KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Streptomyces VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Str

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE

CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC Streptomyces

VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 7/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE

CỦA MỘT SỐ CHỦNG THUỘC STREPTOMYCES

VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT LƯƠNG THỊ YẾN NGUYỆT

KS LÊ HỒNG THỦY TIÊN

Tháng 7/2010

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nổ lực của bản thân là sự chỉ dẫn tận tình của thầy cô, giúp đỡ của bạn bè và sự động viên khích lệ từ gia đình

Bằng lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng Quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

ThS Nguyễn Như Nhứt, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi để hoàn thành khóa luận này

Các anh chị trong Công ty Gia Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận cũng như quá trình làm quen với môi trường làm việc

Các bạn lớp CNSH 32 đã cùng làm việc, động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Má, người luôn dõi theo từng bước đi của tôi, cùng mọi người trong gia đình đã quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện

Lương Thị Yến Ngyệt

TÓM TẮT

ii

Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, mức sống của con người này càng cao Do

đó, nhu cầu ứng dụng khoa học kỹ thuật vào vào đời sống ngày càng nhiều Cùng với

sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ enzyme nói riêng, các chế phẩm enzyme mà đặc biệt là protease được ứng dụng ngày càng nhiều nhiều vào các lĩnh vực như: công nghiệp da, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sữa, chất tẩy rửa…Vi sinh vật là nguồn thu nhận protease phong phú và có giá trị nhất Vì những lý

do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một

số chủng thuộc Streptomyces và ứng dụng trong sản xuất”

Các chủng Streptomyces được xác định khả năng sinh tổng hợp protease Trong

23 chủng Streptomyces nghiên cứu, chủng St 12 cho hoạt tính protease cao nhất

Chủng này được nuôi cấy trong môi trường sinh protease dịch thể với các điều kiện khác nhau để chọn ra điều kiện thích hợp nhất cho sự tổng hợp protease Hoạt tính protease và hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Anson và phương pháp Lowry Kết quả thu được cho thấy protease đạt hoạt tính cao nhất (0,628 đvht/ml) tại pH = 5 và sau 7 ngày nuôi cấy Pepton và sucrose với nồng độ 1 % là nguồn nitrogen và carbon tốt nhất Và sự sinh tổng hợp protease cao trong môi trường bổ sung 5 % MgCl2 Enzyme thu được được tinh sạch sơ bộ bằng cách tủa bằng ethanol với các tỷ lệ và thời gian khác nhau Với tỷ lệ Venzyme : Vethanol là 1:3 trong 20 phút hiệu suất thu hồi hoạt tính đạt tối đa

SUMMARY

iii

The thesis: “Servey the ability of biosynthesizing protease of some Streptomyces

and application in protease production”

Nowadays, society’s developing, the masses’s living standard becomes higher with every passing day Therefore, the application’s need of science and technology become much more Following development of science and technology, enzyme technology, emzyme products in protease group were applied more and more, such as: bating hides, food, dairy industry and laundry detergent…Microorganism is plentiful sources to receive protease Thus, we carry out this thesis

Streptomyces strains were assayed protease production Steptomyces strain St 12

is able to produce the highest activity protease among 23 strains be studied This strain cutivated in liquid protease production media and difference conditions to choose optium condition Enzyme was assayed by Anson and Lowry method using casein and albumin as a substrate The result show that protease production was optimum (0,626 UI/ml) after the incubation of 7 days at pH 5 in shaking culture 1% pepton and sucrose were the best nitrogen and carbon sources In medium adding 5 % MgCl2, protease production ability was best Protease was received by enzyme and ethanol with volume ratio mixing Activity is maximum efficiency at Venzyme : 3Vethanol in 20 minutes

Key words: Streptomyces, protease production, culture, enzyme assay.

