Ứng dụng kỹ thuật real time pcr trong chẩn đoán mycoplasma pneumoniae và chlamydia pneumoniae trên bệnh nhân viêm phổi cộng đồng điều trị tại bệnh viện trường đại học y dược cần thơ, nă

NGUYỄN NGỌC LÂM ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL - TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN MYCOPLASMA PNEUMONIAE VÀ CHLAMYDIA PNEUMONIAE TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI H

NGUYỄN NGỌC LÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL - TIME PCR

TRONG CHẨN ĐOÁN MYCOPLASMA PNEUMONIAE VÀ

CHLAMYDIA PNEUMONIAE TRÊN BỆNH NHÂN

VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG

ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ, NĂM 2020 - 2021

V T ẠC

CẦ T Ơ - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NGỌC LÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL - TIME PCR

TRONG CHẨN ĐOÁN MYCOPLASMA PNEUMONIAE VÀ

CHLAMYDIA PNEUMONIAE TRÊN BỆNH NHÂN

VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG

ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ, NĂM 2020 - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tô đ đâ là đề tài nghiên cứu củ r ê ô dưới sự ướng dẫn khoa h c của T Dươ T ị Loan và Ts Bs Trịnh Thị Hồng Của Các tài li u trích dẫn, các số li u r đề tài là hoàn toàn trung thực và tuân theo

đú êu ầu của mộ đề tài nghiên cứu Đề tài nghiên cứu này là duy nhất và

ư ừ được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả đề tài

Nguyễn Ngọc Lâm

LỜI CẢM ƠN

Lời cả ơ đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biế ơ â à ới Ban giám

hi u Trườ Đại h c Y Dược Cầ T ơ và K Đ ều dưỡng - Kỹ thuật Y h c

đ đà ạo tôi và tạ đ ều ki n thuận lợ để tôi thực hi được luậ vă à

Tôi xin bày tỏ lòng kính tr ng và biế ơ âu ắc tới các cán bộ ướng

dẫn là Ts Dươ T ị Loan và Ts Bs Trịnh Thị Hồng Của, nhữ ười đ

gợi mở ô ý ưởng nghiên cứu và luôn quan â úp đỡ, nhi t tình

ướng dẫn, luôn luôn động viên khích l tôi trong suốt quá trình h c tập,

nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng kính tr ng và biế ơ âu ắc tới PGs Ts Trầ Đỗ

ù , Trưở K Đ ều dưỡng - Kỹ thuật Y h c đ luô qu â úp đỡ,

động viên khích l tôi trong suốt quá trình h c tập và nghiên cứu

Tô â à á ơ T B Võ P ạ T ư, ù ác anh chị

em đồng nghi p tại Khoa Nội tổng hợp, B nh vi n Trườ Đại h Y Dược

Cầ T ơ; quý Thầy Cô và các bạ đồng nghi p tại phòng xét nghi m vi sinh

(Bộ môn Vi sinh), phòng xét nghi m vi sinh (Khoa xét nghi m, B nh vi n

Quân Y 121) và đặc bi t là phòng xét nghi m sinh h c phân tử (Bộ môn Sinh

lý b nh - Miễn dịch) đ ận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Cá ơ á b â và ườ à, đ úp ô ực hi n nghiên cứu

và cung cấp cho tôi những số li u vô ù quý á để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cả ơ đì và bạn bè đ luô ủng hộ và hỗ trợ

về m i mặt trong cuộc số để tôi có thể hoàn thành luận văn

Cần Thơ, ngày 15 tháng 10 năm 2021

Tác giả đề tài

Nguyễn Ngọc Lâm

MỤC LỤC

Trang

C C C V ẾT T T

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BIỂ ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤ ĐỀ 1

C ươ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 B nh viêm phổi cộ đồng và b nh viêm phổi cộ đồng do tác nhân ô đ ển hình 3

1.2 Tá â ô đ ển hình gây viêm phổi cộ đồng 3

1.3 Chẩ đ á lâ à và ận lâm sàng của viêm phổi cộ đồng 9

1.4 Kỹ thuật real - time PCR chẩ đ á M pneumoniae, C pneumoniae 12

C ươ 2 ĐỐ TƯỢ G VÀ P ƯƠ G P P G Ê CỨU 17

2.1 Đố ượng nghiên cứu 17

2.2 P ươ p áp ê ứu 18

2.3 Đạ đức trong nghiên cứu 31

C ươ 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Đặ đ ểm chung củ đố ượng nghiên cứu 33

3.2 Tỷ l nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae ở mẫu đà ủ đố ượng nghiên cứu bằng kỹ thuật real - time PCR 39

3.3 Liên quan giữa tỷ l nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae ở mẫu đà bằng kỹ thuật real - time PCR với một số đặ đ ể u và đặ đ ểm cận lâm sàng củ đố ượng nghiên cứu 42

C ươ 4 BÀN LU N 50 KẾT LU N 63 KIẾN NGHỊ 64

TÀ Ệ T A K ẢO

CÁC PHỤ LỤC

CÁC CH I T T T

ATP Adenosine Triphosphate

COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease

(B nh phổi tắc nghẽn mạn tính) CRP C - reactive protein

(Protein phản ứng C)

Ct Cycle Threshold

(Chu kỳ ưỡng) DNA Deoxyribonucleic Acid

ELISA Enzym - Linked Immunosorbent Assay

(Xét nghi m miễn dịch hấp thụ liên kết với enzym) ICU Intensive Care Unit

(Đơ vị ă ó đặc bi t) NCA Negative Control Amplification

(Đối chứng âm khuế đại) NCE Negative Control of Extraction

(Đối chứng âm tách chiết)

OD Optical Density

(Mậ độ quang h c) PCR Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi trùng hợp) Pos C+ Positive Control

(Đối chứ dươ )

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bả 2.1: ự p ù ợp ủ ế quả á ẫu ứ ở á ê àu rê

ố á re l - time PCR 27

Bả 2.2 C u rì qu á đ ạ uế đạ D A 29

Bảng 3.1: Đặ đ ểm nghề nghi p củ đố ượng nghiên cứu 34

Bảng 3.2: Đặ đ ểm về đị dư ủ đố ượng nghiên cứu 35

Bảng 3.3: Đặ đ ểm về tiền sử mắc các b nh phổi mạn ở đố ượng nghiên cứu 35

Bảng 3.4: Đặ đ ểm về bạch cầu trong công thức máu và chỉ số CRP củ đối ượng nghiên cứu 36

