Phân tích một số hoạt động cung ứng thuốc tại bệnh viện trường đại học y dược huế năm 2011

LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phương pháp phân tích Sibutramin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS” đã được hoàn thành.. Xuất phát từ yêu cầu trê

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THÙY DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SIBUTRAMIN TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHOẺ

BẰNG LC/MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phương pháp phân tích

Sibutramin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS” đã được hoàn thành

Để có được kết quả này, ngoài nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự động

viên, giúp đỡ từ phía nhà trường, bộ môn, cơ quan và gia đình, bạn bè

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lâm Hồng, TS

Đào Thị Thanh Hiền – hai người Thầy đã tận tình định hướng, chỉ bảo, đóng góp ý

kiến và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích -

Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học

tập tại trường; xin cảm ơn Ban lãnh đạo - Viện Dinh dưỡng Quốc gia đã tạo điều

kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Lê Hồng Dũng - người đã trực tiếp

hướng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu; xin gửi lời

cám ơn đến các anh chị, các bạn tại khoa Hóa Thực phẩm – Viện Dinh dưỡng Quốc

gia đã động viên, giúp đỡ, chia sẻ với tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã giúp đỡ,

động viên tôi hết mình để tôi có đủ nghị lực và quyết tâm hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2021

Phạm Thị Thùy Dung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Sibutramin và các chất tương tự 3

1.1.1 Tình trạng thừa cân béo phì và một số biện pháp điều trị 3

1.1.2 Tình trạng trộn trái phép Sibutramin 4

1.2 Tổng quan về Sibutramin 5

1.2.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa của Sibutramin 5

1.2.2 Tính chất dược lý của Sibutramin 6

1.2.3 Một số phương pháp phân tích sibutramin 7

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ 12

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Chất chuẩn 19

2.1.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 19

2.1.3 Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo 19

2.1.4 Dung môi, hóa chất 19

2.1.5 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích Sibutramin bằng LC/MS/MS 20

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dưng phân tích Sibutramin trộn trái phép trong mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhóm giảm cân đang lưu hành trên thị trường 25

PHẦN III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 26

3.1.1 Tối ưu các điều kiện khối phổ 26

3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 28

3.1.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30

3.1.4 Quy trình phân tích Sibutramin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe 35

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 36

3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SIBUTRAMIN TRÊN MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE NHÓM GIẢM CÂN TRÊN THỊ TRƯỜNG 45

BÀN LUẬN 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official

Analytical Communities

Hiệp hội các nhà phân tích chính thống

CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí bắn phá

CE Collision Energy Năng lượng bắn phá

CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

CXP Collision cell Exit Potential Thế đầu ra

DP Declustering Potential Thế đầu vào

EC European Council Hội đồng châu Âu

ESI Electrospray ionization Ion hóa phun sương điện

GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí 2 bên đầu phun

GS2 Ion Source Gas 1 Áp suất của luồng khí nóng

(GS2) HPLC High performance

Liquidchromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ

LOD Limit of detection Giới hạn định tính

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

MeOH Methanol Methanol

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

RSD% Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

TEM Ion Source Temperature Nhiệt độ mao quản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 : Một số phương pháp xác định Sibutramin 9

Bảng 2.1 : Danh mục các mẫu phân tích 18

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện nguồn ESI và phân mảnh Sibutramin 26

Bảng 3.2 : Nồng độ tìm thấy và độ thu hồi Sibutramin với các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau 31

Bảng 3.3 : Nồng độ tìm thấy và độ thu hồi Sibutramin với số lần chiết khác nhau 33

Bảng 3.4 : Nồng độ tìm thấy và độ thu hồi Sibutramin với các mức thời gian chiết 34

Bảng 3.5 : Kết quả độ lặp lại của hệ thống 36

Bảng 3.6 : Tỉ lệ ion của mẫu chuẩn và mẫu placebo nạp chuẩn 38

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Sibutramin 38

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của nền dầu 40

Bảng 3.9: Độ lặp lại và độ thu hồi ở các mức nồng độ thấp, trung bình, cao của Nền dầu 41

Bảng 3.10: Độ lặp lại và độ thu hồi ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình, cao của Nền rắn 43

Bảng 3.11: Kết quả phân tích một số mẫu trên thị trường 46

Bảng 3.12: Tỉ lệ ion của các mẫu thực phát hiện Sibutramin 47

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Sibutramin 5

Hình 1.2: Sơ đồ khối hệ thống Sắc ký lỏng khối phổ 13

Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI 15

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực chập ba 16

Hình 3.1: Phổ khảo sát ion mẹ của Sibutramin 27

Hình 3.2: Phổ khảo sát ion con của Sibutramin 27

Hình 3.3 : Sắc ký đồ chuẩn với tỉ lệ pha động 60:40 29

Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn với tỉ lệ pha động 30: 70 29

