PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var. albino)

Các tế bào gốc này có khả năng biệt hóa thành các tế bào thần kinh và có thể thay thế các tế bào bị mất trong não.. Các tế bào ứng viên được chứng minh là có đặc tính của tế bào gốc thôn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******* *******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG

(Mus musculus var albino)

Sinh viên thực hiện : TÔN LONG TUẤN

Niên khóa : 2008 - 2012

Tháng 7/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******* *******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC

THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG

(Mus musculus var albino)

Tháng 7/2012

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là thành quả của sáu tháng nghiên cứu tại phòng Thí nghiệm

và Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp.HCM và là tâm huyết của tôi sau 4 năm đại học không ngừng nỗ lực, phấn đấu vươn lên khi còn học tập tại trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập

Trân trọng biết ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báo cho tôi trong suốt thời gian học tập

Xin bày tỏ lòng kính trọng và lời biết ơn sâu sắc đến ThS Phan Kim Ngọc và ThS Phạm Văn Phúc, những người đã giúp đỡ tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới anh Vương Gia Tuệ, chị Đinh Thị Hồng Nhung đã tận tình chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm làm việc ở phòng thí nghiệm

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn Yên, Dũng, Triết, Long, những người bạn đồng nghiệp đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH08SH đã chia sẻ cùng tôi vui buồn trong thời gian học tập trên ghế giảng đường đại học, cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tp.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2012

Tôn Long Tuấn

i

TÓM TẮT

Các bệnh thoái hóa thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng đối với người lớn tuổi trên toàn thế giới, trong đó bệnh Parkinson và Alzheimer hầu như được thu hút nhiều nhất Việc hạn chế các liệu pháp chữa trị cho các bệnh này hiện nay dẫn đến tỉ lệ người chết hàng năm cao Cho đến đầu thế kỉ 20, các nhà khoa học chấp nhận giả định rằng

sự tổn thương trong não không thể chữa trị vì thiếu khả năng tạo ra tế bào mới Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện ổ tế bào gốc trong não trưởng thành Các tế bào gốc này có khả năng biệt hóa thành các tế bào thần kinh và có thể thay thế các tế bào bị mất trong não Do đó, việc thiết lập các dòng tế bào gốc thần kinh là cần thiết cho việc khám phá vai trò của chúng trong các liệu pháp phục hồi não

bị tổn thương

Thực hiện phân lập tế bào gốc từ chuột mang thai 2 tuần tuổi Tế bào được nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh có bổ sung các nhân tố B27, N2, EGF, bFGF, heparin, insulin và transferrin Đặc tính gốc thần kinh của các tế bào ứng viên được chứng minh thông qua thí nghiệm tạo sphere, sự biệt hóa thành astrocyte và phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Sau đó, đem tế bào đông lạnh trong môi trường không huyết thanh

Thành công của thử nghiệm đạt được trong việc thiết lập môi trường cho nuôi cấy

tế bào tạo sphere Khi nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh, các sphere có thể hình thành nên các sphere thứ cấp Các sphere có thể đạt được kích thướt tới 1 mm và

có thể duy trì trong vòng 2 tháng Các tế bào ứng viên được chứng minh là có đặc tính của tế bào gốc thông qua khả năng tự làm mới, biệt hóa thành astrocyte, và biểu hiện nestin- marker phổ biến cho tế bào gốc thần kinh và tế bào tiền thân thần kinh Ngoài

ta, các tế bào đông lạnh có tỷ lệ sống sau khi giải đông cao

ii

Neural stem cells can be isolated from fetal, adult brains, differentiate from embryonic stem cells or induced-pluripotent stem cells The establishment of neural stem cell lines are crucial for discovering the roles of them in recovery of damaged brains We isolated neural stem cells from 2-week mouse fetus These cells are cultivated in serum-free medium supplemented with B27, N2, EGF, bFGF, heparin, insulin and transferrin Cells are propagated as floating spheres Charactiristics of neural stem cells are demonstrated on candidate cells through by sphere-formation assay, differentiation to astrocyte assay and immunocytochemistry Cells are cryo-reserved in serum-free condition

We are in establishing the medium in future of floating spheres when cultivating in serum-free medium These spheres can give rise to secondary and tertiary spheres These spheres would reach the diameter of 1 mm and can be maintained in 2 months Candidate cells are proved to have neural stem cells characteristics such as ability to self-renew, differentiate into astrocyte and express nestin – a popular marker for neural stem and progenitor cells Cryoreservation of neural stem cells also gives high rate of active cells after thawing

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình, sơ đồ ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 3

1.3 Nội dung thực hiện 3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tế bào gốc 4

2.1.1 Định nghĩa 4

2.1.2 Ổ tế bào gốc 4

2.1.3 Phân loại và gọi tên tế bào gốc 5

2.1.3.1 Theo tiềm năng biệt hóa 5

2.1.3.2 Theo vị trí thu nhận 5

2.1.3.3 Theo kiểu tế bào biệt hóa 5

2.1.4 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam 6

2.2 Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell_NSC) 6

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh 6

2.2.2 Địnhnghĩa 6

2.2.3 Ổ tế bào gốc thần kinh 7

2.2.4 NSC trong quá trình phát triển của hệ thần kinh trung ương 8

2.2.5 Sự hình thành và phát triển tế bào thần kinh trong não trưởng thành 9

2.2.6 Phương pháp để chứng minh một tế bào ứng viên là NSC 11

2.2.6.1 Phân tích tính gốc thông qua việc phân tích sự tạo tập đoàn 11

iv

2.2.6.2 Khả năng biệt hóa tạo thành các loại tế bào trong hệ thần kinh 12

2.2.6.3 Sự biểu hiện marker của NSC 12

2.3 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh trong in vitro 12

2.3.1 Đặc điểm của NSC khi nuôi cấy 12

2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 13

2.3.2.1 Nuôi cấy lớp đơn 13

2.3.2.2 Nuôi cấy neurosphere 13

2.3.2.3 Nuôi cấy neurosphere cải tiến 14

2.4 Marker của tế bào gốc thần kinh và các tế bào thần kinh trưởng thành 14

2.4.1 Các marker tế bào gốc thần kinh 14

2.4.1.1 Nestin 14

2.4.1.2 Msi1 (homolog of drosophila musashi/Nrp-1) 14

2.4.1.3 Sox1/2 (SRY-related HMG-box gene) 15

2.4.2 Marker cho tế bào gốc tiền thân 15

2.4.2.1 Marker A2B5 15

2.4.2.2 PSA-NCAM (polysialylayed neural cell adhesion molecule) 15

2.4.2.3 Beta tubulin III 15

2.4.3 Marker tế bào thần kinh trưởng thành 16

2.4.3.1 Oligodendrocyte 16

2.4.3.2 Astrocyte 16

2.4.3.3 Neuron 16

2.5 Ứng dụng tế bào gốc thần kinh 16

2.5.1 Bệnh Parkinson 17

2.5.2 Bệnh Alzheimer 18

2.6 Đông lạnh tế bào gốc thần kinh 19

2.6.1 Nguyên lý chung về đông lạnh tế bào 19

2.6.2 Chất bảo quản lạnh cho tế bào gốc thần kinh 20

2.6.3 Dung dịch đệm và các đại phân tử bảo vệ tế bào gốc thần kinh 20

2.6.4 Các phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh 20

2.6.4.1 Phương pháp đông lạnh nhanh 20

2.6.4.2 Phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 21

v

2.6.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng NSC sau đông lạnh và giải đông 21

