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC,

1 atm) nhằm tiêu diệt tất cả các bào tử cũng như các vi sinh vật không mong muốn có sẵn trong môi trường

 Thực hiện pha chế môi trường dịch trích khoai tây:

+ Khoai tây: 100g

+ Saccharose: 25g

+ Pepton: 2.5g

+ Yeast extract: 0.5g

+ Agar: 10g

+ H2O: đủ 1000 ml

Cách thực hiện: Chia agar thành 2 phần bằng nhau bỏ trước vào 2 bình đựng Khoai tây đun với

H2O để sôi trong 20 phút, lọc lấy dịch trong, bổ sung các thành phần còn lại Phân phối vào các bình chứa và đem tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút

 Thực hiện đổ thạch vào đĩa petri:

Toàn bộ quá trình này phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau:

Bước 1: Mở bao giấy gói các hộp petri

Bước 2: Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường

Bước 3: Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn

Bước 4: Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của hộp

Bước 5: Đậy nắp trên lại, xoay tròn hộp petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa Bước 6: Để yên cho môi trường nguội và đông đặc Lật ngược hộp petri để hơi nước bốc ra và khô dần đi

Chú ý: Thao tác đổ thạch phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn

2 Các bước gói đĩa petri:

Bước 1: Trải bao giấy gói đĩa trên mặt phẳng

Bước 2: Lấy 10 đĩa petri đặt thành 1 hàng ở một đầu của bao giấy

Bước 3: Cuốn từ từ một đầu bao lấy 10 đĩa petri

Bước 4: Thực hiện thao tác gấp xéo về 1 bên ở cả 2 đầu nằm ngang của bao giấy

Bước 5: Tiếp tục thực hiện thao tác bao, gấp xéo 2 đầu cho đến khi hết giấy và cố định cả 2 đầu bao giấy

Bài 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỀN VI SINH VẬT

- Chuẩn bị:

 Đĩa petri đã được đổ môi trường giá đỗ (1 đĩa/người, ghi tên và môi trường trên bề mặt đĩa)

 Đèn cồn

 Micro pipet 1000

 Dung dịch chứa vi khuẩn đã được pha loãng có nồng độ 10-5

1 Thao tác cấy ria:

Bước 1: Lau tủ cấy, sát khuẩn dụng cụ, tay bằng cồn 70 độ

Bước 2: Hơ que cấy móc dưới ngọn lửa đèn cồn (đỏ đầu 3 giây)

Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa)

Bước 4: Mở nắm đĩa, dùng que cấy chạm vào nơi không có vi khuẩn (để kiểm tra nhiệt độ không quá nóng)

Bước 5: Quét nhẹ đầu cấy để lấy vi khuẩn

Bước 6: Đóng đĩa mẫu chứa vi khuẩn (hơ đĩa)

Bước 7: Hơ đĩa petri cần cấy

Bước 8: Cấy ria (Đường thứ nhất cấy dày, đường thứ 2 cấy thưa hơn đường thứ nhất bắt từ đường thứ nhất, đường thứ 3 cấy thưa bắt từ đường thứ 2 bắt từ đường thứ 3)

Bước 9: Hơ đĩa petri, tắt đèn cồn

 Kết quả: Đợi sau 2-3 ngày khuẩn lạc hiện lên

Đĩa petri cấy vi khuẩn trong môi trường giá đỗ

2 Thao tác cấy trang:

Bước 1: Lau tủ cấy , sát khuẩn dụng cụ , tay bằng còn 70 độ

Bước 2: Lấy que cấy thủy tinh từ cốc chứa còn 70 độ ra hơ qua lửa đèn cồn

Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa)

Bước 4: Sử dụng micro pipet lấy 100ml dụng dịch chứa vi khuẩn đã được pha loãng ở nồng nồng độ 10-5 cho vào đĩa petri

Bước 5: Sử dụng que cấy thủy tinh trang đều dung dịch ra khắp bề mặt đĩa petri có môi trường PDA đến khi bề mặt khô và không còn dịch nữa

Bước 6: Đậy nắp và xoay đĩa petri trên đèn còn để khử khuẩn

Hình vi khuẩn được cấy trang sau 24h

3 Thao tác cấy móc:

Bước 1: Lau tủ cấy, sát khuẩn dụng cụ, tay bằng cồn 70 độ

Bước 2: Hơ que cấy móc dưới ngọn lửa đèn cồn (đỏ đầu 3 giây)

Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa)

Bước 4: Mở nắm đĩa, dùng que cấy chạm vào nơi không có vi khuẩn (để kiểm tra nhiệt độ không quá nóng)

Bước 5: Quét nhẹ đầu cấy để lấy vi khuẩn

Bước 6: Đóng đĩa mẫu chứa vi khuẩn (hơ đĩa)

Bước 7: Hơ đĩa petri cần cấy

Bước 8: Cấy móc vi khuẩn từ đĩa mẩu sang đĩa cấy, móc 1 điểm hoặc 2 điểm tuỳ ý sao cho có thẩm mỹ

