phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp whartsons jelly dây rốn người

Mặc dù cơ thể chúng ta không thể tái tạo cả một bộ phận trên cơ thể nhưng tế bào máu, tế bào da vẫn thường xuyên được tái sinh trong mỗi chúng ta nhờ những tế bào “toàn năng”, lần đầu ti

TRẦN THỊ DUNG Tên đề tài:

“PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƯỜI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011-2015

Thái Nguyên, năm 2015

TRẦN THỊ DUNG Tên đề tài:

“PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƯỜI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011-2015 Giản viên hướng dẫn : 1 Th.S Vi Đại Lâm Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm

2 TS Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học

Thái Nguyên, năm 2015

Ngoài ra tôi xin gửi lời cảm ơn, biết ơn sâu sắc tới Ths Vi Đại Lâm –

Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thầy đã ủng

hộ, giúp đỡ và tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn qúy thầy cô trong Hội đồng giám khảo, các thầy cô đã nghiệm thu để em có thể tiến hành thực hiện khóa luận này!

Tôi gửi lời cảm ơn đến Ths Lê Bắc Việt, cử nhân Nguyễn Thanh Ngà

là những người anh, người chị tại cơ sở thực tập đã ân cần bảo ban và động viên tôi những lúc khó khăn trong khi nghiên cứu Tôi sẽ luôn ghi nhớ và trân trọng

Sinh viên

Trần Thị Dung

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSCs 13

Bảng 3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy cho 1000ml môi trường 23

Bảng 3.2 Trình tự của mồi chạy RT - PCR 29

Bảng 3.3 Thành phần cho 1 phản ứng RT - PCR 30

Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT - PCR 30

Bảng 4.1 Kết quả tách RNA 35

Bảng 4.2 Kết quả biểu hiện của các marker chỉ thị 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Khả năng tự đổi mới của MSCs 5

Hình 2.2 Tiềm năng biệt hóa của MSCs 7

Hình 2.3 Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc 9

Hình 2.4 Cấu tạo của dây rốn 11

Hình 3.1 Mẫu dây rốn trước khi xử lý 22

Hình 3.2 Phân lập mảnh mô dây rốn trên đĩa nuôi 22

Hình 3.3 Mảnh mô được để khô trong đĩa nuôi 4 giếng 24

Hình 3.4 Xử lý MSCs bằng enzyme, tế bào bong nhiều, tách khỏi mặt đĩa 25

Hình 4.1 Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô 32

Hình 4.2 Tế bào 80% dạng hợp lưu 34

Hình 4.3 Tế bào cấy chuyển 35

Hình 4.4 Kết quả điện di với các marker chỉ thị 36

Hình 4.5 Tế bào giải đông 38

DANH MỤC VIẾT TẮT

CD Cluster of differentiation (Cụm biệt hóa)

CHT Enzyme collagenase / hyaluronidase/trypsin

CT Collagenase/ trypsin

DMEM/F12 Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium/ Ham 12 DNA A xít Deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA A xít Ethylene diamine tetra acetic

EGF Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng lớp biểu bì)

FBS Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bò)

FGF Fibroblast growth factor

HLA Human leukocyte antigen

(Kháng nguyên bạch cầu ở người) HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4 (Yếu tố nhân 4 ở tế bào gan) hWJSCs Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Stem Cells

(Tế bào gốc từ lớp WJ dây rốn người) ITS Insulin – transferin - selenium

MSC Mesenchymal stem cell (Tế bào gốc trung mô)

PBS Phosphate buffer saline (Dung dịch đệm phosphate)

RNA Ribonucleic Acid

RT – PCR Reverse transcription Polymerase chain reaction (Phản ứng

chuỗi tổng hợp phiên mã ngược hay PCR phiên mã ngược) Trp tripsin / EDTA

WJ Wharton’s jelly (Thạch Wharton’s)

