BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử cơ bản COLONY PCR

Q Qu uy y ttrrììn nh h:: Tiến hành đổ gel Agarose và nhỏ mẫu: -- Bước 1: Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE Acetate-ED Tris-Acetate-EDTA ở nhiệt độ TA ở nhiệt độ phòng

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH MINH KHOA ĐIỀU DƯỠNG – KỸ THUẬT Y HỌC

BỘ MÔN XÉT NGHIỆM

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

Buổi 1: 03/10/2022 COLONY PCR  II M Mụ ục c đ đíícch h::

Phát hiện tế bào vi khuẩn có mang tái tổ hợp gen mong muốn trong thời gianngắn, ít tốn kém và đơn giản

IIII D Dụ ụn ng g ccụ ụ::

Đĩa thạch chứa khúm khuẩn

Đầu côn, pipette, giấy

Bước 2: Trộn đều hỗn hợp rồi đun cách thủy ( 90-100ooC) trong vòng 2 phút

Bước 3: Đem mẫu vừa đun cách thủy, đi quay ly tâm 13000 vòng/phút trongvòng 2 phút

Bước 4: Dùng pipette hút 20 µL phần dịch nổi rồi cho vào một đầu tube sạchkhác

Bước 5: Trộn đều rồi hút 2 µL dịch đem đo bằng máy Nanodrop

IIV V K Kếết t q qu uảả::

TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 54.6 NG/ µL A260: 1,093

A280: 0,561 A260/A280: 1,95 A260/A230: 0,91

 Nhận xét:

 Nhận xét: Biểu đồ chBiểu đồ chưa có dạng ưa có dạng hình chuhình chuông chuẩnông chuẩn, do lỗi k, do lỗi kĩ thuật, thĩ thuật, thao tác chưaao tác chưachuẩn, dụng cụ chưa đạt độ sạch

Đồ thi có đỉnh tại 260nm -> Có DNA trong mẫu với tỉ lệ cao

Đồ thị có thêm 1 đỉnh tại 230nm -> có sự xuất hiện của các chất hữu cơ 

Đồ thị không có đỉnh tại 280 nm -> ít có sự ngoại nhiễm của proteinA260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết

A260/A230 < 1.8 : Hiện diện 1 lượng đáng kể các chất hữu cơ 

Buổi 2: 04/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA HBV II M Mụ ục c đ đíícch h::

Tách chiết được DNA của HBV

Pipette, đầu côn, lọ đựng dung dịch sát khuẩn

Máy ly tâm, máy Nanodrop

6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

7 Chuẩn bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tương ứng với

10 Vortex nhẹ để trộn đều Để yên 10 phút

11 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

12 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

13 Nhẹ

13 Nhẹ nhàng thêm vào nhàng thêm vào 900 µl 900 µl KTS4.KTS4

14 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

15 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

16 Làm khô cặn trong 10 phút ở 60ºC trong bồn ủ nhiệt khô

17 Hòa cặn trong 10 µl

17 Hòa cặn trong 10 µl KTS5 Thực hiện ngKTS5 Thực hiện ngay phản ứng phiên mã ngưay phản ứng phiên mã ngượcợc

RT Nếu chưa chạy PCR liền thì bảo quản ở 28ºC trong 23 ngày, hoặc 20ºC trong vòng 6 tháng

-* Sau đó, đo DNA trên máy Nanodrop và ghi nhận kết quả

IIV V K Kếết t q qu uảả::

TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 533,4 ng/ µL A260: 10,669

A280: 5,621 A260/A280: 1.90 A260/A230: 2.4

Nhận xét:

Đồ thị có Đỉnh 260, lệch 270 => có lượng DNA cao nhưng vẫn xuất hiện 1 lượngProtein đáng kể

A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiếtA260/A230 > 1.8 : Đạt độ tinh khiếtKết luận: Mẫu đạt độ tinh sạch

