Nghiên cứu nuôi cấy cảm ứng biệt hóa in vitro tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào sụn

Bên cạnh đó chứng minh đượckhả năng biệt hóa thành tế bào sụn trên in vitro của chính các mẫu TBG mô mỡ đã được cấy ghép vào ổ khớp của bệnh nhân để điều trị thoái hóa khớp sẽ là minh c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

1 TS Đỗ Minh Trung

2 PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm

Hà Nội – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài cấp Nhà Nước ―Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tự thân trong điều trị bệnh thoái hóa khớp‖ mang Mã số: ĐTĐL 2012-G/21 do Học viện Quân y chủ trì

Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận văn này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Nam

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơntới PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học Phân tử cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học Phân tử, Trung tâm nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Minh Trung tại Học viện Quân y cùng các cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi để đề tài được triển khai bảo đảm tiến độ và chất lượng

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tế bào gốcvà phân loại tế bào gốc 3

1.1.1 Tế bào gốc 3

1.1.2 Phân loại tế bào gốc 5

1.2 Tế bào gốc trung mô 9

1.2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc trung mô 9

1.2.2 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô [24] 10

1.3 Tế bào gốc mô mỡ 14

1.3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc từ mô mỡ 14

1.3.3 Ứng dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ để điều trị bệnh ở người 16

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc ở Việt Nam 18

1.4 Bệnh thoái hóa khớp 22

1.4.1 Tình hình mắc bệnh 22

1.4.2 Cơ chế bệnh sinh thoái hoá khớp 23

1.4.3 Một số biến đổi trong bệnh thoái hóa khớp 24

1.5 Các phương pháp điều trị thoái hóa khớp 26

1.5.1 Điều trị không dùng thuốc 26

1.5.2 Điều trị bằng thuốc 26

1.5.3 Điều trị bằng phẫu thuật 26

1.5.4 Điều trị thoái hóa khớp bằng huyết tương giàu tiểu cầu 27

1.5.5 Điều trị thoái hóa khớp bằng tế bào gốc 27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Xác định số lượng và tỷ lệ tế bào sống 30

2.2.2 Xác định độ vô khuẩn của tế bào 30

2.2.3 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 30

2.2.4 Xác định các dấu ấn của tế bào bằng flowcytometry 31

2.2.5 Thu hoạch và bảo quản tế bào 31

2.2.6 Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu 31

2.2.7 Biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ theo hướng tạo thành tế bào sụn: 32

2.2.8 Địa điểm nghiên cứu 34

2.2.9 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ 35

3.2 Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 38

3.3 Nuôi cấy cảm ứng biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào sụn 42

3.3.1 Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào sụn 42

3.4 Biệt hóa tế bào 45

3.5 Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc từ mô mỡ trong quá trình biệt hóa theo hướng thành giống tế bào sụn 46

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DMSO Dimethyl sunfoxide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bê)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát các thành phần môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào sụn 33Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào sụn bằng kỹ thuật RT-PCR 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Khả năng tự tái tạo và biệt hóa tế bào gốc 3

Hình 1.2: Các hình thức phân bào 4

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG 5

Hình 1.4Phân loại tế bào gốc 7

Hình 1.5 Biệt hóa tế bào gốc phôi 7

Hình 1.7 Sự biệt hóa của tế bào gốc mô mỡ 15

Hình 1.8 Cách thức sử dụng tế bào gốc điều trị thoái hóa khớp gối 17

Hình 1.9 Hình ảnh minh họa các mức độ tổn thương sụn khớp 23

Hình 3.1: Nuôi cấy tăng sinh TBG từ Mô mỡ 36

Hình 3.2: Hình ảnh tế bào gốc mô mỡ 36

Hình 3.3: Nhuộm Giemsa tế bào 37

Hình 3.4: Đường cong tăng trưởng của TBG từ mô mỡ 37

Hình 3.5: Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của tế bào sau khi cấy chuyền lần 3 (P3) 39

Biểu đồ 3.6: Nồng độ collagen type II ở các mẫu tế bào được khảo sát ở các môi trường cảm ứng biệt hóa khác nhau 44

Biểu đồ 3.7: Đường chuẩn của collagen type II 44

Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm tế bào bằng Alcian Blue 46

Hình 3.9: Xác định dấu ấn -actin 48

Hình 3.10: Xác định dấu ân Aggrecan của tế bào biệt hóa 49

Hình 3.11: Xác định dấu ân collagen type II của tế bào biệt hóa 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp nhất (chiếm tỷ lệ cao nhất ở các nước phát triển và đang phát triển), gây đau đớn kéo dài cho hàng trăm triệu người, gây tàn phế cho nhiều người Ngoài tác động rất lớn về kinh tế, xã hội, các bệnh xương khớp còn ảnh hưởng nặng nề đến tâm lý, tình cảm của con người Trong các bệnh về xương khớp, bệnh thoái hoá khớp là một trong những bệnh hay gặp Bệnh gây đau đớn kéo dài cuối cùng dẫn đến mất chức năng vận động và tàn phế Bệnh thường xuất hiện ở lứa tuổi trung niên trở đi Biểu hiện bệnh lý sớm nhất

ở sụn khớp bởi các thay đổi về hình thái, sinh hóa, phân tử và sinh học của tế bào và chất cơ bản của sụn dẫn đến nhuyễn hóa, nứt loét và mất sụn khớp Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị nhưng phần lớn các biện pháp điều trị, như dùng thuốc giảm đau, chống viêm và bổ xung dịch khớp đều chỉ mang lại tác dụng giảm đau cho người bệnh mà chưa giải quyết được quá trình tiến triển của bệnh thoái hóa khớp Bên cạnh đó, đa số các thuốc điều trị thoái hóa khớp đều có nhiều tác dụng không mong muốn liên quan tới việc sử dụng dài ngày các thuốc điều trị

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy việc sử dụng tế bào gốc (TBG) trưởng thành có nhiều tiềm năng điều trị rất lớn Hiện nay TBG trưởng thành có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó phổ biến nhất là lấy từ tủy xương và

mô mỡ Kỹ thuật lấy TBG từ mô mỡ có thể cho số lượng tế bào gốc tương đương hoặc lớn hơn so với kỹ thuật lấy từ tủy xương, đây cũng là kỹ thuật ít xâm nhập và

ít gây đau cho bệnh nhân Chính vì vậy mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng

và dễ thực hiện việc phân lập TBG để dùng trong điều trị Trong số các tế bào của

mô mỡ, phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal-vascular fraction: SVF) được quan tâm nhiều trong nghiên cứu TBG, vì đây là nguồn cung cấp các TBG đa tiềm năng TBG từ mô mỡ có thể biệt hóa thành sụn và xương… điều này thể hiện tiềm năng của chúng trong chữa trị bệnh thoái hóa khớp Đã có một số nghiên cứu sử dụng TBG tự thân từ mô mỡ để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy biện pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh

Để kiểm soát chất lượng sản phẩm mẫu TBG được cấy ghép vào cơ thể bệnh nhân, việc đánh giá chất lượng tế bào gốc mô mỡ ở các giai đoạn sau phân lập, bảo quản và hoạt hóa là yêu cầu thiết yếu Bên cạnh đó chứng minh đượckhả năng biệt

hóa thành tế bào sụn trên in vitro của chính các mẫu TBG mô mỡ đã được cấy ghép

vào ổ khớp của bệnh nhân để điều trị thoái hóa khớp sẽ là minh chứng gián tiếp khẳng định cơ chế các TBG được cấy ghép tham gia vào tái tạo mô sụn khớp tổn thương Xa hơn nữa việc cảm ứng biệt hóa TBG mô mỡ thành tế bào sụn trước khi cấy ghép vào ổ khớp cũng là một hướng nghiên cứu nhằm tăng khả năng thành công cũng như rút ngắn thời gian điều trị sau cấy ghép nhờ rút ngắn được thời gian

biệt hóa in vivocủa các TBG sau khi đã được cấy ghép vào ổ khớp.Từ những cơ sở

lý luận và thực tiễn trên chúng tôi tiến hành Đềtài “Nghiên cứu nuôi cấy cảm ứng

biệt hóa in vitro tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào sụn” vớicác mục tiêuchính

của đề tài là:

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ

2 Biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ theo hướng tạo thành tế bào sụn

Hình 1.1: Khả năng tự tái tạo và biệt hóa tế bào gốc [25]

Tự thay mới là khả năng của các TBG tạo ra các tế bào giống hệt chúng về mức độ biệt hóa Thông thường các tế bào phân chia theo kiểu đối xứng như từ một

tế bào tạo ra 2 tế bào giống hệt nhau; các TBG là các tế bào có khả năng phân chia không đối xứng, nghĩa là từ một tế bào tạo ra 2 tế bào không đối xứng nhau, 1 tế bào giống hệt tế bào ban đầu về mức độ biệt hóa, tế bào còn lại đã biệt hóa hơn sẽ tiếp tục phân chia như vậy để tạo thành các tế bào, cơ quan chuyên biệt Khả năng

tự thay mới có đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt chính là cơ sở cho những tiềm năng ứng dụng to lớn của công nghệ TBG [24]

Hình 1.2: Các hình thức phân bào[24]

Nghiên cứu về TBG có thể cho ta thêm những hiểu biết về quá trình biệt hóa

tế bào và sự phát triển của cơ thể người Bản chất của quá trình biệt hóa là việc tắt các gen trong vốn gen chung Hiểu rõ về quá trình này ta có thể chủ động và kiểm soát để tạo ra các tế bào như mong muốn hoặc điều trị các bệnh di truyền

Trên cơ sở các TBG chưa hoàn tất quá trình biệt hóa và khả năng tăng sinh mạnh mẽ của chúng, các nhà khoa học có thể chủ động tạo ra các tế bào giống hệt nhau và ở các giai đoạn sinh lý, bệnh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng, điều này rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như độc tính của các loại thuốc hay các chế phẩm sinh học [24]

Và có thể nói ứng dụng quan trọng và rộng lớn nhất của công nghệ TBG là trong điều trị Trên cơ sở các TBG có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, chúng ta có thể chủ động nuôi cấy TBG trong ống nghiệm sau đó biệt hóa chúng thành các tế bào như tế bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào sụn, tế bào tuyến tụy, tế bào cơ tim… rồi ghép vào cơ thể người bệnh để điều trị một số bệnh như các bệnh lý tim mạch, điều trị Parkinson, tiểu đường, trong lĩnh vực thẩm

mỹ hay thúc đẩy quá trình liền xương… [47]

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG

(Nguồn: http://khoahoc.tv)

1.1.2 Phân loại tế bào gốc

Có nhiều cách để phân loại tế bào gốc như: phân loại dựa vào tiềm năng biệt hóa, phân loại dựa theo nguồn gốc phân lập và phân loại dựa vào kiểu tế bào

mà chúng biệt hóa

1.1.2.1 Phân loại theo đặc tính hay tiềm năng biệt hóa

Theo tiềm năng biệt hóa có thể xếp tế bào gốc thành 4 loại: Tế bào gốc toàn năng (các tế bào phôi dâu), TBG vạn tiềm năng (các tế bào tách từ khối tế bào bên trong của phôi nang), TBG đa tiềm năng (các tế bào tách từ ba lá phôi), TBG đơn năng (tế bào tạo máu…) [24]

 Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cell):

Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào cơ thể từ một tế bào ban đầu Tế bào toàn năng có khả năng phát triển thành thai nhi, tạo ra 1

cơ thể sinh vật hoàn chỉnh Trứng đã thụ tinh (hợp tử) và các tế bào được sinh ra từ các lần phân chia đầu tiên của tế bào trứng đã thụ tinh (giai đoạn 2-4 tế bào – các blastosomer) là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phân chia và biệt hóa ra tất cả các dòng tế bào để tạo ra cơ thể sinh vật hoàn chỉnh [3]

 Tế bào gốc vạn tiềm năng (Pluripotent stem cell):

Là khối tế bào bên trong của Blastocyst Là tế bào có khả năng biệt hoá thành tất cả các tế bào ngoại trừ tế bào phôi

 Tế bào gốc đa tiềm năng (Multipotent stem cells):

Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể từ một tế bào ban đầu Trong cơ thể người, các tế bào gốc đa năng có mặt ở nhiều mô khác nhau như màng xương, máu, tủy xương, cuống rốn, mô mỡ… Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ chỉ tạo nên các

tế bào máu (bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lympho…) hoặc chỉ tạo nên các

tế bào của hệ thống các cơ quan có nguồn gốc từ trung mô thời kì phôi thai như xương, sụn, cơ, khớp, thần kinh, mỡ

 Tế bào gốc đơn năng (Mono/unipotential stem cells):

Tế bào gốc đơn năng còn gọi là tế bào định hướng đơn dòng hay tế bào đầu dòng (progenitor cells), là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một dòng Ví dụ mẫu tiểu cầu, tế bào định hướng dòng lympho, tế bào định hướng dòng hồng cầu, dòng bạch cầu Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều mô đã biệt hóa tính đơn năng và có thể biệt hóa thành chỉ một dòng tế bào Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo

mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào mô mới [35]

1.1.2.2 Phân loại theo dựa theo nguồn gốc phân lập

Theo nguồn gốc phân lập có thể phân tế bào gốc thành: Tế bào gốc phôi, tế bào mầm phôi, tế bào gốc thai, tế bào gốc trưởng thành

Hình 1.4Phân loại tế bào gốc[22]

 Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells):

Tế bào gốc phôi là tế bào gốc vạn năng được lấy từ phôi giai đoạn sớm (4-7 ngày tuổi) Ở giai đoạn này phôi có hình cầu và được gọi là phôi túi (blastocyst) Blastocyst có cấu trúc gồm 3 thành phần: Một lớp tế bào bên ngoài (trophoblast), một khoang chứa đầy dịch và một nhóm có khoảng 30 tế bào vạn năng nằm lệch về một cực gọi là khối tế bào bên trong (inner cell mass) Dùng một loại enzyme đặc biệt để phân tách các tế bào của khối này sẽ thu được cáctế bào gốc phôi

Hình 1.5 Biệt hóa tế bào gốc phôi[25]

Trong những điều kiện nhất định, các tế bào này có thể biệt hóa thành bất kì loại tế bào nào trong cơ thể, về tiềm năng biệt hóa thì đây chính là các tế bào vạn tiềm năng Hơn nữa các tế bào này còn rất non nên có khả năng tăng sinh rất mạnh

mẽ, chúng có thể nhanh chóng tạo ra một số lượng lớn các tế bào nếu được cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết, do vậy các tế bào này có tiềm năng rất lớn trong điều trị Đây cũng là loại tế bào được quan tâm nhiều nhất không chỉ vì tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng mà còn vì vấn đề đạo đức xung quanh việc sử dụng các

tế bào này bởi lẽ để thu được các yếu tố này cần phải phá hủy phôi đồng nghĩa với việc ―giết người‖ và điều này bị nhiều tổ chức và quốc gia lên án [24]

Nguồn phôi cho thu nhận tế bào gốc hiện tại chủ yếu có từ công nghệ IVF hay ICSI Bằng một trong hai kĩ thuật này, từ các tinh trùng và trứng, nhiều phòng thí nghiệm có thể tạo ra phôi một cách chủ động Phôi được nuôi, ủ và thu nhận tế bào gốc ở giai đoạn cần thiết Ngoài nguồn trên, một số trung tâm, phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển các nguồn tế bào gốc từ phôi chuyển nhân, chuyển gen, hay phôi tạo dòng hoặc nhân bản Đây là hướng đi mới để tạo nguồn tế bào gốc phôi sử dụng trong điều trị bệnh

 Tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells):

Tế bào mầm phôi là các tế bào mầm nguyên thủy có tính vạn năng Đó là những tế bào sẽ hình thành nên giao tử (trứng và tinh trùng) ở người trưởng thành Các tế bào mầm nguyên thủy này được phân lập từ phôi 5-9 tuần tuổi hoặc từ thai nhi So với tế bào phôi, các tế bào mầm phôi khó duy trì dài hạn hơn trong nuôi cấy nhân tạo do chúng ở giai đoạn biệt hóa cao hơn [46]

 Tế bào gốc thai (Foetal stem cells):

Tế bào gốc thai (tế bào gốc vạn năng hoặc đa năng) thường được thu nhận từ các mô của thai bỏ, hay các phần phụ của thai nhi sau khi sinh Tuy nhiên, vấn đề đạo lí luôn là cản trở lớn nhất

 Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells):

Còn gọi là tế bào gốc thân Là các tế bào chưa biệt hóa được tìm thấy với một lượng ít các mô người trưởng thành (máu ngoại vi, mô da, mô cơ, mô mỡ…) Đặc biệt trong cơ thể, vai trò chủ yếu của các tế bào gốc trưởng thành là duy trì và sửa chữa mô mà ở đó chúng được tìm ra Tế bào gốc trưởng thành được cho là có

tính đa năng, chúng có thể phát triển thành nhóm các tế bào có quan hệ mật thiết với nhau trong cùng mô Một số loại tế bào gốc trưởng thành có thể có tính vạn năng, hoặc ít nhất có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [62]

Ngày nay, các nhà khoa học càng ngày càng phát hiện ra nhiều ổ tế bào gốc trưởng thành Các kiến thức về vị trí của các ổ tế bào gốc ở các cơ quan, mô đã giúp chỉ ra cách thu nhận và sử dụng chúng trong điều trị bệnh Trong các ổ tế bào gốc trưởng thành, ổ tế bào gốc tủy xương được quan tâm và biết rõ hơn cả Đã từ lâu, tủy xương được xác định là nơi cư ngụ của nhiều tế bào gốc tạo máu Đó là nguồn

tế bào gốc quan trọng trong cơ chế điều hòa số lượng tế bào máu, chúng được đảm bảo cân bằng trong suốt quá trình sống của cơ thể Ngoài tế bào gốc tạo máu, tủy xương còn được biết như là một trong các mô có chứa nguồn tế bào gốc trung mô Nguồn tế bào này có tính mềm dẻo cao, chúng có thể biệt hóa, hay chuyển biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau

 Tế bào gốc ung thư (Cancer Stem cells):

Là những tế bào được lấy ra trực tiếp từ khối u Chúng có những đặc điểm tương đối giống với tế bào gốc phôi và có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào

Các tế bào gốc ung thư được tạo ra bởi các đột biến từ các tế bào gốc bình thường Tuy nhiên, một vài dòng cho thấy rằng tế bào gốc ung thư cũng tạo ra từ các tế bào tiền thân bị đột biến Các tế bào tiền thân này (cũng còn gọi là các tế bào khuyếch đại chuyển – TAC) có thể có khả năng khuyếch đại, nhưng chúng thường không có khả năng tự làm mới như một tế bào gốc Để trở thành tế bào gốc ung thư, một tế bào tiền thân phải có sự tích tụ các đột biến gây nên sự lặp lại, tạo đặc tính tự làm mới

1.2 Tế bào gốc trung mô

1.2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô là tế bào gốc trưởng thành, đa tiềm năng được thu nhận

từ những mô có nguồn gốc từ trung bì như: xương, sụn, chất nền tủy xương, mô xơ

cơ ở khoảng giữa hai tổ chức, cơ vân, mô mỡ [24]

Các tế bào gốc trung mô có hình dáng đặc trưng và giống với các nguyên bào sợi: Đó là các tế bào hình thoi, kích thước 20μm, có nhiều nhánh bào tương, nhân lớn, trong tế bào, lưới nội bào hạt rất phát triển

1.2.2 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô [24]

Mỗi loại tế bào được biệt hóa biểu hiện một số lượng gen nhất định của genome và mỗi một loại tế bào được hình thành qua một kiểu biểu hiện riêng của gen được điều hòa Vì vậy sự biệt hóa tế bào là sự chuyển đổi từ một loại tế bào này thành một loại khác và nó liên quan đến một ―công tắc‖ đóng một số gen đang hoạt động và mở một số gen chưa hoạt động Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều hướng phù hợp với các yếu tố kích thích và sẽ tạo thành một kiểu tế bào chuyên biệt nào đó

Tế bào gốc trung mô là các tế bào có khả năng tăng sinh mạnh mẽ và có thể biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau như các tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh… nói cách khác đây chính là các tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng, chúng là nguồn cung cấp tế bào để bù đắp lại sự thiếu hụt mô Trong cơ thể dưới tác dụng của các tín hiệu từ các vết thương, ổ gẫy xương, ổ viêm, hay chỉ là các điều kiện vi môi trường từ một vị trí đặc biệt nào đó các tế bào này sẽ được huy động và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt

TBG trung mô có khả năng biệt hóa trong điều kiện in vitro, biệt hóa có thể được thực hiện theo những phương pháp như:

- Sử dụng hóa chất cảm ứng biệt hóa: Một số hormone, cytokine, vitamin, các ion Ca2+… một số hóa chất hay sử dụng trong cảm ứng biệt hóa tế bào như Dexamethason, Indomethacin, Hydrocortison, TGF-β với một hàm lượng và tỷ lệ nhất định tùy thuộc vào mỗi loại tế bào Các hóa chất tác động lên tế bào làm tế bào thay đổi sự biểu hiện của gen, hoặc đóng một số gen đang hoạt động và mở một số gen chưa hoạt động Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều hướng phù hợp với kích thích, và sẽ tạo thành một kiểu tế bào chuyên biệt nào đó Ngoài

ra, các nhân tố tăng trưởng thu nhận từ các dịch mô cũng được xem là chất biệt hóa định hướng

- Biệt hóa bằng các chất nền: biệt hóa bằng các chất nền dựa vào sự tương tác giữa tế bào và chất nền trong nuôi cấy tế bào in vitro Tế bào hoạt động nằm trong chất nền ngoại bào ECM (Extra cellular matrix) ECM có chứa các hợp chất cao phân tử như collagen, laminin, fibronectin… Ngoài vai trò làm cấu trúc như một giá thể cho các tế bào, ECM còn có vai trò sinh lý như một vi môi trường của

các tế bào Mỗi mô khác nhau có thành phần ECM của riêng nó Do đó, việc bổ sung ECM thích hợp vào nuôi cấy in vitro giúp các tế bào gốc có thể biệt hóa thành các tế bào mong muốn

- Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa: Khi thực hiện đồng nuôi cấy, tế bào gốc và tế bào đã biệt hóa tương tác mật thiết với nhau, dẫn đến sự truyền các tín hiệu phân tử một cách hiệu quả gây ra sự biệt hóa ở tế bào gốc

- Kích thích vật lý: xung điện, các lực cơ học và xử lý nhiệt có thể làm tế bào gốc biệt hóa Nếu làm giảm nhiệt độ các tế bào cơ tim phôi chuột sẽ làm tăng sự biểu hiện của beta-TGF, tác nhân gây biệt hóa ở một số tế bào

- Các gốc tự do và dạng oxygen hoạt động: các gốc tự do và dạng oxygen hoạt động là những chất truyền tin nội bào quan trọng trong quá trình biệt hóa của

tế bào

- Chuyển gen: phương pháp này thường được sử dụng để điều hòa sự biệt hóa tế bào gốc phôi Đưa gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung một số gen hoạt động vào hệ gen của tế bào gốc phôi, khởi động sự biệt hóa tế bào gốc theo con đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn

 Biệt hóa thành sụn:

Sự biệt hóa MSC thành sụn là một dấu hiệu quan trọng trong sự tái sinh sụn Sụn có khả năng tái sinh thấp bởi sự khan hiếm các tế bào tiền thân tạo sụn trong cơ thể người trưởng thành Hầu hết tế bào trong khớp xương trong người lớn là những

tế bào sụn đã trưởng thành, thay vì những tế bào tiền thân sụn có khả năng tăng nhanh và biệt hóa thành tế bào sụn [22]

- Các nhân tố phát triển chuyển dạng TGF-β1, TGF-β2 hay TGF-β3 cũng được mô tả kích thích sự tạo thành sụn của MSC Sự kết hợp của TGF-β3 và protein-6 tạo hình thể xương (BMP-6), gia tăng sự tích tụ của chất nền sụn

- Quy trình biệt hóa thành sụn [22]:

+ Môi trường biệt hóa thành sụn: 95% DMEM high glucose, 1% 1X ITS +

1 Solution, 1% kháng sinh, 100 µg/ml sodium pyruvate, 50 µg/ml L-ascorbic axit 2-phosphate (AsAP), 40 µg/ml L-proline, 0,1 µM dexamethasone và 10 ng/ml TGF-β3

Sử dụng thuốc nhuộm mô là cách tiện lợi để quan sát sự biệt hóa thành sụn của các tế bào MSC Thuốc nhuộm là tác nhân nhạy cảm với proteoglycan và glycosaminoglycan sulfate Thuốc cảm ứng với các glycosaminoglycan và proteoglycan, bao gồm satranin-O/fast green và Alcian Blue Các thuốc nhuộm mô này đã được sử dụng để đánh dấu các sụn khớp và sự phát triển của đĩa sụn, do đó, chúng là dấu ấn đáng tin cậy cho sự biệt hóa sụn

Sự biệt hóa tạo sụn được điều khiển bởi các nhân tố phiên mã như họ SOX, SOX9 được biểu hiện trong các tế bào sụn đan biệt hóa, sự mất của SOX9 gợi ra sự hình thành xương sụn, giảm sự dị thường của phát triển xương SOX5 và SOX6 được biểu hiện trong suốt quá trình biệt hóa tạo sụn Sự tổng hợp sinh học của collagen type II và aggrecan được điều hòa bởi sự biểu hiện của SOX9 và SOX5, thông qua sự hoạt hóa gen COL2A1 và aggrecan Hơn nữa, các gen collagen như COL9A1, COL9A2, COL9A3 và COL11A2 được biểu hiện đáp ứng lại sự biểu hiện của SOX9

Các kỹ thuật RT-PCR, Western blot và hóa mô miễn dịch rất hiệu quả để xác định sự hiện diện của collagen type II, collagen type X, những proteoglycan khác như aggrecan, decorin và biglycan trong mô sụn Collagen và GAG sulfate có thể được đo một cách định lượng bằng việc sử dụng các tác nhân thương mại hóa sẵn

có, và các kít ELISA, hay các xét nghiệm hóa sinh [22]

1.2.3 Tiềm năng ứng dụng tế bào gốc trung mô [22]

Liệu pháp dựa vào tế bào gốc trung mô đang được tiến hành cho phục hồi các khiếm khuyết do chấn thương, bệnh mãn tính, những dị thường bẩm sinh và việc cắt bỏ khối u

 Cấy ghép:

Khả năng tăng sinh trong nuôi cấy, kết hợp với tiềm năng biệt hóa thành nhiểu kiểu hình, khiến MSC trở thành nguồn tế bào ứng viên cho chiến lược sửa chữa mô Một thuận lợi của việc sử dụng MSC là các tế bào này dễ dàng thu nhận bởi các quy trình tiêu chuẩn từ tủy xương, hay các mô khác Sau đó, tế bào có thể tăng sinh và sử dụng cho cấy ghép

 Sửa chữa xương:

Tiện ích của việc sử dụng MSC trong hàn gắn xương được mô tả tron khuyết tật xương nghiêm trọng của chuột MSC cũng được kiểm tra khả năng phục hồi

xương trong một mô hình lỗ hổng khuyết tật ở đùi chó Việc phân tích sự phát sinh hình thái mô và kĩ thuật X quang cho thấy, xương được lấp đầy các MSC hơn so với đối chứng

 Sửa chữa gân:

Các thử nghiệm về mô hình sửa chữa gân cho thấy, MSC đồng cấy ghép vào vật mang chất nền collagen có thể sẽ sát nhập vào mô mới MSC đã liên kết vào các sợi và các tế bào tại chỗ Để sửa chữa gân Achillies, người ta thấy MSC kết hợp với collagen type I đã lấy lại gần 65% trương lực tối đa của gân bình thường, so với 31% của trương lực tối đa trong đối chứng collagen type I không có tế bào

MSC đã có sự kết hợp với gel collagen type I, và chúng cũng cho thấy đã cải thiện được các đặc tính sinh hóa vào tuần thứ 4, hơn hẳn so với đối chứng không có

tế bào

 Sửa chữa sụn:

Mô sụn khó có khả năng để lành, đặc biệt trong những động vật trưởng thành MSC được quan tâm nhiều trong ứng dụng cho công nghệ tạo mô sụn, sửa chữa sụn

Một số nghiên cứu đã được chỉ đạo sửa chữa những khuyết tật sụn khớp, qua việc cấy MSC vào bên trong những cấu trúc polymere khác nhau, chẳng hạn những vật liệu polymere dựa trên axit hyluronic, axit polylactic

 Hệ thần kinh:

MSC được kiểm tra như là các tác nhân liệu pháp cho sự sửa chữa tổn Uthương não Chuột được tiêm với MSC với gắn với bromodeoxyuridine biểu hiện NruN, một protein chuyên biệt thần kinh, có tính axit, dạng sợi của thần kinh đệm Kiểm tra chức năng cho thấy có kết quả hồi phục quan trọng là đã hàn gắn kín động mạch não (so với đối chứng)

(2) MSC là quần thể tế bào đồng nhất có thể dễ dàng tăng sinh, và (3) MSC có tiềm năng biệt hóa thành nhiều kiểu hình tế bào hữu ích cho mục tiêu chuyên biệt mô Nhờ các thuận lợi trên đã gợi ra tiềm năng ứng dụng MSC vào công nghệ mô

 Điều trị bỏng và tái tạo da:

Tế bào gốc trung mô cũng được sử dụng trong điều trị các khuyết hổng da, cũng như tái tạo da trong những năm gần đây Nhiều báo cáo đã điều trị thành công các khuyết hổng da như bỏng, các vết loét khó lành trong các bệnh tiểu đường bằng tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương

1.3 Tế bào gốc mô mỡ

1.3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc từ mô mỡ

Ngoài ra mô mỡ còn thực hiện chức năng như một cơ quan nội tiết thông qua việc sản xuất ra một số hormone như adiponectin, resistin, angiotensin Thành phần tế bào của mô mỡ bao gồm các tế bào mỡ trưởng thành, tế bào tiền tạo mỡ, nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn mạch máu, tế bào nội mô mạch máu, tế bào quanh mạch, các đại thực bào và tế bào lympho Trong số các tế bào của mô mỡ, phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal-vascular fraction: SVF) được quan tâm nhiều trong nghiên cứu tế bào gốc, vì đây là nguồn cung cấp các tế bào gốc đa tiềm năng [9],[22],[29],[46],[56],[57],[63]

Tùy theo cách thu hoạch mô mỡ, phân lập tế bào, có những thuật ngữ khác nhau

về các tế bào tiền thân đa tiềm năng từ mô mỡ Ví dụ: tế bào thu được từ chọc hút mỡ,

tế bào nền thu được từ mô mỡ (adipose tissue-derived stromal cells: ADSC), tế bào tiền thân tạo mỡ (pre-adipocyte), phân đoạn tế bào nền mạch máu, và một số tên gọi khác