TBG Tế bào gốc

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 0

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học 4

2.1.1 Tế bào gốc 4

2.1.2 Tế bào gốc trung mô 5

2.1.3 Tế bào gốc trung mô ở dây rốn 10

2.2 Nghiên cứu trong nước và nước ngoài 19

2.2.1 Trong nước 19

2.2.2 Nước ngoài 20

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 21

3.3 Nội dung nghiên cứu 21

3.4 Phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào 32

4.2 Kĩ thuật cấy chuyển 34

4.3 Kết quả tách RNA 35

4.4 Biểu hiện các marker của MSCs ở tế bào nuôi cấy 35

4.5 Phương pháp lạnh đông 37

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

I, Tài liệu tiếng việt 41

II, Tài liệu tiếng anh 42

III, Tài liệu internet 43

PHỤ LỤC

A, Nguyên vật liệu, vật tư, trang thiết bị

A.1 Dụng cụ vật tư tiêu hao

A.2 Thiết bị nghiên cứu

A.3 Hóa chất

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Khoa học đã phát hiện rằng một số loài vật như thằn lằn, sao biển có thể tái tạo các bộ phận đã mất trên cơ thể chúng Con người chúng ta cũng có chung những đặc điểm này Mặc dù cơ thể chúng ta không thể tái tạo cả một

bộ phận trên cơ thể nhưng tế bào máu, tế bào da vẫn thường xuyên được tái sinh trong mỗi chúng ta nhờ những tế bào “toàn năng”, lần đầu tiên được phát hiện trong quá trình tiến hành thí nghiệm với tủy xương vào những năm 1950

đã dẫn đến phát hiện về sự tồn tại của tế bào gốc trong cơ thể (TS Phạm

Tế bào gốc cũng có thể được thu nhận từ các mô ở người trưởng thành như tủy xương, máu ngoại vi, nang lông…Tuy nhiên vấn đề này gặp phải khó khăn về kỹ thuật (Logeart-Avramoglou D và cs, 2005) [18], hạn chế về số lượng, tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, già và khó biệt hóa (Bobis S và cs, 2006) [14], có nguy cơ tiềm năng của nhiễm virus trong quá trình phân lập của MSCs từ tủy xương (Romanov Y A và cs, 2003) [23]

Hiện nay, các nhà khoa học đang cố gắng tìm kiếm những nguồn tế bào gốc mới để phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu thực tiễn Những báo cáo gần đây đã chỉ ra rằng, trong nguồn rác thải y tế, dây rốn của trẻ sơ sinh có chứa các tế bào gốc có khả năng biệt hóa cao, gọi là tế bào gốc trung mô Đây được cho là một phát hiện quan trọng vì có thể thu thập các tế bào gốc mà không

gây bất kỳ tổn thương nào tới cơ thể con người nên ít bị cản trở bởi các vấn

đề về luật pháp và đạo đức trong nghiên cứu Tế bào gốc dây rốn là tế bào gốc nhũ nhi, còn rất trẻ nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được

trực tiếp hoặc sau tăng sinh in vitro là rất lớn Nó có những đặc điểm giống

như các tế bào gốc trưởng thành (có tiềm năng biệt hóa đa năng) (Trương Định và cs, 2009) [4]

Các nghiên cứu đã công bố trước đây cho biết, có thể thu được tế bào gốc máu và tế bào gốc trung mô (MSCs) từ các nguồn khác nhau trong dây rốn như máu dây rốn, lớp Wharton’s jelly (WJ là lớp mô đệm của dây rốn), màng lót và lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn (Nguyễn Hồng Trường, 2011) [11] Trong số đó, phân lập MSCs từ lớp Wharton’s jelly dây rốn là hướng đi mới nhất và đang được nghiên cứu rộng rãi

MSCs từ lớp Wharton’s jelly được đánh giá rất cao về tiềm năng ứng

dụng, vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartson's jelly dây rốn người” để hoàn thiện quy trình phân

lập và tìm các chỉ thị bề mặt có vai trò trong việc nhận biết các MSCs từ lớp Wharton’s jelly dây rốn, chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho các nghiên cứu sau này

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người

- Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người

- Tạo ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ các mục đích nghiên cứu trong tương lai

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người

- Nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người

- Tạo ra ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ các mục đích nghiên cứu trong tương lai

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Nghiên cứu được điều kiện nuôi cấy in vitro của tế bào gốc trung mô,

từ đó mở rộng các ứng dụng của loại tế bào gốc này

- Xây dựng được các mô hình thực hành, thí nghiệm trên tế bào gốc trung mô

- Xây dựng được ngân hàng tế bào gốc trung mô phục vụ cho các hướng nghiên cứu trong y sinh học như: Kỹ nghệ mô, liệu pháp tế bào, liệu pháp gen, thử nghiệm độc tố

