Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, bảo quản và bước đầu thăm dò khả năng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thành dạng tế bào cơ tim

Tế bào gốc trung mô Mesenchymal Stem Cell - MSC là một trong ba loại tế bào gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những đặc tính sinh học vượt trội, đang l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯⎯⎯⎯⎯

TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, BẢO QUẢN

VÀ BƯỚC ĐẦU THĂM DÒ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA

TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI

THÀNH DẠNG TẾ BÀO CƠ TIM

Chuyên ngành : Hóa sinh Y học

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2011

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học :

PGS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Nguyễn Thị Hà

CÓ THỂ TÌM HIỂU LUẬN ÁN TẠI

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội

- Viện Thông tin – Thư viện Y học Trung ương

MỘT SỐ CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN

1 Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn

Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ

tủy xương người”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 66 - số 1, 36 - 41

2 Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn

Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Nghiên cứu sử dụng 5-azacytidine để biệt

hóa tế bào gốc trung mô theo hướng cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y

học, Tập 69 - số 4,

3 Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành

Văn, Đỗ Doãn Lợi, (2010), “Biểu hiện marker bề mặt tế bào gốc trung

mô nuôi cấy nguồn gốc tủy xương người”, Tạp chí Y học Việt Nam,

Tập 372, Tháng 8 - số 2, 143 – 148

4 Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn

Lợi, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu biểu hiện một số gen đặc trưng cho tổ chức tim trên tế bào gốc trung mô nuôi cấy trong quá trình

biệt hóa theo hướng tế bào cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 72 -

số 1, 1 - 7

5 Trần Thị Thanh Hương, Phạm Xuân Thắng, Trần Vân Khánh,

Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu sự biến đổi hình

thái cấu trúc của tế bào gốc trung mô trong một số điều kiện biệt hóa in

vitro”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 378, Tháng 2 - số 1, 9 - 13

Lêi c¶m ¬n

Tôi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng Viện 69, Thủ trưởng Bộ

Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh; Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

PGS.TS Tạ Thành Văn, người Thầy đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án, đồng thời là người Thầy đã định hướng và truyền cho tôi lòng say mê và những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

PGS.TS Nguyễn Thị Hà, người Thầy đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu chuyên ngành Hóa sinh Y học, người Thầy không chỉ là tấm gương về lao động khoa học mà còn

là tấm gương trong cuộc sống của tôi

TS Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu b Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi thực hiện nhiều kỹ thuật trong nghiên cứu

Tôi xin trân trọng và chân thành cảm ơn

Khoa Sinh hóa - Viện 69 - Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, Trưởng bộ môn Hóa sinh cùng các thầy cô bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

GS.TS Trịnh Bình, nguyên Trưởng bộ môn Mô phôi, Trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi nhiều góp ý sâu sắc cho luận án

TS Lý Tuấn Khải, Trưởng Khoa Huyết học - Bệnh viện Quân đội

108, đã hỗ trợ cho tôi trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu

Các cán bộ nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, bộ môn Hóa sinh, bộ môn Y sinh học Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội

đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và sử dụng các trang thiết bị của trung tâm, bộ môn để nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị

em trong gia đình, đặc biệt là chồng và các con đã luôn là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tình cảm, tinh thần và vật chất cho tôi để hoàn thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận án này

Hà Nội, tháng 6 năm 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Chọn lựa tế bào bằng huỳnh quang )

(Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào)

NMCT Nhồi máu cơ tim

RT – PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction - (Phản ứng tổng hợp chuỗi ngược)

DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Bảng 1.1 Phân loại một số marker bề mặt tế bào gốc trung mô 12

Bảng 1.2 Một số điều kiện nuôi cấy cơ bản tế bào gốc trung mô 26

Bảng 1.3 Một số loại môi trường và huyết thanh được sử dụng phổ biến

trong nuôi cấy tế bào gốc trung mô 27

Bảng 1.4 Thống kê các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trung mô đối với bệnh tim mạch 37

Bảng 2.1 Các cặp mồi của kỹ thuật PCR 40

Bảng 3.1 Tỷ lệ áp dụng thành công qui trình phân lập, nuôi cấy và qui trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 57

Bảng 3.2 Kích thước đường kính ngang của nhân tế bào nuôi cấy (n= 30) 62

Bảng 3.3 Biểu hiện marker bề mặt của tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1 71

Bảng 3.4 Mức độ biểu hiện marker bề mặt CD13, CD73, CD90 trên tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1 bằng kỹ thuật FACS 71

Bảng 3.5 Kết quả so sánh mức độ biểu hiện của gen MEF2C giữa MSC không biệt hóa và MSC biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs, sử dụng gen tham chiếu là β-actin 86

Biểu đồ 2.1 Cường độ tín hiệu huỳnh quang phân tích biểu hiện marker bề mặt của MSC bằng kỹ thuật FACS 49

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 63

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 65

Biểu đồ 3.3 Các biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD13 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P1 68

Biểu đồ 3.4 Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD73 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 69

Biểu đồ 3.5 Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD90 bề mặt tế bào nuôi cấy

giai đoạn P0 và P1 70

Sơ đồ 1.1 Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn

hình thành và phát triển ở người 3

Sơ đồ 2.1 Thiết kế nghiên cứu 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân 6

Hình 1.2 Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong tủy xương 9

Hình 1.3 Khả năng đa biệt hóa in vitro tạo một số dòng tế bào chức năng

của tế bào gốc trung mô 11

Hình 1.4 Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo nguyên bào xương (C) và đối chứng không biệt hóa (D) 17

Hình 1.5 Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo tế bào mỡ (E) và đối chứng không biệt hóa (F) 18

Hình 1.6 Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo tế bào sụn (G) và đối chứng không biệt hóa (H) 19

Hình 1.7 Các giai đoạn mô bệnh học của bệnh nhồi máu cơ tim 29

Hình 1.8 Minh họa một số tác nhâncảm ứng và thúc đẩy quá trình hình thành tim của động vật có xương sống 30

Hình 1.9 Hình ảnh mô cơ tim dưới kính hiển vi điện tử truyền qua 34

Hình 2.1 Mô hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng 42

Hình 2.2 Dụng cụ hạ nhiệt độ bảo quản tế bào nuôi cấy 45

Hình 2.3 Mô hình nguyên lý tạo dòng của thiết bị đếm tế bào dòng chảy 47

Hình 2.4 Mô hình khuyếch đại tín hiệu phát hiện bằng phức hệ

Enzym - Strepavidin - Biotin trong nhuộm hóa miễn dịch tế bào 50

Hình 3.1 Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,

ngày thứ 15, giai đoạn P0, HE x 100 58

Hình 3.2 Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,

ngày thứ 20, giai đoạn P0, HE x 100 59

Hình 3.3 Hình thái và mật độ tế bào sau khi cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi, HE x200 60

Hình 3.4 Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình sao, hình sợi HE x100 61

Hình 3.5 Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình thoi HE x 100 61

Hình 3.6 Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 64

Hình 3.7 Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 64

Hình 3.8 Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 66

Hình 3.9 Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 67

Hình 3.10 Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ,

sau biệt hóa 10 ngày, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x 100 72

Hình 3.11 Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ, sau 10 ngày biệt hóa, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x200 73

Hình 3.12 Tế bào gốc trung mô phát triển sau bảo quản và phục hồi nuôi cấy, HE x 100 74

Hình 3.13 Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô sau bảo quản - phục hồi nuôi cấy, TEM x3 000 74

Hình 3.14 Tế bào gốc trung mô không biệt hóa dưới kính hiển vi đối pha x200 76 Hình 3.15 Tế bào gốc trung mô biệt hóa bằng 5- azacitidine 4 tuần dưới kính hiển vi đối pha x200 77

