Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

ĐẶT VẤN ĐỀTế bào gốc là một lĩnh vực công nghệ đang dần chiếm lĩnh vị trí dẫnđầu trong lĩnh vực y sinh học cả về nghiên cứu lẫn ứng dụng trên thế giới.Hiện tại và tương lai, tế bào gốc s

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN MINH PHƯƠNG

PHÂN LẬP, NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêngtôi Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa từng công bốtrong bất cứ công trình nào khác.

Tác giả :

Nguyễn Minh Phương

Trang phụ bìa

Mục lục

Các chữ viết tắt

Danh mục bảng và đồ thị

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC 5

1.1.1 Ngoài nước 5

1.1.2 Trong nước 8

1.2 MÔ MỠ 8

1.2.1 Cấu tạo 8

1.2.2 Chức năng 10

1.2.3 Phân loại 11

1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 11

1.3.1 Định nghĩa về tế bào gốc 11

1.3.2 Phân loại tế bào gốc 13

1.3.3 Tế bào gốc trung mô 14

1.4 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 19

1.4.1 Giới thiệu chung 19

1.4.2 Marker bề mặt của tế bào gốc trung mô 20

1.5 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO 24

1.5.1 Nuôi cấy sơ cấp 24

1.5.2 Nuôi cấy thứ cấp 25

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO 26

1.6.1 Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 26

1.6.2 Kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) 27

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1.THIẾT KẾ THÍ NGHỆM 28

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

2.3 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU 28

2.4 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ 28

2.5 VẬT LIỆU 28

2.5.1 Dụng cụ - thiết bị 28

2.5.2 Hóa chất thí nghiệm 32

2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.6.1 Phương pháp thu nhận mỡ 39

2.6.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ 39

2.6.3 Phương pháp xác định tế bào gốc trung mô 42

2.6.3.1 Dựa vào khả năng bám dính 42

2.6.3.2 Dựa vào marker bề mặt 43

2.6.3.3 Dựa vào khả năng biệt hóa in vitro 46

Chương 3 KẾT QUẢ 51

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY 51

3.1.2 Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào 52

3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 54

3.2.1 Đặc điểm bám dính của tế bào 55

3.2.2 Kết quả sự biểu hiện marker bề mặt 57

3.2.3 Kết quả biệt hóa in vitro 62

3.2.3.1 Kết quả biệt hóa thành tế bào mỡ 62

3.2.3.2 Kết quả biệt hóa thành tế bào xương 65

3.2.3.3 Kết quả biệt hóa thành tế bào sụn 67

Chương 4 BÀN LUẬN 68

4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY 68

4.2 ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 68

4.2.1 Khả năng bám dính của tế bào 68

4.2.2 Kết quả sự biểu hiện marker bề mặt 70

4.2.3 Kết quả biệt hóa in vitro 71

4.2.3.1 Kết quả biệt hóa thành tế bào mỡ 71

4.2.3.2 Kết quả biệt hóa thành tế bào xương 72

4.2.3.3 Kết quả biệt hóa thành tế bào sụn 74

KẾT LUẬN 75

KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

PHỤ LỤC

Chữ viết tắt Thuật ngữ Tiếng việt

ADSC Adipose Derived Stem Cells Tế bào gốc thu nhận

từ mô mỡ

AP Alkaline Phosphatase Phosphatase kiềm

BM- MSC Bone Marrow – Mesenchymal Stem

Cell

Tế bào gốc trung môthu nhận từ tủy xươngBMPC Bone Marrow Progenitor Cell Tế bào tiền thân tủy

xươngBMSC Bone Marrow Stromal Cell Tế bào nền tủy xương

cAMP Cyclic adenosine monophosphate AMP vòng

CD Cluster of differentiation Cụm tế bào biệt hóa

DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s

Medium

Môi trường DMEM

ECM Extra Cellular Matrix Chất nền ngoại bào

EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid

thểFBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai

bòHEPES 4-(2-hydroxyelthyl)-1-piperazine-

ethanesulfonic acid

cầu ngườiHSC Hematopoietic Stem Cell Tế bào gốc tạo máu

IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s

cảm ứngISCT The International Society for

Cellular Therapy

Hiệp Hội Quốc Tế choLiệu Pháp Tế BàoKGF Keratinocyte Growth Factor

KTBH Kích thích biệt hóa

chất béoMPC Mesenchymal Progenitor Cell Tế bào tiền thân trung

môMSC Mesenchymal Stem Cell Tế bào gốc trung mô

PBS Phosphate Buffer Solution Dung dịch đệm

phosphatePLA Processed lipoaspirate Tế bào từ mỡ hút được

xử lý

RT – PCR Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng sao chépngược chuỗi polymerSEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử

quét

Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 30 Bảng 2.3: Các kháng nguyên bề mặt cần xác định đối với MSC 45 Bảng 3.1 Thống kê mật độ tế bào thu đƣợc trên các mẫu mô đã tiến hành

Hình 1.1 Cấu tạo của tế bào mỡ 9

Hình 1.2 Một số vị trí tích trữ mô mỡ phổ biến trong cơ thể 10

Hình 1.3 Tiềm năng biệt hóa của MSC thu nhận từ mô mỡ 24

Hình 1.4 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu và các vùng của buồng đếm 26

Hình 2.1 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 31

Hình 2.2 Một số dụng cụ dùng trong nghiên cứu 32

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, nuôi cấy và định danh MSC từ mô mỡ 38

Hình 3.1A Hình ảnh phân lập mẫu mô mỡ 51

Hình 3.1B Hình ảnh phân lập mẫu mô mỡ 51

Hình 3.2 Tế bào gốc sau 2 ngày nuôi cấy trong chai nuôi 55

Hình 3.3 Tế bào gốc sau 3 ngày nuôi cấy trong chai nuôi 56

Hình 3.4 Tế bào gốc sau 7 ngày nuôi cấy trong chai nuôi 56

Hình 3.5 Kết quả phân tích sự biểu hiện các marker của tế bào mẫu số 1 58

Hình 3.6 Kết quả phân tích sự biểu hiện các marker của tế bào mẫu số 2 59

Hình 3.7 Kết quả phân tích sự biểu hiện các marker của tế bào mẫu số 3 60

Hình 3.8 Tế bào gốc được biệt hóa và nhuộm trong đĩa nuôi 24 giếng 62

Hình 3.9 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào mỡ 63

Hình 3.10 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào mỡ nhuộm Oil Red 64

Hình 3.11 Tế bào gốc tích tụ nhiều giọt mỡ bên trong tế bào chất 65

Hình 3.12 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào xương 66

Hình 3.13 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào sụn 67

của tác giả Nguyễn Thị Thanh Giang và cộng sự 69

Hình 4.2 Tế bào gốc có hình thái nguyên bào sợi giống tế bào gốc trung mô

của Koller M.R và cộng sự 69

Hình 4.3 Tế bào gốc có hình thái nguyên bào sợi giống tế bào gốc trung mô

của tác giả Huỳnh Minh Hằng 70

Hình 4.4 TBG trung mô từ mô mỡ được KTBH thành tế bào mỡ của nhóm

tác giả thuộc phòng thí nghiệm Collas (Collaslab)-Oslo, Norway 72

Hình 4.5 TBG trung mô từ mô mỡ được KTBH thành tế bào xương theo quy

trình của nhà sản xuất StemPro® Osteogenesis differentiation Kit 73

Hình 4.6 TBG trung mô từ mô mỡ được KTBH thành tế bào xương nhuộm

AR của tác giả Sarah EB Taylor và cộng sự 73

Hình 4.7 TBG trung mô từ mô mỡ được KTBH thành tế bào xương nhuộm

AR của tác giả Koji Harada và cộng sự 74

Hình 4.8 TBG trung mô từ mô mỡ được KTBH thành tế bào sụn theo quy

trình của nhà sản xuất StemPro® Chondrogenesis differentiation Kit 74

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào gốc là một lĩnh vực công nghệ đang dần chiếm lĩnh vị trí dẫnđầu trong lĩnh vực y sinh học cả về nghiên cứu lẫn ứng dụng trên thế giới.Hiện tại và tương lai, tế bào gốc sẽ đem lại niềm hy vọng lớn cho nhiều cănbệnh hiểm nghèo như mất trí nhớ (Azheimer), ung thư máu, liệt rung(Parkinson), dị tật tim, tiểu đường, bệnh thiểu năng miễn dịch di truyền và cảtrong lĩnh vực thẩm mỹ…

