BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử cơ bản COLONY PCR

Buổi 5: 17/10/2022 TÁCH CHIẾT VI KHUẨN H.PYLORI- Thực hiện tách chiết vi khuẩn H.Pylori bằng phương pháp cột theo kit AccuPid H.pylori Detection Kit Thu được các phân tử Nucleic ở trạng

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐIỀU DƯỠNG – KỸ THUẬT Y HỌC BỘ

Buổi 1: 03/10/2022 COLONY PCR

- Phát hiện tế bào vi khuẩn có mang tái tổ hợp gen mong

muốn trong thời gian ngắn, ít tốn kém và đơn giản.

- Đĩa thạch chứa khúm khuẩn

- Đầu côn, pipette, giấy

- Bước 2: Trộn đều hỗn hợp rồi đun cách thủy ( 90-100 o C) trong vòng 2 phút

- Bước 3: Đem mẫu vừa đun cách thủy, đi quay ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 2 phút

- Bước 4: Dùng pipette hút 20 µL phần dịch nổi rồi cho vào một đầu tube sạch khác

- Bước 5: Trộn đều rồi hút 2 µL dịch đem đo bằng máy Nanodrop

IV Kếết quuảả:

Nhận xét: Biểu đồ chưa có dạng hình chuông chuẩn, do lỗi

kĩ thuật, thao tác chưa chuẩn, dụng cụ chưa đạt độ sạch

Đồ thi có đỉnh tại 260nm -> Có DNA trong mẫu với tỉ lệ cao

Đồ thị có thêm 1 đỉnh tại 230nm -> có sự xuất hiện của các

chất hữu cơ Đồ thị không có đỉnh tại 280 nm -> ít có sự

ngoại nhiễm của protein A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết

A260/A230 < 1.8 : Hiện diện 1 lượng đáng kể các chất hữu cơ

Buổi 2: 04/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA HBV

- Pipette, đầu côn, lọ đựng dung dịch sát khuẩn

- Máy ly tâm, máy Nanodrop

Gồm 17 bước:

ứng với số lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô ở 60ºC.

2 Vortex kỹ ống DNA IC Cho vào epp 5 µl DNA IC

3 Cho vào mỗi eppendorf 900 µl KTS1-R.

4 Cho 100 µl huyết thanh vào mỗi ống Vortex mạnh eppendorf trong ít nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để yên 10 phút.

5 Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ.

6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

7 Chuẩn bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tương ứng với số lượng mẫu.

8 Chuyển 600 µl dịch nổi sang các eppendorf 1,5 ml mới.

Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein biến tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới).

10 Vortex nhẹ để trộn đều Để yên 10 phút.

12 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.

13 Nhẹ nhàng thêm vào 900 µl KTS4.

14 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

15 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.

Đồ thị có Đỉnh 260, lệch 270 => có lượng DNA cao nhưng vẫn xuất hiện 1 lượng Protein đáng kể

A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết

A260/A230 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết

Kết luận: Mẫu đạt độ tinh sạch

Buổi 3: 05/10/2022 KỸ THUẬT PCR

- Găng tay không bột, ống Eppendorf.

- Đầu côn, micropipipetettes, máy Vorortetex

o Hệ mồi nhân bản vùng gene S HBV.

o TaqMan đặc hiệu cho HBV (FAM).

o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX).

IIII Quuy trììnnh thựực hiiệệnn:

phút Sau đó ly tâm nhẹ 3000-4000 rpm và đặt vào rack lạnh.

2 Chuẩn bị các eppendorf 0.2ml, đánh số thứ tự và ghi vào tờ giấy thông tin mẫu (ngày làm mẫu, người thực hiện, số) và thêm 1 eppendorf 0.2ml để chứa mẫu PC (positive control).

3 Đem mẫu và eppendorf vào buồng ATSH để thực hiện.

4 Hút 5µl mẫu DNA XN vào eppendorf 0.2ml.

6 tránhĐem qngoạiuaylynhiễmtâm30.00 vòng/phút trong 1 phút.