Do các tế bào gốc thu được từ mô mỡ chủ yếu là các tế bào gốc trung mô, phân đoạn tế bào này đôi khi còn được gọi là tế bào gốc trung mô thu được từ mô mỡ (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: ATMSC) Đây là các tế bào có hình dạng giống như nguyên bào sợi là hình thái của đặc trưng của tế bào gốc trung mô, giống với các tế bào gốc trung mô thu được từ các mô khác [22],[47],[63]

Năm 2001, Patricia Zuk, và nhóm nghiên cứu của Đại học California phát hiện thấy sản phẩm chọc hút mỡ sau khi rửa với dung dịch PBS và phân hủy với 0,075% collagenase thu được dung dịch giàu tế bào giống nguyên bào sợi cùng với lượng lớn các tế bào quanh mạch, tế bào nội mô và các tế bào cơ trơn Quần thể tế

bào này có thể được duy trì in vitro trong thời gian dài và có thể biệt hoá in vitro

thành các tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào cơ và tế bào xương khi được cảm ứng bằng các chất chuyên biệt [69] Tiếp sau đó, những công bố khác đã góp phần khẳng định tiềm năng của các tế bào gốc từ mô mỡ người có khả năng biệt hoá thành dòng cơ, sụn, thần kinh dưới các điều kiện thích hợp [29],[56],[58],[60]

Hình 1.7 Sự biệt hóa của tế bào gốc mô mỡ[22]

Các nghiên cứu về dấu ấn của tế bào gốc từ mô mỡ cho thấy chúng có các kiểu hình: Dương tính với những marker và gen: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49, CD49, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD166, HLA I, Fibronectin, Endomucin, ASMA, Vimentin, Collagen-1; Âm tính với những marker

và gen: CD11b, CD14, CD19, CD31, CD34, CD45, CD79a, CD80, CD117, CD133, CD144, HLA-DR, c-kit, MyD88, STRO-1, Lin, HLA lớp II Với kiểu hình này, các

tế bào gốc thu được từ mô mỡ thỏa mãn đặc tính của tế bào gốc trung mô; do vậy, có tác giả gọi tế bào gốc thu được từ mô mỡ là tế bào gốc trung mô [22],[46]

So sánh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ với tế bào gốc trung mô từ tủy xương,

De Ugarte và CS (2003) cho rằng dường như hai quần thể tế bào này tương tự nhau, chỉ có một vài khác biệt nhỏ, chủ yếu là kiểu biểu hiện các phân tử bám dính, từ đó

tác giả đã giả thuyết rằng, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tế bào gốc trung mô từ tủy xương là hai tiểu nhóm tế bào gốc trung mô Sự khác biệt một số dấu ấn của chúng có lẽ do môi trường sống đem lại [33] Nhìn trên phương diện thực hành, phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đơn giản hơn từ tủy xương, vì chỉ cần gây tê cục bộ đồng thời thu được số lượng tế bào lớn hơn (khoảng 4x107 tế bào/100 mL mỡ chọc hút so với 1x105 tế bào/30 mL dịch tủy xương) Hơn thế nữa, nhìn trên phương diện khả năng tăng sinh và biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau, nghiên cứu của Zhu và CS (2008) cho rằng các tế bào gốc mô mỡ tốt hơn so với tế bào gốc từ tủy xương [62].

Một trong những mối quan ngại về tế bào gốc là khả năng tạo khối u quái Các nghiên cứu của Pilar và CS (2011); Ra và CS (2011) tiêm tế bào gốc mô mỡ của người vào dưới da chuột nhắt không có miễn dịch thấy các tế bào gốc mô mỡ người vẫn sống sót nhưng không sinh khối u sau 17 tháng kể từ ngày tiêm Điều này cho thấy các tế bào gốc mô mỡ của người trưởng thành ít có khả năng gây ung thư, ngay cả trên cơ thể động vật không có miễn dịch là đối tượng ung thư dễ xuất hiện

từ các tế bào lạ nhất [50], [52] Sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân nuôi cấy tăng sinh in vitro một thời gian rồi sau đó tiêm trở lại cơ thể để điều trị rò hậu môn trong các nghiên cứu thử nghiệm giai đoạn I và II trên hàng trăm bệnh nhân không gặp trường hợp nào sinh ung thư Điều này cũng cho thấy thao tác nuôi cấy tăng sinh in vitro không làm tế bào gốc mô mỡ biến đổi bất thường thành tế bào ung thư (Garcia-Olmo và CS, 2005, 2009) [38],[39]

1.3.3 Ứng dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ để điều trị bệnh ở người

Tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ (Adipose derived stem cells-ADSC) có nhiều đặc điểm tương tự tế bào gốc tủy xương (Bone marrved stem cells-BM-ASCs) cả về mặt hình thái, sự phát triển và các phenotype trên bề mặt Cả hai đều có nguồn gốc

từ lá phôi giữa trong thời kỳ phát triển của bào thai nên còn gọi chung là tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells-MSC) Một tính chất rất quan trọng của ADSC, MSC là có thể phát triển, biệt hóa thành các tế bào có nguồn gốc trung mô như tế bào mô mỡ, nguyên bào sợi, tế bào cơ, xương, sụn, các tế bào tuyến… khi có các tín hiệu và các yếu tố tăng trưởng phù hợp Chúng dễ dàng tăng sinh trong môi trường nuôi cấy khiến MSC trở thành nguồn tế bào gốc đầy hứa hẹn trong y học tái tạo và liệu pháp tế bào

Việc thu nhận ADSC, MSC từ mô mỡ có một số ưu điểm vượt trội hơn các nguồn tế bào gốc trưởng thành khác đó là dễ dàng lấy mà không ảnh hưởng tới sức khỏe của người cho và số lượng tế bào gốc tương đối nhiều đáp ứng được điều trị

mà không cần phải nuôi cấy tăng sinh Nghiên cứu, ứng dụng tế bào gốc trong y học trước đây chủ yếu là sử dụng nguồn tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cells) cho cấy ghép tủy để điều trị một số bệnh lý ác tính và bệnh lý về máu Nghiên cứu,

sử dụng các loại tế bào gốc khác tế bào gốc tạo máu (như tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mô mỡ…) trong y học tái tạo vẫn còn rất mới mẻ, đây là hướng nghiên cứu đầy tiềm năng và có nhiều triển vọng áp dụng thực tế Đặc biệt gần đây, các nghiên cứu về tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPS) đang rất được quan tâm vì nguồn gốc của những tế bào gốc này là từ những tế bào sinh trưởng bình thường Trên thế giới đã

có những bước tiến dài trong việc sử dụng tế bào gốc trung mô trong y học tái tạo Một số ứng dụng đã được công bố chủ yếu của MSC là: điều trị các bệnh mạn tính như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, thoái hóa khớp, bệnh tự miễn, viêm tắc động mạch ngoại vi, chấn thương tủy, liệt tủy, một số bệnh của hệ thần kinh trung ương khác…[26]

Hình 1.8 Cách thức sử dụng tế bào gốc điều trị thoái hóa khớp gối [67]

Nhờ lượng tế bào gốc thu được từ mô mỡ rất lớn và đơn giản nên mô mỡ được đặc biệt quan tâm dưới góc độ là nguồn cung cấp tế bào gốc tự thân của người

trưởng thành[61].Trên website thông tin các thử nghiệm lâm sàng của Mỹ www.clinicaltrials.gov truy cập ngày 01/12/2015 liệt kê trên 100 thử nghiệm lâm sàng sử dụng tế bào gốc mô mỡ để điều trị các bệnh rò quanh hậu môn, tiểu đường týp 2, teo mỡ, tổn thương tủy sống, bệnh mô ghép chống túc chủ, thoái hóa khớp, tái tạo sụn [64]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc ở Việt Nam

