Dược liệu 1 thực hành

Tài liệu học và ôn thi dược liệu 1 thực hành, giải thích nguyên nhân, hiện tượng có trong thí nghiệm. Một số lưu ý trong quá trình thí nghiệm để hoàn thành tốt bài thi. Gồm SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU, SAPONIN, COUMARIN, TANIN, ANTHRANOID, FLAVONOID

Glycosid

Đa số hợp chất là Glycosid

Cấu tạo 2 thành phần:

- Không đường (genin) (Aglycon)  kết hợp với đường  gọi là hợp chất Glycosid

- Trong dược liệu tồn tại song song: Aglycon và Glycosid

Độ tan:

- Glycosid: tan trong dung môi phân cực (nước, ethanol, methanol, hh cồn nước)

- Aglycon: tan trong dm kếm phân cực Tác dụng dược lý:

- Glycosid  phân loại, dược lý  dựa vào Aglycol

- Đường chỉ đóng vai trò quyết định lên độ phân cực

SAPONIN

Saponosid (glycosid của saponin)

Saponin là tên gọi chung của 2 dạng:

- Saponosid (glycosid = sapogenin + đường)

- Sapogenin (không đường) Saponin có cấu trúc cơ bản là triterpen hay steroid dựa vào phần Aglycon

Trong chiết suất và phân lập Saponin  dung môi chọn lọc n-butanol bão hòa nước (lắc phân bố để được độ tinh khiết cao)

5 tính chất đặc trưng:

- Tạo bọt (bền trong nước tối thiểu 15p)  do có cấu trúc 1 đầu thân dầu và 1 đầu thân nước  phải ở dạng Saponosid

- Tạo được tủa với cholesterol

- Phá huyết dù ở nồng độ rất thấp (không phải cái nào cũng có như nhân sâm)

- Dung môi chiết:

Không sử dụng cồn cao độ và nước vì:

Cồn cao độ 96o ngoài chiết được Saponin còn chiết được nhiều chất khác (tạp)

H2O hòa tan chất nhầy có khả năng tạo bọt dương tính giả

 Ngoài Saponin còn có Glycosid tim có khả năng tạo bọt nhưng không bền bằng Saponin

 Cô cạn  để loại cồn  nếu còn cồn thì sẽ phá bọt

 Thêm 2 ml nước cất để hòa tan Saponosid  làm phản ứng tạo bọt không sử dụng nước máy vì tồn tại 1 số ion kim loại  làm phá bọt

Phản ứng Liebermann-Burchard (buộc sa)

Dịch chiết đậm đặc còn lại cô cạn trên bếp  để nguội + 3ml CHCl3 (được xem là dung môi chiết xuất Saponin thu dạng SAPOGENIN + 1 ml Anhydric acetic (háo nước  làm khan nước trong dịch chiết và trong dụng cụ nếu không làm khan khi thực thiện OXH-K với H2SO4 đđ cực kỳ háo nước  sinh nhiệt lớn làm lớp dm trong ống nghiệm sôi sáo trộn hiện tượng mất vòng nhẫn, nếu còn nước cho acid vào nhiều  phản ứng mãnh liệt văng acid ra ngoài) đặt ống

nghiệm vào giá nghiên thêm từ từ 1-2 giọt H2SO4 đđ  để yên quan sát mặt phân các giữa 2 lớp:

- Nếu xuất hiện vòng nhẫn màu hồng đến đỏ tím  Saponin triterpen (lớp trên màu vàng)

- Nếu xuất hiện vòng nhẫn và loan màu xanh lên lớp trên Saponin Steroid

 H2SO4 đậm đặc nặng hơn CHCl3 nên nằm dưới

SKLM

4 yếu tố cơ bản để chuẩn bị SKLM:

- Chấm gì  mẫu thử, mẫu chuẩn

- Chấm lên  bản mỏng, pha tĩnh

- Cho vào bình sắc ký

- Trong đó có  pha động (dung môi)

Dược liệu này phải cam thảo/ Ngũ gia bì không?