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn của đề tài

Biệt hóa thành nhiều loại “tế bào giống tế bào gan” Góp phần phát triển hướng nghiên cứu phục hồi, thay thế các cơ quan nội tạng có nguồn gốc từ trung

bì ở hàng trăm triệu bệnh nhân trên toàn thế giới

Nghiên cứu về quá trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô góp phần hỗ trợ, thúc đẩy những hiểu biết về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của tế bào gốc trung mô nói riêng và tế bào gốc nói chung Gợi mở các hướng nghiên cứu để điều trị bệnh bằng tế bào gốc như: Điều trị bệnh suy tủy, ung thư máu bằng ghép tế bào gốc tạo máu, điều trị bệnh ly thượng bì bọng nước

(epidermolysis bullosa), thoái hóa khớp, liệt tủy sống, các bệnh về thoái hóa

cơ tim, bỏng da hay nám da, bệnh Alzheimer, Parkinson (Hà Loan, 2015)

[27], (Hoàng Hiền, 2015) [28]

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Tế bào gốc

Tế bào gốc (stem cell) là những tế bào chưa có chức năng, có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau về cấu trúc và chức năng tạo nên quá trình hình thành mô, cơ quan và hệ cơ quan trong các cơ thể (Phan Kim Ngọc, 2009) [8]

Tế bào đầu tiên ở cơ thể người và nhiều loài động vật là hợp tử, hợp tử nguyên phân tạo thành phôi nang (đặc hoặc rỗng), các tế bào phôi nang trải qua quá trình di chuyển để xác lập vị trí các mô, cơ quan trong cơ thể Vậy hợp tử chính là tế bào gốc đầu tiên của cơ thể

Các tính chất cơ bản của tế bào gốc bao gồm tính tự làm mới (self renew), khả năng phân chia (self generate) và tự khuếch đại (self propagate), khả năng biệt hóa Trong đó, khả năng biệt hóa và tính tự làm mới là đặc trưng cơ bản được nhắc tới nhiều nhất của các loại tế bào gốc nói chung

Tính tự làm mới giúp duy trì sự có mặt ổn định của tế bào gốc trong cơ thể Một tế bào gốc khi phân chia sẽ tạo nên một tế bào gốc khác giống hệt

nó Vì vậy, tuy liên tục biệt hóa tạo nên các tế bào có chức năng cho cơ thể nhưng lượng tế bào gốc trong cơ thể không bị mất đi Mặt khác, tế bào gốc, nếu giữ nguyên trạng thái không biệt hóa, dường như có khả năng phân chia

vô hạn Một trong hai tế bào con được sinh ra trong nguyên phân của tế bào gốc luôn là bản sao của tế bào mẹ, tế bào con còn lại sẽ biệt hóa theo nhiều giai đoạn để tạo nên tế bào chuyên hóa (Phan Kim Ngọc, 2009) [8]

Khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác được gọi là tiềm năng Tiềm năng càng cao thì khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau càng lớn Tiềm năng của các loại tế bào gốc khác nhau là khác nhau (tùy thuộc cách phân loại) Các tế bào gốc toàn năng có thể biệt hóa thành hầu hết các

loại tế bào trong cơ thể trong khi các tế bào gốc đơn năng lại chỉ biệt hóa thành một loại tế bào với chức năng nhất định Ví dụ: Tế bào gốc máu là tế bào gốc đơn năng, có thể biệt hóa thành tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu )

Các tế bào gốc hiện nay trở thành đối tượng nghiên cứu rất đáng quan tâm bởi những tiềm năng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Các lĩnh vực chủ yếu hiện nay như trong cấy ghép (tế bào, mô, cơ quan), liệu pháp gen, kiểm nghiệm hóa chất và trong nghiên cứu khoa học (Phạm Văn Phúc, 2006) [9]

2.1.2 Tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (MSC) thuộc nhóm tế bào multipotent hay tế bào gốc đa năng và được thu nhận từ những mô có nguồn gốc từ lớp trung bì, chúng có tính mềm dẻo cao Các tế bào này có thể tự đổi mới và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào chuyên biệt khác nhau như xương, mỡ, sụn, thần

kinh, gan, khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp

2.1.2.1 Tính tự làm mới của MSCs

Hình 2.1: Khả năng tự đổi mới của MSCs

Tế bào gốc trung mô có khả năng phân chia, tạo thành một tế bào gốc con giống hệt tế bào gốc ban đầu và một tế bào không mang tính chất của một

tế bào gốc gọi là TAC (transit amplifying cell) Nhìn chung, tế bào MSCs và các tế bào được biệt hóa từ MSCs thuộc nhóm tế bào cần bám dính Tức là trong điều kiện nuôi cấy invitro, MSCs cần bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy nếu không tế bào sẽ nổi lơ lửng, có thể đi vào trạng thái ngừng hoạt động hoặc chết