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN III TÓM TẮT IV

iv

SUMMARY V MỤC LỤC VI DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT X DANH SÁCH CÁC BẢNG XI DANH SÁCH CÁC HÌNH XII

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về protease 3

2.1.1 Giới thiệu chung về protease 3

2.1.1.1 Định nghĩa 3

2.1.1.2 Cấu tạo 3

2.1.1.3 Chức năng sinh học của protease 4

2.1.2 Phân loại protease 4

2.1.3 Ứng dụng 6

2.1.3.1 Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa 6

2.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm 6

2.1.3.3 Trong công nghiệp da 7

2.1.3.4 Trong các lĩnh vực khác 7

2.1.4 Nguồn thu nhận protease 7

2.1.4.1 Động vật 7

2.1.4.2 Thực vật 7

2.1.4.3 Vi sinh vật 8

2.2 Giới thiệu chung về Streptomyces 8

2.2.1 Hình thái và phân loại Streptomyces 8

2.2.1.1 Hình thái 8

2.2.1.2 Phân loại 9

2.2.2 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 10

2.2.3 Chu trình đời sống của Streptomyces 10

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces 12

v

2.2.4.1 Thành phần môi trường 12

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

3.1 Thời gian và đại điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu 14

3.2.1 Giống xạ khuẩn 14

3.2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 14

3.2.2.1 Hóa chất 14

3.2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 14

3.2.3 Các công thức môi trường 14

3.2.3.1 Môi trường cấy chuyền và giữ giống 14

3.2.3.2 Môi trường thử khả năng sinh protease 15

3.3.3.3 Môi trường tăng sinh dịch thể 15

3.3.3.4 Môi trường đếm khuẩn lạc 16

3.3.3.5 Môi trường nuôi cấy dịch thể sinh tồng hợp protease 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống 16

3.3.2 Phương pháp định tính khả năng sinh protease 16

3.3.3 Phương pháp tăng sinh 17

3.3.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 17

3.3.5 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường dịch thể 17

3.3.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme 18

3.3.7 Phương pháp xác định hoạt tính protease 18

3.3.7.1 Nguyên tắc 18

3.3.7.2 Hóa chất 18

3.3.7.3 Dựng đường chuẩn Tyrosine 18

3.3.7.4 Xác định hoạt tính enzyme 19

3.3.7.5 Tính kết quả 19

3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng protein 20

3.3.8.1 Nguyên tắc 20

3.3.8.2 Hóa chất 20

3.3.8.3 Dựng đường chuẩn albumin 21

vi

3.3.8.4 Xác định hàm lượng protein dung dịch mẫu 21

3.3.8.5 Tính kết quả 21

3.3.9 Phương pháp xác định khối lượng sinh khối Streptomyces 21

3.3.10 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease 22

3.3.10.1 Thời gian nuôi cấy 22

3.3.10.2 pH 22

3.3.10.3 Nguồn nitrogen 22

3.3.10.4 Nguồn carbon 22

3.3.10.5 Các loại muối 23

3.3.10.6 Vai trò của các thành phần môi trường nuôi 23

3.3.11 Phương pháp tinh sạch sơ bộ protease 23

3.3.11.1 Khảo sát tỷ lệ tủa 23

3.3.11.2 Khảo sát thời gian tủa 23

3.3.12 Xác định hiệu suất thu hồi hoạt tính protease và hàm lượng protein 23

3.3.13 Phương pháp đánh giá khả năng giặt tẩy của enzyme 24

3.1.14 Sơ đồ nghiên cứu 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả 26

4.1.1 Chọn giống 26

4.1.1.1 Định tính khả năng sinh protease của các chủng Streptomyces 26

4.1.1.2 Thời gian nuôi cấy 28

4.1.2 Kết quả ảnh hưởng của một số yếu tố 28

4.1.2.1 pH 28

4.1.2.2 Nguồn nitrogen 29

4.1.2.3 Nguồn carbon 30

4.1.2.4 Các loại muối 31

4.1.2.5 Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy 32

4.1.3 Tinh sạch sơ bộ protease 33

4.1.3.1 Tỷ lệ tủa 33

4.1.3.2 Thời gian tủa 34

4.1.4 Thử nghiệm chế phẩm protease 35

4.2 Thảo luận 37

vii

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DIFP : Diisopropyl Fluorophosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid

EGTA : Ethylene Glycol Tetraacetic Acid

ISP : International Streptomyces Project

Kbs : Không bổ sung

MT : Môi trường

p-CMB : p-chloromercuribenzoic acid

PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride

TCA : Tricloroacetic Acid

Đvht : Đơn vị hoạt tính

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Tyrosine 19

Bảng 3.2 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease 19

Bảng 3.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Albumin 21

Bảng 4.1 Kết quả đường kính vòng phân giải casein của 23 chủng Streptomyces 26

Bảng 4.2 Hoạt độ protease sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau 28