Tế bào gốc nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng với khả năng

tăng sinh in vitro và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau của

cơ thể đã mở ra một tương lai tươi sáng cho các liệu pháp tế bào Tế bào gốcphôi, tế bào toàn năng, có ưu thế vượt trội nhưng lại bị hạn chế nghiên cứu vàứng dụng do những vấn đề liên quan tới đạo đức y học Vì thế, các nhà khoahọc phải chuyển hướng nghiên cứu sang tế bào gốc từ cá thể trưởng thành Tếbào gốc trung mô là một nguồn tế bào rất tiềm năng nhờ vào nguồn mẫu dồidào, khả năng biệt hóa cao và dễ thực hiện các ca điều trị ghép tự thân Tủyxương, một nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô dồi dào, đã được ứng dụngrộng rãi trong y học Tuy nhiên, việc thu nhận tủy rất khó khăn, gây đau đớn

và ảnh hưởng đến sức khỏe của người bị lấy tủy Ngoài ra, tế bào gốc trung

mô cũng đã được khai thác từ những nguồn mô khác như máu cuống rốn, máungoại vi… [7]

Gần đây, mô mỡ đã gây được nhiều sự chú ý như là một nguồn tế bàogốc trung mô dồi dào, nhiều nghiên cứu còn khẳng định nó có triển vọng hơntủy xương rất nhiều, vì đây là loại mô có các đặc điểm thuận lợi khi tiến hànhthu nhận, nghiên cứu và ứng dụng:

 Thứ nhất, việc thu nhận mô mỡ là đơn giản, ít xâm lấn nên ít gâyđau đớn cho bệnh nhân so với việc thu nhận tủy xương.

 Thứ hai, mô mỡ có chứa các tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội

mô, nguyên bào sợi … và đặc biệt là các tế bào gốc trung mô (MSC)

Các MSC này dễ dàng phân lập, nuôi cấy và tăng sinh in vitro và có thể

cảm ứng biệt hóa thành các tế bào của các dòng tế bào khác

 Thứ ba, mô mỡ chứa các MSC với tỉ lệ khá cao, mỗi gam mô mỡchứa 105

Một trong những xu hướng phát triển rất mạnh trong những năm gầnđây là ghép mô mỡ ứng dụng trong lĩnh vực phẫu thuật thẩm mỹ Tuy nhiên,công việc này đòi hỏi cần phải thu nhận một lượng tế bào mỡ (mô mỡ) khálớn từ chính bệnh nhân Đây là một công việc hết sức khó khăn, làm hạn chếkhả năng ứng dụng của nguồn mô này

Để khắc phục tình trạng trên, người ta hướng đến việc sử dụng TBG thu

từ mô mỡ Phân lập, nuôi cấy trong điều kiện in vitro để tăng số lượng tế bào

phù hợp và ghép trở lại cho chính bệnh nhân TBG thu từ mô mỡ là nguồn tế

bào rất dồi dào, dễ thu nhận và ít ảnh hưởng về mặt đạo lý khi nghiên cứu vàứng dụng Tế bào mỡ, tế bào tiền thân tạo mỡ và TBG thu nhận từ mô mỡ cóứng dụng rất lớn trong lĩnh vực phẫu thuật thẩm mỹ dùng để tái tạo mô theonhu cầu bệnh nhân hay những ứng dụng chữa bệnh khác.

Từ những nhu cầu thực tế trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, nuôi cấy

tế bào gốc trung mô từ mô mỡ” được thực hiện tại bộ môn Mô Phôi trường

Đại Học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh để có thể sử dụng các MSC cho cácnghiên cứu tiếp theo và triển khai ứng dụng trong các liệu pháp tế bào, y họctái tạo và công nghệ mô

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Thực hiện quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người

2 Định danh tế bào gốc trung mô dựa trên 3 đặc điểm:

- Khả năng bám dính

- Sự biểu hiện của các marker bề mặt tế bào

- Tiềm năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1.1 Ngoài nước:

Năm 1964, Rodbell thực hiện công trình nghiên cứu đầu tiên có liênquan đến tế bào tiền thân từ mô mỡ, khi tiến hành nghiên cứu trên loài gặmnhấm [75]

Trong năm 1977, Van và Roncari báo cáo mô mỡ ở chuột trưởng thành

có chứa những tế bào có khả năng tăng trưởng và có những đặc điểm hình tháitương tự các tế bào mỡ [84]

Đến năm 2001, Patricia A Zuk đã đăng bài báo trên tạp chí Tissue Engineering, là nhóm nghiên cứu đầu tiên thu nhận các tế bào gốc trưởng

thành từ dịch hút mô mỡ, đây là những tế bào gốc đa tiềm năng được phân lập

từ phân đoạn chất nền – mạch máu từ mô mỡ [94]

Từ đây, các ADSC từ mô mỡ trở thành đối tượng được nhiều nhà khoahọc, các nhà y học tái tạo quan tâm nghiên cứu Hàng loạt các nghiên cứu, cácbài báo đăng tải các kết quả nghiên cứu về quy trình phân lập tế bào [28], đặcđiểm tế bào và khả năng biệt hóa của các ADSC như biệt hóa thành tế bào mỡ[54], [85]; tế bào xương [62], [66]; khả năng biệt hóa thành tế bào sụn [50],[55], [69]; biệt hóa thành tế bào cơ và dòng tế bào thần kinh [24]

Năm 2002, Patrick CW và Cộng sự (CS) đã thực hiện nghiên cứu nuôicác tế bào tiền thân tạo mỡ từ chuột trên giá thể PLGA, sau đó ghép lại trênchuột thực nghiệm và theo dõi kết quả trong thời gian 1-12 tháng Kết quả cho

thấy có thể tái tạo mô mỡ trong điều kiện in vivo [74].