Các tế bào MSCs có hình dạng thon dài, giống nguyên bào sợi Sau 5-7 ngày nuôi cấy thì phát triển thành những quần lạc Khi tế bào tăng sinh ở mật độ thấp chúng phần lớn có dạng sợi nhưng khi đạt mật độ bao phủ khoảng 80% và bắt đầu tạo thành những “dòng chảy tế bào” song song thì các tế bào trở nên dẹt hơn Hình dạng này còn được gọi là “confluence” hay “hợp lưu tế bào”

2.1.2.2 Tiềm năng biệt hóa của MSCs

MSCs có khả năng biệt hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt (Hình 2.2) Tiềm năng biệt hóa của MSCs phụ thuộc nhiều vào các môi trường nuôi cấy Trong các môi trường nuôi cấy của MSCs, thường có thêm các thành phần bổ sung, có vai trò định hướng biệt hóa Các yếu tố này có thể

là các chất hóa học hoặc hormone thường có vai trò nhất định trong cơ thể (Jinlian Hua1, và cs, 2011) [17] Một vài ví dụ tiêu biểu như:

Khi nghiên cứu khả năng tạo tế bào xương, các tế bào MSCs của người

đã được cảm ứng biệt hóa bằng muối strontium ranelate của acid renalic với nguyên tố Strontium (ký hiệu Sr) Lượng muối strontium ranelate được sử dụng tương đương với nồng độ được phát hiện trong xương, thực phẩm và nước uống của người trong tự nhiên Phương pháp RT - PCR được dùng để phân tích mô hình biểu hiện gene của các tế bào MSC trong thí nghiệm cho thấy gene Cbfa1, một gene có vai trò “công tắc” trong quá trình tạo xương đã được biểu hiện trong thời gian ngắn, 4 ngày sau khi được cảm ứng (tế bào đối chứng biểu hiện gene Cbfa1 sau 14 ngày) Việc biểu hiện gene Cbfa1 cho

thấy MSCs có thể được biệt hóa tạo xương bằng chất cảm ứng một cách chủ động trong phòng thí nghiệm Một loại protein có tên osteonectin, có vai trò trong tái cơ cấu mô hình, cấu trúc xương, sắp xếp các sợi collagen fibril và phân tử hydroxyapatite liên quan tới độ bền của xương cũng được phát hiện sớm hơn bình thường 10 ngày trong thí nghiệm này (Monnipha Sila-ASNA

và cs, 2007) [19]

Các thí nghiệm tương tự cũng được tiến hành với các hướng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau Gần đây nhất, viện Công nghệ sinh học Việt Nam đã công bố kết quả nghiên cứu biệt hóa tế bào MSCs thành tế bào gan bằng chất cảm ứng DMSO (Dimethyl sulfoxide) và chuyển gene để cảm ứng biệt hóa Kết quả phân tích biểu hiện gene bằng RT-PCR cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy, các tế bào MSCs tiếp xúc với DMSO có kết quả dương tính với gene HNF4α HNF4α là một gene chỉ thị đặc trưng cho dòng tế bào gan, đây là một gene điều hòa, có thể có tác động tới hàng loạt các gene liên quan chức năng gan trong cơ thể Những nghiên cứu về chất cảm ứng DMSO và chuyển gene biệt hóa hiện vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu (Nguyễn Văn Hạnh và cs, 2015) [6]

Hình 2.2: Tiềm năng biệt hóa của MSCs

(Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

2.1.2.3 Tính mềm dẻo của MSCs

Khi tế bào MSCs đã biệt hóa thành một tế bào có chức năng, chúng có thể thay đổi chiều hướng biệt hóa thành một loại tế bào khác, có chức năng khác khi thay đổi môi trường nuôi cấy và hiện tượng này được gọi là “Tính mềm dẻo của tế bào gốc” hay “chuyển biệt hóa”

 Đầu tiên, ở cùng một mô nhất định có thể tồn tại những loại tế bào gốc không liên quan gì đến mô đó, ví dụ như tế bào gốc tạo máu tồn tại ở cơ Chính những tế bào này đã tang sinh cùng với tế bào được phân lập có chủ đích

 Thứ hai, có thể các tế bào cấy ghép đã dung hợp với một tế bào khác dẫn đến

sự chuyển thông tin di truyền của tế bào cấy ghép vào trong tế bào vật chủ, từ

đó dẫn đến sự biểu hiện của một số đặc tính gốc trong các tế bào quan sát được như trong quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi và tế bào soma