Bảng 3.5: Đặ đ ểm tổ ươ p ổi trên kết quả chẩ đ á ì ảnh củ đối ượng nghiên cứu 37

Bảng 3.6: Tỷ l phát hi n M pneumoniae, C pneumoniae ở mẫu đà ủ đối ượng nghiên cứu bằng kỹ thuật real - time PCR 39

Bảng 3.7: Tỷ l từng loại vi khuẩn (M pneumoniae, C pneumoniae) ở mẫu đà ủ đố ượng nghiên cứu bằng kỹ thuật real - time PCR 40

Bảng 3.8: Tỷ l đồng nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae ở mẫu đà củ đố ượng nghiên cứu bằng kỹ thuật real - time PCR 40

Bảng 3.9: Liên quan giữa đơ nhiễm M pneumoniae với giới tính, nhóm tuổi, địa dư, ền sử mắc b nh phổi mạn ở đối ượng nghiên cứu 42

Bảng 3.10: Liên quan giữa đơ nhiễm C pneumoniae với giới tính, nhóm tuổ , địa dư, ền sử mắc các b nh phổi mạn ở đố ượng nghiên cứu 43

Bảng 3.11: Liên quan giữa đồng nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae với giới tính, nhóm tuổ , đị dư, ền sử mắc các b nh phổi mạn ở đố ượng nghiên cứu 44

Bảng 3.12: Liên quan giữ đơ ễm M pneumoniae với một số cận lâm

sàng củ đố ượng nghiên cứu 45 44

Bảng 3.13: Liên quan giữa đơ nhiễm C pneumoniae với một số cận lâm

sàng củ đố ượng nghiên cứu 46

Bảng 3.14: Liên quan giữ đồng nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae với

một số cận lâm sàng củ đố ượng nghiên cứu 47

Bảng 3.15: Liên quan giữa đơ nhiễm M pneumoniae với tổ ươ trên

X - quang phổi củ đố ượng nghiên cứu 48

Bảng 3.16: Liên quan giữ đơ ễm C pneumoniae với tổ ươ rê

X - quang phổi củ đố ượng nghiên cứu 48

Bảng 3.17: Liên quan giữa đồng nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae với

tổ ươ rê X - quang phổi củ đố ượng nghiên cứu 49

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 3.1: Tỷ l giới tính trong mẫu nghiên cứu 33 Biểu đồ 3.2: Tỷ l về nhóm tuổi củ đố ượng nghiên cứu 34 Biểu đồ 3.3: Đặ đ ểm lâm sàng của b nh nhân viêm phổi cộ đồng khi nhập

vi n 36 Biểu đồ 3.4: Phân bố tác nhân vi sinh trên mẫu đà ủ đố ượng nghiên cứu thông qua kỹ thuật nuôi cấy vi sinh 38

Biểu đồ 3.5: Phân bố của hai vi khuẩn (M pneumoniae, C pneumoniae) trên

các mẫu có kết quả real - e PCR dươ í 39

Biểu đồ 3.6: Tỷ l đồng nhiễm M pneumoniae, C pneumoniae với các tác

nhân vi sinh khác 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: M pneumoniae rê í ể v đ ử và ấu rú bê r ế bào 5 Hình 1.2: Hình ảnh ký sinh nội bào của C pneumoniae và thể EB, RB qua

kính hiể v đ n tử 8 Hình 1.3: Các khu vực có xuất hi n viêm phổi cộ đồng và tỷ l mắc viêm phổi do tác nhân ô đ ển hình trên thế giới 15 Hình 2.1: H thống máy real - time SaCycler - 96TM và á qu p ổ

Biodrop DUO 23

ĐẶT ẤN ĐỀ

M pneumoniae và C pneumoniae là ộ r á tác nhân ủ ếu â r

b lý v ê p ổ ộ đồ [36], [45] V ê p ổ d C pneumoniae và M pneumoniae ó đặ đ ể dị ễ và lâ à ươ ự u, ứ độ ê

r ủ v ê p ổ d tác nhân à đổ ù e uổ b â , tác nhân v đồ ễ và b lý ề đ è Tạ C âu - Thái Bình

Dươ , C pneumoniae và M pneumoniae là r ă á â í â

v ê p ổ ộ đồ bê ạ á á â v á ư S pneumoniae,

H influenzae và Legionella spp [37] Tỷ l ắ v ê p ổ do C pneumoniae

và M pneumoniae ế ỷ l ừ 22 - 28,6% r ổ ố v ê p ổ ộ

đồ ó ể á đị đượ á â [30], [32] Tỷ l đồ ễ C pneumoniae và M pneumoniae là 3,4% [14] Tỷ l ễ á á â à có

ể ơ ữ d ó ộ ố b â ó b ểu lâ à ẹ và không

ượ ườ lớ uổ và rẻ dướ 02 uổ ặ có đồ ễ á á â v sinh khác và có ự ồ ạ ủ b lý đ è [32], [50] Kể ả ở ườ ẻ

ạ , v ê p ổ do tác nhân ô đ ể ì ếu ô đ ều rị r để ó

ể â r ì rạ ho mạ í á p á , rấ ó đ ều rị [25]

ếu ỉ dự và b ểu lâ à X - quang p ổ thì ô ể

ẩ đ á đượ M pneumoniae, ũ ư p â b ó vớ C pneumoniae

Cá ẩ đ á á đị C pneumoniae, M pneumoniae rướ đâ

ó ều ạ ế: M pneumoniae ó ể uô ấ rê ô rườ P - 4,

ư ầ ờ 2 - 3 uầ và qu rì h p ứ ạp, còn C pneumoniae ký

bắ buộ r ế bà ố ê ô ể uô ấ rê á ô rườ

â ạ , à p ả ự rê ế bà à, ế bà ell 229 và ep - 2… [14], [49], nên ầu ế á p ò đều ô ự uô ấ v

uẩ à P ươ p áp lai vớ đầu dò DNA đượ đề xuấ ư ột quy trình nhanh chóng và cụ thể để thay thế nuôi cấ , ư lại thiếu độ nhạy [34] Bên

ru ề ố [17] Vì vậ , ứ dụ ỹ uậ re l - e PCR để ẩ đ á C pneumoniae và M pneumoniae â v ê p ổ ộ đồ lạ u quả

và ể ê ư ộ u ế ấ ếu bở ả ă p á ớ , ế quả ó và chính xác [6], [35], [47]

