BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử

ĐẠI HỌC THỦY LỢI KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG Bộ môn Công nghệ sinh học BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ .

ĐẠI HỌC THỦY LỢI KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

Bộ môn Công nghệ sinh học

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC

PHÂN TỬ

Họ và tên: Lê Thị Thảo Lớp:61SH

MSV:1951193501 GVHD: TS.Lê Thị Ngọc Quỳnh

Hà Nội, tháng 9, năm 2022

MỤC LỤC:

Bài 1: Làm quen, hiểu nguyên lý các thí nghiệm sinh học phân tử và an

toàn phòng thí nghiệm I-Mở đầu

-Mục đích: Giúp sinh viên làm quen, hiểu nguyên lý các thí nghiệm sinh học phân tử, cách sử dụng pipette và an toàn phòng thí nghiệm

II-Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ và thiết bị

+ Máy khuấy từ

+ Cân phân tích

+ Máy đo pH

+ Nồi hấp khử trùng

+ Box cấy

+ Bể ổn nhiệt

+ Máy lắc ổn nhiệt

+ Máy spin down

+ Máy ly tâm

+ Máy PCR

+ Bể điện di

+ Máy soi gel

+ Bộ pipet 4 cỡ

III-Cách tiến hành

-Tìm hiểu các dụng cụ và thiết bị cần thiết để thực hành sinh học phân tử

*Thực hành sử dụng pipette:

Cắt mẫu giấy parafilm sau đó sử dụng pipette hút 1 lượng nhỏ dung dịch, tập nhả ra trên giấy parafilm rồi lại hút vào nguyên lượng cho đến khi sử dụng thành thạo pipette Với pipette cỡ 100-1000ul thì sử dụng ống eppendorft để thực hành thay vì parafilm

IV-Kết quả

-Sinh viên thông thạo sử dụng pipette, làm quen với các thiết bị trong thực hành sinh học phân tử

-Hiểu các nguyên tắc an toàn phòng thí nghiệm.

V-Kết luận

-Qua bài thực hành sinh viên làm quen, hiểu nguyên lý các thí nghiệm sinh học phân tử và an toàn phòng thí nghiệm

-Tiếp thu thêm được một số kinh nghiệm làm việc trong phòng thí nghiệm

VI-Tài liệu tham khảo

-TS.Lê Thị Ngọc Quỳnh -Đề cương môn học Thí nghiệm Sinh học phân tử (2022)

- -Bài 2: Pha môi trường và chuẩn bị dụng cụ I-Mở đầu

- Mục đích: Sinh viên biết cách pha môi trường để chuẩn bị nuôi cấy vi sinh vật

và cách cấy ria đường zigzag

II-Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Nguyên liệu và hóa chất Dụng cụ và thiết bị

+ Peptone 4g

+ Cao nấm men 2g

+ NaCl 2g

+ Agar

+ Kháng sinh

+ Đĩa petri + Đầu tips các cỡ + Ống falcol cỡ 15ml và 50ml + Ống eppendorft 1.5ml

+ Bình tâm giác cỡ nhỏ + Ống penicillin

Hình 1 Chuẩn bị dụng cụ khử trùng

III-Cách tiến hành

1 Chuẩn bị môi trường LB và môi trường LB có chứa kháng sinh cho chọn lọc

Pha môi trường LB

Thành phần trong 400ml môi trường LB gồm có:

+ Peptone 4g

+ Cao nấm men 2g

+ NaCl 2g

Với môi trường LB agar bổ sung thêm 3g agar vào 200ml môi trường trước khi khử trùng

Với LB có bổ sung kháng sinh thì sau khi khử trùng, để môi trường xuống khoảng 60oC thì tiến hành bổ sung kháng sinh theo yêu cầu

2 Cấy ria đường zigzag vi khuẩn E.Coli chứa vector tái tổ hợp trên môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin (50mg/l)

-Vô trùng buồng nuôi cấy, chuyển dụng cụ gồm môi trường LB lỏng, ống

Fancol, đầu tip 20µl, que cấy, đèn cồn,… vào box cấy, bật đèn tím 15 phút để vô khuẩn buồng cấy sinh học

-Vệ sinh tay bằng cồn 70oC, đĩa petri có môi trường đặc LB có chứa kanamycin (50mg/l)

