Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC



BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC VI SINH

Nhóm 1 – Thứ 6 ca 3 Lớp: DH21SHB

Giảng viên hướng dẫn: TS Trương Phước Thiên Hoàng

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Lan Anh - 21126009 Nguyễn Thị Lan Anh - 21126014 Ngô Ngọc Hải - 21126324

Phạm Thị Mỹ Hạnh - 21126054

Lý Gia Hân - 21126325 Thạch Vinh - 21126259

TP.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 2

Bài 1: Các thao tác cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh 3

1.1 Gói đĩa petri 3

1.2 Pha chế môi trường: Môi trường dịch trích khoai tây 4

1.3 Các phương pháp cấy 5

1.3.1 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy trang 5

1.3.2 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy ria 7

1.3.3 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy móc 9

Bài 4: Quan sát nấm sợi 11

4.1 Tổng quan Trichoderma 11

4.2 Tổng quan Aspergillus 13

Bài 6: Nhuộm Gram 14

6.1 Nhuộm E coli 14

6.2 Nhuộm Bacillus subtilis 15

6.3 Nhuộm Staphylococcus 17

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Nguyễn Lan Anh

21126009

(Nhóm trưởng)

- Làm báo cáo

- Cách gói đĩa petri

- Bổ sung các phần

Nguyễn Thị Lan Anh

21126014

- Cách cấy ria

- Tổng quan Trichoderma

Ngô Ngọc Hải

21126324

- Cách cấy móc

- Cách nhuộm Staphylococcus

Phạm Thị Mỹ Hạnh

21126054

- Cách nhuộm E coli và Bacillus subtilis

Lý Gia Hân

21126325

- Cách pha môi trường dịch trích khoai tây

Thạch Vinh

21126259

- Cách cấy trang

- Tổng quan Aspergillus

Bài 1: Các thao tác cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh

1.1 Gói đĩa petri

1.1.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Đĩa petri (Khoảng 8 đến 10 đĩa)

- Một xấp báo

- Khăn sạch

Lưu ý: Trước khi tiến hành gói đĩa, các đĩa petri đều phải qua hấp tiệt trùng, rửa sạch và lau sạch mới bắt đầu gói đĩa

1.1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Trải báo và đặt các đĩa petri nằm ngang với mặt bàn

Bước 2: Kéo tờ báo lên khoảng hai phần ba, lấy ngón trỏ đẩy các đĩa nằm không đều vào Bẻ hai mép giấy hai bên vào trong, dùng hai ngón trỏ và ngón giữa giữ lại

Bước 3: Cầm nguyên cụm tay, đẩy đĩa lên một tí, vuốt mép bằng ba ngón tay và ép sát vào vành đĩa (tạo ra một cái nếp) và gấp xéo một phần ba đĩa, không vuông góc

Bước 4: Tiếp tục đẩy đĩa lên, gấp thêm một nếp ép sát vào vành đĩa như nếp gấp trước Bên kia cũng làm tương tự, cũng tạo nếp gấp xong đẩy đĩa lên và tạo tiếp nếp gấp mới Bước 5: Khi thấy cuộn gói còn lỏng, ép chặt nó vào và làm tương tự như lúc nãy cho đến hết

1.1.3 Kết quả

Buổi đầu Buổi sau

1.2 Pha chế môi trường: Môi trường dịch trích khoai tây

1.2.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Cân, bếp, nồi và bình chứa

- Khoai tây: 200g

- Saccharose: 50g

- Pepton: 5g

- Yeast extract: 1g

- Agar: 20g

- H2O đủ 1000ml

1.2.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Cân 100g khoai tây sau đó sắc hạt lựu Đem khoai tây đã sắc đun với nước để sôi trong 20 phút trong lúc đun vớt bỏ bọt Nấu cho đủ 500ml nước khoai tây

Bước 2: Bỏ vào becker lần lượt là 25g Saccharose; 2,5g Pepton và 0,5g Yeast extract Bước 3: Cân 10g Agar và chia làm đôi bỏ vào 2 bình chứa

Bước 4: Đổ 500ml nước khoai đã lọc lấy dịch trong hỗn hợp becker sau đó khuấy đều Bước 5: Chia đôi hỗn hợp sau khi đã khuấy đều đổ vào 2 bình chứa và bịt kín bằng bông gòn chống thấm nước rồi buộc giấy báo ở miệng chai