Bảng 4.3 Hoạt độ protease và sinh khối khi nuôi cấy ở các pH khác nhau 29

Bảng 4.4 Hoạt độ protease và sinh khối với các nguồn nitrogen khác nhau 30

Bảng 4.5 Hoạt độ protease và sinh khối với các nguồn carbon khác nhau 31

Bảng 4.6 Hoạt độ protease và sinh khối với các loại muối khác nhau 31

ix

Bảng 4.7 Các môi trường nuôi cấy khiếm khuyết các thành phần khác nhau 32

Bảng 4.8 pH, hoạt tính protease và sinh khối ở các môi trường khác nhau 33

Bảng 4.9 Hiệu suất thu hồi với các tỷ lệ 34

Bảng 4.10 Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hàm lượng protein 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc không gian của renin 3

Hình 2.2 Sơ đồ phân loại protease 5

Hình 2.3 Khuẩn lạc Streptomyces 8

Hình 2.4 Một số loại bào tử xạ khuẩn 9

Hình 2.5 Sơ đồ chu trình đời sống của Streptomyces coelicolor 11

Hình 4.1 Biểu đồ đường kính vòng phân giải casein của 23 chủng Streptomyces 27

Hình 4.2 Vòng phân giải casein của một số chủng Streptomyces 27

Hình 4.2a Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 1 36

Hình 4.2b Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 2 36

Hình 4.2c Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 3 36

Hình 4.2d Vết máu trước và sau thử nghiệm ở khay 4 37

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ sản xuất enzyme và protein nói riêng, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, chăn nuôi, trồng trọt, thủy sản, thú y, y tế…Việc sử dụng enzyme làm tăng hiệu quả đáng kể trong các ngành sản xuất, đồng thời hạn chế ô nhiễm môi trường nhờ thay thế sử dụng các loại hóa chất độc hại

Trong số các enzyme thương mại, protease là enzyme quan trọng nhất và chiếm

đa số với hơn 65% tổng số giá trị các enzyme ứng dụng trong công nghiệp (Jignasha T Thumar và Satya P Singh, 2007) Protease là nhóm các enzyme tham gia xúc tác các phản ứng thủy phân các phân tử protein thành các peptid hoặc amino acid Chúng được ứng dụng nhiều nhất trong một số ngành công nghiệp như: sản xuất các chất tẩy rửa, thuộc da, trong chế biến thực phẩm, sản xuất thức ăn gia súc, xử lý chất thải…

Protease có thể được thu nhận từ động vật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và có nhiều giá trị kinh tế Protease có ở hầu hết các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn (gồm nhiều loài thuộc các giống

Clotridium, Bacillus, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces) và một số loại nấm men

Vi sinh vật có khả năng sinh sản rất nhanh, khả năng trao đổi chất lớn nên có thể chuyển hóa một lượng lớn vật chất môi trường và tổng hợp một lượng lớn protease Vì thế, các chế phẩm protease trên thị trường có nguồn gốc chủ yếu từ vi sinh vật

Mặc dù các sản phẩm protease được sản xuất chủ yếu từ nấm và vi khuẩn, nhưng gần đây xạ khuẩn cũng được nghiên cứu và sử dụng để sản xuất protease Điển hình là

một số chủng Streptomyces như: S clavuligerus, S erythreus, S griseus, S Moderatus

và S rimosus… (Shang-Shyng Yang và Chiou-Mei Lei, 2000) Streptomyces thuộc

nhóm vi khuẩn Gram dương, dạng sợi và được biết nhiều nhất với khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh và enzyme thủy phân có giá trị thương mại

Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất protease, từ vi sinh vật nói chung và

Streptomyces nói riêng, để phục vụ trong các ngành công nghiệp có ý nghĩa thực tiễn to

lớn Từ ý nghĩa thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng

hợp protease của một số chủng thuộc Streptomyces và ứng dụng trong sản xuất”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Chọn lọc chủng Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất trong các chủng Streptomyces do phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia

Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương cung cấp

Khảo sát và nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy và thành phần

môi trường đến sự sinh tổng hợp protease của chủng Stretomyces đã chọn, chọn lọc môi

trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp để tiến hành nuôi cấy thu nhận protease Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch protease từ dịch nuôi cấy, chọn lọc phương pháp tinh sạch cho hiệu suất hoạt tính protease cao nhất