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hi đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật real -

time PCR trong chẩn đoán Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae trên bệnh nhân viêm phổi cộng đồng điều trị tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, năm 2020 - 2021”, với các mục tiêu:

1 Xá định tỷ l nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae bằng kỹ

thuật real - time PCR trên b nh nhân viêm phổi cộ đồng đ ều trị tại B nh

vi Trườ Đại h Y Dược Cầ T ơ, ă 2020 - 2021

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa tỷ l nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae với một số đặ đ ểm chung và cận lâm sàng của b nh nhân viêm

phổi cộ đồng đ ều trị tại B nh vi Trườ Đại h Y Dược Cầ T ơ, ă

2020 - 2021

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm phổi cộng đồng và bệnh viêm phổi cộng đồng do tác nhân không điển hình

V ê p ổ ộ đồ là ì rạ ễ uẩ ạ u ô p ổ ả r

ở bên à b v , b ồ v ê p ế , ố và ú p ế , ểu p ế quả ậ ặ v ê ổ ứ ẽ ủ p ổ

Tác nhân gây v ê p ổ ộ đồ ó ể là á v uẩ , v rút, ấ

và ộ ố á â á , ư ô d rự uẩ l [4]

V ê p ổ do tác nhân k ô đ ể ì là v ê p ổ ộ đồ vớ á

â â b là á v uẩ ô đ ể ì , mà ủ ếu là L pneumoniae,

M pneumoniae và C pneumoniae [4], [29] D đó, uậ ữ “ á nhân không

đ ể ì ” ườ dùng để ỉ các vi uẩ C pneumoniae , M pneumoniae và L pneumoniae [27]

M pneumoniae là á â ô đ ể ì â v ê p ổ ộ đồ

p ổ b ế ấ đượ á đị ở ấ ả á u vự đị lý rê ế ớ , ế ếp

là C pneumoniae và uố ù L pneumoniae [29]

1.2 Tác nhân không điển hình gây viêm phổi cộng đồng

Tác nhân ô đ ển hình gây viêm phổi cộ đồng ường gặp và

được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hi n nay là M pneumoniae và C pneumoniae

1.2.1 Vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae

M pneumoniae là một loài vi khuẩn thuộc chi Mycoplasma, h Mycoplasmataceae, bộ Mycoplasmatales, thuộc ngành Tenericutes

1.2.1.1 Lịch sử nghiên cứu M pneumoniae

M pneumoniae đượ p á lầ đầu ê bở E và ộ ự vào

ă 1944 ( ê ò đượ là á â E ), ó ó í ướ rấ ỏ, có

ể đ qu đượ á lỗ à l và ô p á r ể rê á ô rườ uô

ấ v uẩ ô ườ ê b đầu đượ là v rút

Tr đ ạ 1950 - 1960, M pneumoniae đ đượ á ậ là tác

â â ễ rù đườ ô ấp Đế ă 1962, khi Chanock và các

ộ ự ó ể uô ấ á â E rê ô rườ ô ầ ó ế bà

và đề uấ ả ỉ đị p â l ạ ũ ư ê ủ vậ ư ú b ế ngày nay [11], [33]

Ngày nay, trong các loài Mycoplasma â b ườ , v uẩ M pneumoniae là ộ r ữ Mycoplasma đượ á à quan

M pneumoniae là l ạ v uẩ ó í ướ rấ ỏ, ỉ ươ đươ

vớ á v rút có kích ướ lớ ê ó ể xuyên qua đượ á à l v

uẩ ỡ 450 [33], [55]

uẩ á và v rú ) [8] Vì vậ vớ M pneumoniae ầ p ả ó er l rê

ô rườ uô ấ ú ớ p á r ể đượ [55]

* Tính chất nuôi cấy

M pneumoniae đượ ếp và ó v uẩ vì ú ó ả ă

p á r ể đượ ở các ô rườ â ạ và rê ế bà ố K uô ấ

đò ỏ bắ buộ ô rườ uô ấ p ả ó ữ ấ d dưỡ đặ b (huyế ự , ế uấ e …)

Đ ều uô ấ ủ M pneumoniae là độ ừ 35 - 37o

C, pH 7,0

- 7,8 [7] M pneumoniae uộ ó v uẩ ếu í ư p á r ể ố

r í rườ ó 5% CO2 [11] Ở ô rườ lỏ v uẩ ô là

đụ ô rườ , rê ô rườ đặ , uẩ lạ ỏ và bẹ ư ộ quả rứ

rán [7], [8], đườ í uẩ lạ ế vượ quá 100 μ , M pneumoniae

1000C trong 5 phút M pneumoniae ươ đố bề vớ độ lạ , ó ể

đô bă đượ và ă [7]

* Kháng nguyên

M pneumoniae ó ều l ạ á u ê ó í đặ u l à và

đặ u pe u ế ủ M pneumoniae ỗ l ạ á u ê

á u và ộ p ả ứ đặ u á u ê - á ể

ấ đị [7]

1.2.2 i khuẩn Chlamydia pneumoniae

C pneumoniae là một loài vi khuẩn thuộc chi Chlamydia, h Chlamydiaceae, bộ Chlamydiales, ngành Chlamydiae

1.2.2.1 Lịch sử nghiên cứu C pneumoniae

ă 1965 Woolridge lầ đầu tiên phân lập được vi khuẩn tại ổ viêm kết mạc ở trẻ nhỏ tạ Đà (Taiwan: TW) và đượ đặt tên là TW - 183

Đế ă 1983 Gr lầ đầu tiên phân lập được Chlamydia từ b nh

phẩ đường hô hấp (được lấy ở Seattle, Washington, từ mộ v ê đại h c

bị viêm h ng) với tên g i AR - 39 u đó đượ đổi tên là TWAR và tên này được sử dụng trong các phòng xét nghi m đó [22], [26]

Đến ă 1989, TWAR được công nhận là Chlamydia pneumoniae, một

trong ba loài thuộc chi Chlamydia gây b nh hô hấp cấp tính, gồm viêm phổi, viêm phế quản, viêm xoang và viêm h ng [22]