 Thứ ba, khi thí nghiệm trên cừu Dolly người ta đã quan sát thấy quá trình tái lập trình ở nhân để đạt trạng thái đa tiềm năng khi tiêm nhân của tế bào soma vào trong tế bào chất của một trứng không được thụ tinh đã loại nhân

 Giả thiết thứ tư cho rằng các tế bào với tính nhiều tiềm năng vẫn còn tồn tại ngay cả sau quá trình phát triển phôi Ví dụ, tế bào MAPC (Multipotent Adult

Progenitor Cells) (Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

Hình 2.3: Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc

(Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

2.1.2.4 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô

Nhiều báo cáo khoa học đã cho thấy tế bào gốc trung mô có thể thu nhận từ nhiều nguồn tế bào khác nhau (Barry F.P, 2004) [13], (jarocha D và

- Nguồn từ mô mỡ là một trong những nguồn giàu MSCs Tế bào gốc

mô mỡ cũng được phát hiện có những tiềm năng giống với tế bào gốc từ tủy xương

- Nguồn cuống rốn trẻ sơ sinh: Được biết là nơi tập trung MSCs nhiều hơn cả vì nhiều cấu trúc trong cuống rốn đã được phát hiện là vùng có chứa MSCs ví dụ như máu cuống rốn và lớp nội mô hay trong lớp nhầy Wharton’s jelly (y khoa y dược, 2013 ) [29], (báo cáo kết quả khao học công nghệ, 2011) [30]

Hiện nay, dây rốn trong phòng hộ sinh vẫn được coi là một loại rác thải

y tế Vì vậy, việc phân lập và nuôi cấy thành công các loại tế bào gốc từ cuống rốn trẻ sơ sinh là một bước tiến đáng kể, vì đã tìm ra được một nguồn cung cấp tế bào gốc sạch, dồi dào mà không vấp phải các vấn đề về đạo đức hay gây đau đớn khi lấy tế bào, đồng thời cũng góp phần tái chế rác thải Các

tế bào gốc thu được từ cuống rốn có thể được sử dụng trong nghiên cứu và trong bệnh viện để điều trị các bệnh về máu và hệ miễn dịch

Trong các nguồn trên thì cuống rốn trẻ sơ sinh là một nơi thu nhận được nhiều MSCs nhất MSCs có tồn tại trong nhiều cơ quan bào thai và tuần hoàn trong máu của thai tiền sinh đồng thời với các tế bào gốc tạo máu Chính

vì vậy mà chất nền cuống rốn WJ rất có thể là một nơi tích tụ MSCs dư thừa sau khi chúng rời hệ tuần hoàn

2.1.3 Tế bào gốc trung mô ở dây rốn

2.1.3.1 Dây rốn

Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở thành

tử cung của người mẹ, có vai trò là cầu nối giữa người mẹ và em bé để vận chuyển chất dinh dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ

Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và hai động mạch bao quanh bởi các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là lớp Wharton’s Jelly hay WJ và được bọc bởi màng ối Có thể xác định ba vùng khác nhau của lớp WJ: Vùng dưới màng ối, chất nền WJ, và lớp mô bao quanh các mạch máu Vùng chất nền WJ gồm các phân tử collagen loại I, III,

VI nằm ở trong những khoảng không gian có hình dạng giống như rãnh Xung quanh rãnh này là các phân tử collagen loại VI, laminin và heparin sulfate proteoglycan Các khoảng không gian chứa đầy chất nền WJ có dạng rãnh được bao quanh bởi các tế bào chất nền là các nguyên bào sợi cơ mảnh có dạng ống biểu hiện vimentin, desmin và actin cơ trơn Dây rốn giai đoạn sớm chỉ có vimentin và desmin Cấu trúc và thành phần của dây rốn giúp bảo vệ các mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể hỗ trợ quá trình trao đổi giữa máu dây rốn và dịch ối (Hình 2.4) (Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

Hình 2.4: Cấu tạo của dây rốn (Nguyễn Hồng Trường, 2010) [11]

Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu TBG

Có hai loại TBG đã được xác định trong dây rốn: Loại 1 là MSCs từ lớp WJ, tĩnh mạch, các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối

và máu của dây rốn Loại 2 là TBG tạo máu từ máu dây rốn (Nguyễn Hồng

Trường, 2010) [11] Loại MSCs từ WJ hiện nay đang được quan tâm và đẩy mạnh nghiên cứu