Buổi 3: 05/10/2022 KỸ THUẬT PCR 

GăGăng ng tatay ky khôhông ng bộbột, t, ốnống Eg Eppppenendodorfrf

ĐầĐầu côu côn, n, mimicrcropopipipetettetes, ms, máy Váy Vorortetexx

o Taq DNA polymerase

PPrriimmoobbe e MMiixx::

o Hệ mồi nhân bản vùng gene S HBV

o TaqMan đặc hiệu cho HBV (FAM)

o Hệ mồi nhân bản DNA IC

o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX)

IIIIII Q Qu uy y tr trììn nh t h th hự ực h c hiiệện n::

1

1 Rã đông mRã đông mẫu hoàn tẫu hoàn toàn bằoàn bằng cách đng cách đặt ở nhiặt ở nhiệt độ phòệt độ phòng tối đng tối đa 30 phúta 30 phút Sau đó Sau đó

ly tâm nhẹ 3000-4000 rpm và đặt vào rack lạnh

 Tạo folder, tạo chương trình cho HBV

 Chỉnh Chỉnh chu chu kỳ kỳ nhiệt nhiệt theo theo kit: kit: 1 1 chu chu kỳ kỳ 95°C 95°C - - 15 15 phútphút

   40 40 chu chu kỳ kỳ 95°C 95°C - - 20 20 giâygiây

   60°C 60°C - - 1 1 phút phút (đọc (đọc tín tín hiệu)hiệu)

IIV V K Kếết t q qu uảả::

Buổi 4: 06/10/2022 KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRÊN GEL II N Nggu uyyêên n ttắắcc::

Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật dùng để phân tách và phát hiệncác đoạn DNA (hoặc các đại phân tử khác, RNA và protein) dựa trên kíchthước và điện tích của chúng

DNA mang điện tích âm, di chuyển từ cực âm sang cực dương

Các phân tử DNA có trọng lượng, kích thước khác nhau sẽ đi được các quãngđường khác nhau trong cùng điện trường và cùng thời gian

IIII D Dụ ụn ng g ccụ ụ::

Gel agarose 1%

Ethidium bromide

Dung dịch TAE (Tris – Acetate – EDTA)

Glycogen methylene blue

 DNA chuẩn

Mẫu DNA đã tách chiết

 Nguồn đi Nguồn điệnện

Buồng điện di

Khuôn đổ gel

Hệ thống soi chụp ảnh bằng tia UV

IIIIII Q Qu uy y ttrrììn nh h::

Tiến hành đổ gel Agarose và nhỏ mẫu:

Bước 1: Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE Acetate-ED

(Tris-Acetate-EDTA) ở nhiệt độ TA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào 1 phút, cho vào lò vibalò viba(làm nóng chảy gel và không tạo bọt)

Bước 2: Làm nguội gel xuống 50 – 55°C, thêm 3µl ethidium bromide, đổ gelvào khuôn gel và lắp lược

Bước 3: Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ buffer vào khay gel sao cho buffer ngập gel, cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm

Pha buffer: 10ml TAE + 490 ml ED

Bước 4: DNA mẫu được trộn cùng với 3µl dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromopheno

 bromophenol blue).l blue)

Bước 5: Nạp 5µl DNA mẫu và Bước 5: Nạp 5µl DNA mẫu và 5µl DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm5µl DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắmđiện cực

Bước 6: Điện di trong khoảng 30 - 40 phút với điện thế 100 – 120V.

Bước 7: Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả

IIV V K Kếết t q qu uảả::

Các vạch sáng màu: là điện di đạt hiệu quả

Không có vạch: do PCR thất bại, quá trình tách chiết bị ngoại nhiễm

Buổi 5: 17/10/2022 TÁCH CHIẾT VI KHUẨN H.PYLORI II M Mụ ục c đ đíícch h::

Thực hiện tách chiết vi khuẩn H.Pylori bằng phương pháp cột theo kit

 AccuPid H.pylori Detection Kit 

Thu được các phân tử Nucleic ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phânhủy bởi các tác nhân hóa học hoặc cơ học