Hi n nay, trong các ấn phẩm khoa h c thì tên g i C pneumoniae vẫn

ườ u ê được các tác giả sử dụng [26]

1.2.2.2 Đặc điểm vi sinh vật của C pneumoniae

* Hình thể, kích thước

C pneumoniae là ữ v uẩ ỏ, dạ ì ầu, ô g di độ ,

ô ó vá ế bà nên bắ àu uố uộ Gr [7], [8] C

pneumoniae ý ộ bà bắ buộ , ú đượ p â l ạ là v uẩ dự

vào các à p ầ ế bà và ă rưở bằ cách â đô [22]

C u ỳ p á r ể ủ C pneumoniae ạ à ể á u ể

ơ bả (EB ele e r b d e ) là ữ ế bà rò , â đậ , â ập

ểu ự bà và ể lướ (RB re ul e b d e ) là d C pneumoniae sau khi

â ập, u ể ó ờ ế bà vậ ủ và ạ à dạ lướ T ể EB là

ể â ễ T ể EB ó đườ í 0,3 , ể RB đườ í ừ 0,5 - 1

mm [7], [8], [22]

T ể EB bắ àu ồ uộ bằ uố uộ G e , ươ

p ả vớ ề àu ủ ế bà vậ ủ T ể RB bắ màu xanh uộ

C pneumoniae ý bắ buộ bê r ế bà ố , bở vì ú là

v uẩ ỵ í và ô ó ả ă ổ ợp ATP và p ả p ụ uộ và

ă lượ ủ ế bà vậ ủ để p á r ể và nhân lên, nên ầ uố ấ

C pneumoniae bắ buộ p ả uô ấ rê ế bà ố [26] V uẩ C pneumoniae ườ đượ uô ấ rê ế bà uô C , 2, Hep - 2,

el 229 ú lò đỏ p ô à Đô uộ ắ rắ ũ đượ ử dụ

để p â lập [7], [8], [22]

C í vì vậ , ạ rừ á p ò v ự uô ấ C pneumoniae ằ ụ đí ê ứu ì á p ò v ở

á b v ầu ư ũ ô ự uô ấ v uẩ à

* Sức đề kháng

ứ đề á ủ C pneumoniae ếu, dễ bị êu d bở ứ ó ,

ự í , ấ á uẩ ô ườ K ả ă qu l v uẩ Bị êu

d ở độ 600

C trong 10 phút, ether trong 30 phút, phenol 0,5% trong 24

ờ C ú ó ể ồ ạ ều ă ở độ - 500C đế - 700

C

C pneumoniae ạ ả vớ ều á á penicillin,

cep l p r ứ ế ổ ợp à ế bào, còn kháng sinh tetracyclin, erythromycin thì ứ ế ổ ợp pr e và kháng sinh sulf d ứ ế

ổ ợp f l e Riêng aminoglycosid ì ô ó u quả vớ C pneumoniae [7]

* Kháng nguyên

C pneumoniae có kháng nguyên đặ u ó bả ấ là

l p p l r de, ổ đị vớ K á u ê đặ u l à và đặ

u pe u ế là pr e à à , ô ịu [7]

1.3 Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng của viêm phổi cộng đồng

1.3.1 Triệu chứng lâm sàng của viêm phổi cộng đồng

T ườ ở p á độ ộ vớ ố 40 - 410 C, r ru , ư ó

ỉ ố ẹ 38 - 38,5o

C [5], b ả b ểu ễ rù ô ấp dướ ở

p á ấp í vớ á b ểu , ố , ạ đà , đ u ặ ự (vị rí đ u

ườ uấ bê ổ ươ ), ó ở, đ è là r u ứ ự ể

1.3.2 Cận lâm sàng của viêm phổi cộng đồng

1.3.2.1 Cận lâm sàng không đặc hiệu

- Cô ứ áu ố lượ bạ ầu chung ă > 10 109/L, ă ủ

ếu là bạ ầu ạ trung tính [4]

- X đị lượ CRP và pr l , đ ố độ áu lắ ỉ

ố CRP ă , ỉ ố pr l ă , ố độ áu lắ ă [4]

- ì ả ổ ươ rê X - qu p ổ [4]: ó ều dạ

+ Tổ ươ p ế ổ ươ ì ờ ươ đố đồ ấ

ế ộ uỳ ặ p â uỳ phổi và có hình ảnh phế quả ơ Cá rường hợp ít đ ển hình ơ thấy các hình mờ này không chiếm một thùy hoặc phân thùy hoặc có thể kèm theo xẹp phổi do dịch tiết gây tắc nghẽn các phế quản

+ Tổn ươ phế quản phổi: tổn ươ mờ rả rá , ô đồng nhất, những tổn ươ mờ này có thể chồng lên nhau tạo thành những hình mờ

đậ ơ

+ Tổn ươ g mô kẽ: hình ảnh mờ dạng lưới hoặc lưới nốt khắp cả hai bên phổi, đô ến triển thành những hình mờ rải rác thường xuất hi n ở thùy dưới

+ Thâm nhiễm dạng nốt: hình mờ tròn giới hạn rõ vớ đường kính lớn

ơ 1 trên phim X - quang phổi

- Trên lâm sàng có những trường hợp viêm phổi không phát hi n tổn thươ g trên X - quang phổi, chẩ đ á v ê p ổi nếu b nh nhân có những tri u chứng lâm sàng phù hợp và có thể tiến hành chụp X - quang phổi lần hai sau 24 - 48 giờ [4]

1.3.2.2 Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn M pneumoniae và

C pneumoniae

* Nuôi cấy, nhuộm soi [41], [45]

uô ấ M pneumoniae và C pneumoniae ườ ó ự vì

đò ỏ ô rườ uô ấ đặ b , àu ấ d dưỡ và d ễ r r

ờ á lâu d á v uẩ rấ ậ

uộ Gr và rê í ể v ườ ô ó á rị ẩ

đ á M pneumoniae và C pneumoniae vì ú ô ó ấu ạ vá ế

bà và ó ì ể quá ỏ, ô ể qu á đượ dướ á l ạ í ể

* Chẩn đoán huyết thanh học [41], [45]