Năm 2003, Lee và cộng sự đã thu nhận các tế bào gốc từ mô mỡ chuộtLewis, sau đó cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xương và tế bào mỡ Đây là

nhóm nghiên cứu đầu tiên báo cáo kết quả về khả năng tạo mô mỡ và mô

xương in vivo từ tế bào gốc mô mỡ Đây là chìa khóa cho các ứng dụng kỹ

nghệ mô mỡ và mô xương trong tương lai [61]

Năm 2007, Niemela và cộng sự đã thu nhận tế bào gốc từ mô mỡ, đánh

giá khả năng biệt hóa in vitro và in vivo của các tế bào gốc này Nhóm nghiên

cứu kết luận tế bào gốc từ mô mỡ ứng dụng trong kỹ nghệ mô là rất tiềm năng[72]

Năm 2008, Zhang và cộng sự đã ly trích các tế bào gốc từ mô mỡ người

từ dịch hút mỡ Sau đó nuôi cấy, trộn chung với khung nâng đỡ là gel fibrindạng tiêm và sau đó ghép dưới da ở chuột BALB/C Kết quả ghép cho thấymẫu ghép có thể tạo thành mô mỡ trưởng thành [89] Cùng năm 2008, Zhang

và cộng sự cũng tiến hành thu nhận và nuôi cấy các tế bào tiền thân từ mô mỡngười từ dịch hút mỡ Sau đó, nuôi các tế bào này trên khung nâng đỡcollagen type I Khung nâng đỡ có mang các tế bào gốc này sau đó được ghéplại trên da lưng chuột nude Kết quả nghiên cứu cho thấy, các tế bào này cóthể nuôi được trên khung nâng đỡ collagen và biệt hóa hoàn toàn thành mô

mỡ in vivo trên mô hình động vật [91].

Cũng trong năm 2008, Andrew và cộng sự đã công bố việc sử dụng cáctấm trung bì da vô bào làm khung nâng đỡ cho các ADSC dùng trong khuyếthổng mô mềm do tổn thương da ở chuột Kết quả cho thấy các ADSC sống sótsau khi ghép vào trong cơ thể, tự biệt hóa thành các tế bào nội mô mạch, cácnguyên bào sợi, các dòng biểu mô và cải thiện đáng kể tiến trình lành hóa vếtthương [17]

Năm 2009, Kang và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu đánh giácấu trúc và chức năng của mô hình đồng nuôi cấy 3D Nhóm nghiên cứu tiếnhành nuôi cấy các ADSC và tế bào nội mô trên khung nâng đỡ từ sợi tơkhoảng 2 tuần Kết quả cho thấy có khả năng tạo ra được mô mỡ từ kỹ nghệ

mô in vitro với các đặc điểm của tế bào mỡ trưởng thành từ quá trình biệt hóa

của các ADSC và xuất hiện các cấu trúc giống mạch máu từ tế bào nội mô.Thành công của nghiên cứu này mở ra một triển vọng ứng dụng vô cùng lớncủa kỹ nghệ mô, nhằm khắc phục tình trạng không tạo được mạch máu nuôicho các loại mô được tạo ra từ kỹ nghệ mô [54]

Năm 2012, Handel và cộng sự đã nghiên cứu tạo ra mô mỡ từ kỹ nghệ

mô với sự kết hợp của ADSC từ mô mỡ và khung nâng đỡ để tái tạo mô mềm.Nhóm nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại khung nâng đỡ khác nhau như là sợipolypropylene, các vi hạt alginat để mang các ADSC Kết quả giúp cải thiện

sự tồn tại trong thời gian dài khi tái tạo mô mỡ, đặc biệt là trong các khuyếthổng mô mềm lớn, hỗ trợ sự gắn kết của tế bào với khung nâng đỡ và có thểtạo hình riêng biệt theo từng trường hợp và cảm ứng biệt hóa trực tiếp cácADSC thành các tế bào mỡ tại vị trí ghép [42]

Vào tháng 01 năm 2013, tạp chí Biomaterials đã đăng bài có liên quan

đến tế bào gốc từ mô mỡ đến từ nhóm nghiên cứu của Declercq Trong nghiêncứu này, các ADSC từ mô mỡ được chuyển lên các vi màng mang tế bào đểtạo ra các tấm mô lớn (macrotissues) từ sự kết dính của các vi màng để tạo ramảnh ghép xương Kết quả cho thấy, có thể tạo ra mảnh ghép xương chấtlượng cao (2 cm3) theo chiều dày bằng sự kết hợp của vi màng mang cácADSC từ mô mỡ [24]

Tháng 11 năm 2015, một nghiên cứu được đăng trên tạp chí Aesthet Surg J của Meyer J và cộng sự, đã nghiên cứu phân lập và biệt hóa các tế bào

gốc trung mô của người từ dịch hút mỡ và từ đó áp dụng thành công vào thủthuật ghép mỡ tự thân [70]

1.1.2 Trong nước

Ở Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu có liên quan đến tế bàogốc thu nhận từ mô mỡ chuột, từ mô mỡ người để phục vụ nghiên cứu và ứngdụng lâm sàng nhằm tái tạo các khuyết hổng liên quan đến mô mềm, tái tạocấu trúc mô, phẫu thuật thẩm mỹ hoặc bù đắp các khuyết hổng do chấnthương nhưng chưa nhiều

Hiện tại thì lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng mô mỡ và tế bào gốc thunhận từ mô mỡ nhiều nhất liên quan đến ngành phẫu thuật thẩm mỹ Cáchướng ứng dụng tập trung chủ yếu vào việc chọc hút mô mỡ và ghép lại tựthân cho người bệnh vì nhu cầu làm đẹp là chủ yếu

Việc ứng dụng tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ để điều trị các khuyếthổng mô mềm, tái tạo chức năng mô, điều trị bỏng sâu hoặc mất mô mềm dochấn thương thì chưa có một công trình khoa học hay bài báo nghiên cứuđược đăng trong nước mặc dù có rất nhiều thông tin có liên quan đến việcđiều trị từ tế bào gốc mô mỡ trong các bệnh lý về xương khớp …

1.2 MÔ MỠ

1.2.1 Cấu tạo:

Mô mỡ là mô liên kết mềm, trong đó các tế bào mỡ chiếm phần lớn thểtích mô Trong mô, các tế bào mỡ được giữ ở những vị trí cố định nhờ mạnglưới sợi collagen và dây thần kinh Mô mỡ không chỉ có tế bào mỡ mà nó cònchứa nhiều loại tế bào khác tìm thấy trong phân đoạn mạch nền, bao gồm đạithực bào, nguyên bào sợi, tế bào ngoại mạch,tế bào máu, tế bào nội mô, tiềnbào mỡ, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ [7]

Tỷ lệ số lượng tế bào của mô mỡ như sau: tế bào mỡ trưởng thànhchiếm 16%; tế bào nền từ mô mỡ chiếm 30%; tế bào nội mô chiếm 15%;

những tế bào khác (ví dụ: nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn…) chiếm 30%; và tếbào máu (chỉ tính bạch cầu không tính hồng cầu) 9 % [53].