Loại bỏ được các thành phần tạp nhiễm để thu được sản phẩm tinh sạch

Ưu điểm: Ít tốn thời gian, độ tinh sạch cao và ít độc hại hơn so với phương pháp tách c

 pháp tách chiết bằng dhiết bằng dung môiung môi

Khuyết điểm: Tốn kém hơn và số lượng mẫu có thể làm ít hơn

IIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

Dựa trên nguyên tắc các Acid Nucleic liên kết với pha rắn của silica Trong cácđiều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica sẽ giữ lại DNA và loại bỏcác chất không mong muốn bằng lực ly tâm

 protein, bất hoạt nuất hoạt nuclease và hclease và hỗ trợ gắn ỗ trợ gắn DNA vào sDNA vào silicilic

  Tris-HCL (pH=8): Giữ DNA được hòa tan trong nước

  EDTA (pH=8): Bảo vệ DNA tránh khỏi sự phân hủy của enzyme

  Chất tẩy rửa và enzyme: Tăng hiệu quả hòa tan protein và quátrình ly giải

o KTC2: Ethanol hoăc Isopropanol: Tăng khả năng gắn DNA vào silic

o KTC3: Muối chaotropic nồng độ thấp: Loại bỏ tạp chất

o KTC4: Ethanol : loại bỏ muối chaotropic

o KTL2: EDTA, Tris-HCL, pH = 8-9: tạo môi trường nồng độ muối thấp,

 pH cao làm

 pH cao làm màng silicmàng silica tích điện a tích điện âm đẩy DNA âm đẩy DNA ra khỏi mànra khỏi màng và DNAg và DNAđược bảo vệ bởi EDTA

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h::

1 Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu và thêm

1 eppendorf cho Chứng âm tách chiết

2 Cho tiếp 5 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)

3 Cho 200 μl dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf

4 Cho tiếp 200 μl dịch sinh thiết đã xử lý vào mỗi eppendorf tương ứng

5 Trộn đều và ủ ở 7000C trong 20 phút

6 Thêm vào 100 μl dung dịch KTC2 và trộn đều

7 Đưa hỗn hợp ở bước 6 vào cột Ly tâm 8000 vòng / phút trong 1 phút 8 Chuẩn bị

1 loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Dùng kéo vô trùngcắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp)

9 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml mới Cho vào cột 600μl dung dịch KTC3 Lytâm 8.000 vòng / phút trong 1 phút

( Sử dụng muối có ở nồng độ thích hợp để loại bỏ protein và các thành phần xác tế bào có tro

 bào có trong mẫu)ng mẫu)

10 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml mới Cho vào cột 600μl dung dịch KTC4 Lytâm 8.000 vòng / phút trong 1 phút Đổ bỏ dịch lọc

( Sử dụng ethanol để loại bỏ các thành phần muối chaotropic có ở trước đó)

11 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để loại bỏ hết tất cả các dấu vết của dungdịch KTC4

( Ly tâm để loại bỏ hoàn toàn ethanol có trong mẫu để tránh ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

 phản ứng Real time PCReal time PCR)R)

12 Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml tương tự như bước 1 Chuyển cột sangeppendorf 1,5 ml mới Cho vào 20 μl KTL2 Ủ ở nhiệt độ 7000C trong 20 phút

13 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để thu DNA Lưu mẫu sau khi tách chiết ở -20

oo

C (tối đa 3 tháng) nếu không thực hiện phản ứng PCR ngay

   V Kết quả:

Sample: NHUNG – PHUC – PHONG

IIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

Dựa trên tính hoạt động của DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồichuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn

o Các mồi nhân bản DNA của gene đặc hiệu H.pylori

o Các mồi nhân bản DNA IC

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h::

1. Rã đông các ống MasterMix, PrimobeMix, và ống Chứng dươngQ01HPY01.2-PC hoàn toàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút Sau đ

 phút Sau đó spindowó spindown và đặt vn và đặt vào rack lạnào rack lạnh.h

2 Vortex mạnh ống PrimobeMix, ly tâm nhẹ (spindown) và hút ra 200 μl chuyểnvào ống MasterMix

3 Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette Hút ra lần lượt

20 μl hỗn hợp cho vào từng eppendorf/ strip đã được ghi sẵn tên mẫu

Lưu ý:

 Không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex

 Sử dụng eppendorf hoặc strip phù hợp với máy Real-time PCR 

 Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng

4 Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết và dung dịchChứng dương

5 Cho 5 µl dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dungdịch Chứng dương và nước cất 2 lần lần lượt vào các ống eppendorf/ strip riêng lẻ

đã chuẩn bị ở Bước 18

Lưu ý:

 Phản ứng Real-time PCR phải được đặt vào máy chạy trong vòng 3 giờ sau khi

 bổ sung dị

 bổ sung dịch DNA.ch DNA

 Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu 1 phản ứng cho Chứng âm táchchiết, 1 phản ứng cho Chứng dương và 1 phản ứng với nước cất lần làm chứng

6.1 Cài đặt vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (Plate set up), chọn màuhuỳnh quang FAM, HEX.

6.2 Cài đặt chương trình như sau:

1 chu kì 9500C – 15 phút

45 chu kì 9500C – 20 giây; 5700C – 1 phút

V V K Kếết t q qu uảả::

Dựa vào tính hiệu huỳnh quan của IC và mẫu để định tính

Cả IC và mẫu đều trên ngưỡng phát hiện của quy trình => Dương tính vớiDNA HP

 Nồng độ v Nồng độ vi khuẩn bai khuẩn ban đầu tỉ ln đầu tỉ lệ nghịch vệ nghịch với chu kỳ ới chu kỳ khuếch đại ckhuếch đại của DNAủa DNA

Buổi 8: 20/10/2022  

THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ

THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HBV HBV II M Mụ ục c đ đíícch h::  

Biết được thứ tự sắp xếp DNA của virus gây nên HBV

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị::

LaLaptptop op có có phphần ần mềmềm Bm Bioioededitit

FilFile che chứa ứa các các đođoạn Dạn DNA NA mạcmạch đh đơn ơn (mẫ(mẫu đu đã làã làm PCm PCR)R)

IIIIII Q Qu uy y ttrrììn nh h tth hự ực c h hiiệện n

B

Bưướớc c 11 PPCCR  R  Bư

Bước ớc 2.2 LàLàm sm sạcạch sh sản ản phphẩm ẩm PCPCRRBước

Bước 3.3 Phản ứPhản ứng ging giải trải trình tình tự (seqự (sequencuencing Ping PCR) vCR) với 1 trới 1 trong 4 ong 4 loại dloại ddNTdNTPsPsBư

Bước 4ớc 4 LàLàm sạm sạch sch sản pản phẩhẩm gim giải tải trìrình tnh tựựBư

Bướớc 5c 5 ĐĐiệiện dn di mi mao ao qquảuảnnBước

Bước 6.6 Phân tPhân tích tích trình rình tự đưtự được giợc giải bằnải bằng phầg phần mềm cn mềm chuyêhuyên dụnn dụng theg theo phưo phươngơng pháp strang

 pháp stranger.er

IIV V N Nh hậận x n xéét k t kếết q t qu uảả::

Dựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã được bộ gen của  bộ gen của HBV như hDựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã đượcHBV như hình trên.ình trên. Kết quả định type của các vi khuẩn theo bảng sau:Kết quả định type của các vi khuẩn theo bảng sau:

BUỔI 9 – NGÀY 1/11/2022

TÁCH CHIẾT HCV RNA II M Mụ ục c đ đíícch h::

Xử Xử lý lý huhuyết yết ththanh anh để để thu thu đưđược ợc RNA RNA của của HCVHCV

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị

11 DDụụnng g ccụụ::

Micropipette (10 µl, 200 µl, 1000 µl)Máy quay ly tâm

Máy lắc trộn (votex)Bồn ủ nhiệt khô

Lưu ý:

Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng. cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng

Bưướớc c 33 CChho o 110000 µµl huyết thanh vào eppendorf Vortex mạnh eppendorf trong ítnhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để yên 10 phút