Hình 3.5 : Sắc ký đồ chuẩn với tỉ lệ pha động 10:90 29

Hình 3.6: Độ thu hồi Sibutramin tại các hệ dung môi chiết 32

Hình 3.7: So sánh độ thu hồi Sibutramin giữa các số lần chiết 33

Hình 3.8: So sánh độ thu hồi Sibutramin giữa các thời gian chiết 34

Hình 3.9 : Sắc ký đồ mẫu trắng 37

Hình 3.10 : Sắc ký đồ mẫu placebo nền dầu 37

Hình 3.11 : Sắc ký đồ chuẩn Sibutramin 16 ppb 37

Hình 3.12 : Sắc ký đồ mẫu placebo nền dầu nạp chuẩn 16 ppb 37

Hình 3.13 : Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Sibutramin 39

Hình 3.14: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực N7 46

Hình 3.15: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực N13 46

Hình 3.16: Sắc ký đồ phân tích mẫu thực N14 47

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu nâng cao sức khỏe ngày càng được quan tâm, kéo theo thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) tăng trưởng mạnh mẽ, đặc biệt thực phẩm bảo vệ sức khỏe với thành phần tự nhiên, hỗ trợ làm đẹp, giảm cân Trên thế giới, nhiều loại TPBVSK được quảng cáo với thành phần thảo dược, có nguồn gốc từ tự nhiên được sử dụng rộng rãi cho mục đích giảm béo Lợi dụng việc những sản phẩm này không được coi là thuốc, chỉ công bố tiêu chuẩn chất lượng đơn giản, hầu như không có phương pháp định lượng và giới hạn cho các thành phần hoạt chất chính Vì lợi nhuận, nhiều nhà sản xuất đã trộn trái phép hoạt chất tổng hợp hoá dược vào sản phẩm để tạo ra tác dụng nhanh đối với người sử dụng Nhiều hoạt chất này không an toàn, gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng, thậm trí là tử vong và

đã bị cấm sử dụng làm thuốc tân dược

Nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có tác dụng hỗ trợ giảm cân thuộc nhóm có tần số phát hiện trộn trái phép chất tân dược cao nhất, một trong những tân dược đó là Sibutramin Chất này bị cấm ở cả châu Âu và Hoa Kỳ từ năm 2010; tại Việt Nam, năm

2011, Cục quản lý Dược đã ra văn bản đình chỉ lưu hành và thu hồi toàn bộ thuốc chứa hoạt chất sibutramin, do tác dụng phụ nguy hiểm trên tim mạch ở những người có nguy cơ cao

Đáng lo ngại, sau khi cấm lưu hành thuốc tân dược chứa Sibutramin, thì vẫn liên tục phát hiện Sibutramin trộn trái phép trong TPBVSK có tác dụng giảm cân Tháng 3 năm 2015, thanh tra Bộ Y tế đã xử phạt hành chính với công ty TNHH

Khổng Gia vì phân phối sản phẩm hỗ trợ giảm cân Perfect Slim USA chứa chất cấm Sibutramin Tiếp đến, một số cái tên khác như Golean Detox, trà thảo mộc Vy&Tea; trà thảo mộc Hoa Sâm Đất; “sản phẩm giảm cân họ Nguyễn new”,… liên tiếp bị thu

hồi trên thị trường với một trong các lý do là dương tính với Sibutramin Tháng 7/2018, Cục An toàn thực phẩm đã ra công văn số 3811/ATTP-SP về việc giám sát Sibutramin trong thực phẩm tại một số tỉnh thành

Việc trộn trái phép chất tân dược cấm trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ trong khi được quảng cáo có thành phần 100% thiên nhiên đã gây ra ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và tâm lý hoang mang cho người tiêu dùng Do đó, việc phát hiện được

2

Sibutramin trộn trái phép trong TPBVSK là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính

an toàn của loại sản phẩm này

Xuất phát từ yêu cầu trên, khoá luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp phân

tích Sibutramin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC/MS/MS” đã được tiến hành

với hai mục tiêu sau:

• Xây dựng phương pháp xác định Sibutramin trộn trái phép trong thực phẩm bảo

vệ sức khỏe

• Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra Sibutramin trong một số mẫu

thực phẩm bảo vệ sức khỏe có tác dụng giảm cân trên thị trường

3

PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Sibutramin và các chất tương tự

1.1.1 Tình trạng thừa cân béo phì và một số biện pháp điều trị

Thừa cân và béo phì là một trong những vấn nạn của thế kỷ 21, theo thống kê mới nhất của WHO, tỷ lệ béo phì trên toàn thế giới đã tăng gần gấp ba lần kể từ năm

1975 Vào năm 2016, hơn 1,9 tỷ người trưởng thành, từ 18 tuổi trở lên, bị thừa cân Trong số này có hơn 650 triệu người béo phì [48] Tại Việt Nam, trong công bố kết quả tổng điều tra Dinh dưỡng năm 2019-2020 của Bộ Y tế, đáng lưu ý là tỷ lệ thừa cân, béo phì ở trẻ em tăng từ 8,5% năm 2010 lên thành 19,0% năm 2020 [2] Nhiều liệu pháp điều trị thừa cân và béo phì đã được phát triển như điều trị bằng thể lực, điều trị bằng chế độ ăn uống hay phẫu thuật, trong đó điều trị bằng thuốc giảm béo mang lại hiệu quả nhanh chóng

Nghiên cứu phát triển các thuốc giảm béo bắt đầu từ những năm 1940 Trong

đó, được sử dụng sớm nhất để giảm cân là nhóm thuốc cường giao cảm (như các dẫn xuất amphetamin deoxyephedrin, phentermin và diethylpropion) và nhóm chất cường serotonin (fenfluramin, dexfenfluramin) [41] Các thuốc này tác động đến các thụ thể thần kinh nhằm tăng giải phóng hoặc ức chế tái hấp thu chất dẫn truyền thần kinh Tuy nhiên, hầu hết các thuốc ảnh hưởng đến dẫn truyền thần kinh monoamin được cấp phép để điều trị bệnh béo phì đã bị thu hồi vì xuất hiện phản ứng có hại, như gây nghiện, tăng áp lực động mạch phổi hay gây độc trên tim [33], [47]