7 Tiến hành đem mẫu đi PCR.

Cách chỉnh chu kỳ nhiệt:

Tạo folder, tạo chương trình cho HBV

Chỉnh chu kỳ nhiệt theo kit: 1 chu kỳ 95°C

-15 phút 40 chu kỳ 95°C - 20 giây

60°C - 1 phút (đọc tín hiệu)

IV Kếết quuảả:

Nhận xét:

Kết quả ra Unknow ở cả IC và mẫu -> tách chiết thất bại, cần thực hiện lại Nguyên nhân: Do quá trình thao tác của người thực hiện

Buổi 4: 06/10/2022 KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRÊN GEL

- Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật dùng để phân tách

và phát hiện các đoạn DNA (hoặc các đại phân tử khác, RNA và protein) dựa trên kích thước và điện tích của chúng

quãng đường khác nhau trong cùng điện trường và cùng thời gian

- Gel agarose 1%

- Ethidium bromide

- Dung dịch TAE (Tris – Acetate – EDTA)

- Glycogen methylene blue.

Tiến hành đổ gel Agarose và nhỏ mẫu:

TAE (Tris-Acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên

1 phút, cho vào lò viba (làm nóng chảy gel và không tạo bọt).

- Bước 2: Làm nguội gel xuống 50 – 55°C, thêm 3µl ethidium bromide,

đổ gel vào khuôn gel và lắp lược.

- Bước 3: Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ buffer vào khay gel sao cho buffer ngập gel, cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm.

Pha buffer: 10ml TAE + 490 ml ED.

- Bước 4: DNA mẫu được trộn cùng với 3µl dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue).

- Bước 5: Nạp 5µl DNA mẫu và 5µl DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.

- Bước 6: Điện di trong khoảng 30 - 40 phút với điện thế 100 – 120V.

- Bước 7: Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.

IV Kếết quuảả:

Buổi 5: 17/10/2022 TÁCH CHIẾT VI KHUẨN H.PYLORI

- Thực hiện tách chiết vi khuẩn H.Pylori bằng phương pháp cột theo kit

AccuPid H.pylori Detection Kit

Thu được các phân tử Nucleic ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị

- Ưu điểm: Ít tốn thời gian, độ tinh sạch cao và ít độc hại

hơn so với phương pháp tách chiết bằng dung môi

- Khuyết điểm: Tốn kém hơn và số lượng mẫu có thể làm ít hơn

- Dựa trên nguyên tắc các Acid Nucleic liên kết với pha rắn của silica Trong các

điều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica sẽ giữ lại DNA và loại bỏ các chất không mong muốn bằng lực ly tâm

-Sau các bước loại bỏ các chất không mong muốn, DNA sẽ được dung giải khỏi

màng silica và thu được DNA tinh sạch

- Micropipette, đầu côn, máy ly tâm, máy vortex, máy

nanodrop, bồn ủ nhiệt khô, eppendorf

- Huyết thanh, nước cất

Chất tẩy rửa và enzyme: Tăng hiệu quả hòa tan protein và quá trình ly giải

o KTC2: Ethanol hoăc Isopropanol: Tăng khả năng gắn DNA vào silic o

KTC3: Muối chaotropic nồng độ thấp: Loại bỏ tạp chất

o KTC4: Ethanol : loại bỏ muối chaotropic

o KTL2: EDTA, Tris-HCL, pH = 8-9: tạo môi trường nồng

độ muối thấp, pH cao làm màng silica tích điện âm đẩy DNA ra khỏi màng và DNA được bảo vệ bởi EDTA

IV Quuy trrììnnhh:

1 Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu và thêm

1 eppendorf cho Chứng âm tách chiết.

2 Cho tiếp 5 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)

3 Cho 200 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf.

4 Cho tiếp 200 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l dịch sinh thiết đã xử lý vào mỗi eppendorf tương ứng.

5 Trộn đều và ủ ở 70 0 C trong 20 phút.

6 Thêm vào 100 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l dung dịch KTC2 và trộn đều.

1 loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu

Dùng kéo vô trùng cắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp)

9 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml mới Cho vào cột 600μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l dung dịch KTC3 Ly tâm 8.000 vòng / phút trong 1 phút.

( Sử dụng muối có ở nồng độ thích hợp để loại bỏ protein và

các thành phần xác tế bào có trong mẫu)

10tâm Chuyển8.000vòngcột sang/phúteppendorftrong1phút2,0 mlĐổmớibỏ.dịchColọcvào cột 600μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l

dung dịch KTC4 Ly ( Sử dụng ethanol để loại bỏ các thành phần muối chaotropic có ở trước đó)

11 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để loại bỏ hết tất cả các dấu vết của dung dịch KTC4.

( Ly tâm để loại bỏ hoàn toàn ethanol có trong mẫu để tránh

ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Real time PCR)

1,5 ml mới Cho vào 20 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l KTL2 Ủ ở nhiệt độ 70 0 C trong 20 phút.