2.1.3.2 Các chỉ thị phân tử của tế bào gốc trung mô từ chất nền dây rốn

Tế bào gốc trung mô từ chất nền dây rốn (gọi là hWJSCs hay human Wharton’s Jelly Stem cell) biểu hiện các marker của TBG, gồm marker của các loại tế bào ES (embryonic stem cell), EG (embryonic germ cell), các tế bào tiền chất thần kinh hay TBG thần kinh, biểu hiện actin và vimentin cơ trơn, các marker cho nguyên bào sợi cơ, nestin, enolase chuyên biệt thần kinh (NSE) và protein sợi thần kinh đệm (glia Fibrillary xitic protein – IGFAP), c-kit, oct-4, Tra-1,60; biểu hiện các mức thấp của telomerase và cũng hình thành các cấu trúc tương tự các thể phôi khi nuôi cấy (Trương Định và cs,

là N – cadtherin và troponi tim I Các hWJSCs còn có thể biệt hóa thành các

tế bào mỡ, sụn và xương bằng các yếu tố biệt hóa phù hợp (Trương Định và

cs, 2009) [4], (Romanov Y.A và cs, 2003) [23]

Bảng 2.1: Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSCs

Chỉ thị tế bào

tạo máu

CD4, CD14, CD45, (PTPRC), c–kit/SCFR (CD117)

IL–2R (CD25)

Các phân tử kết

dính

Các Integrin α1(CD49a), α2(CD49b), α3(CD49c), aα(CD49c), β1(CD29), β3(CD61), β4(CD104)

α4(CD49d), αL(CD11a), Cβ2(CD18)

selectin (CD62L), endoglin (CD105), hyaluronate (CD44), CK18, CK19

ICAM –3 (CD50), E–selectin (CD62E), P–selectin (CD62P), PECAM –1 (CD31), vWF, Cadherin 5

Các chỉ thị khác CD9, CD13, Thy–1 (CD90),

HLA–ABC (MHC I) (thấp) HLA–DR (MHC II)

2.1.3.3 Phương pháp RT – PCR kiểm tra biểu hiện các chỉ thị của MSC

RT- PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) là phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ mRNA dựa vào đặc tính phiên

mã ngược Phương pháp RT – PCR vì vậy có thể được dùng để kiểm tra sự biểu hiện và mức biểu hiện của gen ở mức độ RNA

Hoạt động của RT – PCR có sự tham gia của hai loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA và DNA polymerase cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA Nguyên liệu để chạy RT - PCR gồm mẫu RNA tách chiết được, các loại hóa chất, vật liệu cần thiết để tiến hành phản ứng như: enzyme, dNTP, đệm cho hai phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại, mẫu RNA, nước, và một số cặp mồi,… Ngày nay trên thị trường đã có sẵn các

bộ Kit cho RT – PCR, trong đó từ thành phần phản ứng, quy trình đến tối ưu hóa đều được chỉ dẫn rất cụ thể (Lê Thị Thúy Dung, 2014) [31]

Một phản ứng RT – PCR thông thường sẽ có 5 bước:

1 Tách chiết RNA (có thể là RNA tổng số hoặc mRNA)

2 Tạo cDNA bằng phản ứng sao chép ngược

3 Tạo DNA từ cDNA bằng phản ứng PCR thông thường

4 Kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp điện di

5 Giải trình tự sản phẩm (với mồi đặc hiệu cao thì không quá cần thiết) Trong trường hợp các enzyme có nhiệt độ hoạt động gần nhau thì có thể thực hiện bước 2 và bước 3 trong cùng một phản ứng để tăng độ đặc hiệu

và hạn chế nguy cơ nhiễm, cũng như tiết kiệm thời gian (Lê Thị Thúy Dung, 2014) [31]

2.1.3.4 Một số phương pháp phân lập, nuôi cấy và biệt hóa hWJSCs

a) Các phương pháp mới để phân lập và nuôi cấy hWJSCs

Với mục đích nghiên cứu là phát triển các phương pháp thích hợp nhất

để phân lập MSCs có nguồn gốc từ dây rốn người Parvin Salehinejad và cộng

sự đã thực hiện bốn nhóm phương pháp để phân lập hWJSCs Bao gồm ba nhóm enzyme: Collagenase / hyaluronidase / trypsin (CHT), collagenase / trypsin (CT) và trypsin (Trp) và một nhóm nuôi cấy mảnh mô nhỏ (Exp) Ở cả bốn nhóm, đều phân lập được các tế bào hUCMs nhưng số lượng tế bào, khả năng tăng sinh, biểu hiện marker… của các tế bào bị phân lập ở các phương pháp là khác nhau