Quá trình biệt hóa tạo tế bào mỡ gồm nhiều giai đoạn khác nhau Đầutiên, tế bào gốc trung mô tăng sinh và biệt hóa thành tiền tế bào mỡ Tiền tếbào mỡ tiếp tục tăng sinh, trải qua giai đoạn biệt hóa tiếp theo và bắt đầu tíchlũy những giọt lipid nhỏ, những giọt lipid này dung hợp với nhau để tạo thànhgiọt lipid lớn, giai đoạn này gọi là tế bào mỡ trưởng thành

Hình 1.1 Cấu tạo của tế bào mỡ [96]

Dạng hình cầu đặc trưng của tế bào mỡ có sự biến đổi rất lớn về kíchthước (đường kính từ 20 µm đến 200 µm, với thể tích khác nhau từ vài pL tớixấp xỉ 3 nL) Những giọt chất béo chứa hỗn hợp chất béo trung tính,triglyceride, acid béo, phospholipid và cholesterol Khoảng 95% thành phầnlipid được lưu trữ là triacylglycerol và số còn lại là diacylglycerol,phospholipid, acid béo không ester hóa và cholesterol Những nghiên cứuđồng vị phóng xạ cho thấy lipid liên tục được tổng hợp và thay thế, ngay cảtrong những cá thể có sự cân bằng năng lượng Sự ester hóa acid béo và thủyphân triglyceride diễn ra liên tục Chu kỳ thay thế lipid ở chuột là 8 ngày,nghĩa là khoảng 10 % acid béo lưu trữ trong tế bào mỡ được thay thế hàng

ngày Mỡ được phân tách khỏi tế bào chất bởi một màng mỏng tạo thành dạnggiọt Tế bào mỡ có khả năng thay đổi đường kính 20 lần và thể tích vài nghìnlần để thích ứng với sự tăng lên của lượng lipid Sự hình thành những tế bào

mỡ mới từ tiền bào mỡ xảy ra khi các tế bào mỡ có trước không thể tích lũythêm lipid được nữa (ở người, mỗi tế bào tích lũy trung bình 1000pL) [79]

1.2.2 Chức năng

Mô mỡ chủ yếu nằm dưới da và bao quanh các nội quan Các chức năng

dễ nhận thấy của nó là dữ trữ năng lượng, cách nhiệt và tạo thành một lớpđệm bảo vệ các cơ quan Ngoài ra mô mỡ còn có các chức năng rất quan trọngtrong cơ thể như điều hòa sự tăng trưởng, apoptosis, chứng viêm, sự hìnhthành mạch, huyết áp, xơ vữa động mạch, sự phá hủy fibrin, miễn dịch…

Hình 1.2 Một số vị trí tích trữ mô mỡ phổ biến trong cơ thể [97]

Chức năng đa dạng của mô mỡ là nhờ vào khả năng tổng hợp và tiết ramột lượng lớn enzyme, hormone, nhân tố tăng trưởng, cytokine, bổ thể… Bêncạnh đó, nó còn biểu hiện các receptor cho hầu hết những nhân tố này, chophép đáp ứng với những kích thích bên trong và bên ngoài ở cả mức độ cơ

quan và toàn cơ thể Mô mỡ thực hiện chức năng như một cơ quan nội tiếtquan trọng, bởi nó sản xuất một số hormone: Adiponectin, Resistin,Angiotensin, Plasminogen activator inhibitor – 1 (PAI – 1), TNFα, IL – 6,Leptin, Estradiol (E2) [7].

Mô mỡ trắng được tìm thấy ở động vật có vú Ở người, mô mỡ trắngchiếm khoảng 20% trọng lượng cơ thể (ở nam) và 25% (ở nữ) Tế bào mỡtrưởng thành của WAT là giọt lipid lớn và rất ít tế bào chất, với nhân nằm ởrìa tế bào, mô mỡ trắng chứa một không bào lớn, ít ti thể Mô mỡ trắng có bachức năng: cách nhiệt, đệm cơ học, và quan trọng nhất – đó là một nguồnnăng lượng cho cơ thể

1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

1.3.1 Định nghĩa tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong môsống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận

sinh lí Trong điều kiện in vivo hay in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới

với các tính năng riêng biệt mới Chẳng hạn, các tế bào gốc tủy xương hoàntoàn chưa được chuyên hóa, chúng có thể biệt hóa thành các tế bào máuchuyên hóa (chẳng hạn tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu…) và những kiểu tế

bào mới này có các chức năng chuyên biệt như khả năng sản xuất kháng thể,vận chuyển các chất khí… mà trước đó tế bào gốc không hề có Do đó, mộtkiểu tế bào xuất thân có nguồn gốc từ một tế bào khác, thì các tế bào khác đócũng có thể được gọi là “tế bào gốc”.

Hầu hết mọi quá trình sửa chữa mô trong động vật có vú là các sự kiệnđộc lập, nhằm khử biệt hóa (hay biệt hóa ngược), bởi đã có sự hoạt hóa củacác tế bào gốc tiền thân trước đó Theo định nghĩa thì tế bào tiền thân là mộtdạng trung gian giữa tế bào gốc và tế bào biệt hóa Tuy nhiên, một số động vật

có xương sống có thể tái sinh các phần cơ thể bị mất thông qua sự khử biệthóa các tế bào đã chuyên hóa, thành các tế bào tiền thân (tế bào cơ chất).Những tế bào được khử biệt hóa này, sau đó sẽ tăng sinh và hình thành các tếbào chuyên hóa mới của cơ quan tái sinh Một số động vật không xương sống

như Planarian flatworm và thủy tức có thể tái sinh mô nhanh và chính xác.

Với một định nghĩa nghiêm khắc nhất, một tế bào gốc đòi hỏi ít nhấtphải có hai đặc điểm dưới đây:

- Tính tự làm mới: tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn

chu kỳ phân bào nguyên nhiễm mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa

- Tính tiềm năng không giới hạn: tế bào đó có khả năng biệt hóa thành

bất kỳ kiểu tế bào trưởng thành nào Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng vớicác tế bào gốc toàn năng hoặc vạn năng, tuy nhiên, một tế bào gốc đa năng(hay tế bào tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là tế bào gốc

Những đặc tính nói trên có thể được chứng minh in vitro bằng cách sử

dụng các phương pháp đặc thù nhất định, chẳng hạn như phương pháp tạo

dòng Tuy nhiên, cần lưu ý rằng, chính các điều kiện nuôi cấy in vitro cũng có thể làm thay đổi đặc tính của tế bào, khiến nó sẽ “cư xử” theo cách tương tự in vivo.

Một cách khái quát, các định nghĩa về tế bào gốc nói trên chủ yếu dựavào sự biểu hiện các tính trạng hoạt động của tế bào, không chú trọng các đặcthù phân tử.

Bởi được quan tâm ở khía cạnh ứng dụng trong lĩnh vực y sinh nhiềuhơn, do vậy Hội nghị Quốc tế đầu tiên về Tế bào gốc (đã diễn ra từ ngày 28đến 30/10/2003 tại Singapore) đã phát biểu đại ý: “Điểm đặc biệt nhất ở tếbào gốc là chúng không được lập chương trình từ trước và do vậy chúng cókhả năng phát triển thành bất kì loại tế bào trưởng thành nào mà một cơ thểcần… Mục đích cuối cùng của việc nghiên cứu tế bào gốc là đem lại hi vọngcho những người không may mắc phải các chứng bệnh nan y…” [8]

1.3.2 Phân loại tế bào gốc

Với các tác giả khác nhau, có thể có những cách phân loại khác nhau.Vào thời điểm năm 2005 trở về trước, người ta thường chia tế bào gốc thànhhai dạng cơ bản: tế bào gốc phôi (phân lập từ phôi) và tế bào gốc trưởng thành(gồm các tế bào gốc của cơ thể trưởng thành và các nhũ nhi) Nhưng trong cácnăm 2005- 2007, nhiều tác giả đã chính thức thừa nhận loại tế bào gốc nhũ nhi

là một nhóm riêng biệt Mặc dù không phải là tế bào gốc phôi, nhưng rõ ràng

về giải phẫu học, các tế bào gốc nhũ nhi không được khai thác trong một cơthể trưởng thành Hơn nữa, tiềm năng “gốc” của chúng cũng lớn hơn các tếbào gốc trưởng thành, chưa kể các kỹ thuật thu nhận, thao tác chúng cũng cóđiểm khác biệt Một số tác giả khác lại chia tế bào gốc thành bốn loại, baogồm: tế bào gốc phôi, tế bào gốc thai, tế bào gốc cuống rốn và tế bào gốctrưởng thành

