24 c các sensor huỳnh quang hg

Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, [r]

(c) Các sensor huỳnh quang Hg2L 2 và AMC đều có thể phát

hiện Cys trong dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian

của phản ứng xảy ra nhanh, có thể phát hiện được Cys với nồng độ

thấp hơn trong nội bào và thấp hơn so với các sensor đã công bố

5 Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính

huỳnh quang của các chất dựa trên hình học tối ưu tại trạng thái cơ

bản và các trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp

phân tích NBO để xem xét sự biến đổi đặc tính huỳnh quang của các

chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên kết Kết quả tính toán cho

thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm

khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay

đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh

quang trong phức Hg2L 2 Sự phát xạ huỳnh quang của AMC,

AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích

thích electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0 Đây là một

trường hợp ngoại lệ của quy tắc Kasha

MỞ ĐẦU

Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) và Homocysteine (Hcy) là

là những hợp chất thiol, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh học Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người Vì vậy, việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước

Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp huỳnh quang Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể phân tích các chất trong tế bào sống

Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992 Với những

ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại, anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007 bởi tác giả Dương Tuấn Quang

Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…) Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, -S trong vòng hoặc ở mạch hở

Tuy nhiên, đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử

dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có

bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa

sensor với chất phân tích xảy ra chậm Hiện nay, các nhà khoa học trên

thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có

độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II)

Hiện nay, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng

trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh

quang nói riêng Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực

nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít

sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố

Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

"Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của

cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) "

Những đóng góp mới của luận án:

- Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được

công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo

phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất của Hg(II) với L

(Hg2L 2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức,

hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON) Giới hạn phát hiện và giới

hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3

μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới hạn phát hiện và giới hạn

định lượng Cys bằng Hg2L 2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM

- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã

được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng

Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ

huỳnh quang ở hai bước sóng Giới hạn phát hiện và giới hạn định

lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM

- L và AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt

nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang

1.1.1 Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang

NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

1 Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai

sensor huỳnh quang mới là L và AMC Sự kết hợp linh hoạt này đã

giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và thực nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả năng thành công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được

nghiên cứu dự đoán từ tính toán và khẳng định từ kết quả tổng hợp thực nghiệm sau đó

3 Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được

xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu và khẳng định từ các kết quả thực nghiệm

4 (a) Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự

có mặt các ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang là 0,076 μM và 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM Phức Hg2L 2 có thể phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang Giới hạn phát hiện và

giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM Sensor L

phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L 2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng

trao đổi phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys (b) Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys,

GSH, Hcy) trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5

μM và 1,65 μM Sensor AMC phản ứng với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo cơ chế phản ứng AMC cộng Michael

Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0

tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm Trong khi đó, các quá

trình chuyển electron từ S2 về S0tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2

của AMC-Cys là xảy ra Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của

cả hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước

sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171;

điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC-Cys quan sát

được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3 nm là

mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm Ngoài ra, do quá

trình chuyển electron từ S2 về S1 tại cấu hình REES1, với cấu hình S2

tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá

trình (6) ở Hình 3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình

3.48b Đó có thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh

quang ở bước sóng dài (340,3 nm) mạnh hơn rất nhiều so với ở bước

sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong thực nghiệm

Đối với AMC-Hcy và AMC-GSH (tương tự AMC-Cys)

Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các

trạng thái kích thích của AMC, Cys, Hcy và

AMC-GSH cho thấy, đối với sensor AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu

phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu hình REES1 và REES2, điều

này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa hai tiểu

phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu

phần acryloxy bị phân tách mạnh Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa

các MO trong các bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích

của sensor AMC Ngược lại, tại REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và

AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy nằm trong

cùng một mặt phẳng Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen phủ

giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái

Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của

sensor AMC và các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt

nguồn từ trạng thái S1 Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc

của Kasha

1.1.2 Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang 1.1.3 Cấu tạo của sensor huỳnh quang

1.1.4 Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang

1.2 Vai trò của các biothiol trong tế bào và phương pháp phát hiện

1.2.1 Các biothiol và vai trò của chúng 1.2.2 Phương pháp phát hiện các biothiol

1.3 Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II)

1.3.1 Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II) 1.3.2 Phương pháp phát hiện ion Hg (II)

1.4 Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol

1.4.1 Dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde 1.4.2 Dựa trên phản ứng cộng Michael

1.4.3 Dựa trên phản ứng ghép nối peptide 1.4.4 Dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm 1.4.5 Dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester bởi thiol