Bước 6: Đem tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút

1.2.3 Kết quả

Môi trường dịch trích khoai tây

1.3 Các phương pháp cấy

- Các phương pháp cấy: Cấy bằng que cấy trang, cấy móc và cấy ria

- Mục đích: Phân lập vi khuẩn thành các khuẩn lạc đơn phù hợp với mục đích nuôi cấy

vi khuẩn

- Môi trường: Môi trường dịch trích giá đậu, môi trường dịch trích khoai tây,…

1.3.1 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy trang

1.3.1.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Đèn cồn và tủ cấy

- Bình xịt sát khuẩn tay

- Que cấy trang (que cấy tam giác): Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn

- Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (giá đậu)

- Đĩa petri đã có sẵn vi sinh

- Dung dịch có độ pha loãng 1/1000

Lưu ý:

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dung dịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Đối với cấy trang:

+ Cấy đều, nhanh tay

+ Cấy vào vành đĩa

+ Cấy khô

1.3.1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Hơ nóng miệng đĩa trên ngọn lửa (không để quá sát), sau đó mở nắp đĩa dùng pipet 0,1 ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trên đĩa petri

Bước 2: Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng

Bước 3: Mở đĩa petri, đưa thanh gạt chà vào mặt đĩa không có môi trường thạch để làm nguội sau đó nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch, trong quá trình thực hiện thì luôn để nắp đĩa hở

và hơ gần ngọn lửa để môi trường mau khô (Chú ý: Không để quá gần ngọn lửa sẽ làm chết vi khuẩn)

Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt

1.3.1.3 Kết quả

a Nếu thực hiện đúng thao tác, không bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như các hình sau:

=> Tạo ra các khuẩn lạc đơn và đồng nhất (những khuẩn lạc thuần)

b Nếu môi trường chưa khô sẽ tạo ra kết quả như những hình dưới đây:

Môi trường chưa khô

- Hình trái: Môi trường chưa khô và còn ướt nên tạo ra một mảng sinh vật nên không xuất hiện những khuẩn lạc đơn

- Hình phải: Mặc dù vẫn tạo ra các khuẩn lạc đơn nhưng phần giữa vẫn chưa được khô

và chưa cấy vào vành đĩa

c Nếu môi trường bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như những hình dưới đây:

Môi trường bị tạp nhiễm

- Hình trái: Tuy vẫn ra những khuẩn lạc đơn nhưng vẫn xảy ra tình trạng tạp nhiễm (những con lớn hơn)

- Hình phải: Môi trường khô và xuất hiện các khuẩn lạc đơn nhưng chưa cấy vào vành đĩa

1.3.1.4 Khắc phục

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

1.3.2 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy ria

1.3.2.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Đèn cồn và tủ cấy

- Que cấy vòng: Que cấy kim loại đầu có vòng tròn, thường dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng

- Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (giá đậu)

- Bình xịt sát khuẩn tay

- Đĩa petri đã có sẵn vi sinh

Lưu ý:

- Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ

nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dung dịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn, ngọn lửa đèn cồn có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa…

- Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70° hoặc các dung dịch diệt khuẩn

1.3.2.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Dùng que cấy vòng đã được vô trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội và nhúng vào dịch mẫu để có được các vi khuẩn cần phân lập

Bước 2: Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp

+ Cấy vùng 1: Dùng que cấy có vi khuẩn, ria đều trên đĩa thạch theo đường ziczac với diện tích chiếm 1/3 diện tích đĩa thạch

+ Cấy vùng 2: Xoay đĩa 120 độ, tiến hành cấy vùng 2 bằng cách di chuyển que cấy theo đường ziczac thưa hơn so với vùng 1 và vùng 2 cũng chiếm 1/3 đĩa

+ Cấy vùng 3: Xoay đĩa 120 độ và cấy tương tự như cấy vùng 2 Sao cho đường cấy ở vùng 3 cũng phải chạm vào vùng 2 và đường cấy thưa hơn so với vùng 2 Diện tích cấy

là 1/3 đĩa thạch cuối cùng

Bước 3: Các đường cấy ở vùng sau phải chạm vào đường cấy ở vùng trước để đảm bảo

vi khuẩn mọc được ở tất cả các vùng và tạo khuẩn lạc riêng lẻ

Bước 4: Sau khi kết thúc các đường ria, cần đốt tiệt trùng que cấy

Bước 5: Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

Bước 6: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn 24-48h

1.3.2.3 Kết quả

a Nếu thực hiện đúng thao tác sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