Nhưng vào tháng 1 năm 2008, sau khi kết quả các công trình củaShinya Yamanaka (Đại học Kyoto của Nhật) và James Thompson (Đại họcWisconsin của Mĩ) được công bố chính thức, cũng như thuyết tế bào gốc ungthư được nhiều nghiên cứu thẩm định, các tác giả của cuốn sách này tiếp tục

phát triển và đề nghị một cách phân loại khác - chia tế bào gốc thành nămnhóm chính:

- Tế bào gốc phôi (thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ- Blastocyst)

- Tế bào gốc nhũ nhi (thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn,nhau thai, dịch ối, màng lót dây rốn…)

- Tế bào gốc trưởng thành (thu nhận từ cơ thể trưởng thành )

- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể tạm hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo hay tế bào gốc nhân tạo, chúng có tiềm năng như là các tế bào gốc phôi (loại tế bào gốc đã được tạo ra do có sự thao tác in vitro trên chính bộ gene đã

biệt hóa chức năng của chúng)

- Tế bào gốc ung thư được coi là nguồn gốc của khối u và chúng chỉ cótrong các khối u

Từ năm nhóm phân loại lớn nói trên, người ta có thể chia thành cácnhóm nhỏ hay nhóm phụ Một số nhà nghiên cứu nghĩ rằng, các tế bào gốctrưởng thành và thai nhi có thể cũng liên quan đến các tế bào gốc phôi Tương

tự, một vài tế bào gốc được quan sát trong cơ thể trưởng thành có thể mangđặc điểm “tàn dư” của tế bào gốc phôi, chúng được tạo ra để biệt hóa thànhcác cơ quan đang phát triển, hay được cất giữ tại những “ổ” tế bào gốc trong

cơ quan (nơi mà chúng sẽ được sử dụng cho việc sửa chữa khi mô bị tổnthương) Tất nhiên ngoại trừ các tế bào gốc ung thư, bởi chức năng của chúng

là tạo ra mô bệnh [8]

1.3.3 Tế bào gốc trung mô

- Khái niệm tế bào gốc trung mô:

Trong suốt thời kỳ phát triển phôi, những tế bào thuộc dòng trung mô(hay trung phôi bì) sẽ biệt hóa thành tất cả các tế bào của mô liên kết nhưxương, sụn, chất nền tủy xương, mô xơ ở khoảng giữa hai tổ chức, cơ vân,

những mô xơ dầy như gân và dây chằng, cũng như mô mỡ Với những độngvật có xương sống, trung mô chứa đựng những tế bào rời rạc, khác với những

tế bào biểu bì được kết nối một cách chặt chẽ theo hàng, bắt nguồn từ ngoại

bì Những tương tác mô (giữa trung mô biểu mô) rất quan trọng cho cả sựphát sinh xương, lẫn sự tạo thành hình dạng sọ mặt Nhằm hoàn tất quá trìnhphát sinh hình dạng trước khi sinh, nhóm tế bào trung mô dường như tiếp tục

cư trú trong nhiều mô khác nhau và đây là những nguồn có chứa đựng tế bàogốc trung mô trong cơ thể trưởng thành

Ở cơ thể người trưởng thành, vẫn còn nhiều tranh luận để có thể địnhnghĩa đúng cho một dạng tế bào tiền thân chung cho tất cả các thành phần của

mô liên kết Nói một cách rõ hơn, định nghĩa hiện tại về thành phần trung mô(như trung mô phôi) không thể tồn tại trong cơ thể người lớn Không nghi ngờ

gì nữa, các mô liên kết trưởng thành luôn chứa đựng nguồn những tế bào gốctiền thân, các tế bào này rất cần để tham gia vào việc duy trì hoạt tính sinh lícủa mô, chịu trách nhiệm về sự tái sinh mô khi có chấn thương hay bệnh lí

Nhiều thuật ngữ được đề nghị nhằm chỉ định cho tế bào gốc trung mô,bao gồm tế bào gốc trung mô (MSC), tế bào tiền thân trung mô, tế bào tiềnthân tủy xương, hay những tế bào nền tủy xương

Vào những năm 1970, tế bào gốc trung mô ngày nay lần đầu tiênchúng đã được xác định như là các tế bào giống nguyên bào sợi, chúng có khảnăng hình thành tập đoàn Nhiều báo cáo khoa học cho thấy tủy xương, mô

mỡ, nhú răng…đều chứa các tế bào không chỉ có khả năng làm mới mà chúngcòn có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác nhau: xương, mỡ, sụn,cơ…Hơn thế, gần đây, các tế bào gốc được thu nhận từ tủy xương có thể đượccảm ứng để biệt hóa thành các dòng tế bào không hề thuộc dòng tế bào trung

mô (như gan, thận, tim mạch và thần kinh…)

Các MSC ngày càng được xác định đã hiện diện ở nhiều loài, kể cả conngười Những hiểu biết về MSC ngày càng tăng, do vậy có thể khẳng địnhrằng, MSC đã và sẽ có những ứng dụng to lớn trong liệu pháp tế bào, cũngnhư nhiều công nghệ khác [8].

- Đặc điểm của tế bào gốc trung mô:

Một số marker được xác định để phân biệt MSC với các tế bào tạo máu

Ba marker đầu tiên là SH2, SH3 và SH4 cho thấy gắn vào các MSC, màkhông gắn vào các tế bào tạo máu Những nghiên cứu sau đó cho thấy, khángthể SH2 gắn vào endoglin, một receptor nhân tố phát triển chuyển dạng IIIthấy trên các mô trung mô và trên các tế bào nội mô và đại thực bào nhưngngười ta cho rằng marker này không chuyên biệt cho MSC Thêm vào đó, cáckháng thể SH3 và SH4 cho thấy sự gắn kết chuyên biệt với ecto - 5 -nucleotidase (CD73) Trong sự kết hợp SH2, SH3 và SH4 đươc sử dụng đểxác định đặc điểm của MSC người Các marker cho tế bào máu, như anti-CD31, anti-CD1 và anti-CD14 đã được sử dụng chọn lọc âm tính các tế bàotạo máu từ nuôi cấy MSC

Kháng thể STRO-1 rất tốt cho việc xác định, chọn lọc dương tính MSCtrong tủy xương STRO-1 được sử dụng để tách tế bào CFU-f từ tủy xương vàcác tế bào chọn lọc STRO-1 cũng biểu hiện phát triển thành xương, sụn, mỡ

và các tế bào hỗ trợ quá trình tạo máu Không như kháng thể khác, STRO-1

có thể sử dụng không chỉ để nhuộm và xác định đặc tính của MSC mà còn choqui trình tách tế bào bằng các hạt từ tính gắn kháng thể

Ngoài việc sử dụng các kháng thể để xác định các marker biểu hiện bềmặt, các tế bào gốc trung mô cũng được phát hiện dựa vào phương pháp RT-PCT thông qua việc khuyếch đại các mRNA phiên mã từ bộ gen đặc trưngcho kiểu tế bào