Kỹ uậ miễn dịch hấp thụ liên kết với enzym (ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent) dù để p á ự ó ặ ủ và ă u á ủ

G, rấ ó ý ĩ r ẩ đ á ễ M pneumoniae và C pneumoniae

ở đ ạ ấp tính

- ẫu u ập hu ế

* Kỹ thuật sinh học phân tử (real – time PCR) [41], [45]

Vớ ều ượ đ ể ủ ỹ uậ uô ấ và u ế r

ẩ đ á M pneumoniae và C pneumoniae, ướ ẩ đ á đ

p á r ể e ướ ử dụ ỹ uậ p â ử real - time PCR

- ẫu u ập dị rử p ế quả , ẫu đà , ẫu p ế , ẫu ô,

á á á â â b , ỹ uậ real - time PCR đ và đ rở à ộ

r ữ ỹ uậ đượ ứ dụ ều ấ r ẩ đ á á á â

v â b

1.4.1 Khái niệm về kỹ thuật real - time PCR

Kỹ uậ re l - e PCR là ộ p ươ p áp đượ ử dụ để uế

đạ p â ử D A r ố Tu ê , ỹ uậ real - time PCR khác

vớ ỹ uậ PCR ô ườ ở ỗ ó ó ả ă p á và đị lượ

rự ếp ả p ẩ ủ p ả ứ PCR u ỗ u ỳ ủ p ả ứ

P ươ p áp à đò ỏ ộ ế bị luâ đặ b , ó ố

đ đượ ườ độ p á uỳ qu ừ ế ẫu và đượ r bị ươ

rì p ầ ề l ê ế vớ ứ dụ à ẵ rê á v í , p p ử lý

ế quả, á đị ự b ế đổ ườ độ uỳ qu r ừ p ả ứ

uế đạ [16]

1.4.2 Nguyên lý của kỹ thuật real - time PCR

Phản ứng real - e PCR được thực hi n trong một máy gia nhi t có khả ă ếu sáng mỗi một mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dà bước sóng nhấ định

à r á PCR à ò á đị đượ bước sóng ánh sáng phát ra

từ phân tử phát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR Từ đó á ó ể

á đị được tín hi u huỳ qu đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử DNA được tổng hợp ă lê Vì vậy có thể í đượ lượng sản phẩm DNA u được sau phản ứng

ư vậy, quy trình thực hi n kỹ thuật real - e PCR ũ e nguyên tắ ô ường của phản ứng tổng hợp chuỗi vớ 3 đ ạn: biến tính, bắt cặp và kéo dài Tu ê , đặ đ ểm khác bi í là đ ạn DNA được nhân lên sẽ được phát hi n tại mỗi thờ đ ểm diễn ra phản ứng (real - time) Real - time PCR gồm hai quá trình diễ r đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứ PCR và đ độ phát huỳnh quang tỷ l thuận hoặc nghịch với

số đ ạn DNA được tạo thành

Chìa khoá kỹ thuật chính trong kỹ thuật real - time PCR chính là chất phát huỳnh quang Nó sẽ phát huỳnh quang hoặc không phát quang khi có sự

hi n di n của sản phẩm khế đại từ DNA đí [16]

1.5 Tình hình nghiên cứu các tác nhân không điển hình gây viêm phổi cộng đồng trên thế giới và tại Việt Nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu các tác nhân không điển hình gây viêm phổi cộng đồng trên thế giới

Viêm phổi cộ đồng do các tác nhân M pneumoniae, C pneumoniae, hay L pneumoniae chiếm tỷ l từ 22 - 28,6% tổng số viêm phổi cộ đồng có

thể á đị được tác nhân vi sinh [14] Tỷ l này có thể ơ ở những

b nh nhân đến khám và đ ều trị ngoại trú [44]

Tại Mỹ, viêm phổi cộ đồng do tác nhân M pneumoniae chiếm từ 15

- 20% r á rường hợp viêm phổi cộ đồ á đị được tác nhân gây

b nh Tỷ l à ó lú ă , lê đến 50% trong khoảng thời gian mùa hè [40]

Bên cạ đó, ô qu p â í dữ li u quốc tế, tác giả Forest W

Arnold cho biết tỷ l b nh nhân viêm phổi cộ đồng có mắc tác nhân C pneumoniae là 5% ở châu Á, 6% ở Mỹ La tinh, 7% ở châu Âu và 8% ở Bắc

Mỹ [29]

Theo một nghiên cứu từ Khoa truyền nhiễ , Trườ Đại h c Louisville (Mỹ), từ ă 1996 - 2004, với 4.337 b nh nhân viêm phổi cộng đồng ở khắp các nước trên thế giớ được thu thập mẫu và thực hi n xét nghi để tìm tác nhân vi sinh ô đ ển hình bằng kỹ thuật PCR, kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ l mắc chung củ á á â ô đ ển hình trên toàn thế giới là 22%, hầu hết b nh nhân là từ Bắc Mỹ, tiếp theo là châu Mỹ

La tinh và châu Á/châu Phi [30]

Hình 1.3: Các khu vực có xuất hi n viêm phổi cộ đồng

và tỷ l mắc viêm phổi do tác nhân ô đ ển hình trên thế giới [30]

u đó, r mộ bá á ă 2018 ủa Gramegna và các cộng sự, cho biết tỷ l tác nhân ô đ ể ì r á rường hợp mắc viêm phổi

cộ đồng có nhập vi n tại các châu lụ ư u C âu P (22,2%), C âu (4,5%), C âu Âu (4,6%), C âu Đạ Dươ (0%), Bắc Mỹ (5,7%), Nam Mỹ (4,5%) Bá á ũ ỉ rõ mứ độ quan tâm của từng quốc gia và châu lục trong vi c thực hi n xét nghi m chẩ đ á ì tác nhân ô đ ển hình trên các b nh nhân mắc viêm phổi cộ đồng nhập vi n, với tỷ l cao nghiêng về

p í á ước thuộ âu Âu (Ý, Tâ B , P áp …) [18]

Tỷ l mới mắ ước tính khác nhau tùy theo kỹ thuật chẩ đ á , uổi của

b nh nhân; b â đ ều trị ngoại trú, nội trú hay cả hai [14]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu các tác nhân không điển hình gây viêm phổi cộng đồng tại Việt Nam