Hình 3.16 Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô

không biệt hóa TEM x2 500 78

Hình 3.17 Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô biệt hóa

theo hướng tạo tế bào cơ tim theo phương pháp của Tomita và cs 79

Hình 3.18 Hình ảnh siêu cấu trúc xơ trung gian của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs 80

Hình 3.19 Nhuộm kháng thể kháng Desmin tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs ICC x 400 81

Hình 3.20 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện một số gen đặc trưng

tế bào cơ tim của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của

Tomita và cs 82

Hình 3.21 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện gen MEF2C

của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 2 - 4 tuần theo phương pháp của Tomita và

cs 83

Hình 3.22 Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen MEF2C của tế bào gốc trung

mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ÷ 4 tuần 84

mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ÷ 4 tuần 85

Hình 3.24 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện các gen đặc trưng biệt

hóa tế bào cơ tim của MSC biệt hóa 7 ngày theo phương pháp của Shim và cs 87

Hình 4.1 Sự khác biệt về siêu cấu trúc giữa tế bào gốc trung mô không biệt hóa

và tế bào gốc trung mô biệt hóa theo hướng tạo tế bào cơ tim bằng 5 – azacitidin

– TEM 106

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt

Mục lục

Danh mục các bảng, biểu đồ

Danh mục các hình vẽ, hình ảnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc 3

1.1.1 Tế bào gốc và cách gọi tên 3

1.1.2 Những đặc điểm chung của tế bào gốc 5

1.1.3 Tế bào gốc của tủy xương 7

1.2 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells) 10

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 10

1.2.2 Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô 11

1.2.3 Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô 16

1.2.4 Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy 19

1.2.5 Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô 20

1.3 Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 23

1.3.1 Phân lập tế bào gốc trung mô 23

1.3.2 Nuôi cấy tế bào gốc trung mô 26

1.4 Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch 28

1.4.1 Những vấn đề cơ bản của liệu pháp tế bào đối với bệnh lý tim mạch 28 1.4.2 Sự hình thành tim thời kỳ phôi thai và tín hiệu điều tiết 29

1.4.3 Hình thái học tế bào cơ tim và mô cơ tim trưởng thành 33

1.4.4 Các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch 35

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Đối tượng và chất liệu nghiên cứu 38

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 38

2.1.2 Chất liệu nghiên cứu 38

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 38

2.2.1 Dụng cụ 38

2.2.2 Trang thiết bị 38

2.2.3 Hóa chất, thuốc thử 39

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 40

2.3.2 Các quy trình phân lập, nhân nuôi, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người theo hướng dạng tế bào cơ tim 42

2.3.3 Kỹ thuật đánh giá sự thành công của các quy trình được áp dụng 46

2.4 Địa điểm nghiên cứu 55

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 56

2.6 Xử lý số liệu 56

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 57

3.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô tủy xương 57

3.1.1 Tỷ lệ áp dụng thành công quy trình phân lập – nhân nuôi và quy trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 57

3.1.2 Kết quả định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập – nuôi cấy 57

3.1.3 Kết quả phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô sau bảo quản 73

3.2 Kết quả nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim 75

3.2.1 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo trình của Tomita và cs 75 3.2.2 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Shim và cs 87

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 88

Phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89

Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89

Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 94

Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 102

Biệt hóa tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim 102

Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tạo dạng tế bào cơ tim 103

Kết quả biệt hóa theo hướng dạng tế bào cơ tim 105

KẾT LUẬN 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤCs

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại Một trong những phương hướng của y học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với quá trình phục hồi của các mô có tính biệt hóa cao (thần kinh, mô cơ tim) Liệu pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90] Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) là một trong ba loại tế bào gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những đặc tính sinh học vượt trội, đang là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu tái tạo phục hồi mô cơ tim [74],[116] Việc sử dụng MSC trong nghiên cứu và điều trị không vi phạm pháp luật và đạo đức y học Tuy nhiên, MSC là một quần thể

tế bào gốc hiếm, tồn tại rải rác, xen kẽ trong nhiều mô với tỷ lệ rất thấp, do vậy những nghiên cứu về MSC đều được tiến hành trên các tập hợp MSC hình thành sau các quá trình phân lập, nuôi cấy ngoài cơ thể

Từ đầu thế kỷ XX cho đến nay, bệnh tim mạch là một bệnh lý phổ biến trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu ca nhồi máu cơ tim (NMCT) với tỷ lệ tử vong là 25% trong ba năm; có xấp

xỉ 5 triệu bệnh nhân suy tim với tỷ lệ tử vong hàng năm là 20% [47] Ở Việt Nam, số lượng bệnh nhân tim mạch cũng ngày một tăng cao do tuổi thọ được cải thiện cũng như sự gia tăng các yếu tố nguy cơ Kỹ thuật ghép tim không chỉ hạn chế về nguồn hiến tặng, mà hiện nay vẫn tồn tại những vấn đề về kỹ thuật ghép

và chi phí sau ghép Liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý cơ tim nói chung và NMCT nói riêng được cho là có thể khắc phục được cả hai vấn đề nêu trên

Hàng loạt thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp tế bào gốc tủy xương không chọn lọc, tiếp theo là liệu pháp MSC chọn lọc từ tủy xương đã được tiến hành, cho thấy tính hiệu quả và tính an toàn của các liệu pháp này đối với bệnh tim mạch

Tại Việt Nam, sử dụng tế bào gốc của tủy xương hướng tới việc điều trị bệnh tim mạch đã được bắt đầu Kết quả điều trị cấy ghép tế bào gốc tủy xương đầu tiên trên 6 bệnh nhân suy tim nặng sau NMCT được thực hiện tại Viện Tim mạch Quốc gia là rất đáng khích lệ [4],[6] Bên cạnh đó, các nghiên cứu phân lập nhằm tạo ra một tập hợp MSC từ tủy xương với đầy đủ các bằng chứng về tiêu chuẩn nhận biết là hết sức cần thiết, sẵn sàng cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sử dụng chọn lọc MSC sau này Các bằng chứng về khả năng

biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế bào cơ tim của tập hợp MSC nuôi cấy vừa

chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC, vừa góp phần giải thích cơ chế tác dụng cải thiện chức năng tim thu được sau liệu pháp tế bào gốc trên 6 bệnh nhân NMCT như đã trình bày ở trên

Mục tiêu của đề tài:

1 Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô

từ tủy xương người

2 Nghiên cứu áp dụng một số quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô

thành dạng tế bào cơ tim

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ VẤN ĐỀ CƠ BẢN VỀ TẾ BÀO GỐC VÀ SỰ BIỆT HÓA

1.1.1 Tế bào gốc và phân loại

Tế bào gốc đầu tiên của cơ thể xuất hiện từ khi trứng được thụ tinh với tinh

trùng Các tế bào gốc được hình thành tương ứng với từng thời kỳ phát triển của

cá thể Quá trình hình thành và phát triển của cá thể khiến cho các tế bào gốc

giảm dần về khả năng biệt hóa, từ tổng năng (totipotent) của hợp tử, toàn năng

(pluripotent) của các tế bào gốc phôi, đến đa năng (multipotent) của tế bào gốc

trưởng thành và cuối cùng là đơn năng (unipotent) của các tế bào tiền thân

Sơ đồ 1.1 Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn

(6 tuần)