-Dùng que cấy (hoặc tăm cấy vô khuẩn) lấy E.Coli từ ống gốc lưu trữ ở tủ -30oC thực hiện cấy ria đường zigzag trên đĩa môi trường thạch

-Nắp đĩa Falcon, ghi chú tên mẫu tên nhóm và ngày thực hiện trên đĩa

-Chuyển các ống đã nuôi cấy vào máy nuôi cấy, bật chế độ 37oC trong 15 giờ

IV-Kết quả

-Đã khử trùng đầy đủ môi trường, dụng cụ cần thiết

-Đổ thành công đĩa môi trường đặc LB có chứa kanamycin (50mg/l)

-Mỗi sinh viên đã thực hiện cấy ria đường zigzag vi khuẩn E.Coli chứa vector tái tổ hợp trên môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin (50mg/l)

-Thực hiện ghi chú tên mẫu, tên người thực hiện, ngày thực hiện đầy đủ trên đĩa

và đem đi bảo quản

Hình 2 Môi trường LBagar đã khử trùng Hình 3 Đĩa petri đã cấy E.Coli sau 1 tuần

V-Kết luận

-Qua bài thực hành sinh viên biết cách pha môi trường và chuẩn bị dụng cụ để chuẩn bị nuôi cấy vi sinh vật

-Ngoài ra, sinh viên đã biết và thực hành cấy ria đường zigzag trên môi trường đĩa thạch

-Tiếp thu thêm được một số kinh nghiệm làm việc trong phòng thí nghiệm

*Thảo luận

-Thao tác đổ môi trường và cấy vi sinh vật phải được thực hiện trong box cấy -Trước khi sử dụng, lau box cấy bằng cồn 70o, bậtUV 20 phút

-Cho luôn môi trường đã khử trùng vào box cấy bật UV nhưng đĩa đã được cấy

vi sinh vật thì không được cho vào box cấy bật UV vì UV có tác dụng diệt khuẩn nên khi cho môi trường vào dưới đèn UV sẽ ngăn chặn tối đa việc môi trường nhiễm khuẩn, có khả năng ngăn gây đột biến ở khuẩn; nhưng nếu cho đĩa

đã cấy vi sinh vật vào sẽ giết chết vi sinh vật cần phân lập

VI-Tài liệu tham khảo

-TS.Lê Thị Ngọc Quỳnh -Đề cương môn học Thí nghiệm Sinh học phân tử (2022)

- -Bài 3: Nuôi cấy vi khuẩn cho tách chiết plasmid I-Mở đầu

-Mục đích:

• Giúp sinh viên tự xây dựng được kế hoạch thí nghiệm của mình, thiết kế

thí nghiệm, trình bày kế hoạch thí nghiệm của mình trên cơ sở Khung bài

thực hành do giáo viên hướng dẫn

• Sinh viên biết cách chuẩn bị pha các hóa chất đúng nồng độ, đúng pH để

có thể tiến hành thí nghiệm

• Sinh viên nhớ được vai trò của các hóa chất sử dụng trong tách chiết để có

thể áp dụng vào các qui trình khác

• Sinh viên nắm được nguyên lý nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí

nghiệm, tránh tạp nhiễm

-Ý nghĩa:

• Qua bài thực hành này sinh viên có thể chủ động thiết kế, lập kế hoạch

cho thí nghiệm của mình, biết cách nuôi cấy vi khuẩn cho mở đầu tách

chiết DNA

II-Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

1.Nguyên liệu

ST

T

lượng

Ghi chú

1 Chủng E.Coli tái tổ hợp mang plasmid Chủng 1 Giáo viên cung cấp

2.Hóa chất

ST

T

lượng

Đơn vị hóa chất chuẩn

Quy ra hóa chất chuẩn

Ghi chú

3.Dụng cụ

4.Thiết bị

ST

T

III-Cách tiến hành

1.Chuẩn bị dụng cụ

Bình tam giác, que cấy, ống Fancol, môi trường được khử trùng ở 121oC, 1atm trong 30 phút

2.Chuẩn bị hóa chất

-Pha môi trường LB: 1% NaCl, 1% tryptone, 0,5% yeast extract Khử trùng môi trường ở 121oC, 1atm trong 30 phút