Tại Vi t Nam, nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Di u Ngân thực hi n từ tháng 02/2011 đến tháng 02/2013 tại 03 b nh vi n: b nh vi n b nh nhi đới

Khu vực III: tác nhân

ru ươ , b nh vi đ Đố Đ và b nh vi Đức Giang, tác giả đ

sử dụng cả hai kỹ thuật gồm kỹ thuật real - time PCR và chẩn đ á u ết

thanh h c để phát hi n tình trạng nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae

trên 142 b nh nhân mắc viêm phổi cộ đồng ở nhóm tuổi từ 18 - 97 và đ

phát hi n tỷ l nhiễm M pneumoniae là 16,2% và nhiễm C pneumoniae là 10,6% Tr đó, M pneumoniae chiếm tỷ l cao nhất (69,9%) ở nhóm tuổi

từ 18 - 45 [12]

Trong một nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang trên các b nh nhân mắc nhiễm trùng cấp tính hô hấp dưới có nhập vi đ ều trị tại khoa hô hấp của các b nh vi n: Chợ Rẫy, Phạm Ng c Thạ , â dâ G Đị và Đ

ru ươ à p ố Cầ T ơ, ời gian nghiên cứu từ á 5/2016 đến cuối tháng 12/2016, tác giả Phạm Hùng Vân cùng các cộng sự ứng dụng kỹ thuật real - e PCR đ ồi (multiplex - PCR) và đ p á n 3/145 (2,07%)

b nh nhân mắc M pneumoniae và 1/145 (0,7%) b nh nhân mắc C pneumoniae Tr đó, M pneumoniae đượ á định là tác nhân gây b nh

í r 2/3 rường hợp mắc, C pneumoniae là tác nhân chính trong duy

nhất mộ rường hợp [17]

Trê đố ượng là trẻ em, vớ độ tuổi từ 1 - 15 tuổi thì có một số nghiên

cứu sau: Tỷ l phát hi n M pneumoniae bằng kỹ thuật real - time PCR trong

nghiên cứu của hai tác giả Nguyễn Thị Vân Anh và Lê Thị ươ nghiên cứu trên 335 b nh nhân từ 1 - 15 tuổi mắc viêm phổi cộ đồng tại

b nh vi ru ươ ừ tháng 02/2010 đến tháng 02/2011 cho kết quả là 14,3% [1] Tiếp đó, ghiên cứu của tác giả Phạm Thu Hiền trên 722 trẻ mắc viêm phổi cộ đồng từ 1 - 15 tuổi tại b nh vi ru ươ , ừ tháng 7/2010 đến tháng 3/2012, chẩ đ á á â ô đ ển hình bằng kỹ thuật multiplex - PCR, có kiểm chứng bằng chẩ đ á huyết thanh h c, cho kết

quả: M pneumoniae (26,3%), C pneumoniae (3,7%) [9]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá b â đượ ẩ đ á ắ v ê p ổ ộ đồ , ó ập v

đ ều rị ạ K ộ ổ ợp, B v Trườ Đạ Y Dượ Cầ T ơ

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

B nh nhân được chẩ đ á v ê p ổi cộ đồng khi vào vi n, không giới hạn về tuổ và ơ ư rú (b nh nhân có thể xuất hi đầ đủ hoặc không

đầ đủ các tri u chứng lâm sàng, cận lâm sàng của một ca viêm phổi)

T êu uẩ ẩ đ á v ê p ổ ộ đồ ( e “ Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn” ủ Bộ Y ế

- Cậ lâ à : có sự d ủ ì ả ổ ươ trên X - quang

p ổ ổ ươ p ế , ổ ươ p ế quả p ổ , ổ ươ ô ẽ và

â ễ dạ ố ặ ó ể ô ì ấ ổ ươ rê X - quang

p ổ , ố lượ bạ ầu ă > 10 109

/L, ố lượ bạ ầu ạ ru í

ă , ỉ ố CRP ă , pr l ă

Tiêu chuẩn mẫu đà cần lấy để thực hi n xét nghi m real - time PCR

phả đáp ứ được các tiêu chí sau, nếu ô đạt phải lấy lại mẫu:

- Nhầy mủ

- Thể tích mẫu: 1 - 5 ml

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- B nh nhân viêm phổ ư có tiền sử đến/qua/ở/về từ vùng dịch tễ

có b nh Covid - 19 trong khoả 14 à rước khi khởi phát các tri u chứng

hoặc có tiếp xúc gần vớ rường hợp b nh nghi ngờ hoặ á định nhiễm

Covid - 19 trong khoảng 14 ngày rước khi khởi phát các tri u chứng [3]

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

* Địa điểm nghiên cứu:

- Thu thập mẫu nghiên cứu: khoa Nội tổng hợp của B nh vi n Trường

Đại h Y Dược Cầ T ơ

- Thực hi n kỹ thuật xét nghi m:

+ Xử lý mẫu, tách chiết DNA tại phòng xét nghi m Sinh h c phân tử,

Bộ môn Sinh lý b nh - Miễn dị , K Y, Trườ Đại h Y Dược Cần

T ơ

+ Thực hi n kỹ thuật real - time PCR tại phòng xét nghi m vi sinh, Khoa xét nghi m, B nh vi n Quân Y 121

* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7/2020 đến tháng 5/2021

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: ê ứu ô ả ắ

2.2.2 Cỡ mẫu

Công thức tính cỡ mẫu:

đượ ≈ 106,43 (M pneumoniae) và n ≈ 74,29 (C pneumoniae), d đó, ỡ

ẫu ố ểu ầ ê ứu à là 107 ẫu, ộ thêm 10% ụ

ẫu, ó = 120 ẫu T ự ế, ú ô đ u ập đượ 156 ẫu ả các êu uẩ ẫu

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

P ươ p áp n mẫu thuận ti n: ch n tất cả b â đ được chẩn

đ á viêm phổi cộ đồng đến khám và có chỉ định nhập vi đ ều trị tại khoa Nội tổng hợp của B nh vi n Trườ Đại h Y Dược Cầ T ơ ỏa các

tiêu chuẩn ch n mẫu

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Các đặc điểm dân số học, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu

* Đặc điểm dân số học: gồm các biến số sau

- Tuổi: phân thành các nhóm tuổi: 18 - 35 tuổi; 36 - 45 tuổi; 46 - 55

tuổi; 56 - 65 tuổi; > 65 tuổi

- Giới tính: nam; nữ

- Nghề nghi p: phân thành các nhóm: n â v ê à á /vă p ò ; kinh doanh/bán hàng; công nhân; nông dân; nội trợ; thất nghi p; hết tuổi lao động

- ơ ư rú: phân thành hai nhóm: thành thị; nông thôn Theo Khoản 1,

Đ ều 3, Nghị đị 57/2018/ Đ - CP của thủ ướng chính phủ [15] thì:

+ Thành thị: là các quận nộ à , á p ường nội thị và thị trấn;

+ Nông thôn: tất cả á đơ vị à í ơ ở còn lại (xã)

* Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu:

- Biến số cần thu thập chính là các tri u chứ ơ ă của b nh nhân mắc viêm phổi cộ đồng tham gia nghiên cứu: ho khan; ho khạ đờm; có thể

có ho ra máu; khàn tiếng; chảy ũ ; ó ở; đ u ực; sốt; ớn lạnh; ra mồ

ô đê ; ú â ; t mỏ ; đ u đầu; đ u ; đ u ơ; á ă ; êu ảy; buồ ô ; ô ; đ u bụng

- Tiền sử mắc các b nh hô hấp mạn (hen, COPD):

- Hình ảnh X - quang phổi: vị trí tổ ươ

(0) Không tổ ươ (1) Phổi trái

(2) Cả 2 bên (3) Phổi phải

+ Tù ó ườn hoành (có biến chứng tràn dịch màng phổi):

- Kết quả nuôi cấy vi sinh: mô tả bằng tần số, gồm ba giá trị:

+ Tên tác nhân vi sinh phát hi được bằng kỹ thuật nuôi cấy

+ Âm tính

+ Không nuôi cấy

2.2.4.2 Xác định tỷ lệ nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae trên đối tượng nghiên cứu

- Tỷ l nhiễm M pneumoniae hoặc/và C pneumoniae là tỷ l mẫu có

sự hi n di n DNA của M pneumoniae hoặc/và C pneumoniae trong tổng số

mẫu đà u được từ đố ượng nghiên cứu, được phát hi n bằng kỹ thuật real

- time PCR với bộ kit thử do Sacace Biotechnologies (Ý) cung cấp

+ Tỷ l đồng nhiễm cả hai loại M pneumoniae và C pneumoniae

(1) M pneumoniae (+) đồng thời C pneumoniae (+)

(2) Các kết quả còn lại: âm tính hoặ đơ nhiễm M pneumoniae hoặc

đơ ễm C pneumoniae

2.2.4.3 Tìm hiểu mối liên quan giữa nhiễm M pneumoniae và C pneumoniae với đặc điểm chung và một số cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu

Đố ếu ỷ l ễ M pneumoniae, C pneumoniae vớ á đặ đ ể

u , đặ đ ể ậ lâ à ủ đố ượ ê ứu ằ ì ểu ố

l ê qu ữ ễ M pneumoniae, C pneumoniae vớ á b ế ố à

2.2.5 Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu

2.2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu

- B nh nhân đến khám và nhập vi n đ ều trị tại khoa Nội tổng hợp,

B nh vi rườ Đại h Y Dược Cầ T ơ, thỏa tiêu chí ch n mẫu, sau khi được cung cấp đầ đủ thông tin về nghiên cứu, b â đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ được lấy các thông tin về đặ đ ểm dân số h c vào “Phiếu thu thập thông tin b nh nhân” (phụ lục 1)

- Các kết quả cận lâm sàng củ đố ượng nghiên cứu sẽ được thu thập

và p và “P ếu thu thập kết quả cậ lâ à ” (p ụ lục 2) dựa trên các kết quả xét nghi m và kết quả chẩ đ á ì ảnh bằng X - quang trong

b nh án cuả đố ượng nghiên cứu

2.2.5.2 Phương tiện nghiên cứu

- Trang thiết bị, hóa chất và vậ ư êu ần thiết:

Hình 2.1: H thống máy real - time SaCycler - 96TM (1) và Máy quang

p ổ B dr p D O (2)

+ P pe e đ ều chỉ được thể tích (micropipette), á đỡ ố ,

ù ứ ấ ả …

+ Bộ uố ử á ế D A, bộ uố ử real - time PCR

+ Ố p l pr p le e vô rù 1,5 l, eppendorf, l nhựa vô trùng chứa mẫu đà , ống falcon 15 ml, đầu tip có l c vô trùng, bả ộ r p ò (á à , ă , ẩu r , í bả v ắ )

2.2.5.3 Quy trình kỹ thuật real - time PCR sử dụng trong nghiên cứu

Qu rì ỹ uậ ự real - time PCR bằ bộ

ử d Sacace B e l e u ấp, ồ á ỹ uậ lầ lượ ư u

(1) Thu nhận mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

â được hướng dẫn ngồi thẳ lư , í ậ âu để í ơ và lần rồi ho mạnh khạ đà r ười thu mẫu b nh phẩm có thể giúp b nh nhân khạc

đà bằng cách vỗ nhẹ và lư của b nh nhân

Dụng cụ chứa b nh phẩm: l nhựa vô trùng có nắp xoáy Trên dụng cụ chứa phải đượ dá ó đầ đủ và đú ô đú b nh nhân, ngày

và thờ đ ểm lấy b nh phẩm Thể tích: lấy khoảng 1 - 5 ml Kiểm tra số lượng

và chấ lượ đà , rá lẫ ước b t

* Vận chuyển mẫu: gử đến phòng xét nghi m càng sớm càng tốt

vì các tác nhân gây b nh ở đà ó ể bị vi h m c lấn át [2]

* Bảo quản mẫu: nếu ư thể gửi ngay thì mẫu b nh phẩm phả được

bảo quản ở nhi độ 2 - 8C ư ô quá 4 giờ tính từ lúc lấy mẫu [2]

(2) Xử lý mẫu đàm: Nếu b nh phẩ đặc cần làm lỏ đà bằng dung

dịch Acetein (N - acetyl - L - cysteine) ở tỷ l đà /du dịch = 5/1 và dùng máy khuấy vortex làm lỏ đà [2]