Mô thai Máu

dây rốn

Trung mô dây rốn

Tế bào gốc dòng sinh dục

Tế bào gốc dòng sinh dưỡng

Tế bào gốc

phôi

Tế bào mầm sinh dục

Tế bào gốc thai

Tế bào gốc máu dây rốn

Tế bào gốc trung mô dây rốn

Trứng Tinh trùng

Tế bào máu

Mắt Thần kinh

Biểu bì (Da, tóc) Gan

Tế bào trung mô

Tụy

1.1.1.1 Theo khả năng biệt hóa

- Tế bào gốc toàn năng (totipotent): là loại tế bào gốc xuất hiện đầu tiên của cơ

thể sinh vật khi trứng được thụ tinh với tinh trùng, ở giai đoạn phôi dâu (blastomeres) Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa cao nhất, là nguồn gốc hình thành tất cả các loại tế bào của một bào thai hoàn chỉnh

- Tế bào gốc toàn năng (pluripotent): là các tế bào được phân lập từ lớp sinh

khối tế bào bên trong (inner cell mass) ở giai đoạn phôi nang (blastocyst) Trừ tế bào màng nuôi, tế bào gốc toàn năng có khả năng biệt hóa thành những tế bào thuộc ba lá phôi (trung bì, nội bì và ngoại bì) - nguồn gốc của tất cả tế bào có chức năng chuyên biệt của cơ thể sau này Các tế bào gốc toàn năng không biệt hóa tạo ra tế bào màng nuôi, nên từ các tế bào gốc này không có khả năng hình thành một bào thai hoàn chỉnh

- Tế bào gốc đa năng (multipotent): là các tế bào có khả năng biệt hóa thành

nhiều loại tế bào khác nhau, được phân lập từ mô đã biệt hóa nguồn gốc thai hoặc cơ thể trưởng thành, ví dụ: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô

- Tế bào gốc tiềm năng (oligopotent), tứ năng (quartpotent), đơn năng (unipotent): là các tế bào gốc định cư hoặc các tế bào tiền thân tồn tại trong các

mô của thai hoặc cơ thể trưởng thành Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa hạn chế, chỉ tạo ra một hoặc vài dòng tế bào nhất định Ví dụ: tế bào tiền thân dòng tủy, tiền thân dòng lympho là các tế bào gốc tiềm năng, tiền thân tế bào mast là

tế bào gốc đơn năng

1.1.1.2 Theo vị trí phân lập tế bào

- Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cells – ESC): là tế bào gốc được phân lập ở

ngày thứ 6 của giai đoạn phôi nang (blastocyst), tại vị trí lớp sinh khối tế bào bên trong (inner cell mass) Tế bào gốc phôi là tế bào gốc vạn năng có khả năng phân chia vô hạn trong nuôi cấy và biệt hóa tạo ra tất cả các tế bào thuộc ba lá phôi

- Tế bào mầm sinh dục (Embryonic Germ Cells – EGC): là các tế bào gốc được

phân lập từ mào sinh dục (genital ridge) của phôi tuần thứ 6, là tế bào gốc vạn

năng và được coi là nguồn gốc biệt hóa thành các tế bào sinh dục sau này (trứng, tinh trùng)

- Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cells): là tế bào gốc được phân lập từ

nhiều mô trưởng thành của cơ thể: tủy xương, máu tuần hoàn, máu dây rốn, giác mạc, võng mạc, tủy răng, gan, da, dạ dày, tụy v.v Tế bào gốc trưởng thành bao gồm tế bào gốc trưởng thành dòng sinh dưỡng (somatic line) và dòng sinh dục (germ line)

1.1.1.3 Theo hướng biệt hóa chính

- Tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cells – HSC): là loại tế bào gốc đa

năng, có khả năng biệt hóa thành tất cả tế bào thuộc các dòng tế bào máu, bao gồm bạch cầu dòng tủy, bạch cầu dòng lympho, hồng cầu và tiểu cầu Tủy xương là nơi sản sinh ra HSC trong cơ thể trưởng thành

- Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC): là loại tế bào gốc đa

năng không thuộc dòng tế bào tạo máu Đầu tiên, các tế bào này được phân lập

từ tủy xương và hiện nay có thể được phân lập ở nhiều mô khác của bào thai cũng như cơ thể trưởng thành Tế bào gốc này có khả năng biệt hóa “mềm dẻo”

1.1.2 Những đặc điểm chung của tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa hoặc biệt hóa chưa hoàn toàn ở các mức độ khác nhau, vì vậy có khả năng hình thành các dòng tế bào chuyên biệt Ngày nay, người ta đã phân lập được các tế bào gốc từ các mô đã biệt hóa của cơ thể trưởng thành - tế bào gốc trưởng thành Nếu như tế bào gốc phôi và tế bào gốc của bào thai đóng vai trò hình thành cá thể thì tế bào gốc trưởng thành

có vai trò chính trong hệ thống tái tạo, sửa chữa mô; tạo ra các tế bào có chức năng thay thế cho các tế bào bị thiếu hụt do các quá trình sinh lý cũng như bệnh

lý của mô sau khi cá thể chào đời Các tế bào gốc trưởng thành do vậy có khả năng tự làm mới (renewal) và tồn tại trong suốt quá trình sống của cá thể

1.1.2.1 Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa

Một trong những đặc tính căn bản của tế bào gốc là không có cấu trúc đặc hiệu mô, cấu trúc mà nhờ đó các tế bào thực hiện các chức năng chuyên biệt của

từng mô (ví dụ: chức năng co bóp để bơm máu từ tim ra các động mạch của tế

bào cơ tim, chức năng vận chuyển các phân tử oxy của tế bào hồng cầu, chức

năng dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh )

1.1.2.2 Tế bào gốc có khả năng tự làm mới và bảo tồn kiểu hình không biệt hóa

Hình 1.1 Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân

(Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.nih.gov)

Không giống như các tế bào đã biệt hóa cao (tế bào cơ tim hay tế bào thần

kinh), tế bào gốc trưởng thành có khả năng tăng sinh và tự làm mới (self-

renewal) mà vẫn giữ được đặc tính không biệt hóa trong suốt quá trình tồn tại

của mô, cơ thể Quá trình tự làm mới thông qua sự phân chia tế bào một cách

đối xứng (symmetric) tạo ra hai tế bào gốc hoặc phân chia không đối xứng

(asymmetric) tạo ra một tế bào gốc và một tế bào tiền thân bắt đầu có xu hướng

biệt hóa Trong khi đó, các tế bào tiền thân không có khả năng này, chúng phân

chia hình thành hai tế bào biệt hóa có chức năng chuyên biệt (Hình 1.1) Khả

TẾ BÀO TIỀN THÂN

vd: Tế bào tiền thân dòng tủy

năng tự làm mới là một đặc tính giúp phân biệt giữa tế bào gốc trưởng thành và

tế bào tiền thân định cư tại mô

1.1.2.3 Tế bào gốc có thể tạo nên một hoặc vài dòng tế bào có chức năng chuyên biệt

Quá trình tế bào gốc chuyển thành các tế bào có chức năng riêng biệt (tế bào cơ tim, tế bào bêta của tụy, tế bào thần kinh ) được gọi là quá trình biệt hóa (differentiation) Quá trình này xảy ra khi tế bào gốc đáp ứng các tín hiệu bên trong và bên ngoài tế bào Những tín hiệu bên trong được kiểm soát bởi gen của nhân tế bào Những tín hiệu bên ngoài của quá trình biệt hóa tế bào là các tác nhân được tiết ra bởi các tế bào khác (các cytokin, các yếu tố tăng trưởng) Nó còn là sự tiếp xúc trực tiếp của tế bào gốc với các tế bào lân cận và mạng lưới ngoại bào