2.6.5.1 Chất lượng tế bào trước đông lạnh 21

2.6.5.2 Tốc độ làm lạnh 21

6.5.3 Tốc độ giải đông 21

6.5.4 Sự hình thành tinh thể đá 21

2.7 Đánh giá tế bào gốc thần kinh sau giải đông 22

Chương 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

3.2 Vật liệu 23

3.2.1 Mẫu vật 23

3.2.2 Dụng cụ 23

3.2.3 Thiết bị 24

3.2.4 Hóa chất 24

3.2.4.1 Dung dịch đệm rửa tế bào PBS (-) (không có ion Ca2+ và Mg2+) 24

3.2.4.2 Dung dịch tách tế bào - trypsin/EDTA 0,25 % 25

3.2.4.3 Môi trường nuôi tế bào gốc thần kinh 25

3.2.4.4 Dung dịch hyaluronidase (1,0 mg/ml) 25

3.2.4.5 Dung dịch PBS/agarose 1,5% 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc thần kinh 26

3.3.1.1 Phương pháp tráng gel bình Roux 26

3.3.1.2 Phương pháp tráng poly-L-lysine bình Roux 27

3.3.1.3 Phương pháp phân lập và thu nhận tế bào gốc thần kinh chuột từ não chuột 27

3.3.1.4 Phương pháp cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 28

3.3.2 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh 29

3.3.2.1 Phương pháp đánh giá khả năng tự làm mới của tế bào gốc ứng viên 29

3.3.2.2 Phương pháp biệt hóa tế bào gốc thần kinh thành astrocyte 30

3.3.2.3 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu hiện marker nestin 30

3.3.2.4 Phương pháp chứng minh tế bào astrocyte bằng marker GFAP 32

3.3.3 Phương pháp đông lạnh tế bào 32

vi

3.3.3.1 Phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh 32

3.3.3.2 Phương pháp giải đông tế bào gốc thần kinh 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não chuột thai 34

4.1.1 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 34

4.1.2 Kết quả cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 39

4.2 Chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 41

4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới thông qua sự hình thành sphere 41

4.2.2 Đánh giá sự biểu hiện marker của tế bào gốc thần kinh trên tế bào ứng viên 43

4.2.3 Kết quả biệt hóa tế bào gốc thần kinh ứng viên thành tế bào astrocyte 45

4.3 Kết quả bảo quản tế bào 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BDNF Brain-drived neutrophic factor

BSA Bovine serum albumin

ctv Cộng tác viên

DMSO Dimethylsulfoxide

DMEM Dulbecco’s modified essential medium

EC Embryonic carcinoma

EG Embryonic germ cell

FACS Fluorescence activated cell sorting

FBS Fetal bovine serum

FGF Fibroblast growth factor

FITC Fluorescein isothiocyanate

ICM Inner cell mass

GFAP Gial fibrillary acidic protein

NSC Neural stem cell

PBS Phosphate buffer saline

PNS Peripheral nervous system

PSA-NCAM Polysialylayed neural cell adhesion molecule RMS Rostral migratory stream

ix

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

Trang

Hình 2.1 Nguồn tế bào gốc vạn năng phôi người 4

Hình 2.2 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc thần kinh 7

Hình 2.3 Các vị trí của hệ thần kinh chứa NSC 8

Hình 2.4 Minh họa cho ổ tế bào gốc thần kinh 9

Hình 2.5 Sự di chuyển của nguyên bào thần kinh 11

Hình 2.6 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Parkinson 18

Hình 2.7 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Alzheimer 19

Hình 3.1 Một số dụng cụ trong quá trình thí nghiệm 24

Hình 3.2 Một số thiết bị dùng trong quá trình thí nghiệm 25

Hình 3.3 Quy trình phân lập tế bào gốc thần kinh 29

Hình 4.1 Quần thể tế bào đơn ban đầu và sau 2 ngày nuôi cấy sơ cấp 36

Hình 4.2 Mẫu nuôi cấy sơ cấp từ não thai chuột 8,5 ngày tuổi 39

Hình 4.3 Mẫu nuôi cấy sơ cấp từ não thai chuột 18 ngày tuổi 39

Hình 4.4 Cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 40

Hình 4.5 Sự tạo thành các neuosphere thứ cấp từ các sphere sơ cấp 41

Hình 4.6 Sự hoại tử của neurosphere 41

Hình 4.7 Quá trình hình thành sphere sau 24 giờ nuôi cấy 42

Hình 4.8 Sự hình thành sphere sau 1 tuần nuôi cấy 43

Hình 4.9 Nhuộm hóa miễn dịch neurosphere 45

Hình 4.11 Sự thay đổi hình thái của tế bào khi biệt hóa 47

Hình 4.12 Hình thái sphere trong quá trình biệt hóa 47

Hình 4.13 Quá trình biệt hóa tế bào ứng viên thành tế bào astrocyte 48

Hình 4.14 Nhuộm tế bào biệt hóa thành astrocyte bằng GFAP và Hoechst 33342 49

Hình 4.15 Hình thái tế bào giải đông 50

Sơ đồ 3.1 Mô tả các nội dung nghiên cứu 27

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Các bệnh thoái hóa thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng đối với người lớn tuổi trên toàn thế giới Trong đó, bệnh Parkinson và Alzheimer hiện nay đang được quan tâm nhiều nhất Parkinson là một bệnh rối loạn thoái hóa hệ thần trung ương trong vùng chất đen của não và làm giảm khả năng tiết dopamin Nhưng nguyên nhân tại sao các tế bào não sản sinh ra dopamin lại bị thoái hóa và chết đi thì cho tới tận bây giờ khoa học vẫn chưa tìm ra được Y học hiện đại vẫn chưa có cách nào để phòng ngừa

và chữa khỏi hẳn được bệnh Đây là những bệnh nghiêm trọng, đe dọa đến tính mạng

và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân cũng như thân nhân của họ Vào năm 2011, theo thống kê của Parkinson’s Disease Foundation (PDF), có khoảng 7 đến 10 triệu người trên toàn thế giới mắc bệnh Parkinson Con số này nhiều hơn số người mắc bệnh tổn thương cột sống, bệnh Lou Gehrig kết hợp lại Ước tính mỗi năm có 60.000 người Mỹ chẩn đoán mắc bệnh Parkinson mỗi năm và con số này chưa phản ánh hết hàng ngàn trường hợp còn lại được phát hiện Kết hợp chi phí trực tiếp và gián tiếp để chữa trị Parkinson từ người bệnh không có khả năng làm việc ước tính gần 2.500 USD mỗi năm và nếu có phẫu thuật thì có thể lên tới 100.000 USD cho mỗi bệnh nhân Ngoài ra, ngày càng có nhiều bằng chứng về mối liên hệ giữa các bệnh như sức khỏe tâm thần và tiểu đường Điều này nhấn mạnh sự cần thiết cho việc tìm ra một phương pháp điều trị bệnh phù hợp

Hiện nay chưa có thuốc chữa trị khỏi được bệnh Parkinson nói riêng cũng như các bệnh thoái hóa thần kinh nói chung Các phương pháp hiện tại chỉ chú trọng làm sao trì hoãn được sự tiến triển của triệu chứng bệnh mà không trị được nguyên căn Mặc

dù đã có một số loại thuốc có thể làm giảm triệu chứng của bệnh Tuy nhiên, bệnh Parkinson biểu hiện ở mỗi người khác nhau, vì vậy không có một cách dùng thuốc duy nhất cho tất cả bệnh nhân

Trong vài thập kỷ gần đây, chúng ta đã được chứng kiến nhiều thành tựu quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc Sự ra đời của tế bào gốc đã mở ra niềm hy vọng to lớn về khả năng chữa trị bệnh cho con người, đặc biệt các bệnh liên

1

quan đến suy thoái chức năng tế bào Hệ thần kinh là cơ quan phức tạp được cấu thành các tế bào thần kinh, và các tế bào thần kinh đệm có vai trò bao quanh và hỗ trợ các neuron Các neuron sẽ dẫn truyền tính hiệu tác động đến các chức năng, như các quá trình xử lí nhận thức và vận động của cơ thể Một kiểu tế bào thần kinh đệm (tế bào glia) là tế bào oligodendrocyte (tế bào thần kinh đệm ít nhánh), hoạt hóa giúp làm tăng tốc truyền tính hiệu của tế bào thần kinh cho một khoảng cách xa Nếu mất đi tế bào nào trong các kiểu này sẽ gây các bất thường trong chức năng của não