Nguyên tắc của xử lý mẫu đà là là uần nhất và loại trừ tạp nhiễm các mẫu đà bằng dung dịch có chứa N - acetyl - L - cysteine và NaOH Sau khi trung hoà bằ đ m phosphate, vi khuẩn có trong mẫu đà ẽ được tập trung trong cặn nhờ kỹ thuật ly tâm

Xử lý mẫu đà bằng bộ xét nghi m IVD NK SPUTAprep – LJ do công

ty Nam Khoa (Vi t Nam) sản xuất và cung cấp, với các thành phần:

+ Mucoprep (NaOH 0,5M và Na3 Citrate) 50 ml x 3 ống

+ NALC (N - Acetyl - L - Cysteine) 50 mg x 15 ống + Đ m PO4 10X (dung dịch PO4 10X 0,67M) 5 ml x 3 ống

Các thành phầ à được bảo quản ở nhi độ 2 - 8oC

- Chuẩn bị hoá chất:

+ Hoà tan Mucoprep và NALC theo tỷ l 01 ống Mucoprep + 05 ống

A C, u được 50 ml dung dịch Mucoprep - NALC và đủ dùng cho 10 mẫu

đà , lưu ý ỗn dịch sau khi pha xong chỉ dùng trong ngày

+ Pha dung dịch Phosphate buffer 1X bằng cách cho 5 ml Phosphate buffer 10X vào 1 tube 50 ml rồ ê 45 l ước cất, dung dịch này có thể giữ ở nhi độ phòng xét nghi m trong vài tháng

Loại bỏ phầ ước nổi, giữ lại khoả 0,5 l để tách chiết DNA

(3) Kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu đàm

Tách DNA từ mẫu đà bằng hoá chất từ bộ thuốc thử DNA/RNA Prep

do Sacace Biotechnologies (Ý) cung cấp, dùng riêng để tách chiết DNA theo

Bướ 2 C uẩ bị đủ ố lượ ube 1,5 l ầ dù

Bướ 3: Thêm 300 µl du dị l ả và ỗ ube

Bướ 4: Thêm 100 µl ẫu (đ ử lý) và ube ươ ứ

Bướ 5: C uẩ bị ẫu ứ

- Đố ứ â á ế ê 100 µl ứ â vào tube dán nhãn

Cneg

- Đố ứ dươ á ế ê 90 µl ứ â và 10 µl ứ

dươ vào tube dán nhãn Cpos

Bướ 6: Vortex ube ứ ẫu và ủ ở 65°C trong 5 phút

Bướ 7: Thêm 400 µl du dị là ạ và v r e â ấ ả

á ube ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ẩ ậ l ạ bỏ dị ổ rá ả

ưở đế ặ ử dụ p ó l và p ữ á ẫu

Bướ 8: Thêm 500 µl du dị rử ố 3 và ỗ ube V r e ạ và

ly tâm 13.000 vòng trong 60 giây, ẩ ậ l ạ bỏ dị ổ rá ả ưở

đế ặ ử dụ p ó l và p ữ á ẫu

Bướ 9: Thêm 200 µl du dị rử ố 4 và ỗ ube V r e ạ và

ly tâm 13.000 vòng trong 60 giây, ẩ ậ l ạ bỏ dị ổ rá ả ưở

Bướ 12: â á ube ở 13.000 vòng trong 60 giây

Bướ 13: Dị ổ ứ D A (đạ êu ầu về độ ạ ) ẵ à real - time PCR Bả quả ẫu ố đ ả 5 à ở 2 - 8°C ặ ó ể rữ đô ẫu ở - 20 đế - 80°C

* Lưu ý: để á đị D A đạ độ ạ ầ ế ô , ử

dụ á qu p ổ để đ OD ủ du dị ứ D A u á ế

ạ 2 bướ ó 260 và 280 , du dị ứ DNA đượ đá á là tinh ạ OD 260 nm/OD 280 nm ằ r ả 1,8 ± 0,1 [52]

(4) Tiến hành kỹ thuật real - time PCR

Nguyên lý xét nghiệm của bộ kit M pneumoniae/C pneumoniae

Real - TM

Bộ uố ử M pneumoniae/C pneumoniae Real - T dự rê hai

quy trình chính: DNA đượ á ế ừ ẫu và uế đạ bằ p ả ứ

real - time PCR vớ pr be ắ uỳ qu đặ u M pneumoniae, C pneumoniae, vớ vù e ụ êu: M pneumoniae: putative lipoprotein; C pneumoniae: ompA và đố ứ ộ ạ (Internal Control - IC)

X p á C ộ ạ ủ đ ạ DNA bộ e ườ đượ á

ế ừ ẫu và C e ư là đố ứ uế đạ ừ ẫu r ê b đượ ử lý và để á đị ả ă ứ ế p ả ứ C đượ p á rê

Kênh Joe/Yellow

Kênh Rox/Orange

Giải thích

NCE Tá ế Âm tính Âm tính Âm tính ợp l NCA K uế đạ Âm tính Âm tính Âm tính ợp l Pos C+ K uế đạ Dươ í Dươ í Dươ í ợp l

ROX và nhỏ ơ á rị ưỡng chu kỳ (Ct ≤ 33)

- Mẫu âm tính với M pneumoniae DNA và C pneumoniae DNA nếu

giá trị C rê ê FA /ROX ô á định (không xuất hi n) và giá trị Ct trên kênh HEX/JOE nhỏ ơ á rị ưỡng (Ct ≤ 33)

- Mẫu không hợp l khi giá trị C ô đượ á định (vắng mặt) trên kênh FAM và ROX và giá trị C r ê EX/JOE ô đượ á định

hoặc lớ ơ á rị C ưỡng chu kỳ (Ct > 33)

trên kênh JOE (Yellow)/HEX/Cy3.

2.2.6 Phương pháp kiểm soát sai số

2.2.6.1 Kiểm soát sai lệch chọn lựa

Sai l ch ch n lựa trong nghiên cứu à được kiểm soát dựa vào tiêu chuẩn ch n mẫu và tiêu chuẩn loại trừ trong nghiên cứu

2.2.6.2 Kiểm soát sai lệch thông tin

Sai l ô ường do sai l ch từ hai nguồn là sai l ch thông tin

từ ười b và ườ đá á ặc ghi nhận thông tin Phiếu thu thập thông tin b â được thiết kế đú với mục tiêu nghiên cứu, cách dùng từ