Thực hành dược liệu 2

Tài liệu học và ôn thi Dược liệu 2 thực hành, giúp bạn hiểu và giải thích được các hiện tượng xảy ra trong quá trình làm thí nghiệm và áp dụng trong quá trình thi thực hành. Gồm các nội dụng: NHẬN BIẾT TINH BỘT BẰNG KÍNH HIỂN VI, ĐỊNH LƯỢNG CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS, KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID, CHIẾT XUẤT – ĐỊNH TÍNH, KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA TINH DẦU, KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA DẦU BÉO

▪ Là sản phẩm từ quang tổng hợp của cây xanh dự trữ trong hạt, củ, rễ, quả, thân (2-70%), trong

lá (≤ 1-2%)  dưới dạng tinh bột và sử dụng trong quá trình cây không hoạt động: mùa đông  dùng enzym cắt tinh bột thành đường đơn

▪ Tinh bột tồn tại dưới dạng hạt có hình dạng và kích thước khác nhau.==> soi KHV

▪ Không tan trong nước lạnh

▪ Đun với nước bị “hồ hóa” và độ nhớt tăng lên  dễ làm

▪ Trong cây dưới tác động của enzyme, tinh bột bị cắt thành đường hòa tan để đến các bộ phận của cây

Phân biệt tinh bột giữa các loài thực vật dựa vào các đặc điểm:

▪ Hình đa giác: Gạo, Bắp

▪ Hình chỏm cầu: Sắn dây, Khoai mỳ

▪ Hình dĩa: Ý dĩ, Bột mỳ

▪ Hình trứng: Hoài sơn, Đậu xanh, Khoai tây

3

CÁCH TIẾN HÀNH

1 tiêu bản đạt yêu cầu khi:

- Tinh bột phân tán đều trên lam  không dày đặc

Bước 1: Kiểm tra nguồn điện, bật nguồn

Bước 2: Điều chỉnh về vật kính 10x (màu vàng) Cho tiêu bản lên bàn để mẫu, điều chỉnh mẫu về giữa

Bước 3: Dùng ốc sơ cấp nâng bàn để mẫu lên cao nhất

Bước 4: Đưa mắt vào thị kính, di chuyển bàn để mẫu xuống bằng ốc sơ cấp đến khi thấy được hình

ảnh mẫu vật

Bước 5: Tìm cấu tử với vật kính 10x bằng cách di chuyển núm di chuyển bàn để mẫu

Bước 6: Xem cấu tử ở vật kính 40x, điều chỉnh ốc thứ cấp khi chưa nhìn rõ cấu tử

Bước 7: Vẽ hình bằng viết chì và trả lời câu hỏi

“Bằng kỹ thuật vi học cho biết tinh bột này là gì”

TỔNG KẾT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

Tinh bột

hình Đa

giác

Tinh bột bắp - Bắp to hơn gạo

Hình đa giác, các hạt tinh bột rời nhau, thấy nhiều tễ hình sao

Tinh bột gạo - Nhỏ hơn bắp

- Tụ thành từng đám Hình đa giác kích thước nhỏ, hạt tinh bột kết dính thành từng mảng, hầu

như không thấy tễ

Tinh bột sắn Dây Hình chỏm cầu lõm, chiết quang, hầu

như không thấy tễ (lắc ốc vi cấp tới lui thấy như hinh 3D)

Tinh bột Khoai mì Hình chỏm cầu lồi, không chiết quang,

thấy rõ tễ hình sao

- Hình chuông bình thường

Tinh bột

hình dĩa

Tinh bột ý dĩ Mép thường dợn sóng, tễ hình chữ Y

hoặc là một vạch to chia hạt tinh bột làm

Tinh bột khoai Tây Hình trứng đầu to, đầu nhỏ, lộ rõ vân

tăng trưởng khi lắc nhẹ ốc thứ cấp

- Muốn thấy vân lắc ốc vi cấp

5

Tinh bột đậu Xanh Hình trứng, tễ hình xương cá đặc trưng

Tinh bột hoài sơn Đơn giản, không có vân, không có tễ,

nếu có là 1 tễ dài không phân nhánh, dọc theo chiều dài của hạt

NHẬN BIẾT BỘT DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI

Đặc điểm bột dược liệu

▪ Mỗi dược liệu có những đặc điểm mô học đặc trưng, những đặc điểm này có thể được dùng để phân biệt, xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu

▪ Khảo sát bột dược liệu bằng KHV là tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu, phân biệt với các dược liệu dễ bị nhầm lẫn và phát hiện

sự giả mạo nếu có

Đặc điểm cảm quan

▪ Bột lá thường có màu xanh lục tới nâu Các cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khổng, lông

che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ,…

▪ Bột vỏ thân, vỏ rễ thường có màu vàng nâu tới nâu Các cấu tử thường thấy là: mảnh bần, mô

mềm, các loại sợi, tinh thể calci oxalat hay calci carbonat, mô cứng,…

▪ Rễ củ, thân ngầm phình thành củ cần chú ý tới đặc điểm cấu tạo của hạt tinh bột

▪ Hoa thì cần chú ý tới cấu tạo và hình dạng của hạt phấn, biểu bì cùng các loại lông che chở, lông

tiết của bao hoa

Cách tiến hành

Làm như quan sát tinh bột nhưng khác: ban đầu cần  Ghi nhận đặc điểm cảm quan của bột về: màu sắc, mùi, thể chất (xem bột nhận được là bột gì, trong chương trình có 10 bột)  hướng đi tìm cấu tử mong muốn (cấu từ chính) tìm cấu từ phụ (không bắt buộc tìm như dạy, thấy gì ghi náy)

▪ Làm tiêu bản như bài “Nhận biết tinh bột bằng kính hiển vi” nhưng với lượng mẫu nhiều hơn

▪ Quan sát và tìm cấu tử ở vật kính 10x, xác nhận cấu tử ở vật kính 40x

▪ Ghi nhận cấu tử đặc trưng, vẽ cấu tử và trả lời câu hỏi: “Bằng kỹ thuật vi học , cho biết bột dược liệu này là gì?”

3 Lông che chở đơn bào

Xoa bóp giảm đau nhức Strichnyl trị yếu cơ liệt cơ

7

CÀ ĐỘC DƯỢC

Datura metel – Solanaceae (Hơi thở của quỷ thôi miên)  lấy lá

1 Lông che chở đa bào màng lấm tấm, thường có eo thắt*

2 Mảnh biểu bì mang lỗ khí

3 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai

4 Lông tiết đầu đa bào

5 Mảnh mạch vạch

TRÀ (CHÈ)

Camellia sinensis – Theaceae (có polyphenol: chống OXH, có caffein: kích thích TKTW)

9

1 Thể cứng*(cương thể)

2 Tinh thể Canxi oxalat hình cầu gai

3 Mảnh biểu bì mang lỗ khí

4 Mạch vạch

5 Lông che chở đơn bào

VÀNG ĐẮNG

Coscinium fenestratum – Menispermaceae (trị tiêu chảy có berberin)

1 Tế bào, đám tế bào mô cứng*

11

1 Mảnh buồng ẩn khổng*

2 Tinh thể Calci oxalat hình khối

3 Lông che chở đơn bào

1 Hạt phấn có ba lỗ nảy mầm* muốn thấy rõ lắc ốc vi cấp: tìm ở vật kính 40X, tìm ngoài rìa lam

2 Lông che chở đa bào

3 Lông che chở đơn bào

4 Mạch xoắn

ĐẠI HOÀNG

Rheum officinale – Polygonaceae

1 Tinh thể Calci oxalat hình cầu gai*  số lượng nhiều hơn loại khá, đẹp hơn: là chấm đen trên quang trường

13

THUỐC GIÒI

Pouzolzia zeylanica – Urticaceae thanh nhiệt

1 Lông che chở móc câu*

2 Bào thạch

3 Mảnh biểu bì mang lỗ khí

4 Lông che chở đơn bào lấm tấm gai nhỏ *

MUỒNG TRÂU

Senna alata – Fabaceae  lá không thấm nước do cutin lồi

1 Lông che chở đơn bào ngắn, đầu nhọn

2 Tinh thể Calci oxalat hình khôi

3 Mảnh biểu bì phiến lá mang lỗ khí và cutin lồi *

4 Cutin lồi *. >tìm trong mảnh biểu bì mang lỗ khí (thấy khoanh tròn) và trên gân lá

NGŨ BỘI TỬ

Galla sinensis (là tổ của sâu ký sinh trên cây muối) chỉ có ờ Trung Quốc

1 Lông che chở đa bào *

Xanh Trúc đào Đi soi

luôn

Nhiều mảnh lông tua tủa + lông che chở uốn lượn Thuốc giòi Lông che chờ hình móc câu

Muồng trâu Mãnh biểu bì tb hình hạt đậu, lắc nhẹ ống vi cấp xem

phanh tròn tròn trên mảnh  cutin lồi

Cát Mã tiền Di chuyển kính đến các hạt to to  thấy tb vỏ hạt, nội nhũ

Định lượng Cafein bằng phương pháp uv – vis

PHƯƠNG PHÁP UV – VIS

▪ Phương pháp phân tích dựa vào hiệu ứng hấp thụ giữa phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ Tuân theo định luật Lam bertBeer