1.4.6 Dựa trên phản ứng phân tách disulfides bởi thiol 1.4.7 Dựa trên phản ứng hình thành và phân hủy phức 1.4.8 Dựa trên các cơ chế khác

1.5 Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II)

1.5.1 Dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II) 1.5.2 Dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II)

1.6 Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên fluorophore là cyanine và coumarin

1.7 Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu các sensor huỳnh quang

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng

sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc

các biothiol và ion Hg(II):

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của

+ Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L)

phát hiện các biothiol Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành

trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của

sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc

các biothiol:

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và

phản ứng của sensor AMC với các biothiol

+ Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng

dụng của sensor AMC

+ Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của

sensor AMC

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết

- Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn

được thực hiện bằng phương pháp DFT tại B3LYP/LanL2DZ, sử

dụng phần mềm Gaussian 03

- Các thông số năng lượng tương tác được hiệu chỉnh ZPE

gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các

phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng

của các sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia

- Tính toán trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời

gian được thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết

- Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý

thuyết B3LYP/LanL2DZ

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực nghiệm Ngoài

ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ S0→S2 (quá trình (2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0 (quá trình (4) ở Hình 3.48a) Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn cường

độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong thực nghiệm

Hình 3.48 Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng

năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (R GS ) và trạng thái kích thích electron (R EES1 , R EES2 , ) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC;

(b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

(d )

(c )

3.2.3.2 Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang

a Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích

Từ kết quả tính toán cho thấy, trong sensor AMC, bước

chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích

thích S1 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn nhất là

0,5348, tại bước sóng 320,9 nm Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ

yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO,

với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21% Bên cạnh đó, sự xen phủ giữa

HOMO và LUMO là rất lớn, điều này cho thấy việc chuyển electron

từ HOMO sang LUMO là thuận lợi Các bước chuyển trạng thái khác

đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể

Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số

liệu tính toán cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ

bản S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường

độ dao động (f) lần lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất

nhiều so với các bước chuyển khác), tại các bước sóng tương ứng là

300,6; 300,4 và 300,7 nm Trong các bước chuyển trạng thái này,

bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển chính,

với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17; 89,05 và 89,24% Mặt khác,

sự xen phủ giữa HOMO-1 và LUMO là rất lớn, nên việc chuyển

electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi Các bước chuyển trạng

thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể

Kết quả phân tích các MO biên cũng cho thấy, không có sự

xen phủ giữa HOMO và HOMO-1 Do đó, trong AMC, AMC-Cys,

AMC-Hcy và AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến

HOMO-1 Kết quả, các chất AMC, Cys, Hcy và

AMC-GSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở thực nghiệm

b Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang

Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình

chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là bị cấm Tại cấu hình REES2, các

quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là xảy ra Thêm vào đó,

do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn

không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều này dẫn đến cường độ huỳnh

- Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi các phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS

- Đặc tính, ứng dụng của các sensor được thực hiện bởi phương pháp quang phổ huỳnh quang và UV-Vis

- Các điều kiện tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa trên kết quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm công bố trước đây về các phản ứng tương tự [2], [3], [29] Quy trình tổng hợp các sensor được tóm tắt như sau:

a Tổng hợp sensor L

* Tổng hợp CBZT

2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic (4,18 g, 0,03 mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 8 giờ Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và thu được kết tủa Rửa sạch kết tủa nhiều lần với ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất rắn

CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%)

* Tổng hợp sensor L

4-diethylamino-2-hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL ethanol tuyệt đối Thêm 1 giọt piperidine, dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10 giờ, sau đó làm nguôi đến nhiệt độ phòng Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều

lần bởi diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng

3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%)

b Tổng hợp AMC

Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu được dung dịch Làm lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 0 oC Thêm từ từ (trong khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng từng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL) Sau

đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng Thêm nước vào dung dịch thu được để hòa tan các muối amine Tiếp tục rửa sạch pha hữu cơ thu được bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng

muối MgSO4 khan Làm bay hơi dung môi hữu cơ trên máy cô quay

chân không Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng cách kết tinh lại

trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng

khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn

xuất của cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên

phản ứng tạo phức

3.1.1 Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp, đặc trưng của

sensor L

3.1.1.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L

Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ đã được áp dụng cho hệ

nghiên cứu

Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2,

Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các

dạng này đều có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor Trong đó,

donor (nhóm đẩy electron) là một nhóm amino; aceptor (nhóm rút

electron) là ion amoni Chúng được biết đến là những hợp chất màu,

- O2C

N HO

HO

L CBZT

BZT

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L

Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là

nhóm có ái lực mạnh với ion Hg(II); các phản ứng tổng hợp L thực

hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) và giai đoạn (II)