Phân tích Flow cytometry cho thấy các chỉ thị CD44, CD73, CD90 và CD105 được thể hiện trong tất cả các nhóm, trong khi CD34 và CD45 không được thể hiện Các chỉ thị của MSCs như CD73, CD90 được biểu hiện khác nhau trong các nhóm khác nhau: CD90 biểu hiện cao nhất ở nhóm CT và Exp; CD73 biểu hiện cao nhất ở nhóm Exp

Về khả năng tăng sinh, nhóm Exp có khả năng tăng sinh cao nhất Với các nhóm enzyme, các tế bào không tiếp tục tăng sinh sau khoảng 30 ngày nuôi cấy, nhưng ở nhóm Exp, tế bào có thể kéo dài thời gian tăng sinh tới 80 ngày

Về thời gian phân lập, chỉ sau 2 – 3 tiếng đồng hồ đã có thể phân lập được TBG ở phương pháp enzyme, trong khi đó phương pháp Exp phải mất đến 2 – 3 tuần mới quan sát thấy có tế bào mọc ra Số lượng tế bào ban đầu thu được nhiều nhất ở nhóm CT (0,5-1 × 104 tế bào / cm lớp WJ), ít hơn ở CHT (0,25 × 104 tế bào / cm lớp WJ), và ít nhất ở nhóm Trp (1 × 103 tế bào /

cm lớp WJ)

Hình thái tế bào giữa nhóm phân lập bằng enzyme và phân lập bằng nuôi cấy mảnh mô cũng có sự khác nhau Quần thể tế bào trong nhóm Exp có

tính đồng nhất cao với các tế bào giống nguyện bào sợi chiếm ưu thế Ở phương pháp enzyme, quần thể tế bào không đồng nhất, gồm các tế bào giống nguyên bào sợi với độ dài, ngắn khác nhau và cả các tế bào tròn nhỏ

Kết quả ở nghiên cứu trên cho thấy, phương pháp Exp tốn nhiều thời gian nhưng hiệu quả phân lập TBG là cao nhất Đối với phân lập bằng enzyme, tùy vào mục đích phân lập để lựa chọn hỗn hợp enzyme thích hợp (Parvin S., B A Noorjahan và cs, 2012) [20]

b) Các nghiên cứu mới về biệt hóa hWJSCs

Như đã nói ở trên, TBG từ dây rốn nói chung và hWJSCs có rất nhiều

ưu điểm, hiệu quả cao trong ứng dụng trong lâm sàng, vì vậy đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng biệt hóa đa dòng của hWJSCs

Phân tích Real-time reverse transcription polymerase chain reaction đã được thực hiện để xác định biểu hiện mRNA của của ba chỉ thị tế bào gan: ALB, AFP và CK-18 Kết quả cả 3 chỉ thị trên đều biểu hiện Western blot cũng được sử dụng để khẳng định cho kết quả này Phân tích Flow cytometry cho thấy hWJSCs dương tính với các dấu hiệu MSC (CD105, CD90, CD73, CD29, CD44 , CD59) và không biểu hiện các marker CD45, CD34 Phương pháp nhuộm PAS (Periodic acid–Schiff) và khảo nghiệm hấp thu LDL (Low-density lipoprotein) cũng được thực hiện để đánh giá khả năng lưu giữ glycogen và hấp thu lipoprotein của tế bào biệt hóa Kết quả cho thấy các tế bào nhuộm màu đỏ tươi với tỷ lệ phần trăm là 82, 9%, tế bào có thể hấp thu LDL với tỷ lệ cao 85, 8% (Ying N Z., C L Puv, và cs, 2009) [26]

Như vậy, hWJSCs đã được biệt hóa thành công thành tế bào có chức

năng và đặc điểm sinh học giống tế bào gan trong điều kiện in vitro

Trong nghiên cứu của mình, Ariff Bongso và Chui-Yee Fong đã thiết lập một số quy trình biệt hóa thành tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào mỡ và

tế bào sụn (Bongso A., Fong C Y,2012) [15]:

 Biệt hóa tế bào xương: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ trong môi trường tạo xương: DMEM – LG chứa 10% FBS, 50 ug/ml ascorbate -2 phosphate, 10-8 M dexamethasone vào 10mM β – glycerophosphat Môi trường biệt hóa được thay ba ngày một lần, các tế bào sau khi biệt hóa hoàn toàn (dựa vào hình dạng), tiến hành nhuộm hóa mô hay hóa mô miễn dịch