=> Tạo ra các khuẩn lạc đơn và đồng nhất (những khuẩn lạc thuần)

b Nếu thực hiện thao tác không đúng sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

- Hình trái: Đường cấy một quá thưa Đường cấy hai vẫn chạm vào đường cấy thứ ba tuy nhiên do con này nó mạnh với sinh khối lớn nên không tạo ra khuẩn lạc đơn

- Hình phải: Đường cấy một và hai ổn nhưng đường cấy ba sát quá nên tạo ra những khuẩn lạc đơn sẽ ít

1.3.2.4 Khắc phục

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

1.3.3 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy móc

1.3.3.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Đèn cồn và tủ cấy

- Bình xịt sát khuẩn tay

- Que cấy móc (que cấy đầu vuông): Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty

- Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (PDA)

- Đĩa petri đã có sẵn vi sinh

Lưu ý:

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dung dịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay hoặc không tập trung

ở nơi đông người

1.3.3.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Hơ nóng miệng đĩa petri đã có sẵn vi sinh (không để quá sát) và que cấy trên ngọn lửa để khử trùng

Bước 2: Chờ vài giây cho que cấy nguội, sau đó thử lên bề mặt thạch không có vi sinh nếu thạch không nóng chảy thì dùng que cấy quét nhẹ nơi có vi sinh

Bước 3: Hơ miệng đĩa petri có môi trường thạch mới sau đó dùng que cấy chấm vào những điểm trên thạch, đóng nắp đĩa và hơ miệng đĩa 1 lần nữa

Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt

1.3.3.3 Kết quả

a Nếu thực hiện đúng thao tác, không bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

=> Nấm có bào tử, sợi tơ nấm phát triển rất đều

b Nếu thực hiện không đúng thao tác, sẽ bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

- Hình trái: Sợi tơ không thể phát triển được do khi nhiễm khuẩn thì nó sẽ cạnh tranh dinh dưỡng với nấm

- Hình phải: Mặc dù sợi tơ xuất hiện nhưng do đã bị nhiễm khuẩn nên sợi tơ không phát triển tiếp tục nữa

1.3.3.4 Khắc phục

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

Bài 4: Quan sát nấm sợi

4.1 Tổng quan Trichoderma

4.1.1 Trichoderma là gì?

- Đây là tên gọi của chủng nấm có tên đầy đủ là Trichoderma spp, thường sống trong

đất tập trung nhiều ở khu vực rễ cây Chủng nấm này có đến 33 loài, hầu hết đều có lợi cho cây trồng Một số giúp cố định đạm trong đất, số khác phân giải lân hoặc tấn công tiêu diệt các loài nấm bệnh gây hại cho cây trồng Do tính chất đối kháng với nấm bệnh,

nên bà con thường nghe tên gọi của Trichoderma mà là “Nấm đối kháng Trichoderma” 4.1.2 Trichoderma có tác dụng gì?

- Nấm Trichoderma tiết ra enzym có tác dụng phá hủy vỏ tế bào, sau đó hấp thu dinh dưỡng, tiêu diệt các loài nấm có hại như Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii… đây là loài gây ra các bệnh chết nhanh chết chậm trên

tiêu, bệnh lở cổ rễ ở cà phê, bệnh xì mủ sầu riêng, thối rễ ở cây bơ… và các bệnh tương

tự liên quan đến rễ ở các giống cây trồng khác

- Ngoài cơ chế tiêu diệt trực tiếp khi tiếp xúc, Trichoderma còn có cơ chế sinh ra các

“kháng thể” được cấy truyền đi khắp các bộ phận, giúp tiêu diệt nấm hại ở cả lá, cành cây, ngọn cây, quả… mà không cần tiếp xúc