Receptor

Fluorophore

huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol + các amino acids với các dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b)

d Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys

Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ

tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F 450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], với R = 0,982 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys đã được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM

3.2.3 Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của AMC 3.2.3.1 Hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH ở trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích electron Đối với sensor AMC, ở trạng thái cơ bản S0, tiểu phần

coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng Trong khi đó, ở trạng thái kích thích electron S1(REES1) và S2(REES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau

Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, trong các cấu

hình S0(RGS) và S1(REES1), có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và acryloxy Trong khi đó, ở cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng

=7,4, 1/4, v/v, tại 25 o

C) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang

của AMC (10 μM, C 2 H 5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 o

C) trong sự hiện diện của hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser,

Trp, Tyr và Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH

Trong khi đó, dung dịch sensor AMC tự do hiển thị một

dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375

nm và 450 nm (Hình 3.33b) Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ)

của sensor AMC đã được xác định là 0,05 Khi thêm Cys vào

dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần ở cả hai

đỉnh phát xạ Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước

sóng dài tăng mạnh hơn cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước

sóng ngắn Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng

375 và 450 nm như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng

AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi

tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng để xác định Cys

b Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys

Khi thêm Cys từ 0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10

μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm

(F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys Sau đó,

tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys

Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ

mol 1:1 (tương tự Hcy và GSH) Kết quả này phù hợp với kết quả

thu được khi xác định hệ số tỷ lượng của phản ứng giữa AMC với

Cys bằng phương pháp đồng phân tử gam và phân tích phổ khối

lượng của sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys

c Khảo sát ảnh hưởng của các amino axit cạnh tranh

Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung các amino acids có

chứa thiol, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng

lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng

450 nm và tăng vừa phải ở bước sóng phát xạ 375 nm Tuy nhiên,

mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys>

GSH> Hcy (Hình 3.38a)

Đối với amino acids khác không có chứa nhóm thiol hầu như

không làm thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch sensor

AMC (Hình 3.38a) Sự có mặt của amino acids này cũng không làm

ảnh hưởng đến phản ứng giữa các biothiol (Cys, GSH và Hcy) với

AMC, bằng chứng là không xuất hiện sự khác biệt đáng kể giữa phổ

Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I) dựa trên phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic[29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa trên phản ứng phản ứng cộng andol và ngưng tụ croton [3]

a Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I)

Phản ứng hình thành CBZT từ

BZT và acid bromoacetic được

trình bày ở Hình 3.2 và 3.3 Kết quả tính toán cho thấy, phản ứng

giữa BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm để hình thành CBZT là thuận lợi về

S

N COOH

OHC N HO

N +

S

COO

-(12) N

L

H 2 O HO

DHB

Hình 3.5 Các sản phẩm phản ứng có thể

hình thành giữa CBZT với DHB

3.1.1.2 Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của L

a Cấu trúc phân tử của L

Chiều dài các liên kết, số

đo các góc liên kết, góc

nhị diện trong L đã được

tính toán Trong đó, các tiểu phần BZT, acid

bromacetic và DHB ít

thay đổi so với ban đầu

Trong L có sự hình thành

liên kết mới giữa N7 và C11

và liên kết đôi giữa nguyên

tử C10 và nguyên tử C12

b Phân tích phổ UV-Vis của sensor

Phổ UV-Vis của sensor L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm

Trong một công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự

như sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại ở 405 nm, là một chất

phát xạ huỳnh quang mạnh ở bước sóng 495 nm Kết quả này dẫn

đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của L tương tự BZTVPA

c Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L

Bảng 3.5 Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên

quan đến quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Khác với nghiên cứu trên, kết quả tính toán về mặt nhiệt

động cho thấy, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol (bao

gồm Cys, Hcy và GSH) để hình thành các thioether theo tỉ lệ mol 1:1

là thuận lợi về mặt nhiệt động

3.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của AMC

3.2.2.1 Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC

Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm AMC đã được

khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS

3.2.2.2 Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC

a Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC

Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ của dung dịch sensor

AMC tự do đạt cực đại tại bước sóng 275 và 320 nm Khi thêm

Cys vào dung dịch của sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không đáng kể