Biệt hóa tế bào cơ tim: Xử lí với 5 – azacytidine, ủ các MSC 24 giờ trong môi trường DMEM 3μM 5 – azacytidine Chuyển sang môi trường DMEM 10% FBS để ngăn cản sự chết tế bào do sự tiếp xúc quá lâu của 5 – azacytidine Duy trì tế bào ở môi trường DMEM 10% FBS từ 3 ngày đến 5 tuần Để có được môi trường điều kiện tế bào cơ tim, phải chuẩn bị bằng cách nuôi cấy tế bào cơ tim chuột 7 ngày tuổi trong môi trường DMEM với 4,5 g/l glucose, và 10% FBS trong khoảng 72 giờ, môi trường được thu nhận và li tâm khoảng 800 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, cuối cùng dịch nổi

được lọc để sử dụng như môi trường điều kiện cho MSCs (Qian Qian và cs, 2011) [22]

 Biệt hóa tế bào tạo sụn: Cấy chuyền tế bào 2 lần và ủ trong môi trường tạo sụn: DMEM-LG không huyết thanh có 1x insulin – transferin – selenium (IST) + premix (Gibco), 10 ng/ml transforiming growth factor (TGF) (Peprotech)

 Biệt hóa tạo mỡ: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ ấm trong môi trường tạo mỡ (DMEM và 1g/l glucose) chứa 10% FBS, 50 μg/ml ascorbate – 1 phosphate, 10 -7 M dexame thasone và 50 μg/ml indo methacin (Trương Định

và cs, 2009) [4], (Trần Văn Bé và cs, 2010) [1]

2.1.3.5 Ưu điểm của các tế bào gốc từ dây rốn

Hiện nay, các nhà khoa học chứng minh rằng dây rốn là nguồn cung cấp tế bào gốc lý tưởng nhất, sỡ dĩ như vậy vì tế bào gốc được lấy từ nguồn

này có rất nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với nhiều loại tế bào gốc từ mô mỡ, tủy xương Ví dụ như:

Dễ thu hoạch và xử lý mẫu, không gây bất kỳ ảnh hưởng gì đến sức khỏe của cả mẹ và con Thu hoạch và cất giữ tế bào gốc dây rốn không vi phạm đạo đức như tế bào gốc phôi Có thể chủ động kiểm soát tình trạng các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C… đối với các mẫu tế bào gốc bằng các xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ

Tế bào gốc dây rốn là tế bào gốc nhũ nhi, còn rất trẻ nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được trực tiếp hoặc sau tăng sinh in vitro là rất lớn Các tế bào gốc dây rốn không còn là các tế bào gốc phôi do vậy không

còn khả năng tạo ra u quái như tế bào gốc phôi (Phan Kim Ngọc, 2009) [8]

Có thể thu được nhiều loại tế bào gốc bao gồm các tế bào gốc trong máu dây rốn (chứa nhiều tế bào gốc tạo máu) và các tế bào gốc trung mô và tế bào gốc biểu mô từ màng dây rốn

Có thể lưu trữ lâu dài để sử dụng điều trị cho chính người có dây rốn ấy hoặc người thân trong gia đình họ hoặc cho người khác

Các tế bào gốc thu được từ dây rốn và máu thai biểu hiện HLA ở mức thấp và ít bị đào thải trong cấy ghép Đây là nguồn tế bào gốc quan trọng trong việc thay thế tủy xương khi không thể tìm được người cho có HLA phù hợp

Tế bào gốc máu dây rốn “hiền” hơn tế bào gốc tuỷ xương hoặc máu ngoại vi, khi dùng điều trị ít gây ra phản ứng phụ hơn tế bào gốc tuỷ xương hoặc máu ngoại vi, hoặc nếu có thì mức độ phản ứng nhẹ hơn (Bongso A, và

cs, 2012) [15], (Lan Nguyễn, 2013) [32]

Cuối cùng, có thể kết luận dây rốn là nguồn TBG lý tưởng vì xét về khả năng biệt hóa, tế bào gốc dây rốn thuộc loại đa tiềm năng, chúng có thể biệt hóa thành các loại tế bào như: tế bào máu, tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào

sụn, tế bào mỡ, tế bào gan (ngân hàng tế bào gốc, 2012) [33]