Bước 9: Hơ đĩa petri, tắt đèn cồn

Hình ảnh cấy móc

Bài 3: QUAN SÁT NẤM SỢI

Nấm sợi (nấm mốc) thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử Cuống mang bào tử có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm: bào tử kín và bào tử trần

Hai giống nấm sợi Aspergillus và Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn Bào tử vôi tính là bào tử trần

Mucor và Rhizopus thuộc nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes Hệ sợi không có vách ngăn và có thể có rễ giả Bào tử vô tính là bào tử kín Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp Rhizopus có cuống mang bào tử và không phân nhánh Mucor có cuống mang bào tử phân nhánh

- Giới thiệu về nấm Aspergillus

Aspergillus là mộtchibao gồm hàng trăm nấm mốc được tìm thấy ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên toàn thế giới

Nấm Aspergillus dưới kính hiển vi

Aspergillus lần đầu tiên được đưa vào danh mục vào năm 1729 bởi linh mục và nhà sinh vật học người Ý Pier Antonio Micheli Khi quan sát các loại nấm dưới kính hiển vi, Micheli đã liên tưởng đến hình dạng của aspergillum (vòi phun nước thánh), từ tiếng Latin spargere (để rắc), và đặt tên chi cho phù hợp Aspergillum là một cấu trúc hình thành bào tử vô tính phổ biến cho tất cả các loài Aspergillus ; khoảng một phần ba số loài cũng được biết là có giai đoạn hữu tính Trong khi một

số loài Aspergillus được biết là gây nhiễm nấm, những loài khác có tầm quan trọng về mặt thương mại

- Tầm quan trọng thương mại

Các loài Aspergillus rất quan trọng về mặt y tế và thương mại Một số loài có thể gây nhiễm trùng cho người và động vật khác Một số bệnh nhiễm trùng được tìm thấy ở động vật đã được nghiên cứu trong nhiều năm, trong khi các loài khác được tìm thấy ở động vật được mô tả là mới và

cụ thể đối với căn bệnh được điều tra, và những loài khác được biết đến với tên gọi đã được sử dụng cho các sinh vật như hoại sinh Hơn 60 loài Aspergillus là mầm bệnh liên quan đến y tế Đối với con người, một loạt các bệnh như nhiễm trùng tai ngoài, tổn thương da và loét được phân loại là mycetomas

Các loài khác rất quan trọng trong quá trình lên men vi sinh vật thương mại Ví dụ, đồ uống có cồn như rượu sake Nhật Bản thường được làm từ gạo hoặc các thành phần có tinh bột khác (như sắn), thay vì từ nho hoặc lúa mạch mạch nha Các vi sinh vật điển hình được sử dụng để làm rượu, chẳng hạn như nấm men thuộc giống Saccharomyces, không thể lên men các loại tinh bột này Do

đó, nấm mốc koji như Aspergillus oryzae được sử dụng để đầu tiên phân hủy tinh bột thành đường đơn giản hơn

- Sơ lược về nấm tricodema

Trichoderma bao gồm một số lượng lớn thân rễ dạng sợi các chủng nấm được tìm thấy trong một loạt các hệ sinh thái Những loại nấm này hầu hết được phân lập từ rừng hoặc đất nông nghiệp ở mọi vĩ độ và có thể dễ dàng nuôi cấy trong ống nghiệm, một số loài tạo ra mùi ngọt hoặc mùi ‘dừa’ đặc trưng do hoạt tính sinh học dễ bay hơi hợp chất (6-pentyl-α-pyrone) Nấm Trichoderma gồm khoảng 33 loài, có đặc tính sinh sản vô tính Chúng sẽ nhân bản từ một cá thể gốc thành nhiều cá thể khác theo cấp số nhân Nhiệt độ phù hợp cho chúng sinh trưởng là khoảng 25-30 độ C Nấm này

có thể tồn tại ở điều kiện lý tưởng khoảng 1 năm rưỡi Chúng bị tiêu diệt bởi ánh nắng quá gắt hoặc mưa quá lâu Trichoderma là loài nấm hiếu khí sống phụ sinh trên xác bã hữu cơ thực vật trong đất Chúng phân hủy cellulose trong xác bã thực vật tạo thành chất mùn cung cấp dinh dưỡng cho cây

và tăng độ phì nhiêu cho đất

- Lợi ích mà tricodema mang lại :

Trong quá trình sinh sống, nấm trichoderma ức chế sinh trưởng của nhiều loài nấm gây bệnh như: Nấm Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium … Sợi nấm trichoderma quấn chặt các sợi nấm khác Đồng thời tiết ra chất kháng sinh tiêu diệt nấm bệnh Trichoderma được coi là loài nấm đối kháng quan trọng với các loài nấm bệnh trong đất Bản chất mycoparasitic (khả năng tấn công các loại nấm khác và sử dụng chất dinh dưỡng của chúng) của Trichoderma và việc sử dụng tiềm năng của chúng như tác nhân kiểm soát sinh học đối với nấm gây bệnh thực vật đã được biết đến trong hơn sáu thập kỷ qua

Nấm Tricodema dưới kính hiển vi

Bài 4: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN

Tiêu bản giọt ép đem lại rất nhiều thông tin nhưng chúng cũng có những nhược điểm nhất định