Dung môi chiết:

MeOH 80% (tinh khiết hơn cồn dễ cô cạn hơn) hoặc cồn 70% hoặc 96%

Bước 1:

• Chuẩn bị pha động: có độ phân cực trung bình do saponin phân cực trung bình

CHCl3 – MeOH – H2O (65:35:10, lớp dưới) (không hỗn hòa nên pha trước 45p để 2 lớp tách ra hoàn toàn)

Có thể dùng EtOAc – MeOH – H2O (100:17:13) Flavonoid, Saponin

EtOAc-MeOH-H2O (8:1:1)

Bước 2:

• Bão hòa bình sắc ký

Bình sắc ký, giấy lọc,…

 • Các loại bình sắc ký quan sát được

 • Vai trò của giấy lọc: giúp cho quá trình bão hòa bình sắc ký diễn ra được nhanh hơn (dung môi thấm vào giấy, bay hơi, bão hòa không khí trong bình) không dùng giấy lọc cũng được nhưng quá trình bão hòa hơi lâu

 • Yêu cầu của Bình sắc ký: kín, bão hòa, đôi khi không cần giấy lọc  bão hòa chậm, SK tách tốt hơn

Bước 3:

• Chuẩn bị pha tĩnh, mẫu

Bản mỏng, mao quản, mẫu thử, mẫu chuẩn

 • Bản chất của bản mỏng (cơ chế, F254, thao tác trên bản mỏng)

 • Vai trò của Mao quản?  chấm

 • Cách chuẩn bị mẫu thử? Có các lưu ý gì?

- MeOH 80% cô cạn loại hết nước

- Cần hòa tan lại MeOH

- Soi UV kiểm tra mức độ/ lượng mẫu

Bước 4:

• Khai triển sắc ký và phát hiện vết

Thuốc thử H2SO4 10%/cồn (không đặc hiệu)  để khô  gia nhiệt: bốc hơi cồn để lại acid, OXH tạo chất có màu tím (Flavonid  vàng)

Ngoài ra có thể dùng thuốc thử VS  không chọn lọc vì hchh đều cho ra màu sắc khác nhau

 • Thứ tự thực hiện?

- Quan sát bằng mắt thường

- Soi UV

- Nhúng thuốc thử

 • Hiện tượng quan sát được sau khi nhúng? Sau khi nướng?

- Không thấy gì  nướng: nhiệt độ xúc tác phản ứng: xuất hiện vết

• Coumarin là dẫn chất của khung Benzo - α pyron (C6 – C3)

TÍNH CHẤT CÓ ĐƯỢC TỪ VÒNG Benzo - α pyron???

Có liên kết C=O ở vị trí (C6-C3)  tạo tổ hợp COO  liên kết ester nội phân tử (vòng lacton)

 Tham gia phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm, nhiệt  mở vòng

- Dạng tồn tại: AGLYCON

- Độ tan: trong DM kém phân cực: n-hexan,

- Ester nội phân tử + kiềm cắt đứt vòng  khi thêm acid  đóng vòng  Phản ứng đóng mở Ester nội phân tử, kém bền mở

vòng  tính chất đặc trưng

CHCl3, MeOH, EtOH : dm chọn lọc

- Các tính chất đặc biệt:

- Phát huỳnh quang UV 365

- Thăng hoa (tinh thể hình que và trong

suốt) (khác Anthranoid cho hình kim màu vàng)

- Thơm

vòng LACTON

- Khi mở vòng có đồng phân Cis – Trans  tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm > chỉ cần 1 trong 2 phản ứng dương tính thì kết luận có COUMARIN

Phản ứng phụ:

- OH phenol: +FeCl3

- Diazo: thề vào vị trí H6 (otor so với OH số 7)  cam và đỏ cam

Cơ chế đóng – mở vòng Lacton của Coumarin

Cơ chế tăng huỳnh quang trong kiềm của Coumarin

• Dung môi chiết:

Cồn 96o không dùng n-hexan, CHCl3 vì thử nghiệm sau Diazo đóng mở vòng Lacton Phản ứng tiến hành trong môi trường nước còn dung môi kém phân cực sẽ bị tách lớp không thấy hiện tượng các chất gặp nhau còn cồn thì hỗn hòa với thuốc thử định tính

• Liệt kê các phản ứng định tính

- Đóng mở vòng lacton

- Phản ứng tăng huỳnh quang trong kiềm

- Phản ứng của OH-phenol (Diazonium)

 Dịch chiết thu được mà bị đục là do coumarin tồn tại nhiều ở dạng Aglycon, chiết cồn bay hơi bớt lượng nước tăng lên  Aglycon không tan được  đục