▪ Vùng bức xạ sử dụng là vùng tử ngoại hay khả kiến ứng 200-800nm

▪ Bước sóng từ 200-400 nm, được gọi là ánh sáng tử ngoại (UV)

▪ Bước sóng trong khoảng 396-760 nm được gọi là ánh sáng vùng VIS  ánh sáng trắng

Các phương pháp định lượng

Phương pháp đường chuẩn  sử dụng

Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp đo quang vi sai

Phương pháp so sánh 1 chuẩn

Phương pháp đường chuẩn

▪ Pha dãy chuẩn có nồng độ Cc tăng dần một cách đều đặn (cùng điều kiện như dung dịch thử) (ít nhất 4 bình)

▪ Tiến hành đo độ hấp thu Ac của dãy chuẩn ở bước sóng λ đã chọn

▪ Xác định phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn có dạng y= ax+b (với x: nồng độ,

y=độ hấp thu A)  muốn đường thẳng  R 2 : (hệ số tương quan) >0,999…  khi càng tiến gần 1 thì nằm trên đường thẳng

▪ Pha dung dịch mẫu thử Đo độ hấp thụ quang At của mẫu

▪ Xác định nồng độ mẫu thử Ct thông qua phương trình y = ax + b với y = At (A là máy đo) suy

17

▪ Tính base yếu, nối đôi liên hợp

▪ Tan trong nước sôi, CHCl3, thăng hoa

▪ Tác dụng kích thích thần kinh trung ương, tăng tác dụng giảm đau, lợi tiểu

Bằng phương pháp quang phổ, hãy xác định hàm lượng Caffein của mẫu………

Bước 1: XÁC ĐỊNH λmax

Mỗi chất có λmax khác nhau

▪ Xác định bước sóng hấp thu cực đại của dung dịch cafein: dùng một trong các bình chuẩn (C2 → C10), đo ở chế độ spectrum để xác định bước sóng hấp thu cực đại (λmax)

▪ Bước sóng hấp thu cực đại là 275 nm (khoảng 0.532)

Bước 2: Xây dựng đường tuyến tính

Pha dung dịch gốc A

▪ Cân chính xác khoảng 20 mg (sai số +/-10%)  phải đổi sang gam x1000 caffein chuẩn cho vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 30 ml (khoản nửa bình) nước cất, siêu âm (5-10p) đến khi tan hết cafein

▪ Thêm nước cất đến vạch, lắc đều được dung dịch gốc A

▪ Nồng độ dung dịch gốc CA khoảng 200 µg/ml = 200ppm (nếu cân 18 thì 18 *10^3/100)

Pha dãy nồng độ chuẩn từ dung dịch gốc A

▪ Pha các dung dịch C2, C4, C6, C8, C10 từ dung dịch A

Pha dãy nồng độ chuẩn từ dung dịch gốc A

▪ Tính nồng độ dung dịch C2, C4, C6, C8, C10 theo công thức

Trong đó:

X là số ml dung dich A (100 là do pha loãng 100 ml)

▪Đo độ hấp thu Ax của C2, C4, C6, C8, C10 (excel hoặc bằng máy tính)

▪ Xây dựng đường tuyến tính y = ax + b dựa vào Ax , Cx bằng Excel như sau:

▪ Nhập liệu như bảng tương ứng (C và A là tự tính và máy đọc)

▪ Lấy chính xác 4 ml (bằng buret) dung dịch trong bình định mức 250 ml cho vào bình định mức

100 ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều  đo được At

19

▪ Đo độ hấp thu At của mẫu thử

▪ Thay y = At vào phương trình y = ax + b để tìm nồng độ mẫu thử x = Ct (ppm)

▪ Hàm lượng % cafein:

Trong đó:

Ct : nồng độ mẫu thử

m cân: khối lượng dược liệu cân thực tế (g)

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID CHIẾT XUẤT – ĐỊNH

TÍNH

NỘI DUNG

1 CÀ ĐỘC DƯỢC

Dược liệu này có alkaloid không? Nếu có, có phải atropin/scopolamin không?

Bằng TLC hãy cho biết dược liệu này có alkaloid không? Có phải cà độc dược không?

Dược liệu này có berberin không?

Trả lời câu hỏi?