1.1.3 Tế bào gốc của tủy xương

Cấu tạo mô học của tủy xương đã được mô tả khá cụ thể [1] Tủy xương

lấp đầy các ống tủy của xương dài và trong các hốc của xương dẹt Tổng trọng lượng của tủy xương ở người trưởng thành trung bình khoảng 2600 gam Có thể phân biệt bằng mắt thường tủy đỏ và tủy vàng Tủy đỏ là vùng tủy tạo huyết hay tủy hoạt động Tủy vàng giàu tế bào mỡ và thường không tham gia tạo máu Trong trường hợp thiếu máu hoặc thiếu oxy trong máu, tủy vàng nhanh chóng chuyển thành tủy đỏ Tủy xương gồm hệ thống những xoang mạch (mao mạch kiểu xoang) xen kẽ với những khoang tạo máu Những khoang tạo máu có nền là

mô võng và các thành phần gian bào

Trong các lỗ lưới của mô võng chứa một tập hợp các loại tế bào rất đa dạng, chiếm phần lớn là quần thể các tế bào máu ở các giai đoạn phát triển và biệt hóa khác nhau, cùng với đó là các tế bào gốc của tủy xương Cho đến nay đã xác định được ba loại tế bào gốc tuỷ xương, bao gồm: tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cell - HSC), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) và tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cell, EPC) [11] HSC và MSC là hai quần thể tế bào gốc của tủy xương được nhiều nghiên cứu

đề cập tới Sự phân bố và khả năng biệt hóa của chúng trong tủy xương được mô

tả ở hình 1.2

Mô võng gồm những tế bào võng hình sao tựa trên lưới sợi võng Những tế bào này có khả năng thực bào và điều tiết quá trình sinh sản, biệt hóa của các dòng tế bào tạo máu MSC tủy xương được xác định là thuộc loại tế bào võng Thành phần gian bào ở tủy xương gồm collagen, glycosaminoglycan và những glycoprotein cấu trúc Glycosaminoglycan ở tủy xương là hyaluronic acid Hai protein cấu trúc được xác định là fibronectin và laminin

1.1.3.1 Tế bào gốc tạo máu

Ở người trưởng thành, HSC được sản sinh và cư trú chủ yếu tại tủy xương Chúng có thể được huy động và có mặt trong máu ngoại vi, nhưng trong các mô khác (gan, lách) thì rất hiếm HSC chiếm tỷ lệ 1:10.000 các tế bào của tủy xương và nhanh chóng hình thành tất cả các tế bào tiền thân thuộc dòng tế bào

máu in vivo và in vitro [132] HSC được chia thành HSC dài hạn (long-term

repopulating HSC), là tập hợp HSC có tiềm năng tự làm mới cao và HSC ngắn hạn (short- term repopulating HSC), là tập hợp HSC có khả năng hình thành một cách nhanh chóng các tế bào thuộc dòng tế bào máu sau quá trình cấy ghép tủy xương [86] Cả hai quần thể HSC này đặc trưng bởi dấu ấn kháng nguyên bề mặt CD34 và một số kháng nguyên khác chỉ có ở các tế bào máu, như CD38, CD45, HLA-DR[118] và CD133[81]

1.1.3.2 Tế bào gốc trung mô

MSC có nhiều đặc tính khác với HSC Sau khi ly tâm dịch tủy xương với việc sử dụng dung dịch tỷ trọng 1,077 g/ml (hoặc 1,073 g/ml), một tập hợp tế bào đơn nhân chứa MSC (tỷ trọng thấp hơn 1,077 g/ml hoặc 1,073 g/ml) sẽ tập trung thành một lớp ngay trên lớp dung dịch tỷ trọng, được gọi là lớp tế bào

“vòng nhẫn” Bạch cầu hạt và hồng cầu bị lắng xuống, nằm ở đáy ống ly tâm do

có tỷ trọng cao hơn Sau một thời gian nuôi cấy, một tập hợp MSC mới sẽ hình thành từ tập hợp tế bào đơn nhân thu được ở trên MSC bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy, còn HSC bị loại bỏ do không bám dính được MSC tăng sinh và

giữ được kiểu hình không biệt hóa qua nhiều lần cấy chuyển Trong điều kiện

biệt hóa in vitro, MSC hình thành tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn MSC có khả năng tăng sinh cao, với 35 lần nhân đôi in vitro [24] Dưới tác dụng của các

chất gây phân bào như PDGF (platelet-derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor) và IGF-1 (insulin-like growth factor-1) [19], MSC tăng sinh mà vẫn giữ được trạng thái không biệt hóa

Hình 1.2 Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong

tủy xương (Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.nih.gov)

1.1.3.3 Tế bào tiền thân nội mô

Tập hợp tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cells - EPC) còn gọi là tế bào gốc nội mô (Endothelial Stem Cells) Các tế bào này cùng với HSC

và MSC có mặt trong tập hợp tế bào đơn nhân tủy xương Ngoài tủy xương, người ta đã phân lập được EPC từ máu ngoại vi, máu dây rốn Ở người, EPC sau

phân lập biểu hiện một số marker của tế bào tiền thân hay tế bào gốc như CD34, VEGFR-2(vascular endothelial growth factor receptor -2) VEGFR-2 có nhiều tên gọi khácnhư: KDR (kinase insert domain receptor), Flk-1 (fetal liver kinase-1) và CD309 Sau một thời gian nuôi cấy, EPC biểu hiện các marker đặc trưng cho tế bào nội mô như: CD34, CD309, CD31, Tie-2 (tyrosine kinase with immunoglobulin and EGF homology domains) hay CD202 và E- Selectin hay CD62E [10]

1.2 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELLS)

- Từ 1966 – 1987, Friedenstein và cs được coi là một trong những nhà khoa học

có các nghiên cứu tiên phong về MSC, mở ra một thời kỳ bùng nổ các báo cáo

về loại tế bào gốc này Từ tủy xương chuột, Friedenstein đã phân lập được một loại tế bào dạng nguyên bào sợi [44], có khả năng bám dính và tăng sinh mạnh trong môi trường nuôi cấy Các tế bào này có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào (osteoblasts), tế bào mỡ (adipocytes), tế bào sụn (chondrocytes) và được gọi

là tế bào gốc của tủy (marrow stem cells)

- Năm 1991, Caplan đề xuất tên gọi tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) để mô tả các tế bào không đồng nhất, có nguồn gốc tủy xương, có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy thông thường, các tế bào này tăng sinh khi nhân nuôi ngoài cơ thể và có thể biệt hóa để tạo ra các loại tế bào liên kết đa dạng [28] Tuy nhiên theo một số tác giả khác, các tế bào này thuộc loại

tế bào tiền thân và chúng có tên gọi tế bào đệm trung mô (Mesenchymal Stromal Cells - MSC) [97]

- Năm 2004, lần đầu tiên tập hợp MSC chọn lọc sau phân lập và nuôi cấy được

sử dụng trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh nhân NMCT cấp [32]

- Năm 2006, Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International Society for

Cellular Therapy - ISCT) đưa ra tiêu chuẩn tối thiểu để xác định MSC [38]

1.2.2 Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô

1.2.2.1 Nguồn gốc và khả năng biệt hóa

Đầu tiên MSC được phát hiện từ quần thể các tế bào tủy xương Ngày nay

người ta có thể phân lập các tế bào này từ nhiều mô của cơ thể trưởng thành

[18], bao gồm: máu tuần hoàn, máu dây rốn, trung mô dây rốn, tủy xương, mô

mỡ, gan, lách, dịch ối

Hình 1.3 Khả năng đa biệt hóa in vitro tạo một số dòng tế bào chức năng

của tế bào gốc trung mô [70]