Tương tự như trên thế giới, các hoạt động nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam cũng được khởi đầu từ những nghiên cứu thuộc lĩnh vực huyết học với các tế bào gốc tạo máu Ngay cả trước khi bùng nổ sự tập trung chú ý của giới chuyên môn cũng như cộng đồng vào tế bào gốc sau các sự kiện ra đời của cừu Dolly (1996) và phân lập được tế bào gốc phôi người (1998), các nhà huyết học Việt Nam đã có những bước tiên phong trên lĩnh vực tế bào gốc qua triển khai nghiên cứu ghép tuỷ xương (mà bản chất là ghép các tế bào gốc tạo máu) để điều trị các bệnh lý huyết học Trong thập niên từ 1995 đến 2005 tại các cơ sở mạnh về huyết học ở nước ta như Trung tâm Truyền máu-Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh (nay là Bệnh viện TM-HH Tp.HCM), Bệnh viện TƯ Quân đội 108, Trung tâm HH-TM Bệnh viện TƯ Huế, Viện HH-TM TƯ đều đã triển khai các nghiên cứu thuộc lĩnh vực này Có thể nói, về phương diện nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu trong lĩnh vực huyết học, các nhà huyết học Việt Nam đã triển khai được tất cả các kỹ thuật cơ bản từ ghép tế bào gốc tạo máu lấy từ tuỷ xương đến ghép tế bào gốc tạo máu được huy động từ tuỷ xương ra máu ngoại vi và ghép tế bào gốc tạo máu lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh Việc cấy ghép cũng đã được thực hiện với các trường hợp ghép tự thân cũng như các trường hợp ghép khác gen đồng loài phù hợp về HLA [1], [3], [4], [5], [6], [7], [11], [15], [20], [21], [23]

Trong các năm 2006-2007, đã có hàng loạt nghiên cứu tế bào gốc được chọn triển khai ở các cấp khác nhau từ cấp Cơ sở, cấp Thành phố đến cấp Bộ và cấp Nhà nước Giới hạn nghiên cứu không chỉ dừng lại ở tế bào gốc tạo máu điều trị bệnh lý huyết học mà đã tiến dần đến các loại tế bào gốc khác như: tế bào gốc vùng rìa giác mạc, tế bào gốc niêm mạc miệng, tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương, tế bào gốc trung mô màng dây rốn, tế bào gốc trung mô màng ối, tế bào gốc trung mô máu dây rốn, tế bào gốc biểu mô dây rốn Các nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc cũng đã được

đề xuất và đưa vào triển khai, bức tranh nghiên cứu tế bào gốc đã bao gồm cả ba mảng lớn là:(i) tạo nguồn tế bào gốc (phân lập, lưu giữ tế bào gốc các loại); (ii) biệt hoá tế bào gốc thành các tế bào mang tính chuyên biệt hơn và (iii) ứng dụng tế bào gốc, đặc biệt là vào việc điều trị một số bệnh ở người [14]

Về tạo nguồn tế bào gốc, các phòng thí nghiệm cả ở miền Bắc và miền Nam đều đã có các công bố phân lập được tế bào gốc từ tuỷ xương, máu ngoại vi, máu dây rốn, từ màng ối, màng dây rốn, từ lớp Wharton jelly của dây rốn, từ gan, từ niêm mạc miệng, từ vùng rìa giác mạc, từ da, từ các mô sinh dục và thậm trí từ máu kinh nguyệt hay từ phôi gà, từ phôi chuột nhắt Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu toàn diện để giải quyết bài toán duy trì tính gốc của các tế bào này và yêu cầu cần

có số lượng tế bào đủ lớn để điều trị vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện Cho đến nay ở nước ta đã có 2 cơ sở có khả năng thu thập, xử lý và bảo quản dài hạn các tế bào gốc từ máu dây rốn dưới dạng ngân hàng tế bào gốc dây rốn là Bệnh viện TM-HH Tp.HCM và Ngân hàng tế bào gốc MekoStem (cả 2 đều ở Tp.HCM) Riêng ngân hàng Mekostem có khả năng thu thập và bảo quản cả tế bào gốc màng dây rốn theo sự chuyển giao công nghệ của công ty CordLabs (Singapore) Việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc này tuy đã làm chủ được công nghệ thu thập, lưu giữ tế bào gốc máu hay màng dây rốn, nhưng mới chỉ ở quy mô nhỏ Nếu chỉ đáp ứng cho các đối tượng có mục đích sử dụng để cấy ghép tự thân hoặc cho người thân trong gia đình thì các ngân hàng này đã đáp ứng được yêu cầu và tỏ ra có hiệu quả Tuy nhiên, khi việc cấy ghép được thực hiện giữa người cho và người nhận không cùng huyết thống, đặc biệt nếu không cùng chủng tộc, thì cần có các ngân hàng tế bào gốc với số mẫu rất lớn lên tới hàng chục ngàn mẫu mới có cơ hội tìm ngay được mẫu tế bào gốc phù hợp với bệnh nhân cần tế bào gốc để điều trị Điều này cho thấy, về lĩnh vực ngân hàng tế bào gốc dù được coi là đã làm chủ được công nghệ thì việc đầu tư và khai thác chỉ đạt hiệu quả khi ngân hàng tế bào gốc công có được

số mẫu rất lớn [1],[3],[19] Bên cạnh các ngân hàng, nhóm nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm tế bào gốc, Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM cũng đã phân lập được tế bào gốc từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó có cả các tế bào gốc mô mỡ Biệt hoá tế bào gốc thành một số loại tế bào như tế bào giống cơ tim, tế bào giống tế bào thần kinh, tế bào da, xương, sụn, mỡ Đây được coi là hướng nghiên

cứu đi song hành với các nước trên thế giới, nhưng các kết quả chúng ta đã đạt được còn tương đối khiêm tốn Ngoại trừ nghiên cứu của Phòng thí nghiệm tế bào gốc của Đại học KHTN, ĐHQG Tp.HCM một lần tạo ra được tế bào cơ tim có khả năng

co bóp từ tế bào gốc phôi chuột nhắt, các nghiên cứu ở nước ta mới chỉ ở giai đoạn còn tương đối sơ khai Một số nghiên cứu thậm chí mới chỉ bắt đầu Nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc vẫn được đánh giá là khó, phức tạp và đôi khi còn mò mẫm; trong khi đó các yêu cầu về đánh giá theo dõi tế bào biệt hoá đòi hỏi rất nhiều chỉ tiêu để có thể khẳng định không chỉ là tế bào đã được biệt hoá có được biểu hiện chức năng như mong muốn mà còn đòi hỏi chúng phải là các tế bào an toàn không được có các biến đổi bất lợi như các đột biến gen có thể sinh ung thư Hơn thế nữa, nhằm hướng tới ứng dụng điều trị thì hai vấn đề quan trọng là tính ổn định của quy trình biệt hoá và số lượng tế bào sau biệt hoá là các yếu tố cũng góp phần quyết định tính khả thi của ứng dụng tế bào gốc biệt hoá trong điều trị Trong số các nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc, một đề tài cấp Nhà nước nghiên cứu nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để ứng dụng trong điều trị vô sinh nam đã được giao cho Trung tâm công nghệ phôi Học Quân y chủ trì thực hiện từ năm 2009 Các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thành tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào da, tế bào tiết insulin, tế bào giống tế bào thần kinh… vẫn đang được tích cực triển khai ở nhiều phòng thí nghiệm của các cơ sở nghiên cứu trong cả nước [14],[19]

Kế tiếp các kinh nghiệm và kết quả đạt được từ nghiên cứu ứng dụng nguyên bào sợi và tế bào sừng vào điều trị vết bỏng và các vết thương khó liền, năm 2010 Viện Bỏng Quốc Gia được giao chủ trì một Đề tài độc lập cấp Nhà nước biệt hoá các tế bào gốc biểu mô và tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn thành các tế bào da

và chế tạo các vật liệu tương đương da để áp dụng cho điều trị vết thương da Các kết quả mới được công bố cho thấy triển vọng sớm có được các sản phẩm da nhân tạo từ tế bào gốc để ứng dụng cho lĩnh vực liền vết thương [14]