1 Alkaloid là gì?

Max Polonovski  được dùng đến hiện nay

- Hợp chất hữu cơ, có chứa N đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm

- Thường từ thực vật (đôi khi từ động vật)

- Thường có dược tính mạnh (liều dùng phải nhỏ hơn 10 mg) (nicotin, cafein, Taxol )

- Cho phản ứng dương tính với các thuốc thử chung của alkaloid

2 Các dạng tồn tại của Alkaloid, tính tan của các dạng đó? Trong cây Alkaloid tồn tại ở dạng nào?

Tồn tại 2 dạng:

- Dạng base: kém phân cực (CHCl3, CH2Cl2, toluen, benzen)

- Dạng muối: phân cực (tan trong nước trong bài này sd nước acid H2SO4 2%)

Trong cây Alkaloid tồn tại ở dạng muối (vì trong cây rất nhiều acid hữu cơ + Alk base  alk dạng muối) phân cực

Khi chiết Alkaloid từ dược liệu cần chuyển dạng 1-2 lần để loại tạp, tùy vào dạng Alk cần là gì để chuyển dạng (nếu thuốc thử chung cần dạng muối, thuốc thử đặc hiệu cần dạng base)

3 Kể tên các thuốc thử chung, hiện tượng màu sắc tương ứng? để thực hiện phản ứng với thuốc thử chung Alkaloid cần ở dạng nào?

Trả lời cho  Có Alkaloid hay không

(chỉ cần quan sát tủa)kết luận dương tính: đục: +, đục  lắng: ++, lắng ngay lập tức: +++, tủa nhiều ++++

Chỉ cần 1 trong 5 ống đục  kết luận dược liệu có Alkaloid

Âm tính: khi dịch chiết trong suốt

Bản chất của thuốc thử chung: Pha bằng muối của kim loại nặng

Dạng để làm tt chung phải là Alkaloid dạng muối vì tt chung pha trong nước chỉ có dạng muối mới tan trong nước (2 chất phải đồng tan vào nhau)

ĐỊNH TÍNH BẰNG THUỐC THỬ CHUNG

THUỐC THỬ THÀNH PHẦN MÀU CỦA TỦA

Bông trắng, Vàng ngà (bình vôi tủa vàng do dịch chiết

có màu vàng) Bertrand (rất nhạy,

để định lượng) Acid silicotungstic Trắng, trắng ngà

Tiến hành ở dạng muối trong nước acid

4 Kể tên các phản ứng đặc hiệu, thuốc thử và hiện tượng tương ứng của: Cà độc dược, Trà, Mã tiền, Vàng đắng? Để thực hiện các phản ứng đặc hiệu Alkaloid cần ở dạng nào?

Quan sát màu sắc kém bền

Bản chất xảy ra phản ứng OXH khử

Trả lời câu hỏi: dược liệu có chứa (cafein) không

Vitali-Morin tt: HNO3 dd,Aceton, KOH/cồn or metanol (tinh khiết hơn)

Cacothelin (HNO3)

Tím sau đó chuyền sang nâu vàng

Tiến hành alkloid dạng base trong cắn (trừ Berberin và Quinin phải thực hiện dạng muối)

5 Kể tên các phượng pháp chiết xuất Alkaloid?

Chiết alk dạng base :

- Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

Ưu điểm:

Chiết nhanh, chiết kiệt

Phương pháp thường quy (áp dụng cho tất cả alkaloid)

Áp dụng cho quy mô kiểm nghiệm (phòng thí nghiệm)

Áp dụng cho Alk kém bền với nhiệt (Atropin và scopolamin)

Nhược diểm:

- Không phù hợp công nghiệp (vì lượng dmhc thải ra mội trường nhiều ảnh hưởng mt)

- Không dùng với dược liệu tươi (vì trong dl có nước cản trở dmhc không tiếp xúc với tb thực vật  k chiết được)

Hiệu suất phụ thuộc vào quá trình kiềm hóa (nếu ít thì không đủ kiềm hóa, nếu nhiều thì dược liệu ngập nước)

- Cất kéo theo hơi nước

 alkaloid phải ở dạng tự do (base)

 Áp dụng dược liệu: NICOTIN, COIIN, (EPHEDRIN chưng cất hơi nước được do cấu trúc nhỏ dễ bị hơi nước lôi đi theo, không phải tính chất)

 Ưu  alkaloid thu được khá tinh khiết

 Nhược  áp dụng hạn chế số alkaloid (không áp dụng cho chất kém bền và bay hơi với nhiệt)

- Thăng hoa:

 alkaloid phài ở dạng thăng hoa  Ưu: tinh khiết

 Alkaloid có khả năng thăng hoa: cafein (trong trà xanh và cafe), Ephedrin (ít)