Sibutramin là một chất ức chế tái hấp thu noradrenalin, dopamin và serotonin tổng hợp được sử dụng để điều trị bệnh béo phì, được FDA cấp phép từ năm 1997 Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng Sibutramin gây ra tác dụng giảm cân và cải thiện dung nạp lipid, glucose Thuốc này được kê đơn rộng rãi cho đến khi bị thu hồi vào năm 2010 tại Mỹ vì các nghiên cứu chứng minh tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim

và đột quỵ khi sử dụng [21] và sau đó, thuốc cũng bị cấm lưu hành tại các thị trường Châu Âu [19], Australia năm 2010 [43] và tại Việt Nam vào năm 2011 [4], cùng nhiều quốc gia khác

4

1.1.2 Tình trạng trộn trái phép Sibutramin

Mặc dù bị cấm sử dụng ở nhiều quốc gia do tác dụng phụ nghiêm trọng, nhưng

vì hiệu quả giảm cân nhanh chóng, nên Sibutramin bị trộn trái phép vào nhiều sản phẩm trên thị trường

Trên thế giới, vào tháng 3 năm 2009, Dieter Müller và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các trường hợp ngộ độc Sibutramin từ các loại “thực phẩm bổ sung” của Trung Quốc được bán ở châu Âu, có chứa gấp đôi liều lượng của loại thuốc này được cấp phép lưu hành [31] Vào tháng 10 năm 2011, FDA đã cảnh báo rằng 20 nhãn hiệu TPBVSK

đã có chứa Sibutramin [42]

Năm 2018, một bài báo xuất bản trên JAMA Netwwork Open đã gây xôn xao

khi báo cáo rằng các loại thuốc không được phê duyệt đã được tìm thấy trong một số sản phẩm được dán nhãn là TPBVSK Các nhà nghiên cứu báo cáo rằng từ năm 2007 đến năm 2016, FDA đã đưa ra cảnh báo đối với 776 thực phẩm bổ sung có trộn các thành phần hoạt chất hoá dược không được đăng kí Trong số 317 sản phẩm thuộc nhóm hỗ trợ giảm cân được báo cáo, đáng lưu ý rằng có đến 269 sản phẩm có phát hiện Sibutramin (chiếm 84,9%) [42] FDA cũng duy trì một danh sách các sản phẩm giảm cân bị nhiễm độc được tiếp thị dưới dạng thực phẩm bảo vệ sức khoẻ có chứa các thành phần ẩn và có thể không an toàn, trong đó có Sibutramin [20]

Tại Việt Nam, Bộ Y tế đã ra quyết định cấm lưu hành thuốc tân dược chứa Sibutramin vào 11/2010 Tuy nhiên, những năm gần đây, thông qua các chương trình giám sát chủ động vẫn liên tục phát hiện các TPBVSK bị trộn trái phép Sibutramin Tháng 11/2019, Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế) đưa ra cảnh báo sản phẩm TPBVSK

Viên giảm cân Giáng Ngọc Eva (số kiểm soát 012019, hạn dùng 28/5/2022) của Công

ty TNHH Thương mại Dược phẩm Quốc tế BML không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm do chứa chất cấm Sibutramin, kết quả kiểm nghiệm chất Sibutramin Hydroclorid chứa hàm lượng 13,96 mg/viên [5]

Trước Giáng ngọc Eva, không ít thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ giảm cân bị

cơ quan đình chỉ, thu hồi vì chứa chất cấm nguy hiểm này Ngày 01/3/2019 Cục An toàn thực phẩm đã ra quyết định tạm dừng lưu thông và thu hồi đối với lô sản phẩm

thực phẩm bảo vệ sức khỏe trà giảm cân Vy&Tea (NSX 20/12/2018, HSD 20/12/2019)

5

của tổ chức công bố, sản xuất sản phẩm là Công ty TNHH Một thành viên dịch vụ thương mại Hà Vy, nguyên nhân do phát hiện hai chất cấm sử dụng trong thực phẩm là Sibutramin và Phenolphthalein [6]

Đầu tháng 8/2018, Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế) ra quyết định thu hồi sản

phẩm giảm cân mang tên Trà thảo mộc Hoa Sâm Đất của Công ty TNHH Sản xuất và

Thương mại Hoàng ZN (địa chỉ: 89/994E Lê Đức Thọ, phường 6, quận Gò Vấp, TP HCM) vì có chứa chất cấm Sibutramin [7]

Cùng với chương trình giám sát chủ động, ngày 19/7/2018, Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế đã có Công văn số 3811/ATTP-SP gửi Giám đốc Sở Y tế các tỉnh thành phố trực thuộc Trung ương, Trưởng ban Quản lý An toàn thực phẩm các tỉnh, thành phố: Hồ Chí Minh, Đà Nẵng, Bắc Ninh về việc giám sát sản phẩm thực phẩm có chứa Sibutramin [3]