MSC là tế bào gốc có khả năng đa biệt hóa, trong đó MSC có khả năng biệt

hóa thành ba loại tế bào (tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn) Các nghiên cứu in

vitro đã chứng minh trong từng môi trường cảm ứng MSC có xu hướng biệt hóa

theo nhiều hướng riêng biệt, không chỉ tạo nên các tế bào thuộc trung bì phôi (tế

bào cơ, tế bào xương, tế bào cơ tim) mà còn tạo thành các tế bào thuộc ngoại bì

phôi (tế bào thần kinh), hoặc thuộc nội bì phôi (tế bào gan, tụy, biểu mô hô hấp),

Tăng sinh và chuyển dạng

Tế bào sụn tăng sản

được mô tả ở hình 1.3 Tuy nhiên các bằng chứng về khả năng biệt hóa in vivo

của MSC vẫn chưa thực sự thuyết phục

1.2.2.2 Marker bề mặt của tế bào gốc trung mô

Xác định các protein bề mặt đặc hiệu tế bào - marker bề mặt, nhằm mục tiêu

mô tả đặc điểm và nhận biết một loại tế bào nào đó Các marker bề mặt của một loại tế bào còn cho biết mối tương tác giữa tế bào này với các tế bào xung quanh

và với vi môi trường lân cận

Bảng 1.1 Phân loại một số marker bề mặt tế bào gốc trung mô [70]

Thụ thể mạng lưới gian bào

ICAM-1 hay CD54; ICAM-2 hay CD102, VCAM-1 hay CD106, ALCAM hay CD166, CD105, các intergrin của thụ thể

hyaluronate: 1, 2, 3, V, 1, 2, 3, 4 hay tương ứng lần lượt là: CD49a, CD49b, CD49c, CD51, CD29, CD18, CD61, CD104

ICAM-1: Intercellular adhesion molecule -1: phân tử bám dính gian bào - 1

IFN –  R: Interferon gama receptor: thụ thể của interferon gama

IGF-1: Insulin - like growth fartor 1: yếu tố tăng trưởng giống insulin - 1

IL-R: Interleukine receptor: thụ thể của interleukine

PDGF-R: Platelet derived growth factor receptor: thụ thể của yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu

TGF- R: Transforming growth factor bêta receptor: thụ thể của yếu tố chuyển dạng phát triển bêta

TNF-R: Tumor necrosis factor receptor: thụ thể của yếu tố hoại tử u

Sca-1: Stem cell antigen - 1: kháng nguyên tế bào gốc - 1

VCAM-1: Vascular adhesion molecule -1: phân tử bám dính thành mạch - 1

MSC biểu hiện các marker CD44, CD73, CD90 và CD105, trong khi không biểu hiện các marker của dòng tế bào tạo máu như CD14, CD31, CD33, CD34

và CD45 MSC nuôi cấy âm tính với một số marker của tế bào nội mô như yếu

tố von-Willebrand và P-selectin [18] Nghiên cứu của Conget cho thấy trên bề mặt MSC biểu hiện các kháng nguyên liên quan đến sự bám dính ngoại bào như các integrin aVb3 và aVb5 (CD51), các chuỗi đơn integrin a4, a5 và b1 (CD49d, CD49e và CD29); ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) và CD44H [34] Các phân tử này giúp cho MSC bám dính được với mạng lưới ngoại bào và với

bề mặt nhựa nuôi cấy

MSC có biểu hiện ở mức độ thấp các phân tử MHC (major histocompatibility complex) lớp I và không có các kháng nguyên MHC lớp II MSC cũng không biểu hiện các phân tử đồng kích thích (co-stimulatory molecule) như B7-1, B7-2, CD80, CD86, CD40 và CD40L [69]

1.2.2.3 Khả năng sinh học

Ngoài vai trò tạo môi trường cho các quá trình tăng sinh và biệt hóa của HSC ở tủy xương, cho đến nay nhiều khả năng sinh học của MSC đã được xác định

 Khả năng tiết cytokin

Các mô trưởng thành đều có các vị trí hoặc nơi cư ngụ của các tế bào gốc – thường ở vùng tế bào đệm, nơi có liên hệ chặt chẽ và điều tiết các hoạt động của

các tế bào gốc In vitro, MSC tổng hợp và tiết ra các cytokin, chemokin và các

yếu tố tăng trưởng [60],[68] như:

- Các Interleukine (IL) : IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15;

- LIF: yếu tố ức chế bạch cầu (leucocyte inhibitory factor);

- G-CSF : yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt (granulocyte colony stimulating factor);

- GM-CSF: yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào - bạch cầu hạt (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor);

- Yếu tố tế bào gốc (stem cell factor);

- M-CSF: yếu tố kích thích tạo cụm đại thực bào (macrophage stimulating factor);

colony flkcolony 3L: ligand của tyrosine kinase colony 3 giống fms (fms like tyrosine kinasecolony 3

ligand)

Do MSC có các thụ thể của cytokin như: 1R (interleukin 1 receptor), 3R (interleukin 3 receptor), IL-4R (interleukin 4 receptor), IL-6R (interleukin 6 receptor) và IL-7R (interleukin 7 receptor) nên khi bị cảm ứng bởi các cytokin này, chúng tiết ra nhiều loại chemokin bạch cầu ở mức độ cao, đáng chú ý nhất

IL-là CXCL9 (CXC9 ligand), CXCL10 (CXC10 ligand) và CXCL11 (CXC 11 ligand)

Mặc dù chưa tìm ra marker bề mặt nào là marker duy nhất đặc hiệu cho MSC nhưng hàng loạt các marker đã được xác định cùng với khả năng tiết các cytokin và chemokin của MSC đã gợi ý khả năng chia sẻ các tín hiệu gian bào

và khả năng tương tác của MSC với các tế bào khác trong quá trình tăng sinh và biệt hóa

 Khả năng di chuyển và định cư ngoài tủy xương

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh: khi đưa vào cơ thể động vật thực nghiệm, MSC nuôi cấy có thể định cư ở ngoài tủy xương, đặc biệt vào các vùng mô bị

tổn thương và tại đó chúng có khả năng tăng cường quá trình làm liền vết thương, hỗ trợ sự tái tạo mô; và có thể khôi phục vi môi trường của tủy xương trong mô hình thực nghiệm loại bỏ tủy bằng liệu pháp hóa học (myeloablative chemotherapy) hoặc xâm nhập vào các khối u [102] Sự di chuyển đặc hiệu của MSC được cho là do sự tác động của các chemokin Thực tế, các nghiên cứu đã tìm thấy sự biểu hiện các thụ thể của các chemokin: CCR1(CC1 receptor), CCR4 (CC4 receptor), CCR7 (CC7 receptor), CXCR5 (CXC5 receptor) và CCR10 (CC10 receptor) trên các MSC [62],[126], những thụ thể có thể có vai trò đối với khả năng di chuyển đặc hiệu trên

Cũng như các loại tế bào gốc khác, MSC chịu sự điều hòa của vi môi trường nơi chúng tồn tại Vi môi trường này được tạo nên bởi nhiều yếu tố và với các mức độ khác nhau, các yếu tố này có thể tương tác độc lập nhưng chủ yếu là dưới dạng phối hợp tác động lên tế bào Biểu hiện gen của các cytokin và chemokin của MSC phân lập từ phổi khác biệt so với MSC có nguồn gốc tủy xương Điều này có thể là do vi môi trường của các mô khác nhau đã xác lập các chức năng khác nhau của MSC [71] Sau khi bị kích thích bởi các tổn thương cơ học, quá trình viêm, nhiễm trùng và ung thư, MSC di cư khỏi nơi trú ngụ của chúng và thâm nhập vào các vùng tổn thương, dẫn đến quá trình tái tạo mô Các tín hiệu cụ thể trong quá trình tác động của MSC nhằm sửa chữa các tổn thương cho tới nay vẫn chưa được biết một cách rõ ràng Đặc tính này của MSC nếu được áp dụng sẽ hình thành một liệu pháp điều trị mới tạo điều kiện sửa chữa các mô bị tổn thương [29]