Ứng dụng tế bào gốc để điều trị một số bệnh ở trẻ em: Năm 2010 Bộ KH&CN cũng đã triển khai một đề tài nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng các tế bào gốc từ máu dây rốn và từ tuỷ xương hoặc tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi để điều trị cho các bệnh nhi Sau các kết quả thành công bước đầu ở Bệnh viện TM-

HH Tp.HCM với 10 trường hợp ghép tế bào gốc máu dây rốn để điều trị một số

bệnh máu và cơ quan tạo máu của bệnh nhi, việc tiếp tục mở rộng các nghiên cứu này với số ca bệnh nhiều hơn và số mặt bệnh phong phú hơn là cần thiết để sớm đưa

kỹ thuật điều trị này trở thành thường quy tại nước ta Bệnh viện Nhi Trung ương hiện đang chủ trì 2 đề tài độc lập cấp Nhà nước theo hướng nghiên cứu ứng dụng trị liệu tế bào gốc cho các bệnh nhi [4],[5],[7]

Ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh lý giác mạc Hai cơ sở nhãn khoa ở nước ta

là Bệnh viện mắt Tp.HCM và Viện mắt TƯ (Phối hợp với Bộ môn Mô phôi trường Đại học Y Hà Nội) đã ứng dụng thành công việc cấy ghép tế bào gốc để điều trị bệnh lý giác mạc Kết quả thu được là sản phẩm của quá trình hợp tác quốc tế và hợp tác liên viện-trường khu vực Tp.HCM cũng như khu vực Hà Nội Năm 2010, Bệnh viện mắt TƯ đã nhận chủ trì một đề tài cấp Nhà nước theo hướng này và Bệnh viện mắt Tp.HCM cũng đang tích cực mở rộng ứng dụng này với số bệnh nhân đông hơn để hoàn thiện hơn nữa kỹ thuật điều trị mới này [14]

Ứng dụng tế bào gốc để điều trị bệnh tim: Các nghiên cứu bước đầu ứng dụng tế bào gốc từ tuỷ xương tự thân để hỗ trợ điều trị suy tim sau nhồi máu có tim

đã được Viện tim mạch Việt Nam phối hợp với Bệnh viện TƯ Quân đội 108 Các kết quả bước đầu triển khai trên 9 bệnh nhân cho thấy có hiệu quả trên bệnh nhân và không thấy tai biến của việc bơm tế bào gốc vào tim Hướng nghiên cứu này đang được tiếp tục với số bệnh nhân lớn hơn vừa để hoàn thiện quy trình điều trị vừa có thêm số liệu đầy đủ hơn của phương pháp điều trị này [24]

Ứng dụng tế bào gốc để điều trị bệnh xương khớp Từ nghiên cứu cho thấy các tế bào gốc từ tuỷ xương có thể biến đổi thành các tế bào xương, sụn, nhiều nước trên thế giới đã áp dụng quy trình tiêm trực tiếp dịch tuỷ xương hoặc các tế bào tạo xương được biệt hoá từ tế bào gốc tuỷ xương của chính bệnh nhân vào ổ gãy xương hoặc khuyết hổng xương hay vết thương xương khó liền Theo hướng này BS Cao Thỉ công tác tại Bệnh viện Chợ Rẫy bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ y học về chủ

đề sử dụng dịch hút tủy xương chứa các tế bào gốc để điều trị vết thương gãy xương cẳng tay khó liền; BS Nguyễn Mạnh Khánh công tác tại Bệnh viện Việt Đức bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ y học về chủ đề sử dụng khối tế bào nhân từ dịch hút tủy xương chứa các tế bào gốc để điều trị vết thương gãy xương cẳng chân khó liền và khớp giả Các số liệu BS Khánh sử dụng là một phần của đề tài cấp Nhà nước do

Bệnh viện TƯ Quân đội 108 phối hợp với Bệnh viện Việt Đức thực hiện từ năm

2008 ứng dụng tế bào gốc tự thân từ tủy xương để điều trị gãy xương khó liền, khớp giả, cũng như hỗ trợ điều trị chỉnh hình kéo dài chi Đây là hướng đi rất khả quan với hàng trăm trường hợp ghép tự thân đã được thực hiện cho thấy tính an toàn của

sử dụng tế bào gốc tự thân từ nơi này được tiêm vào nơi khác cũng như hiệu quả biệt hóa và/hoặc kích thích biệt hóa tạo tế bào xương in vivo của các tế bào gốc từ tủy xương [10],[14],[16],[17],[18]

Năm 2012 Khoa Sinh học phân tử (C17) – Bệnh viện TƯQĐ 108 được đầu

tư Dự án Labo nghiên cứu tế bào gốc Sau khi đưa vào hoạt động đến nay, tại Labo

tế bào gốc đã tách, chế biến và lưu giữ bảo quản sản phẩm tế bào gốc tạo máu (HSCs) cho 10 bệnh nhân có chỉ định ghép tủy điều trị các bệnh về máu trong đó có

2 bệnh nhân ghép đồng loại (Allogeneic marrow transplants), các bệnh nhân sau ghép đều ổn định Hiện nay, Labo đang tiếp tục phát triển tạo ra các sản phẩm tế bào gốc có chất lượng tốt nhất phục vụ điều trị và nghiên cứu Tế bào gốc mô mỡ (ADSC, MSC) là hướng đi tiếp theo để điều trị một số bệnh mạn tính như thoái hóa khớp gối, bệnh lý khớp gối khác, xơ gan, viêm tắc động tĩnh mạch ngoại vi…

1.4 Bệnh thoái hóa khớp

1.4.1 Tình hình mắc bệnh

Thoái hoá khớp là một trong những bệnh hay gặp trong các bệnh về xương khớp, là một bệnh gây đau đớn kéo dài và mất chức năng vận động và tàn phế Bệnh thường xuất hiện ở lứa tuổi trung niên trở đi Ở lứa tuổi 45-55 tỉ lệ mắc bệnh ở nam và nữ ngang nhau, nhưng sau tuổi 55 bệnh gặp ở phụ nữ với tỉ lệ cao hơn so với nam Nghề nghiệp có liên quan đến tỉ lệ mắc bệnh thoái hoá khớp Thoái hóa khớp có thể gặp ở bất kỳ vị trí nào trên cơ thể, tuy nhiên hay gặp và để lại hậu quả nặng nề là khớp gối Thoái hóa khớp là hậu quả của quá trình cơ học và sinh học làm mất cân bằng giữa tổng hợp và giáng hóa của sụn và xương dưới sụn Sự mất cân bằng này có thể được bắt đầu bởi nhiều yếu tố: quá tải vận động, chấn thương,

di truyền Biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở sụn khớp bởi các thay đổi về hình thái, sinh hóa, phân tử và sinh học của tế bào và chất cơ bản của sụn dẫn đến nhuyễn hóa, nứt loét và mất sụn khớp, xơ hóa xương dưới sụn, tạo gai xương và hốc xương dưới sụn [2],[8]

Hình 1.9 Hình ảnh minh họa các mức độ tổn thương sụn khớp

Nguồn: Theo Linda (2001) [72]

Theo thống kê của WHO năm 2009, tại bắc Mỹ và châu Âu tỷ lệ bị thoái hóa khớp là 200 người/100.000 dân và có đến 15% bị thoái hóa khớp ở lứa tuổi 55 - 75