Vi sinh vật di chuyển trong dịch lỏng bởi chuyển động Brown hay tự chuyển động nên rất khó khăn trong việc quan sát Chúng ta có thể thấy được hình dạng và hoạt động của vi sinh vật nhưng không thể xác định chính xác hình thái của chúng (đặc biệt là nhóm vi khuẩn) Do vậy, để xác định chính xác hình thái của vi sinh vật người ta thường sử dụng phương pháp nhuộm màu (quan sát vi sinh vật chết)

Vi khuẩn có thành tế bào vững chắc để duy trì hình dạng của mình Vì vậy, chúng ta có thể phân loại vi khuẩn căn cứ theo hình dạng của chúng Vi khuẩn có ba dạng cơ bản: hình cầu (spherical, round), hình que (hình gậy, rod) và hình xoắn (spiraled) Vi khuẩn hình cầu gọi là coccus (số nhiều

là cocci) Vi khuẩn hình que gọi là bacillus (số nhiều là bacilli) hay chỉ đơn giản gọi là rod Vi khuẩn

có dạng xoắn có tối thiểu hai đến ba đường cong trên tế bào được gọi là spirillum (số nhiều là spirilla)

Các vi khuẩn có tế bào dài và ngoằn ngoèo với các vòng xoắn (lỏng hoặc chặt) được gọi là spirochetes Cách thức mà các tế bào tạo thành nhóm thì đặc trưng cho từng giống hoặc loài vi khuẩn Các tế bào đứng thành từng cặp (diplococci), đứng thành chuỗi (streptococci), đứng thành từng cụm (staphylococci), hoặc đứng thành một cụm bốn tế bào (tetrads), và đôi khi chúng cũng đứng thành từng tế bào riêng lẻ

Các vi khuẩn hình que (bacilli) thường ở dạng một tế bào riêng lẻ, nhưng cũng có khixuất hiện

ở dạng một cặp nối tiếp nhau (diplobacilli) hay đứng thành một chuỗi dài (streptobacilli) Một số loài có khuynh hướng đứng thành một cụm các tế bào hình que song song (palisade) hoặc tạo thành hình chữ V, X, Y khi chúng nhân đôi và phân chia

Một số loài tạo thành nhiều hình dáng và kích thước khác nhau (đa hình thể, pleomorphism) Các xoắn khuẩn thường xuất hiện ở dạng một tế bào đứng riêng lẻ và thường không kết thành nhóm

Tạo vết bôi và làm tiêu bản nhuộm đơn

Tạo vết bôi vi khuẩn (bacterial smear) là làm khô tế bào vi khuẩn trên phiến kính Các bước thực hiện cơ bản là (1) vi khuẩn được trải lên phiến kính sao cho các tế bào nằm thành một lớp mỏng, (2) tế bào vi khuẩn không bị rửa trôi trong quá trình nhuộm và (3) vi khuẩn không bị biến dạng

Sử dụng phương pháp nhuộm đơn sẽ tạo sự tương phản giữa vi khuẩn và cảnh nền

Phương pháp này được dùng để thu thập thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của tế bào Bước kế tiếp là đặt phiến kính lên giá, phủ lên vết bôi phẩm nhuộm, chờ một vài giây Các phẩm nhuộm cơ bản thường dùng là crystal violet (thời gian nhuộm 20 – 30 giây), carbolfuchsin (thời gian nhuộm 5 – 10 giây) hoặc methylene blue (thời gian nhuộm 1 phút)

Tạo vết bôi

Tạo vết bôi vi khuẩn là làm khô tế bào vi khuẩn trên phiến kính

⁕ Quy trình :

Bước 1: Dùng bút lông (không xoay khi cho lớn vi khuẩn ở một đầu phiến kính Dùng que cấy tròn đã được hơ đèn cồn để thanh trùng để nguội

Bước 2: Dùng que cấy vòng lấy 2 giọt nước để trên phiến kính , sau đó thanh trùng que cấy và lấy khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển hai vòng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kính Trải đều trên diện tích khoảng ½ inch

Bước 3: Hơ nhẹ phiến kính trên đèn cồn dùng que cấy vòng trải tế bào vi khuẩn cho đến khi tế bào vi khuẩn cố định và chết vi khuẩn để bám vào phiến kính ( việc này sẽ giúp vi khuẩn không bị rửa trôi trong quá trình nhuộm và vi khuẩn không bị biến dạng)

Nhuộm đơn

⁕ Quy trình :

Bước 1 : Đặt phiến kính lên giá

Bước 2 : Nhuộm vi khuẩn với 2 giọt phẩm nhuộm Crystal violet để trong vòng 1 phút

Bước 3 : Rửa trôi phẩm nhuộm bằng nước trong vài giây

Bước 4 : Tiếp tục nhỏ 2 giọt Lugol để trong 1 phút, rửa cồn rồi trán nhanh với nước

Bước 5 : Nhỏ dung dịch alcohol 90% để vài giây rồi rửa lại với nước

Bước 6 : Nhỏ 2 giọt dung dịch Safranin để 1 phút, rửa nước và để khô

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 100X với vật kính dầu