 Khả năng ức chế miễn dịch

MSC được cho là loại tế bào có khả năng ức chế miễn dịch Tác dụng chung của MSC trên hệ miễn dịch là “lái” các đáp ứng miễn dịch theo chiều hướng dung nạp hoặc kháng viêm, thể hiện ở sự chuyển dạng Th1 (T - helper type 1) thành dạng Th2 (T - helper type 2), giảm tổng hợp IFN -  (interferon gama) từ

tế bào giết tự nhiên (natural killer cell - NK cell) và giảm sản xuất kháng thể của

tế bào lympho B Do vậy, MSC điều tiết quá trình hình thành dòng lympho và

ức chế đáp ứng miễn dịch dịch thể MSC tủy xương tham gia vào quá trình trưởng thành của tế bào lympho T và tế bào lympho B thông qua các yếu tố tăng trưởng, các cytokin, các phân tử bám dính [7] Ngoài ra, MSC điều chỉnh tác dụng điều hòa miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch mắc phải nhờ sự tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các yếu tố hòa tan [73] MSC không có MHC lớp

II do vậy chúng có khả năng vượt qua được hàng rào miễn dịch trong các liệu pháp cấy ghép khác gen cùng loài [72]

1.2.3 Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô

Nghiên cứu khả năng biệt hóa in vitro của MSC được tiến hành từ rất sớm

Bắt đầu là các nghiên cứu về khả năng biệt hóa tạo các loại tế bào thuộc tập hợp

tế bào đệm tủy xương (tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn) Sự hình thành các tế bào này được cho là do quá trình biệt hóa của MSC trong tủy xương [48] Sau

đó là hàng loạt những nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng tạo ra các loại tế bào có cùng nguồn gốc hay khác nguồn gốc phôi thai như: tế bào cơ, tế bào cơ tim, tế bào thuộc hệ thần kinh, tế bào gan, tế bào tụy [48] Các nghiên cứu này nhắm tới việc sử dụng liệu pháp tế bào trong việc tái tạo, phục hồi các mô khi

cần thiết Khả năng biệt hóa in vitro tạo ra 3 loại tế bào nêu trên (tạo cốt bào, tế

bào mỡ, tế bào sụn) được ISCT chọn là một trong ba tiêu chuẩn tối thiểu để khẳng định tập hợp tế bào thu được sau phân lập, nuôi cấy từ nhiều nguồn là tập hợp MSC [38]

1.2.3.1 Biệt hóa tạo tạo cốt bào

 Tác nhân gây biệt hóa: Các nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng hình thành

các tế bào khoáng hóa sử dụng nhiều loại tác nhân như BMP (bone morphogenetic protein), dexamethasone, 1,25 dihydroxy vitamin D3, acid ascorbic và -glycerophosphate [34],[94] Các tác nhân này gắn với các thụ thể tương ứng như: dexamethasone gắn với thụ thể của glucocorticoid, 1,25 dihydroxy vitamin D3 gắn với thụ thể của vitamin D Quá trình đáp ứng hình thành tạo cốt bào của MSC tăng lên khi bổ sung các loại BMP vào môi trường

nuôi cấy

 Kết quả biệt hóa

Các tế bào xuất hiện tượng tạo khoáng trong bào tương sau 14  21 ngày

biệt hóa Phương pháp nhuộm hóa tế bào Alizarin đỏ hoặc von - Kossa xác định

có hay không sự lắng đọng calcium phosphate trong tế bào Ngoài ra có thể xác

định kết quả biệt hóa tạo tạo cốt bào bằng cách phân tích sự biểu hiện một số

protein đặc trưng khác, như: osteocalcin – một protein không thuộc collagen,

được tiết ra bởi tạo cốt bào và có liên quan đến mạng lưới khoáng hóa của mô

xương; hay sự biểu hiện của yếu tố phiên mã của tạo cốt bào Cbfa1 (core

binding factor alpha1) [39]

Hình 1.4 Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mô sau biệt hóa

thành tạo cốt bào (C) và không định hướng biệt hóa (D) [37]

Một giả thuyết được đưa ra là quá trình tạo mỡ và xương của MSC có mối

liên quan thuận nghịch, do các tác nhân sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo tế

bào mỡ cũng được sử dụng trong quá trình biệt hóa tạo xương và ngược lại

[40],[50]

1.2.3.2 Biệt hóa tạo tế bào mỡ

 Tác nhân gây biệt hóa : MSC biệt hóa hình thành các tế bào mỡ khi bổ sung

vào môi trường nuôi cấy hỗn hợp dexamethason, indomethacin, insulin,

isobutylmethylxanthin, thiazolidinedion [34],[51]

Tác dụng phổ biến của các tác nhân biệt hóa là làm tăng cAMP trong bào

tương do ức chế hoạt tính của enzym phosphodiesterase như :

isobutylmethylxanthin Các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy là các

ligand của các thụ thể màng nhân như : dexamethason của thụ thể

glucocorticoid; rosiglitazon của PPAR (peroxisome proliferator-activated

receptor )

 Kết quả biệt hóa

MSC thay đổi hình dạng tế bào từ dạng hình sợi sang dạng hình ovan, có

chứa các giọt mỡ trong bào tương sau từ 3 ÷ 9 ngày biệt hóa Các hạt mỡ có thể

quan sát trực tiếp dưới KHV quang học đối pha do chúng có độ chiết quang

khác với độ chiết quang của nước

Hình 1.5 Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa

thành tế bào mỡ (E) và không định hướng biệt hóa (F) [37]

Các hạt mỡ được hình thành bắt màu thuốc nhuộm chuyên biệt (Oil - Red

O), quan sát được dưới KHV quang học Ngoài ra có thể xác định biểu hiện các

marker về gen của tế bào mỡ trưởng thành như: Protein gắn với acid béo 4 (fatty

acid-binding protein 4), lipoprotein lipase; các adipokin (adiponectin, leptin) và

các tế bào mỡ này bị phân giải lipid bởi các chất chủ vận adrenergic (adrenergic

agonist) [34],[49],[111]

1.2.3.3 Biệt hóa tạo tế bào sụn

 Tác nhân biệt hóa: Các tác nhân gây biệt hóa MSC hình thành tế bào sụn

bao gồm: ascorbate, BMP 6 (bone morphogenetic protein 6), dexamethason,

TGF-β (transforming growth factor β) [64],[78] Ngoài việc sử dụng các tác

nhân bổ sung vào môi trường nuôi cấy vừa nêu trên, quá trình biệt hóa MSC

theo hướng tạo tế bào sụn cần được tiến hành trong điều kiện nuôi cấy không

gian ba chiều Đây là điều kiện nuôi cấy khác biệt so với nuôi cấy tế bào bám

dính đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy tương ứng với điều kiện nuôi cấy không

gian hai chiều Theo cách này, môi trường nuôi cấy chứa các hạt vi khối lượng

hoặc nuôi cấy trong mạng lưới như agarose hoặc alginate

 Kết quả biệt hóa

MSC sau biệt hóa biểu hiện các protein đặc trưng cho tổ chức sụn: Collagen

typ II, Collagen typ X, Aggrecan

Hình 1.6 Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mô sau biệt hóa

thành tế bào sụn (G) và không định hướng biệt hóa (H) [37]