Số lượng tế bào MSC thay đổi phụ thuộc vào tuổi của từng cá thể.Trong phôi, các mô thuộc trung mô hình thành từ mật độ tương đối cao củacác tế bào tiền thân trong một chất nền ngoại bào đầy nước và lỏng lẻo Sựbiệt hóa từng mảnh của các nhóm tế bào tiền thân này tạo ra các tế bào chuyênbiệt và do đó, chúng hình thành nên các mô liên quan đến sự điều hòa dươngtính của quá trình tổng hợp các phức hợp và các chất nền ngoại bào chuyênbiệt mô Tỉ số giữa tế bào và chất nền đi từ cao đến thấp trong suốt quá trìnhbiệt hóa Tuy vậy, chất nền thêm vào gấp nhiều lần làm gia tăng kích thước tolớn của mô đang hình thành Trong quá trình này, nhiều tế bào tiền thân biệthóa trực tiếp thành các tế bào chuyên biệt và số lượng tế bào MSC sẽ tươngđối giảm đi trong phôi Tương tự, từ khi sinh ra đến thời niên thiếu, kíchthước cơ thể gia tăng nhiều lần, điều này phải liên quan đến hoạt động trựctiếp của một số MSC thành các kiểu hình khác nhau Đó là lí do tại sao sự tổnthương mô của một đứa trẻ dưới 5 tuổi, sự sửa chữa mô là do tái sinh vì sốlượng MSC tương đối cao; ở tuổi 20, tuy cùng mô nhưng chỉ có thể sửa chữavới mô xơ nhiều sợi Ở tuổi 50, người ta còn rất ít MSC cho việc sửa chữa môtổn thương.

Có 6 giai đoạn khác nhau tạo sự khác biệt về số lượng MSC Mỗi giaiđoạn đó, sự biểu hiện khả năng sửa chữa mô khác nhau Các thời kì khác nhau

đó là:

(1) Phôi, thụ tinh đến khi sinh(2) Trẻ sơ sinh đến 6 tuổi(3) Thiếu niên, 7 – 20 tuổi(4) Phát triển hoàn chỉnh bộ xương, 20-30 tuổi(5) Giữa cuộc đời, 35-55 tuổi

(6) Cuối cuộc đời, 60- 90 tuổi

Đây là sự khác biệt so với tế bào gốc tạo máu, mặc dù lượng và tiềmnăng tế bào HSC tương đối hằng định từ khi sinh ra đến cuối cuộc đời, nhưng

số lượng MSC lại có sự thay đổi lớn

Đây là vấn đề nền tảng và rõ nét về sự khác nhau, cả định nghĩa và chứcnăng sinh học của MSC và HSC [8]

- Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô

Nguồn thu nhận tế bào MSC ban đầu là tủy xương, gần đây có thể táchchúng từ các nguồn khác, như máu ngoại vi, mỡ, hệ mạch và cơ, máu cuốngrốn… [1] Việc mô tả các quần thể tế bào tiền thân trong hệ mạch phù hợp vớicác dữ liệu đề nghị rằng, MSC là một phần của dòng tế bào cơ trơn và điều đócho thấy, các tế bào đa tiềm năng trong mỡ có thể thực sự là hệ mạch Bất kể

tế bào người hay động vật, việc sử dụng huyết thanh bào thai bò FBS cho nuôicấy đều rất quan trọng cho sự thành công tăng sinh và duy trì tiềm năng biệthóa

Nhiều phương pháp để thu nhận và nhân khối MSC từ các loài khácnhau, kể cả người, chuột, thỏ được công bố Hầu hết các phương pháp này sửdụng nuôi cấy MSC dựa vào đặc tính bám dính trên bề mặt nhựa và sử dụngnồng độ huyết thanh thấp hơn trong nuôi cấy tế bào máu, để loại bỏ hầu hếtcác tế bào tạo máu không bám dính Sự khác biệt giữa các phòng thí nghiệm

là ban đầu họ sử dụng môi trường cơ bản MEM hay DMEM, lượng huyếtthanh và tế bào được tinh sạch một phần ra sao bằng li tâm trên một gradient

Khi thu nhận và nuôi cấy tủy xương, người ta đã quan sát thấy mộtnhóm các tế bào giống nguyên bào sợi biệt hóa thành tế bào xương Những tếbào giống nguyên bào sợi này bám chặt vào bề mặt của vật liệu nuôi, chúngkhông chỉ tăng sinh gấp đôi mà còn biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác(ngoài tế bào xương) như tế bào sụn, nguyên bào cơ và tế bào mỡ [8]

- Định danh tế bào gốc trung mô

Theo tiêu chí của Ủy ban TBG mô và trung mô của Hiệp Hội liệu pháp

tế bào quốc tế [27] đã đưa ra các tiêu chí chung để xác định một loại tế bàogốc là MSC cần phải thỏa 3 điều kiện sau:

- Thứ nhất, các MSC phải là các tế bào có khả năng bám dính khi tiến hành nuôi cấy trên bề mặt chai nuôi.

- Thứ hai, các tế bào này phải biểu hiện được các marker bề mặt như CD105, CD73 và CD90, không biểu hiện các marker như CD45, CD34, CD14 và HLA- DR .

- Thứ ba, phải có khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, tế bào

mỡ hoặc tế bào sụn trong điều kiện in vitro.

Vì vậy, dựa theo các tiêu chuẩn trên, nếu chúng ta muốn xác định các tếbào phân lập, nuôi cấy từ mô mỡ là các MSC thì phải thực hiện đầy đủ cácđiều kiện này [10]

1.4 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ

1.4.1 Giới thiệu chung:

Tế bào gốc từ mô mỡ được phát hiện đầu tiên vào năm 1980 do Plaas

và Vryer Các tác giả cho rằng, mô mỡ bò trưởng thành chứa tế bào có tiềmnăng biệt hóa từ tế bào giống nguyên bào sợi thành tế bào mỡ Một số nghiêncứu đã kiểm tra sự tồn tại của tế bào gốc trong mô mỡ ở các loài khác nhau

Năm 2001, Patricia Zuk và nhóm nghiên cứu của đại học California(Mỹ) công bố thu nhận được tế bào từ mỡ hút được xử lý (PLA) PLA là dungdịch giàu tế bào được thu nhận bằng kỹ thuật chọc hút mỡ Mỡ sau khi thunhận được rửa với dung dịch PBS và tách với collagenase 0,075% Phân lớpmạch nền được thu nhận bao gồm các loại tế bào khác nhau như MSC, tế bàogốc tạo máu và các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mạch, nguyên

bào sợi, tế bào máu, tế bào tiền thân tạo mỡ và tế bào quanh mao mạch Đểphân lập tế bào gốc trung mô khỏi các tế bào khác, tế bào được nuôi trên bềmặt nuôi cấy plastic trong thời gian dài, trong đó các tế bào có khả năng bámdính bám trên bề mặt nuôi cấy có khả năng sống sót trong khi các tế bào pháttriển huyền phù như tế bào tạo máu không có khả năng tăng sinh và bị loại bỏtrong quá trình nuôi Sau vài lần cấy chuyển, các tế bào không phải tế bào gốcnhư tế bào nội mô có khả năng tăng sinh và chu kỳ sống có giới hạn không thểduy trì trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy mất đi trong quá trình nuôi LượngADSC thu nhận từ mô mỡ tương đương (hay nhiều hơn) lượng BMSC thu từtủy xương [25] Với 30 ml tủy xương thu được khoảng 1x105

tế bào [20],trong khi với 21 ml mỡ hút dưới xương bánh chè có thể thu được khoảng5,5x106 tế bào [86] Quần thể tế bào này có thể được duy trì trong điều kiện in vitro trong thời gian dài với khả năng tăng sinh ổn định và khả năng biệt hóa

thành các dòng tế bào khác nhau

Việc phát hiện sự tồn tại của nguồn tế bào gốc trung mô trong mô mỡ

đã mở ra một tiềm năng to lớn trong ứng dụng điều trị Thứ nhất, mô này làphổ biến, có nhiều trong cơ thể người, dễ dàng thu nhận Lượng MSC tự thâncần thiết cho nghiên cứu có thể được thu nhận từ khoảng 1g mỡ Hơn nữa, chỉcần gây mê cục bộ và vết thương có thể lành trong vòng 1 tuần Nếu mỡ thunhận từ người cho là mỡ hút hoặc mỡ từ phẫu thuật dưới da, thì lượng MSC