Nhiều nghiên cứu hiện tại đã hướng đến điều trị bệnh Parkinson bằng tế bào gốc được xem như là mô hình tiêu biểu cho việc điều trị theo liệu pháp này đối với các bệnh thần kinh Tế bào gốc được cấy vào vị trí tổn thương của não và biệt hóa thành các tế bào neuron tiết dopamin, điều này mang lại hy vọng trong việc điều trị bệnh này (Perrier và ctv, 2004) Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, trong não trưởng thành

có thể sản sinh ra tế bào thần kinh mới để hồi phục lại chức năng của não (Zhao và ctv, 2008) Tuy nhiên, tế bào gốc trưởng thành rất ít ở mô hay cơ quan trưởng thành, do đó

để phân lập được các tế bào này là một thách thức, và các phương pháp giúp tăng sinh

tế bào trong nuôi cấy vẫn chưa được tối ưu Tế bào gốc có nguồn gốc từ não thai do

tính đa năng cao hơn tế bào gốc trưởng thành nên khả năng tăng sinh mạnh trong in

vitro Nhìn chung, các tế bào gốc từ não thai phát triển tương đối dễ dàng trong quá

trình nuôi cấy nhân tạo và biệt hóa thành nhiều dạng tế bào khác nhau nên có tiềm năng ứng dụng lớn trong cấy ghép và điều trị bệnh mãn tính và nan giải mà hiện nay chưa có biện pháp điều trị hiệu quả

Vì vậy, trong phạm vi đề tài này tìm hiểu phương pháp thu nhận, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột hiệu quả nhất, nhằm thu nhận tế bào gốc thần kinh với số lượng nhiều và sức sống tốt để ứng dụng cho những nghiên cứu trên

mô hình động vật bị bệnh lí thần kinh hay những nghiên cứu lâm sàng trên người

2

1.2 Yêu cầu đề tài

Xây dựng quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh và bảo quản tế bào gốc thần kinh

từ não thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) Từ đó, tạo ra dòng tế bào gốc

thần kinh ổn định để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng trong việc hỗ trợ, điều trị nhiều bệnh thần kinh

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột nhắt trắng (Mus

musculus var albino) trong môi trường không huyết thanh DMEM/F12 có bổ sung các

thành phần dinh dưỡng B27, N2, heparin, insulin và các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF Chứng minh tính gốc của tế bào ứng viên sau khoảng 3 đến 4 lần cấy chuyền tăng sinh thông qua khả năng tạo sphere, biệt hóa thành tế bào astrocyte và sự biểu hiện marker nestin

Thiết lập quy trình bảo quản tế bào gốc thần kinh Đánh giá tế bào trước đông lạnh và sau khi giải đông theo hình thái, khả năng tăng sinh tiếp tục của tế bào sau giải đông

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tế bào gốc

2.1.1 Định nghĩa

Tế bào gốc (Stem Cell_SC) là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng

sinh lí Trong điều kiện in vivo hay in vitro, một tế bào gốc có thể tiến hành một số

lượng lớn chu kỳ phân bào nguyên nhiễm thông qua sự tự làm mới (self-renewal) và

có khả năng biệt hóa (differentiation) thành bất kỳ kiểu tế bào trưởng thành nào (Phan Kim Ngọc, 2009) Về cơ bản, mọi tế bào trong cơ thể người đều có nguồn gốc từ trứng

đã thụ tinh (còn được gọi là hợp tử), là sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng

Hình 2.1 Nguồn tế bào gốc vạn năng phôi người

http://sgugegenetics.pbworks.com/f/1301869124/StemPic1-small.jpg

2.1.2 Ổ tế bào gốc

Ổ tế bào gốc (stem cell niche) là vi môi trường (microenviroment) mà ở đó chứa quần thể tế bào gốc Cấu trúc ổ tế bào gốc bao gồm tế bào xung quanh ổ, chất nền ngoại bào, các yếu tố có thể hòa tan được (Alvarez-Buylla và Lim, 2004) Nhờ đó, tế bào gốc tránh được các yếu tố kích thích biệt hóa và hiện tượng apoptosis để giữ trạng thái cân bằng với sự tăng sinh của tế bào gốc (Moore và Lemischka, 2006)

4

2.1.3 Phân loại và gọi tên tế bào gốc

2.1.3.1 Theo tiềm năng biệt hóa

Tế bào toàn năng hay toàn thế (totipotent): có tiềm năng cao nhất và có thể trở thành tất cả các tế bào của cơ thể Ở động vật có vú kể cả người, có hơn 200 loại tế bào thuộc các nhóm tế bào thần kinh, tế bào cơ, tế bào biểu mô, tế bào máu,…

Tế bào đa năng hay vạn năng (pluripotent): mô tả tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các tế bào xuất xứ từ ba lớp phôi: ngoại bì, trung bì, nội bì Một trong ba lớp này

sẽ tạo ra tất cả các loại tế bào chuyên biệt trong cơ thể

Tế bào đa năng (multipotent): dùng để chỉ những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều tế bào khác Một số tác giả cho rằng thuật ngữ pluripotent và multipotent

là hoàn toàn giống nhau, chúng đều mô tả những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác nhau

2.1.3.2 Theo vị trí thu nhận

Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell_ES) được thu nhận đầu tiên từ phôi chuột vào năm 1981, ở người vào năm 1998 từ lớp sinh khối bên trong (inner cell mass_ ICM) của phôi giai đoạn phôi nang Tế bào gốc phôi có khả năng phân chia vô hạn và biệt hóa thành các tế bào khác nhau từ ba lớp phôi

Tế bào mầm (tế bào gốc sinh dục; embryonic germ cell_EG) thu nhận từ rãnh sinh dục, có tính vạn năng và có một số khác biệt so với tế bào ES Tế bào mầm được gọi theo kiểu tế bào biệt hóa, nghĩa là chúng biệt hóa thành các tế bào sinh dục

Tế bào gốc biểu mô ung thư phôi (embryonic carcinoma_EC) thu nhận đầu tiên từ khối u trong tinh hoàn và buồng trứng ở một số chủng chuột EC có bản chất giống như các tế bào gốc phôi, có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác

Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell_AS) được tìm thấy hầu hết ở các mô chuyên biệt trong cơ thể trưởng thành là loại tế bào chưa chuyên hóa như trong tủy xương, máu, giác mạc, gan… (Paspala và ctv, 2011) Các tế bào này có thể tự đổi mới

và biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chuyên biệt

2.1.3.3 Theo kiểu tế bào biệt hóa

Tế bào gốc cơ tim là tế bào sẽ biệt hoá thành tế bào cơ tim, tế bào gốc xương là những tế bào biệt hoá thành những tế bào xương… Nhưng có một số tác giả cho rằng

5

cách gọi tên này không thật hợp lí vì các tế bào trên là những tế bào tiền thân (progenitor cell) hay cơ chất (precursor cell) không phải là những tế bào gốc thực thụ

2.1.4 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghệ tế bào gốc vẫn còn khá mới mẻ, đặc biệt là tế bào gốc phôi Chỉ trong vài năm tiếp cận và nghiên cứu ứng dụng đến nay đã thu được những thành công bước đầu Năm 2005, một công trình xuất sắc của GS Phan Toàn Thắng phát hiện từ màng lót dây cuốn rốn đã hứa hẹn nhiều ứng dụng trong trị liệu Vào đầu năm 2009, các nhà khoa học Viện Bỏng Quốc Gia nghiên cứu và ứng dụng thành công công nghệ tế bào gốc trong cơ chế tái tạo da, qua đó điều trị bệnh loét khó lành Ngày 15/02/2009, Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem được khai trương tại Tp Hồ Chí Minh,

là ngân hàng chính quy và hiện đại theo tiêu chuẩn quốc tế (Phan Kim Ngọc, 2009) Hiện nay, tế bào gốc đã thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới, góp phần tìm ra giải pháp và nhân rộng hoạt động cấy ghép tế bào gốc cho các nước có nguồn lực hạn chế nói chung và Việt Nam nói riêng

2.2 Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell_NSC)