 Khắc phục: cho 1 lượng cồn 96 vừa đủ hòa tan coumarin và trong lại

 Ống 1: bị đục  do dịch chiết có Aglycon không tan trong nước

 Ống 2: cho kiềm vào đun nóng  Coumarin mở vòng tạo dạng muối Coumarinat  tan trong nước  trong

 Ống 2a: đang ở dạng muối Coumarinat + H2O  trong

 Ống 2b: Acid hóa bằng HCl đđ  từ dạng Coumarinat chuyển về dạng Aglycon ban đầu đóng vòng: đục

 Ống 2 tăng huỳnh quang trong mt kiềm: mở vòng tạo muối Coumarinat (CIS) + UV 364

(TRANS) muối Coumarat phát quang mạnh hơn (nửa sáng nửa tối)

 Phản ứng Diazo: thế vào vị trí para ở H6  màu cam hoặc đỏ cam

 Điều kiện: Coumarin phải mở vòng do kiềm

 Thuốc thử Diazo: được pha trong acid sulfanilic với NaNO2 với dung môi hòa tan là HCl  thuốc thử có tính acid

 Lưu ý: nhỏ vào thuốc thử vừa đủ  nếu dư môi trường kiềm mất đi phản ứng không sảy ra

TANIN

TANIN là:

- Hợp chất polyphenol (nhiều OH trên vòng benzen  giúp chống OXH:

EGCG epi galo catechin galas)

- Tính thuộc da (tủa với Protein) (đặc trưng): pholyphenol sẽ thực hiện phản ứng Hidro với aa của protein làn tăng khối lượng protein tủa xuống

THUỘC DA = TANING, TANNAT

- Vị chát, kích ứng dạ dày

- Cấu trúc phức tạp, khối lượng phân tử lớn

Độ tan:

Dễ tan trong kiềm loãng, trong hỗn hợp cồn nước

Tan được trong cồn, glycerin, propylen glycol, acetol và ethyl acetat

Không tan trong dung môi kém phân cực

Tạo tủa với dung dịch nước và protein  định tính

- Đơn vị cấu tạo: acid galic (liên kết với acid galic khác theo liên kết 1-3) (galo là 3

OH liền kề)

- Liên kết qua cầu nối C-C bền

- CT: Flavonoid ( C6-C3-C6) (Flavan 3,4 dion)

- Tác dụng với FeCl3 (phản ứng thế và ngưng tụ) 

- Khi tác dụng với FeCl3  xanh đen

xanh rêu nhạt hơn (do OH không liền kề)

Tóm lại:

Để xác định có phải Tanin không?  tủa với Protein

Phân loại: với Fe3+

Bằng 30ml nước sôi đun 10p lọc thu dịch lọc trong

Nếu dịch lọc đục  trong dược liệu có tanin không thủy phân bị lẫn vào dịch lọc  đục  muốn trong thì thêm nước sôi

 Không dùng cồn để chiết vì  làm biến tính Protein đong vón tủa

Định tính:

Phản ứng với dung dịch Protein

Phản ứng với với gelatin muối lắc  (+) tủa trắng đục khi soi với ống chứng

Phân biệt 2 loại tanin: cho 1 giọt FeCl3 1%, pha loãng với nước để nhìn rõ màu

- Tanin pyrogallic: màu xanh đen

- Tanin pyrocatechic: màu xanh rêu

Biết được liền kề hay không liền kề

OH-SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC

LIỆU Lịch sử

• Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet phát minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll (hông chỉ có 1 màu xanh)

Chroman (màu) + Graphy (ghi chép)

Giới thiệu về sắc ký

Sắc ký (chromatography) dùng để tách các chất trong một hỗn hợp nhờ vào sự phân chia của các

chất này giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha động di chuyển dọc theo pha tĩnh theo một hướng nhất định

(Thin Layer Chromatophraphy –TLC)

(Liquid Column – LC)

Pha tĩnh có thể là một chất rắn hoặc chất lỏng được giữ trên một chất rắn hay một gel Pha tĩnh có

thể được nhồi vào một cột, hoặc trải thành một lớp hoặc phân tán thành một lớp phim,…

Pha động có thể là chất khí, chất lỏng hoặc chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất lỏng siêu tới

hạn)

Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như:

4 cơ chế: mỗi phương pháp sắc ký có 1 cơ chế khác nhau

• Hấp phụ (Adsorption) SKLM dựa vào độ phân cực: O, N, H2O, OH

• Phân bố (Partrition) SKLM pha đảo, HPLC

• Trao đổi ion (Ion-Exchange)  cột

• Rây phân tử (Modecules exclusion) Sephadex dựa vào khồi lượng phân tử

(chất phân cực sẽ hấp thụ tốt chất phân cực)

(chất bị rửa trôi  phản hấp phụ)

Các phương pháp sắc ký

• Sắc ký cột (Column Chromatography, CC)

• Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)

• Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

• Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performmance Liquid Chromatography, HPLC)

• Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performmance Liquid Chromatography, UPLC)

SẮC KÝ LỚP MỎNG

• SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh Do đó SKLM thuộc sắc ký lỏng – rắn

• Cơ chế: Hấp phụ chiếm phần lớn

Pha tĩnh: trương nở theo chiều dọc và chiều ngang

PHA TĨNH TRONG SKLM PHA THUẬN

• Chất phân cực, trung tâm hấp phụ là các nhóm -OH silanol (bịch hút ẩm trong bánh kẹo)

(-Si-OH, HO-Si-(-Si-OH, -Si- trihydroxyl) có tính acid pha tĩnh phân cực (OH phân cực)

• Hoạt tính hấp phụ do –OH trên bề mặt quyết định

• Hàm ẩm tăng sẽ làm giảm hoạt độ

• Hoạt hóa 120oC/ 1 giờ trước khi sử dụng sấy loại bỏ lớp nước trên silicagel  tăng hấp thụ

 Có tính acid: phần lớn các chất trong tự nhiên đều có tính acid

 SKLM pha thuận: có pha tĩnh phân cực

Nhôm oxyd

VD: Alumina: Al2O3.nH2O

• Kích thước hạt thường thô hơn (lớn hơn) so với silica gel

• Là chất hấp phụ phân cực mạnh (hơi kém hơn Silica gel)

• Có 3 loại nhóm: Oxyd nhôm trung tính, acid, base

 Tính kiềm dùng làm phân tách Alkaloid

• Hoạt tính tùy theo lượng nước

• Hoạt hóa 120oC/ 1 giờ trước khi sử dụng

• Theo Brockman: 5 bậc oxyd nhôm

So sánh silica gel và nhôm oxyd

Silicagel Nhôm oxyd

PHA TĨNH TRONG SKLM PHA ĐẢO

(RP: REVERSE PHASE-TLC)

Mắc tiền

Silicagel - ghép (Silicagel boned phase)

• Chất mang là các hạt silica đồng nhất, xốp, bền cơ học có d=3,5-10 μm được thủy phân hoàn toàn

bằng HCl 0.1M ở nhiệt độ cao /1 ngày để tạo thành các nhóm Silanol và gemsilanol

• Các nhóm Silanol và gem-silanol được cho phản ứng với clorosilane để tạo thành các -Si-O-Si-R,

Si-R ( R là chuỗi 8C hay 18C )

• Chất hấp phụ đã được tiêu chuẩn hóa

• Chất hấp phụ có chất kết dính: silica gel G, kieselguhr G,oxyd nhôm G trôn sẵn 5% thạch cao

• Chất hấp phụ không kết dính: silica gel H, oxyd nhôm H

• Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thị huỳnh quang: silica gel GF254 , silica gel HF254

• Có thể tự tráng hoặc sử dụng bản tráng sẵn (thủy tinh, giấy nhôm, polymer)

• Ưu điểm của bản mỏng tráng sẵn:

• Độ ổn định cao, thao tác đơn giản và dễ dàng hơn

• Tính đồng nhất cao: thích hợp để bán định lượng, định lượng

• Hiệu lực tách cao hơn bản mỏng tráng thủ công

Bảng mẫu cắt sẵn

TCL silicagel 60 F254

25 Glass plates 20x20cm

- 60 đường kính lỗ xoang của hạt silicagel

- F254 trộn chất phát huỳnh quang ở bước sóng 254 nm

- 25 glass: 25 bảng mỏng tráng sẵn

- Chất hấp thu UV sẽ bị tối máu (có liên kết đôi liên hợp)