Hình 3.33 Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM)

trong C 2 H 5 OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) tại 25C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang,

AMC (10 μM) khi thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys

trong C 2 H 5 OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25C, bước sóng kích thích 320 nm

0,998 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã được xác định

tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM

3.2 Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh

quang AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol dựa

trên phản ứng cộng Michael

3.2.1 Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng

giữa sensor AMC với các biothiol

3.2.1.1 Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại ở

bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159]

Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4-

metylcouramin) từ dẫn xuất của coumarin dùng để phát hiện các

biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael, hợp chất

4-methyl-7-hydroxylcoumarin được chọn làm fluorophore, còn receptor là

acryloyl chloride, vì phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng

thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với dẫn

xuất axit [2] và receptor này có thể gây ra phản ứng cộng với

Hình 3.29 Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Kết quả tính toán cho thấy, ΔG 298 của phản ứng tổng hợp

sensor AMC là âm, theo đó phản ứng tổng hợp sensor AMC là thuận

lợi về mặt nhiệt động

3.2.1.2 Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với

các biothiol

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây, phản

ứng cộng Michael giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các

Receptor Fluorophore

Bước chuyển

MO Năng lượng

(eV)

Bước sóng (nm)

một kỳ vọng rằng L là hợp chất phát huỳnh quang

3.1.2 Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L

3.1.2.1 Thực nghiệm tổng hợp L

Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm CBZT và L đã

được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ FAB-MS

3.1.2.2 Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.10 Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM)

trong C 2 H 5 OH/H 2 O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) trong C 2 H 5 OH/H 2 O

Như dự đoán từ tính toán, L phát huỳnh quang màu đỏ, với

hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175; bước sóng huỳnh quang

cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm

b Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của

sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng và làm thay đổi phổ

UV-Vis và phổ huỳnh quang của L Cường độ huỳnh quang dung

dịch L giảm dần khi tăng nồng độ Hg(II)

c Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II)

Hình 3.12 cho thấy, cường độ huỳnh quang

dung dịch L giảm mạnh

khi nồng độ ion Hg(II) tăng từ 0 đến 5,0 M; và sau đó giảm không đáng

kể khi tiếp tục tăng nồng

độ ion Hg(II) Điều này

cho thấy L phản ứng với Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1

Hình 3.12 Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản

ứng giữa ion Hg(II) với L (L (5,0 M) trong

C 2 H 5 OH/H 2 O (1/9, v/v) ở pH ~7,4, bước sóng huỳnh

quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.11 Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0

μM) trong C 2 H 5 OH/H 2 O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO 4 ) 2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM)

trong C 2 H 5 OH/H 2 O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO 4 ) 2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.24 cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2: ở phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần dần biến mất, đồng thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước sóng 540 nm; ở phổ huỳnh quang, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại

b Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản ứng của Hg 2 L 2 với các biothiol

Kết quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ các amino acids

có chứa nhóm thiol mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang của dung dịch Các amino acids khác không chứa nhóm thiol hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch phức Hg2L2 Điều này cho thấy, phức Hg2L2 như một sensor huỳnh quang để phát hiện chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các amino acids không chứa nhóm thiol Kết quả thí nghiệm ở Hình 3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp đến là GSH, Hcy

c Khảo sát sử dụng Hg 2 L 2 phát hiện định lượng Cys

Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5 μM, biến thiên cường

độ huỳnh quang (F 585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể hiện

bởi phương trình F 585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R =

Hình 3.25 (a) Phổ huỳnh quang của Hg 2 L 2 (2,5 μM) trong C 2 H 5 OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) tại 25 o C khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His (Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên ngoại trừ Cys, Hcy và GSH) (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch

Hg 2 L 2 (2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác

3.1.4 Nghiên cứu sử dụng phức Hg 2 L 2 phát hiện các biothiol

3.1.4.1 Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ các phản ứng tạo phức

Hằng số bền của phức đã được xác định bằng phương pháp

chuẩn độ huỳnh quang Kết quả tính toán đã xác định được hằng số

bền của phức Hg2L2 bằng 1017,45 (M-3) Trong khi đó, hằng số cân

bằng tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với các biothiol RSH, (2Hg(II)

+ 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) đối với Cys, GSH, Hcy tương ứng là