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh

Vào giữa thế kỉ XX, người ta cho rằng các tế bào thần kinh mới có thể được hình thành não động vật có vú trưởng thành Đến năm 1960, Joseph và Gopal đã đưa ra các bằng chứng về sự phát triển những tế bào thần kinh mới ở người trưởng thành Vào những năm 1980, các nhà khoa học cấy các tế bào tiết dopamin từ tuyến thượng thận của chính bệnh nhân vào não, tuy nhiên chỉ cải thiện tạm thời

Đến thập niên 1990, đã có nhiều nghiên cứu hướng đến việc xác định NSC

(Paspala và ctv, 2011) Năm 1992, các tế bào gốc thần kinh người được nuôi cấy in

vitro thành công (Ayuso-Sacido và ctv, 2008)

Ngày 3/12/2007, Arenas và đồng nghiệp tại viện Karolinska (Thụy Điển) xác định nguồn tế bào gốc thần kinh/tiền thân não giữa, mang lại hiệu quả đáng kể khi cấy ghép vào chuột mang bệnh Parkinson (Phan Kim Ngọc, 2009)

2.2.2 Định nghĩa

Tế bào gốc thần kinh là các tế bào có khả năng tăng sinh và tự làm mới, được phân lập từ não và tủy sống mà không liên quan đến giai đoạn phát triển, có thể là ở thời kỳ phôi thai, bào thai, hoặc thời kỳ trưởng thành Sau đó các tế bào này biệt hóa thành các

6

loại tế bào của não, bao gồm tế bào thần kinh (neuron), tế bào hình sao (astrocyte) và

tế bào thần kinh đệm ít gai (oligodendrocyte) (Martin và Kuschinsky W., 2006)

Hình 2.2 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc thần kinh

(Martin và Kuschinsky W., 2006)

2.2.3 Ổ tế bào gốc thần kinh

NSC có thể được phân lập từ nhiều vùng khác nhau trong não trưởng thành và hệ thần kinh ngoại vi Tuy nhiên, vùng SVZ của não thất bên và vùng SGZ của vùng hồi hải mã là hai vùng đặc biệt mà trong đó tập trung và nuôi dưỡng cho sự hình thành và phát triển NSC (Doetsch, 2003; Landgren và Curtis, 2011)

Bằng chứng cho sự tồn tại ổ tế bào gốc thần kinh được thực hiện bằng cách cấy tế bào gốc thần kinh vào vùng không chứa tế bào thần kinh của não động vật thì thấy vùng được cấy tế bào gốc thần kinh này tăng sinh, di cư và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa (Paspala và ctv, 2011) Ngoài ra, tế bào gốc thần kinh được cấy vào có khả năng cung cấp cytokine và các yếu tố dinh dưỡng thần kinh, giúp hỗ trợ trong việc xây dựng hệ thống thần kinh (Yun và ctv, 2011)

Trong não của động vật có vú trưởng thành (in vivo), tế bào gốc thần kinh tham

gia vào quá trình phát triển hệ thần kinh dưới các điều kiện sinh lí tại một số vị trí đặc biệt: vùng SVZ của não thất bên, vùng SGZ của vùng hồi hải mã Các tế bào gốc thần kinh cũng có khả năng sửa chữa hư hại cho hệ thần kinh trung ương

7

Hình 2.3 Các vị trí của hệ thần kinh chứa NSC

(www.nature.com/nature/journal/v414/n6859/fig_tab/414112a0_F1.html#figure)

2.2.4 NSC trong quá trình phát triển của hệ thần kinh trung ương

Trong suốt quá trình phát triển của não, các chương trình thiết lập từ trước tạo ra quần thể NSC biệt hóa theo không gian và thời gian (Alvarez-Buylla và ctv, 2001) Trong quá trình phát triển của phôi, sự biệt hóa là sự kiện trung tâm Sự phát sinh hình thái, quá trình tổ chức các tế bào và mô là yếu tố đầu tiên cần cho sự biệt hóa tế bào

Sự kiện trung tâm của phôi vị là sắp xếp lại các phôi bào để tạo thành ba lá phôi bao gồm ngoại bì, trung bì và nội bì Một phần ngoại bì vùng lưng được biệt hóa thành tế bào thần kinh, vùng này của phôi được gọi là tấm thần kinh Quá trình hình thành phôi thần kinh sẽ tạo ra ống thần kinh và phôi ở giai đoạn này được gọi là phôi thần kinh Ống thần kinh sẽ tạo thành não và tủy sống

Sự phát sinh thần kinh trong não thai bắt đầu với sự cảm ứng từ tế bào biểu mô thần kinh, mà sẽ hình thành nên các tấm thần kinh ở phôi chuột 7 ngày rưỡi và sau đó gấp lại hình thành nên các ống thần kinh (Gotz và Huttner, 2005) Hai đầu ống thần kinh sẽ tiếp xúc với mặt trên cùng của não thất Ban đầu, các tế bào biểu mô thần kinh phân chia đồng đều tại bề mặt của não thất để tăng sinh quần thể tế bào gốc Tuy nhiên, tại một thời điểm nhất định, chúng bắt đầu phân chia không đồng đều tạo ra một

tế bào gốc mà nó vẫn giữ nguyên trên vùng não thất và một tế bào khác di chuyển tỏa tia hướng ra ngoài (Haubensak và ctv, 2004) Các tế bào này chịu trách nhiệm cho sự phát sinh thần kinh trong ống thần kinh và sau đó chúng hình thành nên các tế bào thần kinh đệm tỏa tia Tế bào thần kinh đệm tỏa tia được hình thành ở chuột khoảng 9 ngày

8

rưỡi Các tế bào này có nguồn gốc từ các tế bào biểu mô thần kinh tại thời điểm bắt đầu sự phát sinh thần kinh và sự hiện diện các loại tế bào chính trong quá trình phát triển của não, nơi mà chúng hoạt động như là các tế bào tiền thân thần kinh cũng như

là giá thể cho sự di cư của các tế bào thần kinh mới sinh (Conti và Cattaneo, 2010)

2.2.5 Sự hình thành và phát triển tế bào thần kinh trong não trưởng thành

Theo suy nghĩ trước đây thì sự phát sinh thần kinh chỉ xảy ra ở giai đoạn phát triển phôi trong CNS động vật có vú Tuy nhiên, nghiên cứu đầu tiên bởi Altman và Das vào năm 1965 đã khẳng định rằng điều này vẫn xảy ra trong não trưởng thành Ở động vật có vú kể cả người, neuron tăng lên tại các vùng não giới hạn nhất định như hành khứu giác và vùng hồi hải mã (Zhao và ctv, 2008)

Hình 2.4 Minh họa cho ổ tế bào gốc thần kinh (Doetsch, 2003)

Trong hai cấu trúc SVZ và SGZ, các tế bào nội mô hình thành nên các mạch máu

và màng nền đáy, là thành phần thiết yếu của ổ tế bào gốc Các tế bào nội mô này dính

tế bào gốc kiểu B của SVZ và SGZ để tạo ra tín hiệu khác nhau điều khiển sự tự làm mới của tế bào gốc và quy định số phận của các dòng tế bào (Shen và ctv, 2004) Trong vùng SVZ của não thất bên (lateral ventricle_LV) (hình 2.4 a), tế bào kiểu

B (neuroblast tăng sinh chậm) lót dưới lớp tế bào lông rung màng não thất E chức

9

năng như là NSC Chúng hình thành nên các tế bào kiểu C (tế bào tiền thân thần kinh), sau đó tạo ra nguyên bào thần kinh A (neuroblast) Lớp tế bào lót khoang não - tủy sống từ phần lót ngoài của não thất, phân cách vùng não thất bên với SVZ Tế bào kiểu

B định vị kề bên các tế bào lót khoang não-tủy sống và kéo dài xuyên qua lớp tế bào lót khoang não - tủy sống để tiếp xúc với vùng não thất bên, hình thành một ống tế bào thần kinh đệm và bao quanh một nhóm nguyên bào thần kinh A