1.2.4 Tiêu chuẩn tối thiểu của một tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy

Nhiều cố gắng tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm kiểu hình của MSC đã

được tiến hành, nhưng cho đến nay người ta vẫn chưa xác được marker bề mặt

duy nhất của MSC Điều này gây khó khăn cho việc phân lập, chọn lọc cũng

như đánh giá quần thể MSC một cách chính xác Hiệp hội quốc tế về liệu pháp

tế bào (ISCT) đã đưa ra các tiêu chuẩn tối thiểu nhằm xác định một quần thể MSC sau phân lập, nuôi cấy [38], theo đó:

 MSC phải bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn

 MSC biểu hiện dương tính với CD105, CD73 và CD90; biểu hiện âm tính với CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79 hoặc CD19 và HLA-DR

 MSC có khả năng biệt hóa in vitro thành tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn

Tiêu chuẩn này nhằm thống nhất các kết quả nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thể giới Các công bố nghiên cứu về việc phân lập MSC từ các

mô trưởng thành, về đặc tính cũng như khả năng ứng dụng của MSC cần tuân

thủ những tiêu chuẩn tối thiểu nêu trên của ISCT

1.2.5 Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô

Các bằng chứng in vivo và in vitro cho thấy MSC là loại tế bào gốc có tiềm

năng nhất so với các loại tế bào gốc và tế bào tiền thân khác đã được nghiên cứu với mục đích sửa chữa tái tạo mô cơ tim trong điều trị các bệnh tim mạch nói chung và NMCT nói riêng

MSC có nhiều đặc tính nổi trội với vai trò ứng cử viên cho liệu pháp cấy

ghép tế bào, bao gồm: i) dễ dàng nuôi cấy đạt số lượng lớn; ii) có tiềm năng sửa

chữa thành mạch cũng như cơ tim; iii) có các thuộc tính điều hòa miễn dịch và khả năng ứng dụng trong điều trị đồng loại (allogenetic) Những đặc tính này là

kết quả thu được từ các nghiên cứu cơ bản cũng như những ứng dụng điều trị tim mạch

1.2.5.1 Sự biểu hiện các marker đặc hiệu cơ tim

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh MSC có được kiểu hình của tế bào cơ tim

khi biệt hóa in vitro (bằng 5-azacytidin) và in vivo (trong mô hình chuột bị gây NMCT) [122] Ngoài ra, một số phương pháp biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế

bào cơ tim khác cũng cho kết quả tương tự

Các marker đặc hiệu tế bào cơ tim như: yếu tố phiên mã đặc hiệu tim (Nkx2.5, GATA4) và các protein thuộc đơn vị co cơ (sacomeres) như: myosin chuỗi nặng của tim (cardiac myosin heavy chain - MHC), α-sarcomeric actinin, cTnT (cardiac troponin T) biểu hiện ở MSC khi đồng nuôi cấy với tế bào cơ tim trưởng thành [8],[133],[136] Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh khả năng MSC biểu hiện kiểu hình của tế bào cơ tim trong mô cơ tim khỏe mạnh cũng như mô cơ tim bị nhồi máu [112],[122]

Không chỉ biểu hiện các protein co cơ, MSC trong điều kiện nuôi cấy giọt treo, sau đó là nuôi cấy trong mạng lưới ngoại bào (extracellular matrix - ECM)

đã được chứng minh là có khả năng hình thành các protein đặc hiệu khác của tế bào cơ tim như: α1c - các tiểu đơn vị α của kênh canxi loại L đặc hiệu tim (cardiac-specific L-type calcium channel), Kv4.3 – kênh vận chuyển kali ra ngoài (transient outward potassium channel) và ANP [138],[96]

1.2.5.2 Sự kết nối tế bào – tế bào thông qua các mối liên kết khe (gap junctions)

Khả năng liên kết của MSC với các tế bào cơ tim tại chỗ được chứng minh khi các MSC này biểu hiện connexin 40 và connexin 43 - các protein nằm trong các mối liên kết khe liên tế bào cơ tim trưởng thành, với điều kiện bổ sung vào môi trường nuôi cấy các yếu tố tăng trưởng như: FGF-2 (fibroblast growth factor 2), IGF-1 (insuline - like growth factor 1), BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) Các kênh nối chức năng đặc hiệu của tế bào cơ tim được cấu tạo bởi connexin 40 và connexin 43 không chỉ là nơi diễn ra sự thay đổi hiệu điện thế chức năng bất đối xứng cục bộ (partially asymmetric junctional currents) [124],

mà còn là kênh cho phép trao đổi các phân tử nhỏ và tín hiệu thứ cấp của các tế bào ở gần nhau, có vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ tế bào cơ tim [56]

1.2.5.3 Giải phóng các cytokin có tác dụng bảo vệ mô tim và hoạt hóa các tế bào tiền thân khác

MSC không chỉ tác động tới các tế bào lân cận thông qua cơ chế tiếp xúc trực tiếp mà còn thông qua hoạt động cận tiết (paracrine), tiết ra các tác nhân

tham gia vào quá trình làm tổ, phân bào, chống apoptosis và tân tạo mạch Các tác nhân này còn là những tác nhân có vai trò nuôi dưỡng như: VEGF, HGF (hepatocyte growth factor), IGF-1 và SDF-1 (stromal cell-derived factor-1α) [89],[137] MSC biến đổi gen, tăng cường biểu hiện gen Akt – gen mã hóa cho một loại tín hiệu nội bào có bản chất protein, có khả năng giải phóng ra các yếu

tố bảo vệ mô tim, đủ tác động bảo vệ tế bào trong mô hình gây thiếu oxy tâm thất của chuột trưởng thành [53]

Hiện nay, người ta đã chứng minh tác động cận tiết của MSC có thể được

sử dụng như một liệu pháp nhằm hoạt hóa các tế bào gốc tim nội sinh HGF là một trong nhiều yếu tố được tiết ra bởi MSC Những yếu tố này tác động đến các tế bào gốc tim nội sinh, nhờ đó thúc đẩy sự hoạt hóa, tăng sinh, di chuyển và biệt hóa các tế bào này [84]

MSC cũng tiết ra SDF-1α (stromal cell-derived factor-1α) [137], một chemokin có tác dụng đối với sự di chuyển của EPC, có tác dụng hình thành mạch máu mới Mặt khác các nghiên cứu cũng cho thấy các chemokin có tác dụng điều tiết sự tuyển mộ HSC và hỗ trợ nuôi dưỡng tế bào cơ tim trong mô cơ tim [137]

1.2.5.4 Biểu hiện đa dạng các marker tế bào cơ trơn, tế bào nội mô và tế bào

cơ tim

Tế bào cơ tim trưởng thành biệt hóa cao nên mô cơ tim hạn chế về khả năng

tự tái tạo khi xảy ra sự thiếu hụt tế bào do hoại tử Việc cấy ghép tế bào gốc và

tế bào tiền thân vào mô cơ tim không chỉ nhằm tăng sinh các tế bào sau cấy ghép có khả năng co bóp, thay thế các tế bào cơ tim đã mất đi, tạo sự bắt cặp điện cơ với tế bào cơ tim tại chỗ mà còn cần có sự biệt hóa đa dạng tạo nên các loại tế bào khác thuộc mô cơ tim như tế bào nội mô và tế bào cơ trơn [97] Tác nhân khử methyl hóa DNA (5-azacytidin) từ lâu đã được biết đến như

là chất gây biệt hóa MSC theo hướng tạo tế bào cơ tim Các nghiên cứu chứng minh rằng khi xử lý với 5-azacytidin, MSC có biểu hiện của kênh Ca2+

và K+(current flux across) đặc trưng cho tế bào cơ tim [12]