PHA ĐỘNG SKLM

Định nghĩa pha động: Là hệ dung môi (độ phân cực khác nhau) khai triển di chuyển dọc theo bản

mỏng làm di chuyển các chất trong mẫu thử với vận tốc khác nhau, tạo nhiều vết Rf khác nhau (Sắc

ký đồ)

• Thay đổi tùy theo cơ chế tách

• Thường pha động là một hỗn hợp 2 hay nhiều hơn 2 thành phần được gọi là hệ dung môi →

tăng cường sức rửa giải

• Để cải thiện khả năng tách của hỗn hợp, 1 lượng nhỏ kiềm, acid … có thể được thêm vào hệ

dung môi (modifier)

• Độ tinh khiết của dung môi: có 1 kết quả tốt, lặp lại

• Để đánh giá khả năng rửa giải của 1 dung môi người ta thường dùng khái niệm “độ phân cực”

của dung môi, được dự đoán bằng moment lưỡng cực, hằng số điện môi, thực nghiệm v.v…

Độ phân cực của một số dung môi thông dụng:

Thứ tự rửa giải tăng dần (độ phân cực)

n-Hex < Toluen < Bz < Diethylether < DCM < CHCl3 < EtOAc < Aceton < EtOH < MeOH < HCOOH,AcOH < H2O

PE<n-hex<Toluen<Bz<Diethylether<Dicloromethan (DCM)<CHCl3 <

Aceton<EtOH<MeOH<HCOOH<AcOH<H2O

CH=CH<OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<NH2<OH<COOH (hấp phụ tăng dần)

chọn dung môi nằm ở nhóm (gần nhau) nếu trong cùng 1 nhóm phải cách xa nhau

Lựa chọn dung môi trong SKLM:

*Qui tắc tam giác Stahl (1960’)

“Dung môi và mẫu thử luôn cùng một pha”

Mẫu thử Chất hấp phụ (SP) Hệ dung môi khai triển (MP)

(silica gel, oxyd nhôm )

Phân cực kém (PE, n-hexan, Tol, Bz, Cf, EtOAc…)

(silica gel RP…)

Phân cực mạnh (ACN, Me, H2O)

Yêu cầu cho một dung môi sắc ký tốt:

Dung môi càng phân cực  Rf càng cano (chất đi xa)

• Hòa tan tốt mẫu thử

• Không phản ứng với mẫu thử

• Linh động, độ nhớt thấp

• Nhiệt độ sôi không quá thấp, không quá cao

• Không có mùi khó chịu

• An toàn, không độc hại

• Rẻ tiền, dễ kiếm

• Sức rửa giải của pha động để Rf : 0,2 – 0,8

 Pha động: dung môi và mẫu thử luôn cùng 1 pha

 Pha thuận: pha tĩnh phân cực, mẫu luôn kém phân cực

Cách viết tên một hệ dung môi:

- DM kém phân cực viết trước, phân cực viết sau, các “modifier” viết sau cùng

- Giữa các dung môi là dấu “-”

- DM có thể viết thành tên hay kí hiệu nhưng phải thống nhất

Vd: Chloroform – ethylacetat – acid formic hoặc CHCl3 – EtOAc – HCOOH

- Tỷ lệ các dung môi được viết trong dấu ngoặc đơn và giữa chúng là dấu hai chấm Nếu có ghi chú

gì thì cũng ghi tiếp trong dấu ngoặc này nhưng sau dấu chấm phẩy

Vd: CHCl3 – MeOH – H2O (65:35:10; lớp dưới)  45p-1h mới tách lớp  pha động không hỗn hóa

• Lượng dung môi

• Giấy lọc bão hòa dung môi

• Thời gian

➢ Chuẩn bị bản mỏng

• Chọn kích thước tùy theo nhu cầu phân tích

• Dùng bút chì vạch nhẹ đường xuất phát và đường kết thúc của dung môi

➢ Chuẩn bị mao quản sạch

➢ Chuẩn bị mẫu

• Mẫu là chất lỏng có thể chấm trực tiếp

• Mẫu là chất rắn cần phải hòa tan trong dmhc phù hợp không dùng nước  dùng cổn dễ bay

hơi mau khô, phù hợp độ phân cực

• Mẫu là dược liệu ?  lấy hoạt chất trong dược liệu ra  chấm SK