1020,1; 1020,2 và 1019,7 Vì vậy, phản ứng giữa Hg2L2 với các

biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với các biothiol

và giải phóng L tự do có thể xảy ra

Kết quả nghiên cứu về mặt nhiệt động của sự tương tác giữa

ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy ra vì có

ΔG 298 là âm nhất (ΔG 298 = -821,6 kcal.mol-1)

2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14)

Sự biến thiên của năng lượng tự do của phản ứng tạo Hg2L 2

từ ion Hg(II) và sensor L là -410,2 kcal.mol‾1

Do đó, phản ứng sau xảy ra (vì có ΔG 298 là -1232 kcal.mol-1):

Hg2L 2 + 4 H2Cys + 80H

3.1.4.2 Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg 2 L 2 làm sensor

huỳnh quang phát hiện các biothiol

a Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của Hg 2 L 2

Hình 3.24 Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch

Hg 2 L 2 (2,5 μM) trong C 2 H 5 OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, ở 25 C khi thêm 0-10

μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm

d Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại cạnh tranh

Hình 3.13 cho thấy, không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào trong phổ UV-Vis cũng như phổ huỳnh quang khi thêm các ion kim loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I)

với nồng độ gấp 5 lần so với L Như vậy, L có thể phát hiện chọn lọc

ion Hg(II) trong sự hiện diện các ion này

e Khảo sát sử dụng sensor L phát hiện định lượng ion Hg(II)

Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L: biến

thiên mật độ quang (ΔA 540 ) và biến thiên cường độ huỳnh quang

(∆I 585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) bởi các phương

trình tương ứng: ΔA 540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)],

∆I 585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng phương pháp trắc quang tương

ứng là 15,3 μg/L và 51,2 μg/L hay 0,076 μM và 0,25 μM và phương pháp huỳnh quang tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059

μM và 0,19 μM

3.1.3 Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.13 Phổ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của L (1,5 μM) với sự hiện diện của các ion

kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho mỗi ion kim loại) trong C 2 H 5 OH/H 2 O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

tại mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

a Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg 2 L 2

Kết quả tính toán sự hình thành phức giữa ion Hg(II) và L

theo tỷ lệ mol 1:1 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có

một cấu trúc hình học bền được tìm thấy là Hg2L 2 và được thể hiện

ở Hình 3.16 Sự hình thành phức Hg2L 2 là thuận lợi về mặt nhiệt

động, với giá trị ∆G 298 là -410,2 kcal mol-1 Các liên kết tạo phức

gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, và O26O71 Các liên

kết này hình thành được cho là dựa trên kết quả tính toán khoảng

cách giữa các nguyên tử nhỏ hơn đáng kể so với tổng bán kính Van

der Waals của nguyên tử tham gia liên kết

Để khẳng định cấu trúc của phức Hg2L2, phân tích AIM đã

được tiến hành Kết quả phân tích cho thấy: có sự tồn tại các điểm tới

hạn liên kết (BCPs) giữa các điểm tiếp xúc giữa các phối tử O, S với

Hg(II), các liên kết này là liên kết cộng hóa trị và có sự tồn tại các

điểm tới hạn vòng RCPs giữa các tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu

trúc vòng)

Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào bản chất

electron của các liên kết, phân tích NBO cũng được tiến hành Kết

quả cho thấy, L tự do có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát

huỳnh quang); L trong phức: cặp electron của N7 không còn liên hợp

vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có sự

chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang của phức

b Phân tích đặc tính huỳnh quang của phức Hg 2 L 2

Kết quả tính toán ở Bảng 3.8 cho thấy, sự hình thành phức

Hg2L2 đã dẫn đến sự chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ các phối

tử L đến các ion kim loại Hg(II) trung tâm và thu hẹp khoảng cách

năng lượng giữa HOMO và LUMO Kết quả, ở trạng thái kích thích

chính (cường độ dao động lớn nhất và bằng 0,5913) từ S0→S2, với sự

đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có

năng lượng kích thích rất nhỏ là 1,37 eV Điều này dẫn đến bước

sóng phát xạ huỳnh quang của phức sẽ chuyển về vùng bước sóng

dài, lớn hơn 900 nm Vì vậy, trong thực tế không phát hiện được

huỳnh quang từ phức Hg2L2

Bảng 3.8 Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của Hg 2 L 2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

MO Năng lượng

(eV)

Bước sóng (nm)

2,57 27,67