BBưướớc c 44 CChho o 220000 µµl KTS2 Lắc trộn thật kỹBước

Bước 5.5 Ly tâLy tâm 13m 13.000 000 vòngvòng/phú/phút trt trong 1ong 10 phú0 phút ở nt ở nhiệt hiệt độ pđộ phònghòng

Bước Bước 6.6 ChuẩChuẩn bị mộn bị một eppt eppendoendorf 1,5 rf 1,5 ml mớml mới có ghi có ghi tên i tên mẫu, nmẫu, người gười thực hthực hiệniệnB

Bưướớc 7c 7 CChhuuyyểển n 660000 µµl dịch l dịch nổi sang nổi sang eppendorf 1,5 ml eppendorf 1,5 ml mới.mới

Lưu ýLưu ý: chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein biến: chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein biếntính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới)

Khởi động máy tính kết nối với Nanodrop và chọn phần đo Acid nucleic

Rửa máy: bằng 1 µl nước cất

Đo blank: dùng pipette hút 1 – 2 µl dung dịch TE vào vị trí đo, đóng cánhtay máy lại và đo blank, sau đó dùng khăn giấy lau sạch

Điền Sample ID trước khi đo mẫu

Hút 1 – 2 microllit dung dịch trong ống tube 2 vào vị trí đo, đóng cánh taymáy, ấn Measure để thực hiện đo mẫu

Đọc kết quả

V V N Nh hậận n xxéét t k kếết t q qu uảả::

- Mẫu tách chiết không được tinh sạch

- Nguyên nhân: Do thao tác kỹ thuật, không tuân thủ đúng thời gian phản ứng, dothuốc thử, dụng cụ được tái sử dụng dẫn tới có sự ngoại nhiễm của chất hữu cơ 

Găng tay không bột, ống Eppendorf.

Đầu côn, micropipettes

o dATP, dTTP dCTP, dGTP.

o Taq DNA polymerase

Primobe Mix:

o Hệ mồi nhân bản vùng gene S Hp

o TaqMan đặc hiệu cho Hp(FAM)

o Hệ mồi nhân bản DNA IC

o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX)

33 MMẫẫuu::

RNA bộ gene của các vi khuẩn HCV có trong mẫu huyết thanh

IIIIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

Hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica), phụ thuộc vào nồng độ muối và

 pH của dun

 pH của dung dịch ly g dịch ly giải tế bgiải tế bào.ào

DNA sạch sẽ được dung giải khỏi màng

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h tth hự ực c h hiiệện n::

Bước Bước 1.1 Rã đôRã đông cáng các ốnc ống Masg MasterMterMix, ix, PrimPrimobeMobeMix vix và chứà chứng dưng dương ơng hoànhoàntoàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút Sau đó ly tâmnhẹ 5 – 10 giây và đặt vào rack lạnh

Bước 4.4 VortVortex nhex nhẹ từnẹ từng dung dung dịg dịch DNch DNA xét A xét nghinghiệp, dệp, dung ung dịch dịch chứchứngng

âm tách chiết, dung dịch chứng dương

Lưu ý:

KhôKhông đng được ược trộtrộn ốnn ống Mag MaststerMerMix bix bằng ằng mámáy voy vortrtex.ex

Sử dụSử dụng eng eppeppendndororf 0,f 0,2 ml 2 ml phù phù hợp hợp với với máy máy ReaReal-tl-time ime PCRPCR

MỗMỗi hi hỗn ỗn hợhợp cp chuhuẩn ẩn bị bị đủ đủ chcho 1o 19 p9 phảhản ứnn ứng.g

Bước 5 Cho 10 µl dung dịch RNA xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách chiết,dung dịch chứng dương vào các ống Eppendorf 0.2 ml riêng lẻ đã chuẩn bị ở bước 3

Lưu ý:

Phản Phản ứng Rứng Real-eal-time time PCR pPCR phải hải được được đặt đặt vào mvào máy cháy chạy trạy trong ong vòng vòng 3 giờ 3 giờ sausaukhi bổ sung dịch RNA