Chiết alk dạng muối:

- Chiết bằng nước acid

Ưu:

- Dùng cho qui mô công nghiệp (vì lượng dmhc thải ra môi trường ít hơn),, rẻ tiền, an toàn

- Chiết được 1 số có tạp kém phân cực nhiều (lá có nhiều corophin, hạt có dầu béo)  loại tạp ngay từ bước đầu

Nhược: dành có Alk có hàm lượng cao, chậm và không chiết kiết

- Chiết bằng cồn acid

Sử dụng hỗn hợp cồn acid để tăng dịch chiết

6 Alkaloid có khả năng bay hơi và thằng hoa:

- Thể lỏng/ chưng cất được: NICOTIN, CONIIN

- Thăng hoa: CAFEIN, EPHEDRIN

Các thuốc thử chung

(+) Dung dịch đục nhưng không lắng xuống

(++) Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút

(+++) Có tủa lắng xuống ngay

23

(++++) Có tủa nhiều

ATROPIN/SCOPOLAMIN

Trong cà độc dược

1 Dược liệu này có alkaloid không? Nếu có, có phải atropin/scopolamin không?

2 Bằng TLC hãy cho biết dược liệu này có alkaloid không? Có phải cà độc dược không?

Phản ứng Vitali-Morin (định tính acid tropic)

Bốc hơi dịch chloroform trên cách thuỷ trong một chén sứ cho tới cắn khô Thêm vào cắn 5 giọt

HNO3 đậm đặc rồi đun trên bếp cách thủy đến cắn khô

Để nguội, thêm vào chén 3-5 ml aceton, 2-3 giọt

KOH 5% trong MeOH, lắc đều, sẽ xuất hiện màu tím (hoặc màu tím hoa cà) không bền

Dùng tác nhân kiềm hóa là Na2CO3 vì tính kiềm của Na2CO3>Atropin >NH3> Scopolamin

Không dùng NaOH vì có lk este sẽ bị thủy phân

Không dùng nước acid (H2SO4 2%) do phải dùng nhiệt độ mà 2 chất trên kém bền nhiệt  bị thủy

Lấy dịch cô cho cạn hết

Cho đến khi nào k còn sủi bọt khí thêm 1 ít rồi thử pH10

 Chỉ có thể sử dụng 1 phương pháp là sử dụng dmhc trong môi trường kiềm tb Na2CO3 hoặc NaHCO3

Nếu làm ẩm quá ướt hoặc quá khô thì làm hiệu suất chiết thấp  quan sát k rõ (ướt nước bao quanh

dl  bao quanh dược liệu k cho CHCl3 k thấm vào dược liệu) (khô thì CHCk3 vẫn thấm nhưng chưa kiềm hóa hoặc ít  k đủ lượng Alk từ dạng muối về base  dạng muối chiếm ưu thế k tan trong dmhc  k chiết được)

Sau khi lắc với CHCl3 lọc qua bông (lấy nhiều dịch k xuống do dmhc bay hơi)

CHCl3 nặng hơn nước lớp dưới  H2SO4 lớp trên

Na2SO4 khan cm trên cục bông

- Nếu cho dư Na2CO3 quá pH 10 thì  tạo nhũ (Na2CO3 có độ nhớt + CHCL3)  có thề phá bằng H2SO4 acid hóa lại về pH 10

Thuốc thử chung: không cho nhiều  tủa sẽ tan

Dragendorff  đục ++

Bouchardat  đục ++

Valse-Mayer  đục ++

Bertrand  đục ++

Hager (kém nhạy nhất)  trong suốt  -

 Thuốc thử chung dương tính  có Alkaloid

Phản ứng Vitali – morin

Nguyên tắc: định tính acid tropic (do cấu tạo bởi khung tropan và acid tropic liên kết qua dây nối

este)

25

CAFEIN

Dược liệu này có alkaloid không? Nếu có, có phải cafein không?

Phản ứng Murexid: Dịch CHCl3 (A) này đã được làm khan với một ít Na2SO4 rồi cho vào một

chén sứ nhỏ Bốc hơi dịch CHCl3 trên bếp cách thuỷ đến cắn khô Nhỏ lên cắn 3 giọt HCl đậm đặc

và 2 giọt H2O2 đậm đặc, tráng đều Bốc hơi hỗn hợp này trên bếp cách thuỷ đến cắn Thêm vào cắn

vài giọt NH4OH đđ sẽ xuất hiện màu tím sim

Cafein tan trong nước sôi

Muối + tạp pc

base

K sd NH3 vì có thêm tanin + Alk  phức tanat bền

Chi làm 2 phần