3 Thao tác thực hiện thí nghiệm

-Vô trùng buồng nuôi cấy, chuyển dụng cụ gồm môi trường LB lỏng, ống

Fancol, đầu tip 20µl, que cấy, đèn cồn, vào box cấy, bật đèn tím 15 phút để vô khuẩn buồng cấy sinh học

-Vệ sinh tay bằng cồn 70oC, chuyển 5ml môi trường lỏng LB có chứa

kanamycin (50mg/l) sang ống fancol 15ml

-Dùng que cấy ( hoặc tăm cấy vô khuẩn) lấy một khuẩn lạc E.Coli chuyển sang ống Fancol có chứa môi trường

-Nắp kín ống fancol, ghi chú tên trên ống

-Chuyển các ống đã nuôi cấy vào máy nuôi cấy, bật chế độ lắc 150-200

vòng/phút, 37oC trong 15 giờ

IV-Kết quả

-Mỗi sinh viên cấy được một ống fancol môi trường LB lỏng chứa khuẩn lạc E.Coli từ đĩa thạch petri

-Đưa các ống fancol đã nuôi cấy vào máy nuôi cấy, bật chế độ lắc 150-200 vòng/phút, 37oC trong 15 giờ thu được ống fancol chứa khuẩn E.Coli đã phát triển thành một quần thể

Hình 4 Ống fancol đối hứng và ống fancol nuôi cấy khuẩn lạc E.coli

V-Kết luận

-Qua bài thực hành, sinh viên nắm được nguyên lý nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm, tránh tạp nhiễm

-Biết cách nuôi cấy vi khuẩn cho mục đích tách chiết DNA

-Tiếp thu thêm được một số kinh nghiệm làm việc trong phòng thí nghiệm

*Thảo luận:

-Trong quá trình nuôi cấy khuẩn E.Coli trong môi trường LB lỏng, ở bước chọn một khuẩn lạc từ đĩa petri chuyển sang ống fancol cần chọn một khuẩn lạc riêng

rẽ màu trắng trong( trong đĩa đã cấy xuất hiện 2 loại khuẩn: màu vàng và màu trắng trong) để đảm bảo khuẩn lạc từ một dòng tế bào Ngoài ra, cũng không chọn khuẩn lạc trên những đường cấy dày vì ở những đường này có thể có nhiều dòng tế bào chồng lên nhau

VI-Tài liệu tham khảo

-TS.Lê Thị Ngọc Quỳnh -Đề cương môn học Thí nghiệm Sinh học phân tử (2022)

- -Bài 4: Tách chiết ADN plasmid và xác định nồng độ ADN

I-Mở đầu

-Mục đích: Giúp sinh viên biết cách chuẩn bị các dung dịch hóa chất cho sinh học phân tử, hiểu được nguyên lý và thực hành tách chiết được ADN plasmid

của E coli tái tổ hợp

- Ý nghĩa: Qua bài thực hành này sinh viên có thể chủ động tách chiết được mẫu ADN plasmid từ vi khuẩn gram âm

II-Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

1 Nguyên liệu

ST

T

lượng

Ghi chú

1 Chủng E.Coli mang plasmid được

nuôi lắc 200v/p qua đêm trong 10ml

môi trường LB lỏng ở 37oC

cung cấp

2 Hóa chất

vị Số

lượng

Đơn vị hóa chất chuẩn

Quy ra hóa chất chuẩn

Ghi chú

1

2M, pH8

2

2M, pH8

6 Sodium dodecyl

g

0.02

7 CH3COOK

9 Chloroform ml 5 ml 5

10 Ethanol 96% tinh

3 Dụng cụ

ST

T

4 Thiết bị

1 Máy ly tâm

Eppendorf

IV-Cách tiến hành

1 Chuẩn bị dụng cụ

Ông Fancol, đầu tip, Eppendorf được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 30 phút, sấy khô

Nước cất 2 lần hoặc nước deion được khử trùng, giữ ở nhiệt độ phòng

2 Chuẩn bị hóa chất

-Dung dịch I (50 mM Tris-HCl, pH 8; 10 mM EDTA, pH 8; 50 mM glucose): Hòa 50 µl Tris -HCl 2M, pH8; 20 µl EDTA 1M, pH8; 100 µl glucose 1M và và