MSC của chuột tăng sinh khi nuôi cấy cùng với tế bào cơ tim hoặc tế bào cơ trơn trưởng thành và biểu hiện các marker của tế bào cơ tim (α-actin, desmin, cTnT) hoặc tế bào cơ trơn (calponin và αSMA) tương ứng [129] Thêm vào đó,

sự biệt hóa MSC theo hướng tế bào nội mô khi có mặt các tác nhân VEGF,

IGF-1 và EGF trong môi trường biệt hóa cũng được mô tả từ nhiều nghiên cứu khác nhau Các tế bào sau biệt hóa dương tính khi nhuộm với kháng thể kháng von

Willebrand factor (vWF) và VEGF receptor-2 (Flk-1) [75]

Đáng chú ý là việc xử lý ex vivo MSC với hỗn hợp insulin, dexamethason

và ascorbic acid gây biểu hiện: troponin I, sarcomeric tropomyosin và titin của tim, do vậy đã hình thành các tế bào dạng tế bào cơ tim [114] Những phát hiện gần đây cho thấy các protein biểu hiện trong vùng cơ tim bị nhồi máu như TGF-

β1 và BMP-2 có thể cảm ứng in vitro MSC, dẫn tới sự biểu hiện các marker đặc

trưng tim đối với tập hợp MSC này [30]

1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY XƯƠNG NGƯỜI

Mật độ MSC trong tủy xương và các mô trưởng thành là rất thấp nên để có

đủ số lượng tế bào cho nghiên cứu in vitro, in vivo cũng như các thử nghiệm lâm

sàng, đòi hỏi phải thực hiện các bước phân lập và nhân nuôi ngoài cơ thể Điều kiện nuôi cấy còn hỗ trợ việc loại bỏ HSC khi phần lớn HSC không có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy như đối với MSC Do vậy, có thể nói sự kết hợp hai giai đoạn: phân lập và nuôi cấy đã tạo ra một quần thể MSC nuôi cấy nhất định Hiện nay những mô tả về đặc điểm của MSC phần lớn có được từ việc nghiên cứu các tập hợp MSC này, những hiểu biết về MSC nguyên thủy còn rất hạn chế

1.3.1 Phân lập tế bào gốc trung mô tủy xương người

Nhiều phương pháp phân lập khác nhau đã được mô tả để có thể thu được một tập hợp chứa MSC từ hỗn hợp ban đầu là các tế bào của tủy xương người Hiện nay phương pháp phân lập MSC thường dựa trên các nguyên lý là sự kết

hợp đa dạng các đặc tính của MSC: i) khả năng bám dính, ii) các đặc điểm nhân

và bào tương, iii) các marker bề mặt âm tính hoặc dương tính

1.3.1.1 Dựa vào khả năng bám dính của tế bào gốc trung mô

 Cơ sở: MSC có các phân tử bám dính trên bề mặt tế bào, do vậy trong điều

kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các tế bào này có khả năng bám đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy và có hình dạng giống nguyên bào sợi [38] Trong khi đó, HSC trong tủy xương không có khả năng bám dính này, sẽ bị loại bỏ dần khi thay mới môi trường

Phương pháp phân lập dựa vào khả năng bám dính của MSC là phương pháp được Friedenstein và cs mô tả [44], nhờ đó tác giả phát hiện trong tủy xương chuột một loại tế bào có khả năng bám dính, không thuộc dòng tế bào máu và có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào Hiện nay khả năng bám dính vẫn được dùng để phân lập MSC Phương pháp này còn được áp dụng có hiệu quả đối với phân lập MSC có nguồn gốc từ các mô rắn như thành mạch máu, thành dây rốn và trở thành một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để xác định tập hợp

tế bào là MSC sau khi phân lập từ một mô nào đó trong cơ thể [38]

Ngoài ưu điểm là không đòi hỏi nhiều loại trang thiết bị, hạn chế của phương pháp là hiệu quả nuôi cấy sơ cấp MSC từ tủy xương thấp do trong tủy xương chiếm chủ yếu là các tế bào thuộc dòng máu ở nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau

1.3.1.2 Dựa vào tỷ trọng của tế bào – Kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng

 Nguyên lý: Tạo lớp dung dịch tỷ trọng khác biệt với tỷ trọng của loại tế bào

cần tách Trong hỗn hợp tế bào của dịch tủy xương, MSC thuộc loại tế bào đơn nhân, có tỷ trọng tương đương với tế bào lympho và bạch cầu mono Các tế bào đơn nhân có tỷ trọng thấp hơn hồng cầu và bạch cầu hạt Một hệ gradient tỷ trọng được tạo ra bằng cách sử dụng một dung dịch có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng của MSC nhưng thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt Cho dung dịch

tỷ trọng này vào ống ly tâm, nhỏ hỗn dịch tế bào của tủy xương (được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy) lên phía trên sao cho tạo được diện tiếp xúc phân biệt

giữa hai lớp Sau khi ly tâm, tập hợp tế bào đơn nhân có chứa MSC tạo thành một lớp tế bào “vòng nhẫn”, nằm sát trên lớp dung dịch tỷ trọng Hồng cầu và bạch cầu hạt nằm ở đáy ống, phía dưới của lớp dung dịch tỷ trọng

- Các loại dung dịch tỷ trọng: Trong phân lập MSC cũng như tế bào đơn nhân

tủy xương, người ta thường sử dụng dung dịch có tỷ trọng 1,073 g/ml hoặc 1,077 g/ml, ví dụ:

* Các sản phẩm Ficoll: Ficoll là dung dịch chứa các hạt polysaccharid

(sucrose) trọng lượng phân tử cao và natri diatrizoate trung tính, kị nước, kích thước hạt từ 2 ÷ 7 nm Histopaque - 1077 và Ficoll – uromiro là các loại dung dịch Ficoll có tỷ trọng 1,077 g/ml

* Các sản phẩm Percoll: Percoll là dung dịch chứa các hạt colloidal silica,

đường kính 15 ÷ 30 mm (23% w/w trong nước), được bao phủ bởi polyvinylpyrrolidon Percoll được dùng trong phân tách các tế bào, bào quan, virut bằng ly tâm tỷ trọng do có độ nhớt thấp, độ thẩm thấu (osmolarity) thấp, không gây độc cho tế bào và các thành phần của tế bào

Kỹ thuật ly tâm gradient theo tỷ trọng thu hoạch các tế bào đơn nhân tủy

xương là kỹ thuật được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu phân lập MSC in

vivo và in vitro, với ưu điểm là dễ tiến hành và mang lại hiệu quả phân lập cao

Kỹ thuật này có thể phối hợp với các kỹ thuật khác nhằm tăng cường hiệu quả

và chất lượng phân lập MSC từ nhiều loại dịch cơ thể khác nhau: dịch hút mỡ, dịch hút tủy xương, máu tuần hoàn, dịch ối

1.3.1.3 Dựa vào các kháng nguyên bề mặt

 Cơ sở: MSC đã được xác định biểu hiện một số marker bề mặt đặc trưng

[38], tuy nhiên đây là sự mô tả tập hợp MSC sau khi đã phân lập và nuôi cấy Một số marker khác hiện đã được sử dụng để chọn lựa trực tiếp từ tủy xương để

có được một tập hợp tế bào có khả năng tăng sinh mạnh và có các đặc điểm của MSC, bao gồm: Stro – 1, CD49a, CD146, CD271 [103] Việc sử dụng các marker bề mặt thông qua phản ứng miễn dịch để chọn lọc âm tính hoặc dương tính Quá trình chọn lọc tế bào sau đó được thực hiện trên các thiết bị chuyên