13 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để thu DNA Lưu mẫu sau khi tách chiết ở

o

-20 C (tối đa 3 tháng) nếu không thực hiện phản ứng PCR ngay.

V Kết quả:

- Sample: NHUNG – PHUC – PHONG

- A260: 0.705

- A280: 0.455

- 260/280: 1.55 < 1.8

- 260/230: 1.19 <1.8

Mẫu chưa đạt độ tinh khiết, nguyên nhân do kỹ thuật của người thực hiện

chưa chuẩn dẫn đến chưa thể tách được hoàn toàn DNA, 1 lượng DNA vẫn còn sót lại trong lưới silica.

chuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn.

o Các mồi nhân bản DNA của gene đặc hiệu H.pylori

IV Quuy trrììnnhh:

1 Rã đông các ống MasterMix, PrimobeMix, và ống Chứng dương

Q01HPY01.2-PC hoàn toàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30

phút Sau đó spindown và đặt vào rack lạnh.

2 Vortex mạnh ống PrimobeMix, ly tâm nhẹ (spindown) và hút ra 200 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l chuyển

vào ống MasterMix.

3 Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette Hút ra lần lượt

20 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)l hỗn hợp cho vào từng eppendorf/ strip đã được ghi sẵn tên mẫu. Lưu ý:

Không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex

Sử dụng eppendorf hoặc strip phù hợp với máy

Real-time PCR Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng

4 Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết và dung dịch Chứng dương.

dịch Chứng dương và nước cất 2 lần lần lượt vào các ống eppendorf/ strip riêng lẻ

đã chuẩn bị ở Bước 18.

Lưu ý:

Phản ứng Real-time PCR phải được đặt vào máy chạy

trong vòng 3 giờ sau khi bổ sung dịch DNA.

Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu 1 phản ứng cho Chứng âm tách chiết, 1 phản ứng cho Chứng dương

và 1 phản ứng với nước cất lần làm chứng âm PCR.

Thứ tự chuẩn bị các phản ứng phải là: Chứng âm PCR -> Chứng âm tách chiết ->Mẫu xét nghiệm -> Chứng dương

6 Đậy nắp các eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) và đặt vào máy Real-time PCR.

6.1 Cài đặt vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy

(Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM, HEX.

6.2 Cài đặt chương trình như sau:

1 chu kì 95 0 C – 15 phút

45 chu kì 95 0 C – 20 giây; 57 0 C – 1 phút

- Dựa vào tính hiệu huỳnh quan của IC và mẫu để định tính.

DNA HP.

- Nồng độ vi khuẩn ban đầu tỉ lệ nghịch với chu kỳ khuếch đại của DNA

- File chứa các đoạn DNA mạch đơn (mẫu đã làm PCR)

IIII Quuy trrììnnh thhựực hiiệện

Bưướớc 1 PCCR

Bước 2 Làm sạcạch sản phẩm PCR

Bước 3 Phản ứng giải trình tự (sequencing PCR) với 1 trong 4 loại ddNTPs

Bước 4 Làm sạch sản phẩhẩm giải trình tự

Bướớc 5 Điệiện di mao quản

Bước 6 Phân tích trình tự được giải bằng phần mềm

chuyên dụng theo phương pháp stranger.

IV Nhhậận xét kết quuảả:

- Dựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã được

bộ gen của HBV như hình trên.

- Kết quả định type của các vi khuẩn theo bảng sau:

BUỔI 9 – NGÀY 1/11/2022

TÁCH CHIẾT HCV RNA I Mục đíícch:

- Xử lý huyết thanh để thu được RNA của HCV.

1 Dụụnng cụụ:

Micropipette (10 µl, 200 µl, 1000 µl) Máy quay ly tâm

Máy lắc trộn (votex) Bồn ủ nhiệt khô.

IIII Quuy trrììnnh thựực hiiệệnn:

Bước 1 Chuẩn bị một eppendorf 1,5 ml, ghi tên mẫu, người thực hiện Bật bồn ủ nhiệt khô ở 60 0 C.

Bước 2 Cho tiếp vào mỗi eppendororf 900 µl KTS1 – R.

Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng.

Bưướớc 3 Chho 1000 µ l huyết thanh vào eppendorf Vortex mạnh

eppendorf trong ít nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để

yên 10 phút

Bưướớc 4 Chho 2000 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ

Bước 5.

Bước 6.

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị một eppendorf 1,5 ml mới có ghi tên mẫu, người thực hiện

Bưướớc 7 Chhuuyyểển 6000 µ l dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml mới.

Lưu ý: chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục

(protein biến tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới).