1.2 Tổng quan về Sibutramin

Sibutramin (tên thương mại là Meridia ® ở Hoa Kỳ, Reductil ® ở Châu Âu và các nước khác), dạng thường dùng là Sibutramin hydrochlorid monohydrat, là một chất dùng đường uống để điều trị béo phì Nó là một chất kích thích tác động trung tâm về mặt hóa học liên quan đến amphetamin do đó nó được phân loại là chất được kiểm

soát theo Bảng IV ở Hoa Kỳ Tháng 10/2010, Sibutramin (Meridia®) bị rút khỏi thị trường Canada và Mỹ do lo ngại thuốc làm tăng nguy cơ đau tim và đột quỵ ở những bệnh nhân có tiền sử bệnh tim [10]

1.2.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa của Sibutramin

• Công thức phân tử: C17H26ClN

• Khối lượng phân tử: 279,8 g/mol

• Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Sibutramin [12]

6

• Tên khoa học:

(+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N,N dimethylcyclobutan-methylamin [12]

• Dạng thường dùng: Sibutramin hydroclorid monohydrat

• Độ tan: Độ tan của sibutramin (C17H26ClN) trong nước (pH 7,4) là 0,04 mg/mL, của sibutramin hydrochlorid monohydrat là 5,2 mg/mL Sibutramin base tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [12]

• Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramin base có nhiệt độ nóng chảy là 55,15ºC và enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramin hydroclorid monohydrat có nhiệt độ nóng chảy ở 119ºC [12]

• Bước sóng hấp thụ: Sibutramin base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS và có cực đại hấp thụ tại bước sóng 225 nm [40]

1.2.2 Tính chất dược lý của Sibutramin

a Dược động học:

• Hấp thu và phân bố: Sibutramin hấp thu tốt qua đường tiêu hóa sau khi uống;

sinh khả dụng trung bình đạt 77% Sibutramin, và 2 chất chuyển hóa có hoạt tính là mono và di-desmethyl M1 và M2 liên kết nhiều với protein huyết tương (tương ứng là 97%, 94% và 94%) Thời gian để thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1,2h [29]

• Chuyển hóa và thải trừ: Sibutramin chuyển hóa mạnh qua gan bởi cytochrom P450CYP3A4 (độ thanh thải là 1750L/giờ và thời gian bán thải 1,1h) Qua qua trình demethyl hóa tạo 2 chất chuyển hóa có hoạt tính là M1 và M2 M1 và M2, trải qua quá trình hydroxyl hóa và liên hợp để tạo thành các chất chuyển hóa không hoạt động, M5

và M6 Nồng độ đỉnh trong huyết thanh của M1 và M2 đạt được trong vòng 3h và thời gian bán thải là 14 và 16 giờ [29]

Thải trừ Sibutramin và các chất chuyển hóa có hoạt tính của nó diễn ra chủ yếu ở gan, 85% các chất chuyển hóa không có hoạt tính khác thải trừ chủ yếu qua nước tiểu

và phân [29]

b Dược lực học:

• Cơ chế tác dụng: Tác dụng điều trị của Sibutramin chủ yếu là do các chất

chuyển hóa amin đầu tiên và thứ cấp có hoạt tính của nó (chất chuyển hóa 1 và chất chuyển hóa 2), là các chất ức chế tái hấp thu noradrenalin, serotonin và dopamin Trong mô não, chất chuyển hóa 1 và chất chuyển hóa 2 ức chế tái hấp thu norandrenalin và serotonin mạnh hơn gấp 3 lần ức chế tái hấp thu dopamin Bằng cách

ức chế tái hấp thu các chất dẫn truyền thần kinh này, Sibutramin thúc đẩy cảm giác no

và giảm cảm giác thèm ăn, do đó làm giảm lượng thức ăn [10]

c ADR và Tác dụng không mong muốn:

• Số lượng các biến cố tim mạch cao hơn đã được quan sát thấy ở những người dùng sibutramin so với nhóm chứng (11,4% so với 10,0%) [22] Vào năm 2010, FDA

đã ghi nhận những lo ngại rằng sibutramin làm tăng nguy cơ đau tim và đột quỵ ở những bệnh nhân có tiền sử bệnh tim mạch [22]

• Trong một tổng quan năm 2016 của Cochrane, Sibutramin được phát hiện là làm tăng đáng kể huyết áp và nhịp tim ở một số bệnh nhân, trong tổng quan cập nhật vào năm 2021 sibutramin không được đưa vào vì thuốc đã bị thu hồi khỏi thị trường [38]

• Sibutramin đồng thời cũng kích thích quá mức hệ thần kinh trung ương và gây

ra các tác dụng phụ thường gặp là: khô miệng, tăng cảm giác thèm ăn một cách nghịch

lý, buồn nôn, có vị lạ trong miệng, đau bụng, táo bón, khó ngủ, chóng mặt, buồn ngủ, đau bụng kinh, đau đầu, đỏ bừng, hoặc đau khớp/cơ [24]

1.2.3 Một số phương pháp phân tích sibutramin

Cùng với sự phát triển của thị trường TPBVSK, những sản phẩm có nguồn gốc

từ thiên nhiên được giới thiệu với tác dụng giảm cân tăng trưởng mạnh mẽ, tuy nhiên kèm theo đó cũng là sự gia tăng của những báo cáo phát hiện việc trộn trái phép Sibutramin trong những sản phẩm này