1830 µl nước cất vô trùng, lắc đều, để trên đá hoặc giữ ở 4oC

-Dung dịch II (0,2 M NaOH; 1% SDS) pha trước khi sử dụng: Trộn 2000 µl SDS 2%, 800 µl NaOH 1M, 1200 µl nước cất vô trùng, lắc đều, để ở nhiệt độ thường

-Dung dịch III (3 M potassium acetate; 11,5% acetic acid): Hòa 600 µl

potassium acetate 5M, 285 µl nước, 115 µl acetic acid đậm đặc, lắc đều, để trên

đá hoặc giữ ở 4oC

RNAse 10 mg/mL: Hòa 1 mg RNAse vào 0,1 mL nước, lắc đều

3 Thao tác thực hiện thí nghiệm

-Bước 1: Cấy chuyển 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn vào 5 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh và nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC

-Bước 2: Chuyển dịch nuôi cấy vào các ống effendorf 1.5 ml và ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch nổi

(Chuyển 2ml dịch nuôi vào ống effendoft 1,5ml qua 2 lần mỗi lần 1ml: chuyển 1ml dịch nuôi vào ống effendoft 1,5ml đem ly tâm loại dịch nổi rồi tiếp tục chuyển 1ml dịch nuôi vào ống effendoft và đem lý tâm lần 2)

-Bước 3: Hòa tan tế bào trong 200 µl dung dịch I, voltex mạnh để tế bào trộn đều trong dung dịch Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Dung dịch I: (phá vỡ màng tế bào): GTE solution: 50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA pH 8,0, khử trùng và bảo quản ở 4oC

-Bước 4: Bổ sung 200 µl dung dịch II, lắc nhanh vài lần, ủ hỗn hợp trong đá 5 phút

(ủ lạnh hỗn hợp trong đá để giảm thiểu tối đa kha năng hoạt hóa các enzyme nội sinh trong tế bào)

Dung dịch II: (làm biến tính DNA nhiễm sắc thể) : 0.2 N NaOH, 1% SDS -Bước 5: Bổ sung 300 µl dung dịch III để lạnh, voltex nhẹ (dung pipette đảo hoặc lắc bằng tay), ủ hỗn hợp trong đá 10 phút

Dung dịch III: (tủa hỗn hợp SDS-protein, RNA và các DNA nhiễm sắc thể) 5M CH3COOK, 3 M CH3COOH Bảo quản ở nhiệt độ phòng - Bước 6: Ly tâm

14000 vòng/phút, 10 phút ở 4 oC

-Bước 7: Hút phần dịch sang một ống effendorf mới, bổ sung 0,5 ml isopropanol hoặc ethanol 100% lạnh (để tủa DNA), voltex

-Bước 8: Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi (sẽ thấy DNA màu trắng đục lắng xuống dưới =>thu tủa)

-Bước 9: Rửa tủa bằng cách thêm từ từ 0.5 ml ethanol 70%, chắt bỏ cẩn thận, ko làm mất tủa

-Bước 10: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút (cho vào box cấy

mở quạt vì trong box cấy sạch hơn bên ngoài)

-Bước 11: Nhẹ nhàng hòa tan tủa trong 100 µl đệm TE 1X hoặc H2O khử ion,

bổ sung thêm RNase đến nồng độ cuối 20 µg/ml ủ ở 37 oC trong 30’ Sau đó, plasmid được bảo quản ở -20oC

Xác định nồng độ ADN

-Bước 1: Rửa cuvet bằng nước, 1 lần bằng cồn, lau sạch bằng giấy

-Bước 2: Thực hiện quá trình blank bằng chất chuẩn (nước deion), đo khoảng 3 lần sau đó bằng chất chuẩn để kiểm tra lại kết quả

- Bước 3: Đo mẫu plasmid vừa tách (đo tỷ lệ DNA/protein)

Chú ý: cuvet có 2 mặt cho ánh sáng đi qua nên không được chạm tay vào vào 2

mặt đó

- Bước 4: Ghi lại kết quả A260, A280, A260/A280 Trong đó độ tinh sạch thể hiện qua giá trị A260/A280

-Công thức tính nồng độ OD:

[DNA] = 50 x số lần pha loãng x số đọc ở A260 (đơn vị: µg/ml) trong đó 50 là lượng DNA có trong máy đo OD (Tùy thiết bị sử dụng)

IV-Kết quả

Hình 5 Kết quả đo OD

-Kết quả sau khi đo OD được thể hiện trong bảng sau:

-Nếu tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2 thì DNA được xem là tinh sạch Tỷ

lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất Đối với dung dịch DNA sợi đôi, nếu tỷ lệ này quá lớn thì chứng tỏ DNA có chứa trong mẫu bị biến tính hay

bị phân hủy

-Từ kết quả ở bảng trên ta thấy OD ở bước sóng A260/A280 là 2,08 Kết quả không nhỏ hơn 1,8 và cũng không quá lớn so với khoảng tỷ lệ 1,8-2 nên DNA plasmid tách được được xem là tinh sạch

V-Kết luận

-Qua bài thực hành, sinh viên biết cách chuẩn bị các dung dịch hóa chất để thực hành tách chiết DNA plasmid

-Hiểu được nguyên lý à thực hành tách chiết được DNA plasmid của E.coli tái tổ hợp

-Tiếp thu thêm được một số kinh nghiệm làm việc trong phòng thí nghiệm

*Thảo luận

-Trong quá trình tách chiết DNA plasmid, cần có bước bổ sung ethanol 100% và 70%, đây là bước cần thiết đẻ loại bỏ các thành phần còn sót lại trên màng như protein, polysaccharide hay thậm chí là chất màu nhằm đạt hiệu suất tách chiết

và tinh sạch DNA cao Muối còn sót lại làm giảm quá trình rửa giải acid nucleic đưa đến kết quả đọc OD ở bước sóng A230 cao và tỷ lệ A260/230 thấp nên cần thực hiện bước rửa DNA bằng ethanol tới 2 lần

-Ngoài ra, đầu tiên sử dụng ethanol 100% lạnh để thu được nhiều DNA tủa hơn

mà không bị nhiễm muối, sau đó cần rửa tủa với ethanol 70% để loại bỏ muối (muối dư sẽ được hòa tan trong % nước của ethanol 70%)

-DNA plasmid sau tủa với ethanol 100% sau ly tâm có màu trắng, sau khi làm khô sẽ khó quan sát và tan hoàn toàn trong TE hoặc trong nước deion

-Bước làm khô tủa nhằm loại ethanol vì nếu vẫn còn sót lại ethanol, nucleic acid không thể bị hydrate hóa đầy đủ dẫn tới hiệu suất tách chiết DNA thấp

 Ý nghĩa của các hóa chất trong tách chiết DNA plasmid:

 Các muối chaotropic ở nồng độ cao làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Vander Waals và các tương tác kỵ nước Do đặc tính này, các chất chaotropic có một số tác dụng sau: ly giải màng tế bào; biến tính protein, DNA và các đại phân tử khác; bất hoạt nuclease; thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic

 Một số chất tẩy rửa và enzyme cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hòa tan protein và quá trình ly giải

 Ethanol có tác dụng rửa tủa

 Với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải

VI-Tài liệu tham khảo

-TS.Lê Thị Ngọc Quỳnh -Đề cương môn học Thí nghiệm Sinh học phân tử (2022)

- -Bài 5: Điện di kiểm tra chất lượng adn plasmid I- Mở đầu

-Mục đích: Giúp sinh viên hiểu được nguyên lý điện di, phương pháp chọn nồng

độ gel thích hợp, cách điện di và quan sát, phân tích kết quả sau điện di ADN

-Ý nghĩa: Qua bài thực hành này sinh viên có thể chủ động lựa chọn được gel

thích hợp cho phân tích ADN nói chung

II- Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

1 Nguyên liệu

ST

T

1 DNA hệ gen và DNAplasmid đã

được tách chiết 50(ng/µl)

cung cấp

2 Hóa chất

vị Số

lượng

Đơn vị hóa chất chuẩn

Quy ra hóa chất chuẩn

Ghi chú

1

Cho 100ml TAE

50x

2

Cho 100ml TAE

50x

3 C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8

(muối EDTA

Cho 100ml TAE

50x

3 Ethidium bromide

4 Đệm tra mẫu

3.Dụng cụ

ST

T

4.Thiết bị

ST

T

III-Cách tiến hành

1 Chuẩn bị dụng cụ

Đầu tip, Eppendorf được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 30 phút, sấy khô Nước cất 2 lần hoặc nước deion được khử trùng, giữ ở nhiệt độ phòng