Bưướớc 8 Thhêêm 600 µ l KTS3.

Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng.

Bước 9 Vortex nhẹ để trộn đều Để yên 10 phút.

Bước 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ

phòng Bước 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh

Bước 12 Thêm 900 µl KTS4 (có thể rửa 2 lần)

Bước 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ

phòng Bước 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh.

0

Bước 15 Làm khô cặn trong 10 phút ở 60 C trong bồn ủ nhiệt khô

Bước 16 Hòa cặn trong 20 µ l KTS5 Nếu không tiến hành phản

ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản RNA tách chiết ở

2-8 0 C trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở - 20 0 C trong vòng 6 tháng.

IV. Kiểm tra độ tininh sạch của mẫu bằng máy Nanodrop:

- Rửa máy: bằng 1 µl nước cất.

- Đo blank: dùng pipette hút 1 – 2 µl dung dịch TE vào vị trí đo, đóng cánh tay máy lại và đo blank, sau đó dùng khăn giấy lau sạch.

- Điền Sample ID trước khi đo mẫu.

- Hút 1 – 2 microllit dung dịch trong ống tube 2 vào vị trí đo, đóng cánh tay máy, ấn Measure để thực hiện đo mẫu.

- Mẫu tách chiết không được tinh sạch

- Nguyên nhân: Do thao tác kỹ thuật, không tuân thủ đúng thời gian phản ứng, do thuốc thử, dụng cụ được tái sử dụng dẫn tới có sự ngoại nhiễm của chất hữu cơ

- Găng tay không bột, ống Eppendorf.

- Đầu côn, micropipettes.

o dATP, dTTP dCTP, dGTP.

o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX).

- DNA sạch sẽ được dung giải khỏi màng.

IV Quuy trrììnnh thhựực hiiệệnn:

Bước 1 Rã đông các ống MasterMix, PrimobeMix và chứng dương hoàn toàn nhẹ5 bằng –

10 cách giây đặt và đặt ởnhiệt vào độ rack phò lạnh g . trong tối đa 30 phút Sau đó ly tâm

Lưu ý: Thao tác Chứng dương tách biệt với 2 ống MasterMix và PrimobeMix để hạn chế nguy cơ nhiễm

Bước 2 Vortex mạnh ống PrimobeMix và hút ra 200 µl chuyển vào ống MasterMix.

Lưu ý: Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix

trong quá trình vortex, dẫn đến việc không đủ thể tích hút

Bước 3 Trộn đều hỗn hợp có trong ống MAsterMix bằng micropipette.

Hút lần lượt 18 µl hỗn hợp trên cho vào từng Eppendorf 0.2 ml.

Bước 4 Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệp, dung dịch chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương.

Lưu ý:

- Không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex.

- Sử dụng eppendororf 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR.

- Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng.

Bước 5 Cho 10 µl dung dịch RNA xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương vào các

ống Eppendorf 0.2 ml riêng lẻ đã chuẩn bị ở bước 3.

Lưu ý:

- Phản ứng Real-time PCR phải được đặt vào máy chạy trong vòng 3 giờ sau khi bổ sung dịch RNA.

- Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu 1 phản ứng cho Chứng âm tách chiết, 3 phản ứng cho 3 ống Chứng dương và 1 phản ứng với nước cất 2 lần (hoặc dung dịch KTS5) làm Chứng âm PCR.

chiết → Mẫu xét nghiệm → 3 Chứng dương.

Bước 5.Đậy nắp các Eppendorf 0.2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ và đặt vào máy Real – time PCR.

Bước 6 Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho RNA của HCV) và HEX (đặc trưng cho RNA chứng nội ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho các giếng

chứng dương là Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương trên máy khi sử dụng các mẫu chứng dương E3, E5 và E7 lần lượt là 5x103, 5x105 và 5x107 copies.

- File chứa các đoạn RNA mạch đơn (mẫu đã làm PCR)

Bưướớc 1 PCCR

Bước 2 Làm sạcạch sản phẩm PCR

Bước 3 Phản ứng giải trình tự (sequencing PCR) với 1 trong 4 loại ddNTPs

Bước 4 Làm sạch sản phẩhẩm giải trình tự

Bước 5 Điện di mao quản

Bước 6 Phân tích trình tự được giải bằng phần mềm chuyên dụng theo phương pháp stranger.

IV Nhhậận xéét kết quuảả:

- Dựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã được bộ gen của HCV như hình trên.

Bài tập 1

Bài tập 2

Bài tập 3

Bài tập 4

Bài tập 6