Các tế bào chưa trưởng thành có nguồn gốc từ các tế bào kiểu B là tế bào tiền thân của nguyên bào thần kinh A Một lớp màng đáy kéo dài từ các mạch máu đến các tế bào lót khoang não - tủy sống tiếp xúc với các loại tế bào trong vùng SVZ Các tế bào kiểu B biểu hiện marker GFAP, chúng có khả năng tự làm mới, hình thành nên các tế bào kiểu C tiền thân khuếch đại chuyển và rồi tiến đến các nguyên bào thần kinh A Các nguyên bào thần kinh A biệt hóa thành các tế bào thần kinh sau đó di cư hướng đến hành khứu giác và các vùng cần thiết khác Ngoài ra, tế bào kiểu B có thể tạo ra tế bào thần kinh đệm ít gai (Temple 2001; Mirescu và Gould, 2003)

Trong vùng SGZ (hình 2.4 b), tế bào kiểu B đính vào mạch máu (blood vessel) và nhận tín hiệu từ tế bào biểu mô để NSC trải qua quá trình tự làm mới D và biệt hóa G (Doetsch, 2003) Ngoài ra, các tế bào kiểu B biểu hiện GFAP và có chức năng như tế bào gốc, thông qua quá trình tự làm mới để tạo ra các tế bào chị em và các tế bào thần kinh có hạt (Temple, 2001; Doetsch, 2003) Hơn 30.000 nguyên bào thần kinh thoát khỏi SVZ tới RMS của động vật gặm nhấm mỗi ngày (Alvarez-Buylla và ctv, 2001) Một điều đặc biệt là khả năng biệt hóa của các tế bào tiền thân vùng SVZ bị giới hạn,

số phận của các tế bào con cháu được xác định bởi thông tin về vị trí được thiết lập trong suốt sự phát triển của hệ thần kinh trung ương (Merkle và ctv, 2007)

Tế bào thần kinh mới liên tục được bổ sung vào các mạch thần trong não trưởng thành (Doetsch, 2003) Xác định tế bào gốc, sự phát sinh thần kinh trong não trưởng thành đã được làm rõ trong vùng SVZ của chuột trưởng thành

Ở hình 2.5 minh họa cho các nguyên bào thần kinh sinh ra tại vùng SVZ và di cư thông qua một con đường đặc biệt được tìm thấy ở não một số động vật gọi là rostral migratory stream (RMS) và đi đến hành khứu giác (Nakaguchi và ctv, 2010) Ở đây chúng biệt hóa thành hai loại tế bào thần kinh trung gian khứu giác là tế bào hạt và tế bào periglomerular (Doetsch và Scharff, 2001)

10

Hình 2.5 Sự di chuyển của nguyên bào thần kinh

(Martin và Kuschinsky W., 2006)

2.2.6 Phương pháp để chứng minh một tế bào ứng viên là NSC

Với sự tiến bộ trong công nghệ nuôi cấy tế bào đã cho phép các nhà nghiên cứu thu nhận tế bào gốc thần kinh từ lớp ICM giai đoạn phôi nang (Conti và Cattaneo, 2010), từ tế bào gốc vạn năng cảm ứng, các ổ tế bào gốc của não thai và trưởng thành

trong in vitro (Conti và Cattaneo, 2010) Các quy trình nuôi cấy NSC trong điều kiện

bám dính và không bán dính dựa trên các yếu tố tăng trưởng đã được phát triển rộng rãi (Kokovay và ctv, 2008) Sau đây là một số chiến lược cho thu nhận NSC hiện nay:

2.2.6.1 Phân tích tính gốc thông qua việc phân tích sự tạo tập đoàn

Phương pháp này có tính tiêu chuẩn cho việc xác định tính gốc của tế bào gốc nói chung và tế bào gốc thần kinh nói riêng Nguyên tắc chung là tế bào gốc có khả năng phát triển thành tập đoàn, trong khi đó các tế bào biệt hóa không có khả năng này Cụ thể là một nhóm các tế bào, trong đó có chứa tế bào gốc thần kinh được nuôi trong môi trường lỏng không huyết thanh, bổ sung yếu tố sinh trưởng EGF hay FGF-2, B27, N2, insulin, transferrin, serin, progesteron Các tế bào không phải là các tế bào gốc thần kinh sẽ chết trong môi trường chọn lọc, trong khi các tế bào gốc thần kinh vẫn phát triển tốt và hình thành các cụm tế bào từ các tế bào đơn gọi là neurosphere và có thể phát triển trong thời gian dài.Trong một điều kiện và một thời gian nuôi cấy nhất định, một tế bào đơn sẽ hình thành một tập đoàn, tập đoàn có kích thước càng lớn thì tế bào ban đầu của nó có tính gốc càng cao, do vậy có thể tách tế bào gốc ra khỏi quần thể ban đầu Kĩ thuật này được tiến hành đầu tiên bởi Temple (1989), nhằm phân tích sự tạo tập đoàn các tế bào gốc thần kinh mà ngày nay còn được sử dụng

11

2.2.6.2 Khả năng biệt hóa tạo thành các loại tế bào trong hệ thần kinh

Tiến hành biệt hóa tế bào đơn từ các sphere sau khi thu nhận, được đem nuôi trong môi trường DMEM/F12 bổ sung các thành phần thiết yếu như B27, N2, heparin, insulin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovin serum_FBS) và loại bỏ các yếu tố tăng trưởng EGF và FGF Để tăng khả năng biệt hóa, các tế bào được nuôi trên bình Roux có tráng poly-L-lysine trước đó thì chúng sẽ bám và biệt hóa thành tất cả các tế bào của hệ thần kinh như neuron, astrocyte và oligodendrocyte

2.2.6.3 Sự biểu hiện marker của tế bào gốc thần kinh

Các gốc thần kinh biểu hiện dương tính với marker nestin Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành biệt hóa thành các tế bào trong hệ thần kinh Đối với tế bào astrocyte thì biểu hiện dương tính với GFAP, còn đối với neuron biểu hiện dương tính với MAP2 Hầu hết phương pháp này đòi hỏi phải tạo ra huyền phù tế bào đơn (chứa tế bào NSC),

rồi sàng lọc bằng kháng thể đơn dòng với marker kháng nguyên bề mặt

2.3 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh trong in vitro

2.3.1 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh khi nuôi cấy

Các nghiên cứu trước đây có thể khái quát rằng yếu tố điều khiển sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc phôi thần kinh được xếp vào hai nhóm chính, các yếu tố bên ngoài và các yếu tố bên trong từ cơ chất nuôi cấy, thành phần môi trường và một số tương tác phức tạp giữa các tế bào (Tsai và ctv, 2000)

Môi trường DMEM/F12 thì tế bào neuron sống lâu hơn DMEM Môi trường căn bản DMEM/F12 được phát triển ở nồng độ tối ưu các thành phần nhưng thiếu trong DMEM như alanine, asparagine, cysteine, glutamate, proline và vitamin B12 Do tế bào gốc thần kinh phát triển ở nồng độ đường cao, cần có thêm một số chất cho quá trình chuyển hóa như putrescin, progesterone, transferrin, insulin, selenium salt gọi tắt

là yếu tố bổ sung N2 Trong môi trường DMEM/F12 kết hợp với FGF, EGF, B27 và N2 được sử dụng cho sự phát triển và tăng sinh cho các tế bào thần kinh sau nguyên phân Có thể sử dụng cho hầu hết các tế bào hệ thần kinh trung ương, đặc biệt giúp các

tế bào gốc phôi phát triển tối ưu và sống trong khoảng thời gian dài

Tuy nhiên, sự kết hợp B27 với DMEM/F12 còn tồn tại nhiều vấn đề như làm giảm đáng kể dưỡng chất từ môi trường để cung cấp cho neuron và sinh ra nhóm chất gây