- Trichoderma còn giúp tạo môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật cố định đạm (khuẩn lạc), phân giải lân… Nói chung Trichoderma cộng sinh tốt với tất cả các loài sinh vật

có ích trong đất, giúp tăng độ tơi xốp cho đất Một số chủng Trichoderma còn tiết ra

enzym giúp phân hủy mùn, rễ cây, các loại phân hữu cơ, giúp chuyển hóa thành các dạng chất mà cây có thể hấp thu được Ví dụ enzym cellulase, chitinase, protease, pectinase, amlylase

- Trong quá trình ủ phân chuồng, ủ phân hữu cơ từ xác động thực vật Việc trộn chung

Trichoderma vào thành phần ủ giúp giảm mùi hôi, đẩy nhanh tiến trình phân giải, tiết

kiệm được thời gian ủ phân Đồng thời còn có thể kết hợp với biolactyl, subtyl… để tổng hợp nên các chế phẩm sinh học khác

4.1.3 Ưu điểm

+ Không gây hại cho người và vật nuôi, phát triển nhanh trong đất

+ Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh

+ Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử

+ Đẩy nhanh quá trình hấp thu chất dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng cây trồng

Trichoderma sp

4.2 Tổng quan Aspergillus

4.2.1 Aspergillus là gì?

- Nấm sợi Aspergillus thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, không có hình thức sinh

sản hữu tính, hệ sợi có vách ngăn, bào tử vôi tính là bào tử trần, phần lớn sống hoại sinh trong đất

- Bộ phận sinh bào tử của Aspergillus có cấu trúc đặc biệt gồm đính bào đài mọc từ tế

bào chân, ngọn đỉnh bào đài, tiểu bào đài, trên tiểu bào đài sinh ra các bào tử có kích thước nhỏ, nhìn trông giống như bông hoa cúc

4.2.2 Vai trò gây bệnh của Aspergillus

- Aspergillus có thể gây rất nhiều bệnh cho người và động vật Nấm có thể gây độc

(nhiễm độc tố nấm trong thức ăn ô nhiễm), gây bệnh (dị ứng, nấm phát triển tại chỗ

không xâm nhập và bệnh nấm xâm nhập) Aspergillus chủ yếu gây bệnh ở phổi, đôi khi

gây bệnh ngoài phổi

4.2.3 Điều trị

- Thể dị ứng: Điều trị như điều trị hen

- Bướu nấm: Phẫu thuật nếu điều kiện bệnh nhân cho phép, thường chống chỉ định do bệnh phổi cũ, thuốc không có tác dụng

- Nấm xâm nhập: Nấm đáp ứng với thuốc kém Có thể dùng amphotericin B phối hợp flucytosine hoặc rifampicin, nhóm azole có thể dùng itraconazole Hiện nay đang hy

vọng vào các thuốc mới như voriconazole, caspofungin có tác dụng tốt với Aspergillus

Aspergillus sp

Bài 6: Nhuộm Gram

6.1 Nhuộm E coli

6.1.1 Chuẩn bị dụng cụ

+ Dung dịch Crystal violet

+ Dung dịch Lugol

+ Cồn tẩy 90°

+ Dung dịch Safranin

+ Nước, bình tia

+ Que cấy vòng

+ Mẫu khuẩn lạc

+ Đèn cồn

+ Lame

6.1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Nhỏ 1 giọt nước lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy mẫu vi khuẩn đã chuẩn bị

từ trước cho vào giọt nước (Xác định rõ vùng để trải đều mẫu, ghi tên và đánh dấu lên lame nếu cần thiết)

Bước 2: Dàn vi khuẩn đều lên lame bằng que cấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi lame khô

Bước 3: Nhuộm:

- Nhỏ 2 giọt dung dịch Crystal violet và trải đều lên vùng đã xác định, để khoảng 1 phút Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (Lưu ý: Khi rửa thì không để tia nước chiếu thẳng

vô vùng đã chứa mẫu)

- Nhỏ dung dịch Lugol và trải đều lên vùng chứa mẫu để cố định màu, để khoảng 1 phút Rửa dưới vòi nước

- Tẩy màu bằng cồn 90° và rửa lại nhanh bằng nước

- Nhỏ dung dịch đỏ Safranin, trải đều, để khoảng 1 phút Rồi tiếp tục rửa dưới vòi nước

- Để khô tự nhiên

Bước 4: Soi mẫu dưới kính hiển vi

6.1.3 Kết quả