8

Hiện nay, nhiều phương pháp đã được áp dụng để xác định Sibutramin trong TPBVSK như sắc ký lớp mỏng (TLC) [35]; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [15], [30]; sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/DAD) [15], [18], [37], [39], [50]; sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) [25], [26], [34], [44], phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [16], [45], [50]… Trong khi TLC chủ yếu được sử dụng để phân tích định tính, HPLC

là phương pháp được lựa chọn cho mục đích định lượng

Phương pháp sắc kí lớp mỏng và sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (TLC, HPTLC)

có ưu điểm là quy trình xử lý mẫu đơn giản, dễ dàng vận hành về mặt kỹ thuật Tuy nhiên, phương pháp này có hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả khi không đáp ứng độ nhạy và kết quả phân tích phải phụ thuộc nhiều vào dung dịch chuẩn

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một phương pháp có quy trình xử lý mẫu đơn giản, độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và phân tích được trên các nền mẫu phức tạp Tuy nhiên kỹ thuật, thiết bị phức tạp, khó vận hành nên chưa phổ biến rộng rãi

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định Sibutramin trộn trái phép với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao Để tăng cường độ chính xác và khả năng phát hiện Sibutramin chỉ được thêm với lượng nhỏ, hiện nay phương pháp LC-MS dần được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của detector khối phổ [1] Phương pháp LC-MS có các ưu điểm vượt trội so với HPLC/DAD về độ nhạy, giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng biệt của các ion, cho thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất phân tích có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc

ký lỏng thường không làm được

Trong số các kỹ thuật LC-MS, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI) có

độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao [13]

Tóm tắt một số phương pháp xác định Sibutramin bằng HPLC/DAD và LC-MS trong thực phẩm được trình bày ở bảng 1.1 Với các phương pháp sử dụng kỹ thuật

Điều kiện sắc ký Xử lý mẫu Kết

6 chất trộn trái phép trong thực phẩm bổ sung, bao gồm cả sibutramin)

- Hệ thống HPLC:

Cột Spherigel C8 (200 x 4,6 mm; 5 µm)

Pha động: gradient A: Acetonitril B: Dung dịch Amonium format 20mM

Tốc độ dòng:

1ml/phút

tiêm:10µL 0,2ml/phút dịch rửa giải đưa vào

hệ thống MS

- Điều kiện MS:

ESI (+), ion mẹ m/z 280,0 Ion con

153, 139

Toàn bộ 1 g mẫu túi trà hoặc 0,5 g cho mẫu viên nang chiết bằng 20 ml metanol trong 10 phút; ly tâm

ở 12.000 vòng / phút trong 10 phút Định mức 50ml

Dung dịch được lọc qua màng nylon 0,45

µm trước khi được tiêm vào HPLC-ESI-

MS

C

=0,212

- 96,2 mg/g

3,5 µm) + Pha động:

Gradient A: Acid formic 0,1% trong H2O B: acid formic

acetonitril + Thể tích tiêm 10µL

+Tốc độ dòng : 0,3ml/phút

- Điều kiện MS:

ESI (+), ion mẹ m/z 280; ion con

200 mg chế phẩm nghiền thành bột mịn được hòa tan trong 2

mL metanol (100 mg / mL) Siêu âm 20 phút, ly tâm và lọc màng PTFE 0,5 µm

Pha loãng bằng Methanol và đưa vào phân tích LC/PAD

[26]

Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm)

Acetonitril và H2O (1:1, v/v) được aicd hóa với acid formic 0,1%

Tốc độ dòng 0,4ml/phút

Thể tích tiêm 5µL

- Điều kiện MS:

ESI (+), ion mẹ m/z 280; ion con m/z 125, 139, 153

100 mg mẫu chiết với 25ml methanol Vortex 10 phút, siêu

âm 10 phút, để lắng

30 phút, gạn và pha loãng bằng methanol

C=

0,000184- 4,81 mg/

viên LOQ=

Nhiệt độ cột: 30C

Gradient

A (acid formic 0,1% trong 5%

acetonitril)

B (axit formic

acetonitril 95%) Tốc độ dòng 0,25 ml/phút

Thể tích tiêm 2µL

- Điều kiện MS:

ESI (+) ion mẹ m/z 280,2; ion con m/z 138,9; 124,9

1g mẫu được chiết sau đó định mức đến 50ml bằng methanol;

siêu âm 30 phút, lọc qua màng 0,22 µm

Từ 0.03- 132.40 mg/g (2010),

từ 0.88-76.2 mg/g (2011),

và từ 0.07- 0.24 mg/g (2012)

và gói bột

- Cột Zorbax SB C18 (150 mm × 2,1 mm; 3,5 μm)

- Nhiệt độ cột:

40ºC

- Pha động:

Gradient A: acid formic

- Phân tích 1 đơn vị liều: Nghiền mịn mẫu, chiết với methanol, lắc phút,

ly tâm 15 phút tốc độ

4600 vòng/phút

- Chuẩn nội: didesmethylsibu-

N,N-Nồng

độ sibutra-mine đạt 0,011 mg/kg trở lên

[27]

11

0,1% trong nước B: acid formic

acetonitril

- Tốc độ dòng 0,2ml/phút

- Thể tích tiêm 10

µL

- Điều kiện MS:

ESI (+), ion mẹ m/s 280,2; ion con m/z 125,0

tramin hydrochlorid

6

LC-MS/MS

Viên nén/nang cứng

+ Cột sắc ký: C18 + Nhiệt độ cột:

40ºC + Pha động:

Gradient A: ammonium format 2mM + acid formic 0.05%

/H2O B: ammonium format 2mM + acid formic 0.05%

/MeOH + Thể tích tiêm: 1

µL + Tốc độ dòng:

0.3 ml/min

- Điều kiện MS:

ESI (+), ion mẹ m/z 280,18; ion con m/z 153,0

Cân 0,1g mẫu Chiết bằng 20 ml ACN

Lắc bằng máy lắc trong 30 phút

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút

Pha loãng đến nống

độ thích hợp Lọc qua màng lọc 0.2

µm

LOQ:

10 ng/g

[44]

7 HPLC Viên

nang cứng

+ Cột sắc ký: C18 (100 x 4.6 cm;

5µm) + Nhiệt độ cột:

+ Pha động: Đẳng dòng

55% ACN + 0.1%

TFA và 45%

H2O+ 0.1% TFA + Thể tích tiêm:

10µL + Tốc độ dòng:

1ml/min

Cân 0,1g mẫu Chiết bằng 5ml MeOH 50%, siêu âm

10 phút

Chiết qua cột SPE, rửa giải bằng 5-5 ml MeOH, CHCl3 Tách lớp CHCl3, làm bay hơi, hòa tan lại bằng MeOH

Lọc qua màng 0,45

µm

[17]

+ Nhiệt độ cột:

40ºC + Pha động:

A: H20: ACN = 95: 5 (pH=4.3; 10

mm ammonium format)

B: H20: ACN = 5:

95 (pH=4.3; 10

mm ammonium

format)

Gradient: 50% A/

50%B + Tốc độ dòng:

600 μL/min

- Điều kiện MS:

ESI (+), m/z ion

mẹ 280; ion con 125; 139

Chiết toàn bộ viên nang với 10ml ACN 80%, siêu âm, ly tâm

Pha loãng dịch lọc

100 lần với ACN 50%

+ Cột sắc ký: C18 + Pha động:

Gradient A: ACN

acetat 2mM : acid formic 0,1 %/H2O

- Điều kiện sắc ký:

ESI (+), m/z ion

mẹ 279,9; ion con 124,8; 138,4

Cân 1,0 g mẫu Chiết bằng 20ml MeOH, siêu âm trong 20 phút, ly tâm

4000 v/phút trong 10 phút

Chiết lần 2 tương tự, định mức 50ml Lọc dịch chiết, tinh chế bằng than hoạt

ái lực giữa pha tĩnh và pha động Tùy theo bản chất pha tĩnh, người ta chia ra 2 loại là sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo Hiện nay, sắc ký pha đảo được ứng dụng rộng rãi hơn trong phân tích dược phẩm, với pha tĩnh là các silica đã được alkyl hóa, ít phân cực còn pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như nước, methanol, acetonitril, … hay hỗn hợp của chúng [1]

Tùy thuộc vào bản chất mà chất phân tích sau khi được tách riêng và rửa giải ra khỏi cột sắc ký có thể được phát hiện bằng detector như UV-Vis, huỳnh quang, độ dẫn điện, MS,… Phương pháp sắc ký cho phép tách riêng các chất nhưng việc định tính hay định lượng một cách tin cậy sẽ phụ thuộc vào detector Detector sẽ được lựa chọn dựa theo tính chất lý, hóa của đối tượng chất cần phân tích để tạo tín hiệu đáp ứng thích hợp

14

1.3.2 Bộ phận MS

Khối phổ MS (mass- spectrometry) là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao Đầu tiên các chất phân tích được ion hóa bằng kỹ thuật khác nhau sau đó trong chân không các ion tạo thành này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ khối lượng – điện tích của mỗi ion (m/z) và sau cùng tiến hành đo cường độ của chúng Phổ khối thu được cho thấy mức độ xuất hiện các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó MS

hỗ trợ rất nhiều trong phân tích định lượng, đồng thời từ số khối của các ion thu được trực tiếp từ khối phổ giúp cho việc định danh chất đó

Cấu tạo thiết bị khối phổ gồm các phần chính: bộ phận nạp mẫu (trong LC-MS

bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký), nguồn ion, bộ phận phân tách khối, detector

• Nguồn ion hóa mẫu:

Có nhiệm vụ ion hóa phân tử trung hòa thành các ion, gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao Một số kỹ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như Ion hóa điện tử (Electrospray Ionization – ESI), Ion hóa hóa học ở

áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển,…[13] Trong nghiên cứu này, kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI được sử dụng

Kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI :

Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản

mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun mịn bằng khí N2 thoát ra xung quanh ống mao quản Dưới tác động của điện thế cao, có sự tạo thành các hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản Các phân tử dung môi bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể nhỏ dần Sau đó các ion dương hay âm tạo thành được đưa vào bộ phận phân tách ion Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài do một dòng khí Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương hoặc ion âm

15

Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI [11]

• Bộ phận phân tách khối

Có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng

biệt Có thể phân chia bộ phận phân tích khối thành 4 loại:

- Bộ phân tích từ

- Bộ phân tích tứ cực

- Bộ phân tích thời gian bay

- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron

Bộ phân tích trong nghiên cứu này là bộ phân tích tứ cực chập ba Bộ phân tích khối ba tức cực gồm ba tứ cực ghép nối với nhau

16

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực chập ba [36]

Trong đó: Q1 có nhiệm vụ tách ion, một số ion được chọn lọc (thường gọi là tiền ion) từ đây vào Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He,… Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion con được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện [36]

• Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển

Có 2 dạng truyền thống:

• Nhân electron (electron multiplier): Tác động của một ion lên bề mặt của các bán dẫn sẽ tạo ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các bán dẫn khác để tạo ra các electron khác Quá trình cứ thế tiếp diễn để tạo ra nhiều electron

17

Các electron được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu – tức là

số lượng ion đến detector

• Nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo ra theo cách trên va chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon Các photon này được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

18

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng mẫu phân tích là các thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế: rắn (trà giảm cân, viên nang cứng), dầu (viên nang mềm) Đây là 2 dạng bào chế gặp phổ biến nhất trong các TPBVSK nhóm hỗ trợ giảm cân Các mẫu phân tích là mẫu lưu tại khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng Quốc gia có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau, đang được lưu hành trên thị trường, được thu thập trên địa bàn 6 tỉnh miền Bắc Danh mục các mẫu phân tích được mã hóa như bảng 2.1

Bảng 2.1 : Danh mục các mẫu phân tích

STT Mã số Sản phẩm Cơ sở sản xuất, thu thập mẫu Khu vực

7 N7 Giảm cân Phục Linh Công ty Dược 242

9 N9 Giảm cân gold Nhà thuốc Nam Hồng

10 N10 Queen slim Công ty dược Tràng An

Ninh Bình

11 N11 Slimmutea Công ty dược Tràng An

12 N12 Giảm cân PV Cửa hàng Vũ Duyên

13 N13 Giảm cân Minhon Cửa hàng Vũ Duyên

14 N14 Sevenday Nhà thuốc Hạnh Hải

Thanh Hóa

15 N15 Giảm cân Bona Nhà thuốc Hạnh Hải

16 N16 New Lishow Nhà thuốc Hạnh Hải

19

2.1.2 Chất chuẩn

Sibutramin hydroclorid monohydrat, C17H29Cl2NO, hàm lượng 99,9%, CAS number 125494-59-9, hãng sản xuất HPC Standards GmbH, Đức, số lô 786547, lọ 50mg

2.1.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

• Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Tiến hành cân chính xác 0,0160 g chất chuẩn Sibutramin hydroclorid monohydrat cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ bằng ACN, được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1600 ppm

• Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn gốc 1600 ppm pha loãng bằng Acetonitril theo tỉ lệ thích hợp để tạo dãy chuẩn làm việc

2.1.3 Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo

Do nền mẫu là thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược nên thành phần nền mẫu của các sản phẩm rất đa dạng Vì vậy, trong khoá luận tốt nghiệp này thành phần nền mẫu của 17 mẫu TPBVSK trên thị trường đã được khảo sát sơ bộ, sau

đó chọn nền mẫu có tính đại diện nhất, không chứa Sibutramin, làm mẫu placebo cho

2 nền là mẫu N12 cho nền dầu và mẫu N16 cho nền rắn và tiến hành chiết theo quy trình chiết

2.1.4 Dung môi, hóa chất

• Amonium format (> 99,0%) của Merck – Đức

• Acid formic (≥ 98,0%) của Merck - Đức

• Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH) (độ tinh khiết ≥ 99,97%) dùng cho LC-MS của Merck - Đức

• Nước khử ion 18mΩ

2.1.5 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:

• Hệ thống máy LC-MS/MS AB SCIEX QTRAP® 5500 của Mỹ sử dụng phần mềm Analyst® 1.6.2

• Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức)

• Máy lắc xoáy vortex Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mỹ)

• Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)

20

• Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm

• Cân phân tích độ chính xác 0,0001 g Mettler Toledo (d = 0,1 mg; Max 120g)

• Màng lọc PTFE 0,45 μm của Mỹ

• Ống nghiệm PTFE 15ml, ống falcol 50 ml

• Micropipet Eppendorf 100 – 1000 µL, 20 – 200 µL, 10 – 100 µL

• Các dụng cụ khác: Bình định mức 10,00 – 25,00 – 250,0 – 500,0 ml, pipet thủy tinh, cốc có mỏ, ống đong, phễu, vial loại 1,5 ml

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• Tối ưu hóa các điều kiện LC- MS/MS

• Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sibutramin

• Thẩm định phương pháp phân tích đã được xây dựng

• Ứng dụng phương pháp phân tích để kiểm tra một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có tác dụng hỗ trợ giảm cân

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích Sibutramin bằng LC/MS/MS

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Tiến hành phân tích trên máy LC-MS/MS AB SCIEX QTRAP® 5500 loại Triple Quadrupole (bộ phận phân tích khối dạng tứ cực chập ba), lựa chọn và khảo sát các điều kiện khối phổ phù hợp

• Nguồn Ion hóa: lựa chọn loại nguồn ESI (ion hóa phun sương điện) tạo ion dương, lựa chọn các thông số của nguồn ion hóa về nhiệt độ khí phun, tốc độ khí phun, áp suất đầu phun, thế nguồn ion hóa

• Điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo các ion con: thế đầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE)

• Lựa chọn mảnh ion con để định tính, trong đó mảnh có tín hiệu cao nhất dùng để định lượng

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Sibutramin nồng độ khoảng 100 ppb Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột sắc ký và thành phần pha động

21

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa trên các đặc tính lý hóa của dược chất và các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu trên các mẫu nghiên cứu:

• Lựa chọn quy trình dự kiến

• Khảo sát một số tỷ lệ dung môi chiết xuất

• Khảo sát số lần chiết xuất: chiết 1 lần và chiết 2 lần

• Khảo sát thời gian siêu âm: 15, 30 và 45 phút

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, hiệu quả có thể chiết Sibutramin với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích bằng LC-MS/MS