đủ để cấy ghép ngay sau đó mà không cần qua bước nhân khối ex vivo Thứ

hai, mô này cũng là nguồn tế bào có thể tự tái tạo Thứ ba, và quan trọng nhất,

nó là nguồn mô tự ghép

1.4.2 Marker bề mặt của tế bào gốc trung mô

Hầu hết các protein bề mặt được biểu hiện bởi MSC cũng được biểuhiện ở bởi các ADSC Các nghiên cứu về marker của tế bào gốc từ mô mỡ chothấy chúng có các kiểu hình sau:

 Những phân tử bám dính: ADSC có biểu hiện CD9, CD29,CD49e, CD54, CD105, CD106, và CD166 và không biểu hiện CD11b, CD18,CD50, CD56 và CD62 trên bề mặt tế bào [43], [44].

 Những phân tử thụ quan: ADSC biểu hiện CD44 và CD71,CD144

 Những enzyme bề mặt: ADSC biểu hiện CD10, CD13, và CD73.Những protein chất nền ngoại bào và glycoprotein: ADSC biểu hiện collagentype I và III osteopontin, ostenectin, CD90, CD105 và CD146 [43], [53]

 Protein bộ xương tế bào: ADSC biểu hiện intracellular α smoothmuscle actin và vimentin

 Protein điều hòa bổ thể: ADSC dương tính với CD55 và CD95

 Kháng nguyên tương hợp mô: ADSC dương tính với HLA –ABC và âm tính với HLA- DR (ít hơn 1% ADSC biểu hiện protein HLA –DR) [19], [53]

 ADSC không biểu hiện marker tế bào gốc máu và tế bào gốc nội

mô như CD3, CD4, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD31,CD33, CD38, CD34, C45, CD56, CD62p, CD79α, CD104, CD144 [19], [43],[53]

Vẫn còn một số không nhất quán giữa các nghiên cứu về các marker

của ADSC Ví dụ, trong khi Gronthos và cộng sự [41] tìm thấy CD34 và

CD106 trên ADSC, Zuk và cộng sự [95] thì không Tương tự, trong khi Zuk

và cộng sự [95] tìm thấy Stro – 1, Gronthos và cộng sự [41] thì không Sựkhông nhất quán này có thể do sự khác nhau trong phương pháp phân lập tếbào, những tế bào được nuôi cấy sau bao lâu để phân tích, việc sử dụng nhữngkháng thể đơn dòng dò tìm những epitope khác nhau trên protein bề mặt giống

nhau và độ nhạy khác nhau giữa phương pháp hóa mô miễn dịch và flowcytometry.

Ngoài ra, CD90, CD34, CD106, CD105 và Stro – 1 biểu hiện một cáchbiến động trong ADSC cả người và động vật, đặc biệt trong những tế bào mớiphân lập hoặc ở những bước cấy chuyền sớm ADSC mới phân lập và sau khicấy chuyền đều biểu hiện những marker tế bào gốc CD166, CD44, CD29,CD73, CD90 và CD105 Tuy nhiên, sự biểu hiện của những marker này tănglên rất nhiều với sự tăng lên của số lần cấy chuyền, đạt đến 98% ở lần cấychuyền thứ 4 ADSC cũng biểu hiện CD11, CD14, CD45 và CD34 (nhữngmarker của tế bào gốc tạo máu) nhưng sau đó sẽ giảm hoặc mất đi với sự tănglên của số lần cấy chuyền [43]

De Ugarte và cộng sự [24] cũng đã so sánh sự biểu hiện marker bề mặt

tế bào trên ADSC và BMSC ở người Theo nghiên cứu trên, dường như haiquần thể tế bào này tương tự nhau, chỉ có vài khác biệt Những khác biệt nàychủ yếu trong sự biểu hiện các phân tử bám dính:

 ADSC biểu hiện CD9f (alpha 4 intergrin), trong khi BMSC khôngbiểu hiện

 ADSC âm tính cho CD106/VCAM1, trong khi BMSC dương tính

 ADSC biểu hiện mức cao của CD54 (ICAM1), còn BMSC biểuhiện yếu

 CD43+ được biểu hiện yếu trên ADSC, nhưng không biểu hiệntrên BMSC

CD44 là một receptor hyaluronic acid hay fibronectin được biểu hiệnbởi các BMSC và ADSC

Dựa vào các kết quả nghiên cứu, De Ugarte và cộng sự đã giả thuyết

rằng, cả ADSC và BMSC là hai nhóm phụ của tế bào gốc trung mô Sự khác

biệt của một số marker là do môi trường sống của chúng Gronthos và cộng sự(2001) đã nghiên cứu ADSC trong trạng thái biệt hóa và không biệt hóa Cácnghiên cứu đồng ý với công bố của De Ugarte và cộng sự, Gronthos và cộng

sự thấy rằng ADSC biểu hiện các protein: CD9, CD10, CD13, CD29, CD34,

CD44, CD49d, và e, CD54, CD55, CD59, CD105, CD106, CD146, CD166.Tuy nhiên, không giống với BMSC, nhóm của Gronthos không phát hiện sựbiểu hiện STRO – 1 trên ADSC người [8]

1.4.3 Tiềm năng biệt hóa:

TBG từ mô mỡ được xác định là TBG trung mô nên nó có khả năngbiệt hóa thành các dòng tế bào trung mô khác nhau, chẳng hạn như tế bào mỡ[18], [21], [36], [37], [38], [71], [88]; tế bào xương [21], [71], [73], [88]; tếbào sụn [21], [65], [71], [73], [88]; tế bào cơ [21], [71], [88] Quá trình nàygọi là sự biệt hóa chuyên biệt dòng

Ngày càng nhiều bằng chứng về khả năng biệt hóa ADSC thành tế bàokhông chỉ là tế bào có nguồn gốc trung bì mà còn là tế bào có nguồn gốc từlớp phôi khác như là tế bào thần kinh [34], [87], [93]; tế bào tuyến tụy nội tiết[51]; tế bào gan [18], [32], [49]; tế bào nội mô [60]; tế bào cơ tim [88]; tế bàosừng [29], [82];…Quá trình này gọi là sự chuyển biệt hóa

Tuy vậy, trước khi xảy ra quá trình biệt hóa tạo dòng chuyên biệt, MSCphải được chỉ định hoặc được trao quyền tạo thành dòng tế bào nào đó (chẳnghạn như dòng tế bào tạo mỡ) Các “hộp số phân tử” chưa được biết một cách

cụ thể Đến nay hầu hết nhân tố sao mã được cho là nguyên nhân quyết định

số phận của MSC biệt hóa thành dòng chuyên biệt

Hình 1.3 Tiềm năng biệt hóa của MSC thu nhận từ mô mỡ [98]