Ở Mỹ có hơn 13% số người ở độ tuổi 55 - 64 tuổi và hơn 17% số người ở độ tuổi 65

- 74 tuổi bị đau và mất vận động liên quan đến thoái hóa khớp, gây thiệt hại 68 triệu ngày công lao động hàng năm và 4 triệu người phải nằm viện do bệnh Khoảng 100.000 bệnh nhân ở Mỹ không thể đi lại được do bệnh nặng Thoái hóa khớp gối là nguyên nhân gây tàn tật cho người già đứng thứ 2 sau bệnh tim mạch Ở Pháp, bệnh thoái hóa khớp chiếm 28,6% các bệnh về xương khớp, ước tính có tới 3,4 triệu người tới điều trị bệnh thoái khớp mỗi năm Tỷ lệ này ở Trung Quốc là 280 - 300 người/100.000 dân [45]

1.4.2 Cơ chế bệnh sinh thoái hoá khớp

Thoái hóa khớp hay còn gọi là viêm khớp, là quá trình lão hóa của tổ chức sụn khớp, đầu xương và các tổ chức phần mềm quanh khớp Bệnh thường xuất hiện từ

từ, ban đầu bệnh nhân có thể có các dấu hiệu cứng khớp, khô khớp, sau đó là đau nhức các khớp và khó vận động Theo các chuyên gia y tế, nguyên nhân gây ra thoái hóa khớp là do tuổi cao, tình trạng béo phì, tính di truyền hoặc do chấn thương nhẹ mãn tính ở khớp Ngoài ra, thoái hóa khớp cũng có thể xảy ra khi người bệnh mắc các bệnh viêm khớp dạng thấp, đái tháo đường

Nhiều thuyết giải thích sự thoái hoá sụn trong bệnh thoái hoá khớp Theo thuyết cơ học, khi có sự quá tải cơ học làm thay đổi chuyển hoá của các tế bào sụn, hình thành các enzym tiêu protein gây phá vỡ các chất căn bản của sụn

Ở giai đoạn muộn các tế bào sụn có biểu hiện phì đại, tăng tiết các cytokin như Interleukin I (IL-1); yếu tố hoại tử u alfa (TNF- ) và các yếu tố tăng trưởng khác, các enzym làm tiêu các chất căn bản như: các collagenase, gelatinase, stromolysin, các enzym khác như lysosyme và cathepsin IL-1 và TNF- gây thoái hoá sụn bằng cách kích thích tiết các enzym gây phá hủy collagen và proteoglycan, đồng thời ức chế tổng hợp các protein của chất căn bản của sụn Các enzym kể trên

bị ức chế bởi một protein có trọng lượng phân tử nhỏ, gọi là chất ức chế tổ chức của metalloproteinase Sự cân bằng giữa các chất kích thích và ức chế hoạt tính của các enzym đảm bảo sự chuyển hoá sụn bình thường Khi tăng yếu tố kích thích hoạt tính enzym dẫn đến thoái hoá sụn khớp Quá trình thoái hoá khớp không kiểm soát được, vì khi có biến đổi cấu trúc sụn thì tác động cơ học lên khớp cũng thay đổi, dẫn đến những quá tải nặng hơn, làm giải phóng nhiều enzym gây thoái hoá hơn và tiếp tục như vậy quá trình thoái hoá liên tục xảy ra

Trong bệnh thoái hóa khớp gối, triệu chứng đau chính là nguyên nhân đầu tiên khiến bệnh nhân đi khám bệnh Trong những trường hợp nặng, đau do kích thích của các vết nứt nhỏ ở vùng đầu xương dưới sụn, hoặc do gai xương làm căng kéo các đầu mút thần kinh ở màng xương gây đau khớp Ở một số bệnh nhân, triệu chứng đau trở nên trầm trọng làm bệnh nhân phải đi khập khiễng kèm theo lên xuống cầu thang rất khó Một số phải dùng gậy, nạng, hoặc không thể đi lại được [8], [53], [54], [59]

1.4.3 Một số biến đổi trong bệnh thoái hóa khớp

Khi bị tổn thương thoái hóa, sụn khớp chuyển sang màu vàng nhạt hoặc nâu, mất dần tính đàn hồi, mỏng, dãn, khô, nứt nẻ Những thay đổi này tiến triển cùng với sự nặng lên của bệnh, cuối cùng làm xuất hiện những vết loét, mất dần tổ chức sụn làm trơ ra các đầu xương phía dưới, phần diềm xương và sụn mọc thêm gai xương Các gai xương bị phủ bởi sụn trong hoặc sụn sợi mới hình thành và có cấu trúc không đồng nhất [8]

1.4.3.1 Các biến đổi vi thể

Mô bệnh học bệnh thoái hóa khớp được đánh giá theo Hội nghiên cứu

thoái hóa khớp quốc tế, gồm 6 độ sau [8],[41]:

- Độ 1: bề mặt sụn khớp còn nguyên vẹn, bằng phẳng và có thể thấy xơ hóa ít,

tế bào còn sinh sản Các vùng giữa và vùng sâu của sụn khớp không bị ảnh hưởng

- Độ 2: bề mặt diện khớp bị gián đoạn, xơ hóa từ bề mặt qua vùng nông của sụn khớp tới tận giữa của sụn Biến đổi này có thể kèm theo với tăng sinh tế bào, chất cơ bản của mô sụn tăng khả năng bắt màu thuốc nhuộm và/hoặc tế bào hoại tử

ở vùng giữa của sụn khớp

- Độ 3: Các vết nứt đứng dọc kéo dài vào tận trong vùng giữa của sụn khớp

Xơ hóa của chất cơ bản lan thẳng đứng xuống vào trong vùng giữa của sụn khớp Khi thoái hóa khớp tiến triển các vết nứt có thể tách ra các nhánh và kéo dài vào tận vùng sâu của sụn khớp, các dấu hiệu tế bào chết ở các vùng giáp với các vết nứt

- Độ 4: Sụn khớp bị chợt loét Có thể quan sát thấy hiện tượng mất chất cơ bản của mô sụn, mất chất cơ bản ở giai đoạn sớm nhất chỉ biểu hiện bởi bong lá sụn mỏng khỏi vùng nông của sụn khớp Các vết chợt rộng hơn dẫn tới hình thành hố, mất chất căn bản ở trong các vùng bị nứt

- Độ 5: diện khớp mất hết mô sụn trong bao phủ, trở nên trần trụi, sụn trong không lắng đọng khoáng chất bị loét trợt hoàn toàn Diện khớp chỉ là mô sụn có khoáng chất lắng đọng hoặc là mô xương

- Độ 6: biến dạng khớp Các quá trình gãy xương vi thể, sửa chữa lại mô xương làm biến đổi đường viền của diện khớp, mô sụn đã bị chợt loét hoặc mất Các gai xương hình thành ở bờ và trong vùng trung tâm diện khớp

1.4.3.2 Các biến đổi mô xương dưới sụn

Mô xương dưới sụn sẽ dày lên và biến đổi, mô xương trở nên xơ cứng và kém ngấm khoáng chất, với chu kỳ sửa sang xương lại xảy ra nhanh hơn do đó xương có chất lượng kém hơn Sự thiếu hụt các tạo cốt bào có thể là một phần cơ chế bệnh sinh của thoái hóa khớp Các quá tải về cơ học tác động lên các khớp chịu

lực có thể gây gãy xương vi thể ở lớp xương dưới sụn và phủ lên lớp sụn

Như vậy lớp sụn dần bị khuyết xương và lớp xương dưới sụn xơ hóa dần, tăng sự đậm đặc có thể phân bố quá tải cơ học một cách bất thường lên sụn dẫn đến giảm khoảng không gian cho sửa chữa, lực này thay đổi một cách tăng dần ở chất căn bản của sụn, do đó giải thích sự tiến triển chậm và tăng dần hình ảnh lâm sàng của thoái hóa khớp Có thể giả thiết rằng sự hình thành gai xương là nhằm bù trừ và bảo vệ sụn khớp khi có sự tác động lại các lực tác động lên khớp [8]