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra Theo hướng dẫn của AOAC 2016 [14], phương pháp phân tích Sibutramin bằng LC/MS/MS được thẩm định về các tiêu chí sau:

Cách xác định: Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một

dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic mảnh định lượng của các lần tiêm sắc ký

Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0%[9]

22

2.3.2.2 Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích khi:

• Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, tại thời điểm trùng với thời gian lưu của pic chất phân tích tín hiệu đo phải không vượt quá 20% đáp ứng pic của mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn

• Sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt

để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất Một chất phân tích bằng LC-MS/MS được coi là đặc hiệu khi có tối thiểu 4 điểm nhận dạng, tương đương với 1 ion mẹ và 2 ion con; ngoài ra tỷ lệ 2 ion con trên mẫu thử phải phù hợp với trên chuẩn [32]

Cách xác định: Chuẩn bị các mẫu sau:

• Mẫu chuẩn

• Mẫu placebo

• Mẫu placebo nạp chuẩn Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm xuất hiện pic của

Sibutramin không được xuất hiện các pic lạ

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Cách xác định:

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần Giới hạn dưới của đường chuẩn xác định dựa vào giá trị LOQ, giới hạn trên của đường chuẩn căn cứ vào hàm lượng Sibutramin được trộn vào thực phẩm bảo vệ sức khoẻ từ các nghiên cứu trước

đó Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

23

Yêu cầu:

• Đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ r ≤1

• Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính và phải có độ đúng nằm trong khoảng 85%-115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80%-120%

2.3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử

có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp

• Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

• Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

• Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Tính LOQ: Giá trị LOQ tính bằng công thức : LOQ = 10xSD

24

2.3.2.5 Độ chính xác

Độ lặp lại là chỉ tiêu đánh giá mức độ sai lệch kết quả giữa các lần phân tích khác nhau trong điều kiện lặp lại được tiến hành bởi cùng một người, trên cùng loại mẫu thử, cùng một thiết bị, phương pháp

Cách xác định:

Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác định bằng cách tiến hành 7 phép thử song song trên một mẫu placebo nạp chuẩn (mỗi lần bắt đầu từ cân hay đong mẫu) ở các mức nồng độ thấp, trung bình và cao Đánh giá sự phân tán

số liệu dựa vào giá trị RSD (%)

2.3.2.6 Độ đúng

Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá trình chiết tách, xử lý mẫu Xác định độ thu hồi chất phân tích bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của chất phân tích trong các mẫu kiểm tra chất lượng có qua quá trình chiết tách, xử lý với đáp ứng tương ứng của các mẫu chuẩn không qua xử lý, chiết tách (mẫu trong nền mẫu)

25

Cách xác định:

Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu

placebo ở 3 mức nồng độ: nồng độ thấp, nồng độ trung bình, nồng độ cao Tại mỗi

mức nồng độ, phân tích lặp lại 7 lần Độ thu hồi của Sibutramin được tính theo công

thức sau:

R (%)=Ct

Cc 100(%)

Trong đó: Ct là hàm lượng chất chuẩn tính được theo đường chuẩn

Cc là hàm lượng chất chuẩn thêm vào

Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% tại mức nồng độ 1 ppm, 100 ppb và 60-115%

tại mức nồng độ 10 ppb

2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dưng phân tích Sibutramin trộn trái phép

trong mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhóm giảm cân đang lưu hành trên thị

trường

Từ phương pháp đã xây dựng, nhằm bước đầu đánh giá sự có mặt Sibutramin

trong một số thực phẩm bảo vệ sức khoẻ có tác dụng giảm cân, phương pháp chọn

mẫu có chủ đích đã được sử dụng, lựa chọn 17 loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe có tác

dụng giảm cân được thu thập trên địa bàn 6 tỉnh miền Bắc, mỗi loại một mẫu Phân

tích Sibutramin trong các mẫu thu thập theo quy trình đã chuẩn hóa để bước đầu kiểm

tra sự có mặt của các chất này trong TPBVSK đang lưu hành trên thị trường

26

PHẦN III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1 Tối ưu các điều kiện khối phổ

Qua tham khảo một số tài liệu [25], [44] về phương pháp xác định Sibutramin,

kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI với chế độ bắn phá ion dương được lựa chọn tiến hành khảo sát Để xác định điều kiện khối phổ tối ưu, tiến hành pha dung dịch chuẩn Sibutramin với nồng độ 100 ppb Tiến hành tiêm mẫu vào thẳng MS, đặt tốc độ

tiêm 7,00 μL/phút, khoảng quét từ 50 Da đến 500 Da để xác định ion mẹ, thường cho tín hiệu lớn nhất, có số khối lớn hơn khối lượng phân tử 1 đơn vị (m/z= M+1) khi ion ở

dạng phân tử [M-H]+ Sau khi lựa chọn được ion mẹ, chuyển sang chế độ chạy

Product ion (MS2) để khảo sát các điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con Ion con có

cường độ tín hiệu lớn hơn, ổn định hơn được lựa chọn làm ion định lượng, ion còn lại được dùng cho mục đích định tính Các thông số thế đầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu tự động bằng phần mềm với mỗi ion con, kết quả khảo sát khối phổ như sau:

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện nguồn ESI và phân mảnh Sibutramin

280,1 Ion con 1 124,9

Ion con 2 103,0

Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 45 psi

Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 45 psi