12

tổn thương tới thần kinh (excitotoxin) trong môi trường Excitotoxin này là các acid amin phản ứng với các thụ thể chuyên biệt trong não, hoặc gây kích thích quá mức sự

dẫn truyền thần kinh trong não dẫn đến chết tế bào thần kinh

Ngoài ra, việc bổ sung yếu tố tăng trưởng thì khác nhau ở các loài khác nhau NSC

ở chuột nuôi cấy thì cần FGF, EGF và heparin, còn ở chuột rat thì chỉ cần có FGF để hình thành neurosphere Hơn thế nữa, dưới các điều kiện thích hợp, các neurosphere tương tác với EGF hoặc FGF có thể bám vào cơ chất và cảm ứng để biệt hóa thành neuron, astrocyte và oligodendrocyte (Young và ctv, 2005)

Để tế bào bám tốt, bề mặt dụng cụ nuôi cần phải phủ các protein ngoại bào cần thiết như poly-L-lysine, fibronectin, laminin, polyornithine, collagen, thylene-co-vinyl

alcohol Tuy nhiên, hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro, nhiều cơ chất được sử dụng như

yếu tố hòa tan hoặc cơ chất dùng bao phủ, có thể gây ảnh hưởng khác nhau lên tế bào nuôi cấy Ví dụ, poly-D-lysine, hầu như là cơ chất dùng để bao phủ bề mặt trong nuôi cấy neuron hệ thần kinh trung ương, được chứng minh cải thiện khả năng sống của tế bào tốt hơn (Young và ctv, 2003) Nhưng khi poly-D-lysine được huyền phù trong môi trường, nó tạo ra chất độc gây chết tế bào (Liu và Hong, 2003)

2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh

2.3.2.1 Nuôi cấy lớp đơn

Các cơ chất thường sử dụng để phủ dụng cụ nuôi là poly-L-lysine hoặc kết hợp với laminin, fibronectin, hoặc polyornithine, được ủ với dụng cụ nuôi để chúng bám vào bề mặt đĩa trước Thực chất, đây là phương pháp nhằm tạo ra một vi môi trường giống như trong não nơi mà chúng hiện diện Các protein dùng để bao phủ đĩa là chuyên biệt cho sự bám dính của tế bào tại vi môi trường não Trong trạng thái bám dính, với sự hiện diện của các mitogen như EGF, FGF thì các NSC tăng sinh không biệt hóa Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng phương pháp này khó giữ được trạng thái không biệt hóa của tế bào, khi nuôi cấy trong thời gian dài

2.3.2.2 Nuôi cấy neurosphere

Một trong những tiến bộ trong nghiên cứu NSC là sự phát triển phương pháp neurosphere Neurosphere là các khối cầu gồm nhiều tế bào lơ lửng có nguồn gốc từ một tế bào NSC đơn (Reynolds và ctv, 2005) Trong phương này, các NSC không bám vào dụng cụ nuôi Chiến lược này nhằm tránh sự biệt hóa của các tế bào NSC khi bám

13

dính Nếu chuyển các neurosphere này sang môi trường có huyết thanh, loại bỏ các mitogen thì chúng nhanh chóng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thần kinh Tuy nhiên, nuôi cấy một thời gian dài, các neurosphere to dần lên và chạm với bề mặt, chúng sẽ bám, khi ấy các tế bào bề ngoài của neurosphere sẽ biệt hóa

2.3.2.3 Nuôi cấy neurosphere cải tiến

Thấy được hạn chế của phương pháp nuôi cấy trước, Zheng và cộng tác viên vào

năm 2007 đã sử dụng gel agarose bao phủ bề mặt bình nuôi Gel agarose giúp ngăn

chặn sự bám dính của neurosphere vào dụng cụ nuôi Theo kết quả công bố, việc sử dụng hệ thống nuôi chống bám bằng gel agarose có thể nuôi tế bào gốc thần kinh ít nhất suốt 3 tháng liền mà chúng không biệt hóa, không có hiện tượng bám dính xảy ra Kết quả còn cho biết thêm gel agarose không gây ảnh hưởng đến sự tăng sinh và khả năng biệt hóa của tế bào gốc thần kinh sau này (Zheng và ctv, 2007)

Mặc dù đã có nhiều nỗ lực được thực hiện để hiểu rõ hơn ở cấp độ tế bào và phân

tử liên quan đến sự biệt hóa, tuy vậy để xác định được nguồn thu nhận NSC tốt nhất

trong in vitro, quy trình tối ưu hóa và sự tăng sinh nhanh vẫn còn là mục tiêu trung tâm

của nghiên cứu tế bào gốc Sự khác nhau về các kết quả trong nghiên cứu có lẽ được

giải thích bởi các quy trình nuôi cấy in vitro khác nhau cũng như là sử dụng các dòng

tế bào phôi, thai chuột khác nhau (Klein và Fishell, 2004)

2.4 Marker của tế bào gốc thần kinh và các tế bào thần kinh trưởng thành

2.4.1 Các marker tế bào gốc thần kinh

2.4.1.1 Nestin

Nestin là một sợi filament trung gian với domain xoắn alpha, có trong các khung sườn tế bào Nestin biểu hiện trội trong các quần thể tế bào gốc hay tiền thân của hệ thống thần kinh trung ương, khi các tế bào thần kinh đã biệt hóa dần, gen này được điều hòa giảm và có thể được thay thế bởi các protein khác Dường như tất cả các tế

bào gốc thần kinh tăng sinh sẽ biểu hiện nestin Trong điều kiện in vitro và in vivo, có

thể sử dụng kháng thể đơn dòng và đa dòng để đánh dấu nestin rất hiệu quả Kháng thể được sử dụng nhiều nhất là Rat401

2.4.1.2 Msi1 (homolog of drosophila musashi/Nrp-1)

Musashi 1 (Msi 1) là protein gắn RNA ở thần kinh, chứa hai motif nhận diện RNA

Cả RNA và protein này định vị nhiều trong não thai và thai trưởng thành, chủ yếu

14

trong các quần thể tế bào tiền thân hay tế bào gốc Khi đánh dấu Msi 1, chúng cũng hiện diện trong một số tế bào thần kinh hình sao và cả ở các neuron không còn khả năng nguyên phân

2.4.1.3 Sox1/2 (SRY-related HMG-box gene)

Yếu tố phiên mã sox1 và sox2 có domain gắn DNA gọi là HMG box, chúng gắn DNA thông qua các gốc lớn của DNA một cách chuyên biệt mRNA của sox1/2 biểu hiện trong các tế bào của giai đoạn sớm nhất trong quá trình hình thành thần kinh Ngoài ra, hai protein này là các marker quan trọng được sử dụng chuyên biệt để phân loại các tế bào tiền thân thần kinh

2.4.2 Marker cho tế bào gốc tiền thân

Có sự tồn tại tế bào tiền thân dòng thần kinh hay dòng thần kinh đệm ngoài tế bào gốc thần kinh Nhìn chung thuyết sinh học tế bào gốc thần kinh thừa nhận điều này Tuy nhiên các bằng chứng thực nghiệm vẫn còn thiếu

2.4.2.1 Marker A2B5

Marker A2B5 là kháng nguyên bề mặt được biểu hiện cả bởi các tế bào tiền thân

dòng thần kinh và dòng thần kinh đệm, mặc dù nó thường được sử dụng như là marker chuyên biệt cho các tế bào tiền thân O2A (oligodendrocyte/type 2 astrocyte), hay tế bào tiền thân thần kinh đệm ít nhánh

Các khảo sát sử dụng chất trắng não cho thấy phân đoạn dương tính A2B5 từ phân tách bằng FACS có chứa các tế bào tiền thân đa năng Do vậy phải chăng quần thể tế bào gốc biểu hiện kháng nguyên này Ngoài các tế bào tiền thân, dường như các tế bào thần kinh đệm ít nhánh đang trưởng thành cũng biểu hiện A2B5

2.4.2.2 PSA-NCAM (polysialylayed neural cell adhesion molecule)

Phân tử PSA-NCAM (polysialylayed neural cell adhesion molecule) biểu hiện bởi một quần thể tế bào tiền thân giới hạn dòng thần kinh đệm từ não sau khi sinh Tuy nhiên, tế bào tiền thân thần kinh và có thể là tế bào gốc ba tiềm năng cũng biểu hiện một kiểu đồng dạng của phân tử marker này