ADSC là nguồn thay thế TBG trưởng thành tự thân, có thể thu nhậnnhiều lần với số lượng lớn mà không hoặc rất ít ảnh hưởng đến sức khỏe củabệnh nhân Quan trọng nhất là khi phân tích để so sánh MSC từ tủy xương, từ

mô mỡ và từ cuống rốn, cho thấy rõ ràng rằng ADSC không khác về hình thái,kiểu miễn dịch, tần số tạo dòng và khả năng biệt hóa Những đặc điểm này đãmang lại nhiều triển vọng cho các ứng dụng trong lâm sàng của MSC thunhận từ mô mỡ

1.5 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

1.5.1 Nuôi cấy sơ cấp: Là phương pháp sử dụng các tế bào sau khi được

tách từ các mảnh mô và trước lần cấy chuyền đầu tiên Quy trình được tiến

hành bắt đầu từ lúc thu nhận các mẫu sinh thiết, các mảnh mô sống Sau đó,các mảnh mô được xử lí sơ bộ để loại bỏ vi khuẩn, nấm cũng như các yếu tốkhông mong muốn khác Sau đó, sẽ được tách thành dạng huyền phù với các

tế bào đơn lẻ trước khi cho vào tủ nuôi tế bào [46] Có nhiều phương pháp đểtách rời các tế bào thành dạng huyền phù nhưng không gây tổn thương đáng

kể cho tế bào Các tế bào trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau và liên kếtvới chất nền ngoại bào nhờ các cầu nối protein hình thành giữa các tế bào vớinhau Để tách rời các tế bào khỏi khối mô người ta thường dùng các tác động

cơ học bẻ gãy những cầu nối hoặc/và dùng các enzyme để phân hủy các cầunối trên Tác động cơ học được thực hiện bằng cách cắt nhuyễn mô, sau đóhuyền phù trong dung dịch PBS và để lắng rồi thu dịch trong, dịch đó có chứa

tế bào đơn Phương pháp này cho hiệu quả không cao, số lượng tế bào đơn thunhận ít, vì vậy, thường áp dụng cho những mẫu mô có kích thước lớn vàkhông khan hiếm Tuy nhiên, việc tách bằng phương pháp cơ học sẽ thu đượcnhững tế bào có khả năng sống cao Trong phương pháp tách tế bào bằngenzyme, các protease được sử dụng là những enzyme thủy phân protein nhưtrypsine, collagenase, elactase, pronase, dispase hay một tổ hợp các enzymekhác nhau Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khảnăng tiếp xúc của mô với enzyme sau đó sẽ sử dụng enzyme để thu nhận đượclượng tế bào tối đa [47]

1.5.2 Nuôi cấy thứ cấp:

Được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp Vì hầu hếtcác tế bào sau khi nuôi cấy sẽ được bảo quản đông lạnh nên việc nuôi cấy thứcấp được bắt đầu bằng việc giải đông và nuôi cấy trong các môi trường thíchhợp

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO

Đánh giá số lượng tế bào sống một cách nhanh và chính xác là một yêucầu quan trọng trong nhiều trường hợp thí nghiệm khác nhau, đặc biệt là trongnuôi cấy tế bào động vật Mục tiêu của việc đánh giá này là nhằm đo lường sựbiểu hiện, sự tăng sinh của tế bào; đo lường hoạt động của các yếu tố tăngtrưởng; để thực hiện các nghiên cứu so sánh; kiểm tra lô môi trường; thửnghiệm độc tính;…Vì vậy việc xác định số lượng tế bào là một yêu cầu hếtsức quan trọng

Một phương pháp thường dùng để đếm tế bào khá hiệu quả và đơn giản

đó là sử dụng buồng đếm hồng cầu

1.6.1 Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu [15]

Phương pháp cổ điển nhất để định lượng tế bào là đếm trực tiếp sốlượng tế bào sử dụng buồng đếm hồng cầu, thường kết hợp với thuốc nhuộmnhư trypan blue để phân biệt những tế bào sống với những tế bào chết.Phương pháp xác định số lượng tế bào dựa vào thuốc nhộm để đánh giá tế bàosống/chết này là chủ quan nên không thể cho ra một kết quả chính xác tuyệtđối Tuy nhiên phương pháp này lại có ưu điểm là đơn giản, nhanh và rẻ tiền,hơn nữa chỉ lấy một mẫu nhỏ của mẫu cần xác định mật độ tế bào

Hình 1.4 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu và các vùng của buồng đếm [15]

Việc đếm tế bào có thể được tự động hóa bằng máy đếm điện tử, đặcbiệt đối với trường hợp nuôi dịch tế bào huyền phù Để đảm bảo việc nuôi cấy

tế bào đạt được mức độ tăng trưởng tối ưu trước khi cấy chuyền hoặc bảoquản đông lạnh thì cần phải biết được số lượng tế bào và cần phải đánh giá tỷ

lệ phần trăm sống/chết của quần thể tế bào đó Do đó, phương pháp đếm tếbào bằng buồng đếm hồng cầu thường được sử dụng cho mục đích này

1.6.2 Kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào

Ở phương pháp này, các tế bào được chạy theo tuần tự qua một chùmánh sáng laser, qua đó xuất hiện những khúc xạ ánh sáng khi đi qua tế bào vàđược phát hiện bởi những bộ vi nhận cảm ánh sáng Nếu tế bào được nhuộmvới chất huỳnh quang trước đó hay gắn với kháng thể huỳnh quang, thì huỳnhquang sẽ được laser kích hoạt và được phát hiện bởi tube nhận cảm ánh sángthứ hai Thông số thu được sẽ được xử lý và hiển thị bằng hình ảnh hai hoặc

ba chiều trên màn hình Phương pháp này thường được áp dụng với mục đíchphân lập hoặc nhận diện tế bào với những đặc tính có thể nhận dạng dựa vàokhúc xạ ánh sáng (kích thước tế bào) hoặc tính bắt huỳnh quang (DNA, RNA,cấu trúc protein, hoạt tính enzyme, kháng nguyên đặc hiệu) Ngoài ra, phươngpháp này còn kết hợp thêm công dụng định lượng tế bào Thông số lần mà ánhsáng laser đập vào bộ phận cảm nhận ánh sáng, máy có thể tính được lượng tếbào có trong mẫu Đây là phương pháp có rất nhiều ưu điểm nhưng bị giớihạn bởi mật độ tế bào (tối đa là 1 x 107 tế bào trong một lần phân lập) Nhượcđiểm của phương pháp này là giá thành rất đắt và cần có chuyên gia sử dụngmáy

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thực nghiệm mô tả

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mô mỡ người được thu nhận từ việc chọc hút mỡ hoặc các mô mỡ thừađược thu nhận từ các quy trình phẫu thuật

2.3 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU

Mẫu mô được thu nhận từ các người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến mô

để tiến hành nghiên cứu

Có các xét nghiệm âm tính với các bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền,HIV, HBV, HCV và VDRL…

2.4 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ

Các mẫu mô không đạt yêu cầu là các mẫu mô của người hiến bị cácbệnh như: bị các bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, HIV, HBV, HCV, vàVDRL…

2.5 VẬT LIỆU

2.5.1 Dụng cụ - thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

1 Máy ly tâm lạnh Hettich Zentrifugen Đức

5 Tủ thao tác vô trùng Clyde-apac Mỹ

6 Kính hiển vi đảo ngƣợc Nikon Eclipse TE 300 Nhật

7 Kính hiển vi quan sát đôi Leica Laborluxs Singapore

11 Tủ lạnh – 20o