2.4.2.3 Beta tubulin III

Kháng nguyên beta tubulin III cũng biểu hiện phần lớn các tế bào thần kinh sau khi nguyên phân Tuy nhiên trong dòng di cư rostral, một quần thể tế bào biểu hiện beta tubulin III vẫn còn hoạt tính nguyên phân

15

2.4.3 Marker tế bào thần kinh trưởng thành

2.4.3.1 Oligodendrocyte

Oligodendrocytes (OGs) trong in vitro đặc trưng bởi hình thái học và kiểu kháng

nguyên, trải qua 4 giai đoạn phát triển bao gồm progenitor cell, pro-oligodendrocytes (pro-OGs), pre-mylinating OGs, myelinating OGs Kháng thể đơn dòng A2B5 và O4 lần lượt nhận biết phức hợp ganglioside biểu hiện trên bề mặt của tế bào tiền thân oligodendrocyte và epitope trên bề mặt biểu hiện trong pro-OG Còn GalC và MBP nhận diện marker cho pre-myelinating OGs và myelinating OGs

2.4.3.2 Astrocyte

Astrocyte kiểu 1 và 2 dương tính với GFAP Ngoài ra, astrocyte kiểu 2 biểu hiện dương tính với A2B5 Trái với neuron và oligodendrocyte, astrocyte thì có tính mềm dẻo cao, khả năng tăng sinh mạnh và di cư Các nghiên cứu nhận định rằng astrocyte điều chỉnh cho vị trí liên kết synapse (Ullian và ctv, 2001) dẫn đến ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng thần kinh

2.4.3.3 Neuron

Các neuron dương tính với PSA-NCAM Có 3 loại kháng thể đơn dòng khác nhau nhận diện kháng nguyên trên bề mặt neuron là β-tubulin III, MAP-2, sợi trung gian NFM Hầu như các tế bào này nhuộm với các kháng thể MAP2, chúng nhận ra được

đồng đẳng của MAP2 Kết hợp xử lý tế bào gốc hay tiền thân thần kinh với sự hiện

diện của dbcAMP và INF-γ, sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp cả hai để thúc đẩy sự biệt hóa thành neuron biểu hiện β- tubulin III, phản ứng với glutamate ngoại bào Ở nồng

độ tối ưu 4 mM dbcAMP và 150 ng/mL INF-γ cho số lượng neuron tối đa (Zahir và ctv, 2009) Ngoài ra, INF-γ là một cytokin tác động theo nhiều hướng và có vai trò quan trọng trong việc biệt hóa tế bào tiền thân thành neuron (Johansson và ctv, 2008)

2.5 Ứng dụng tế bào gốc thần kinh

Liệu pháp tế bào gốc hứa hẹn những ứng dụng to lớn trong việc chữa trị các bệnh

ở người, đặc biệt các bệnh liên quan đến sự mất mát, hay suy thoái chức năng của tế bào Thông qua liệu pháp tế bào gốc, những căn bệnh nan y đang được điều trị có hiệu quả Sự cấy ghép tế bào gốc hay tiền thân thần kinh mang lại niềm hy vọng lớn trong việc sửa chữa các tác động đến hệ thần kinh do tổn thương hay bệnh tật Các phương pháp tiếp cận đã được chứng minh là hiệu quả, không chỉ cho các bệnh nhân bị đột

16

quỵ, tổn thương cột sống, mà còn ở những bệnh nhân với các bệnh về thoái hóa não bộ như Parkinson, Alzheimer và đa xơ cứng tế bào thần kinh (Shen và ctv, 2004)

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng tế bào gốc phôi thai và trưởng thành để phục hồi lại các vùng của não bị ảnh hưởng bởi những căn bệnh này Bằng cách cấy tế bào gốc phôi vào trong hệ thần kinh trung ương tại các vùng bị tổn thương Ở đây các tế bào này tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt có thể hình thành khớp thần kinh, liên kết với các cơ, mở rộng các sợi trục và quan trọng nhất

có thể thực hiện được chức năng (Wichterle và ctv, 2002)

2.5.1 Bệnh Parkinson

Parkinson là một bệnh rối loạn thoái hóa hệ thần trung ương trong vùng chất đen của não và làm giảm khả năng tiết dopamin Đây là một chất dẫn truyền tín hiệu thần kinh từ tế bào này sang tế bào khác ở bên trong của não, nó giúp cho tế bào não chỉ huy và kiểm soát được các cử động của bắp thịt ở chân tay và ở mặt Khi bị bệnh Parkinson, những tế bào sản sinh ra chất dopamine này bị suy thoái và chết dần Điều này xảy ra ở một phần rất nhỏ của não gọi là chất đen (substantia nigra)

Nhưng nguyên nhân tại sao các tế bào não sản sinh ra dopamine lại bị thoái hóa và chết đi, cho tới tận bây giờ khoa học vẫn chưa tìm ra được Cho đến nay, y học hiện đại vẫn chưa có cách nào để phòng ngừa và chữa khỏi hẳn được bệnh Mặc dù đã có một số loại thuốc có thể làm giảm triệu chứng của bệnh nhưng mà không trị được căn nguyên Mặt khác, bệnh Parkinson biểu hiện ở mỗi người khác nhau, vì vậy không có một cách dùng thuốc duy nhất cho tất cả mọi bệnh nhân

Vào những năm 1980, người ta cố gắng cấy các tế bào tiết dopamine từ tuyến thượng thận của chính bệnh nhân vào não, các thử nghiệm này có sự cải thiện đáng kể tình trạng của bệnh nhân, tuy nhiên, chỉ tạm thời và bệnh nhân bị sụt cân nhanh

Hiện nay, nhiều nghiên cứu hướng đến điều trị bệnh Parkinson bằng tế bào gốc được xem như là mô hình tiêu biểu cho việc điều trị theo liệu pháp này đối với các bệnh thần kinh Tế bào gốc được cấy vào não biệt hóa thành các tế bào neuron tiết dopamin, điều này mang lại hy vọng trong việc điều trị bệnh Gần 80% các chức năng vận động được cải thiện sau 36 tháng điều trị (Ertelt, 2009)

Có hai cách sử dụng NSC cho liệu pháp chữa trị bệnh Parkinson (hình 2.6) Một là

in vivo, nơi mà các tế bào tự biệt hóa trong chính cơ thể chủ Thứ hai là in vitro, các

17

NSC được thu nhận bên ngoài cơ thể để nuôi cấy biệt hóa và sau đó cấy ghép vào cơ thể (Lowenbruck & Storch, 2011)

Hình 2.6 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Parkinson

(Lindvall và Kokaia, 2010)

2.5.2 Bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer gây ra do mảng lão hóa và đám rối cô động ở tế bào thần kinh Năm 1991, giả thuyết amyloid cho rằng sự tích tụ của amyloid beta (Aβ) là nguyên nhân cơ bản của bệnh Alzheimer Trong năm 2009, lý thuyết này đã được cập nhật rằng một họ hàng gần của protein amyloid beta (không nhất thiết phải là chính

amyloid beta) có thể là thủ phạm chính trong căn bệnh này (Nikolaev, 2009) Hồi hải

mã là nhóm tế bào thần kinh rất nhạy cảm và mong manh Khi các đám rối và mảng lắng đọng lại ở nhóm tế bào này làm chúng bị hủy diệt trước nhất Những thuốc đang hiện có chỉ làm chậm sự tiến triển của bệnh chứ không ngăn chặn được sự suy thoái các tế bào thần kinh Hiện nay vẫn chưa có loại thuốc tác động làm tan mảng và đám rối mà chỉ có thuốc điều chỉnh hai chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter) chính được cho là ảnh hưởng đến bệnh Alzheimer, là acetylcholine và glutamate

Liệu pháp tế bào gốc cũng có khả năng giúp ích cho bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer Cấy tế bào gốc để giải phóng các yếu tố tăng trưởng hoặc tiêm thuốc để phục hồi sự phát sinh thần kinh Khi các nhà nghiên cứu cấy ghép các tế bào thần kinh được tạo ra trong phòng thí nghiệm vào não bệnh nhân để thay thế các tế bào não bị

18

phá hủy Các tế bào này tự len lỏi vào trong mô của vùng chân hải mã, vùng não có liên quan tới sự hình thành trí nhớ Sau đó, chúng bắt đầu sản sinh ra chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine, một chất cần thiết cho việc thu hồi trí nhớ Kỹ thuật mới này

sẽ dẫn tới một phương thức chữa trị mới cho những bệnh nhân Alzheimer Chúng ta có thể có sẵn các tế bào thần kinh của người và nhanh chóng tạo ra hàng nghìn loại thuốc

Hình 2.7 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Alzheimer

(Lindvall và Kokaia, 2010)

2.6 Đông lạnh tế bào gốc thần kinh

2.6.1 Nguyên lý chung về đông lạnh tế bào

Theo quan điểm sinh học, nguyên lý của việc bảo quản lạnh đều giống nhau ở tất

cả các tế bào sống, quan trọng nhất là phải loại bỏ hầu hết nước khỏi tế bào trước khi chúng kết đông bên trong tế bào Đông lạnh tế bào là quá trình đưa tế bào từ điều kiện sinh lý (37oC, 5% CO2) với môi trường dịch sinh lí, xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp (-196oC, trong nitơ lỏng) trong môi trường đông lạnh (còn gọi là chất bảo quản đông lạnh - cryoprotectant) Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hóa và phát triển của tế bào dừng lại, nhưng chúng không chết, do đó có thể giữ tế bào

ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài

19

2.6.2 Chất bảo quản lạnh cho tế bào gốc thần kinh

Chất bảo quản đông lạnh là những chất có khối lượng phân tử nhỏ, độc tính thấp, tương tác với nước qua liên kết hydro và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào Trong môi trường đông lạnh thủy tinh hóa cho NSC, luôn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) như glycerol, dimethylsulfoxide (DMSO) để khử nước bên trong tế bào và một chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) như các saccharide làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn Các chất bảo quản đông lạnh có thể hạn chế đến mức tối đa các tổn thương

do tác động của nhiệt trong quy trình đông lạnh gây ra, tuy nhiên khi sử dụng chúng với nồng độ quá cao thì hầu hết các chất này gây độc với tế bào

2.6.3 Dung dịch đệm và các đại phân tử bảo vệ tế bào gốc thần kinh

Quá trình đông lạnh và giải đông đều được tiến hành bên ngoài tủ CO2 Nên môi trường đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hóa nên là đệm muối phosphate hay đệm HEPES 20 mM Các hợp chất đại phân tử chủ yếu là các polymer như PVP Ngoài ra, còn có các loại protein được sử dụng như huyết thanh bò (Bovine serum albumin_BSA), huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum_FBS) và loại ít phổ biến khác là các glycoprotein giảm nhiệt (Thermal hysteresis protein_THPs) do Wohlschlag (1969) chiết tách từ huyết thanh của một loài cá sống ở Bắc cực có tác dụng làm thay đổi điểm đông mà không làm thay đổi điểm tan

2.6.4 Các phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh

Các liệu pháp NSC có tiềm năng cao trong việc ứng dụng lâm sàng trong tương lai, điều này cho thấy tầm quan trọng của việc bảo quản lạnh NSC như là một điều kiện tiên quyết để đảm bảo chất lượng an toàn, lưu trữ và phân phối NSC (Milosevic, 2005) Hiện nay, NSC được đông lạnh bằng hai phương pháp phổ biến: đông lạnh chậm (slow freezing) và thủy tinh hóa (vitrification) Sau một thời gian, tiến hành giải đông nuôi cấy NSC để kiểm tra khả năng tăng sinh, biệt hóa thành nhiều dòng tế bào thần kinh

2.6.4.1 Phương pháp đông lạnh nhanh

Tế bào được đông lạnh trong cryotube 1,8 ml trong môi trường bảo quản, được giảm nhiệt độ -800C qua đêm; và sáng hôm sau cho vào nitơ lỏng -1960C

20

2.6.4.2 Phương pháp thủy tinh hóa (vitrification)

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh tế bào với thời gian rất nhanh Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt như thủy tinh, đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh Phương pháp thủy tinh hóa sử dụng nồng độ chất bảo quản cao và tốc độ làm lạnh nhanh điều này giúp tế bào bị khử nước, làm giảm sự hình thành tinh thể đá và tăng tính nhớt ở nhiệt độ thấp

2.6.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng NSC sau đông lạnh và giải đông 2.6.5.1 Chất lượng tế bào trước đông lạnh

Một quy trình đông lạnh thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, từ việc lựa chọn quy trình đông lạnh thích hợp, đến việc nuôi cấy và chọn lựa chất lượng tế bào trước khi đông lạnh, sao cho tỷ lệ sống của tế bào sau giải đông là cao nhất

2.6.5.2 Tốc độ làm lạnh

Tốc độ làm lạnh là một trong những yếu tố chính quyết định sự sống sót của tế bào trong suốt quá trình bảo quản Làm lạnh chậm có thể gây chết tế bào do thời gian tiếp xúc của chúng với dung dịch bảo quản Ngược lại, làm lạnh quá nhanh sẽ không đủ thời gian để quá trình khử nước diễn ra hoàn toàn, kết quả là hình thành tinh thể đá nội bào gây tổn thương (Nguyễn Thị Xuân Trâm, 2007)

2.6.5.3 Tốc độ giải đông

Thông thường tế bào đặt trong dung dịch giải đông ở 200C, –370C Sau khi giải đông tế bào, tế bào phải tái hấp thu nước và các chất bảo quản đông lạnh phải được loại bỏ Việc này được làm nhanh và cần thực hiện pha loãng từ từ qua từng bước để tránh sự thay đổi áp suất thẩm thấu đột ngột, gây tổn thương cho tế bào

2.6.5.4 Sự hình thành tinh thể đá

Sự hình thành tinh thể đá nội và ngoại bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đông lạnh Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành Ở tốc độ làm lạnh thích hợp thì tinh thể nước đá sáu cạnh được hình thành Khi tốc độ làm lạnh nhanh hơn, tinh thể đá sẽ là cây thông không

đồng dạng, nếu tốc độ nhanh hơn nữa thì nó có dạng hình cầu với diện tích bề mặt lớn

21

2.7 Đánh giá tế bào gốc thần kinh sau giải đông

Trong quá trình đông lạnh và giải đông, NSC trải qua nhiều thay đổi về mặt lý học

và hóa học, điều này ít nhiều gây tổn thương và làm suy giảm sức sống của tế bào, thậm chí tế bào bị chết sau khi đưa trở lại điều kiện sinh lý ban đầu Có hai tiêu chuẩn

cơ bản để đánh giá khả năng sống của tế bào sau giải đông: theo hình thái của tế bào

và theo khả năng tăng sinh tiếp của tế bào sau giải đông

Yếu tố hình thái (quan sát bằng mắt dưới kính hiển vi đảo ngược) được quan tâm nhiều nhất, bởi lẽ điều này phản ánh phần nào khả năng sống và phát triển của tế bào ở những giai đoạn tiếp theo, cũng như tỷ lệ sống sau khi giải đông và cấy chuyền Các tế bào sau khi giải đông được đánh giá thông qua 3 chỉ tiêu: tỉ lệ sống chết, khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa của chúng Số lượng tế bào còn sống phải đạt trên 50%

số lượng tế bào trước khi đông lạnh

Hình thái của tế bào được đánh giá ngay sau khi giải đông chỉ đủ để kết luận tế bào sống hay không sống, nhưng những tế bào này có khả năng phát triển tiếp tục hay không mới thật sự là tiêu chuẩn quan trọng Thông thường, sau khi được giải đông, tế bào được nuôi cấy trong điều kiện 370C; 5%CO2 Sau đó, đánh giá khả năng tăng sinh, biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào của hệ thần kinh trung ương như neuron, astrocyte và oligodendrocyte

22