1.3 Nội dung thực hiện

Định tính khả năng phân giải protein của các chủng Streptomyces nghiên cứu, chọn lọc sơ bộ một số chủng Streptomyces cho vòng phân giải protein lớn nhất

Tiến hành nuôi cấy các chủng chọn lọc trên môi trường nuôi cấy sinh protease,

chọn lọc chủng Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất

Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

protease của chủng Streptomyces đã lựa chọn

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường lên khả năng sinh tổng

hợp protease của chủng Streptomyces đã chọn

Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces đã lựa chọn trong môi trường nuôi

cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp, nghiên cứu tinh sạch sơ bộ để thu nhận protease từ dịch nuôi cấy

Thử nghiệm chế phẩm protease thu được để thủy phân protein có trong vết máu trên vải

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.1.2 Cấu tạo

Protease là các phân tử protein có khả năng xúc tác thủy phân các liên kết peptid

và có chứa tâm hoạt động trong cấu tạo phân tử Đây là vị trí gắn với cơ chất trong quá trình thủy phân Riêng mỗi loại protease đều có cấu tạo khác nhau, đặc biệt là cấu tạo của tâm hoạt động vì thế chúng thực hiện những chức năng sinh học khác nhau

Một ví dụ về cấu tạo phân tử của renin, một protease thuộc nhóm aspartic protease Trong cấu tạo, renin có tâm hoạt động nằm sâu trong khe giữa hai thùy (lobe) tương đồng Hoạt động thủy phân của tâm hoạt động gồm hai acid aspartic, mỗi acid aspartic nằm trong mỗi thùy (lobe) của phân tử renin Một thành phần chính của tâm hoạt động là một subpocket riêng biệt (S3sp), là điểm đặc trưng của renin và cũng

là duy nhất trong nhóm các aspartate protease (Alan H Gradman và ctv, 2008)

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của renin

(Alan H Gradman và ctv, 2008)

Khác với cấu tạo của renin, tâm hoạt động của các cysteine protease nói chung thường được cấu tạo bởi bốn pocket (S1, S2, S3 và S1’) S1 là pocket được xác định ít

rõ ràng nhất trong các cysteine protease, thường giữ glutamin của “oxyanion hole” Pocket được xác định rõ ràng nhất là S2, chi phối đặc trưng của các gốc kết hợp Mặc

dù, hầu hết những phần còn lại ở đây đều là kỵ nước, nhưng đôi khi có phần có cực như glutamic hoặc acid aspartic thì hiện diện ở phần rỗng của cuối pocket Một trong những phần còn lại bảo tồn khá cao trong S1’ là tryptophan, được biết với khả năng tương tác kỵ nước với cơ chất Các khu vực giàu glycine của các vị trí kết hợp thì biểu trưng cho S3 (Yogesh A Sabnis và ctv, 2003)

2.1.1.3 Chức năng sinh học của protease

Protease đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho các sinh vật sống Vì thế, với những chức năng khác nhau, chúng được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống Trong

cơ thể, protease đảm nhận nhiều chức năng như hoạt hóa zymogen, đông máu, phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, hoạt hóa bổ thể, sản xuất hormon, trong thụ tinh và tiêu hóa thức ăn… Protease hoạt hóa các zymogen bằng cách cắt một liên kết peptid trong phân tử của chúng làm chúng trở thành các phân tử hoạt động Ngoài ra, protease còn tăng sự phân chia tế bào và tổng hợp DNA nên được xem là yếu tố làm phát triển

tế bào bình thường cũng như tế bào ác tính (Hans Neurath và Keneth A Walsh, 1976)

Ở một số vi sinh vật, các protease ngoại bào giúp phân hủy nguồn cơ chất ngoài môi trường thành những chất dễ hấp thu mà vi sinh vật có thể sử dụng Do đó, các vi sinh vật này có thể sử dụng nhiều nguồn cơ chất giàu protein trong môi trường xung quanh Các protease nội bào được xem là có vai trò quan trọng hơn so với các protease ngoại bào Chúng thực hiện nhiều chức năng như: phân hủy các peptid đưa từ môi trường vào thành các amino acid để sử dụng và đồng thời cũng loại bỏ một số peptide gây độc cho tế bào, phân hủy các protein tổng hợp sai, tham gia vào quá trình tự chết của tế bào…

2.1.2 Phân loại protease (A Sumantha và ctv, 2006)

Protease là một nhóm lớn, phức tạp và có các đặc tính khác nhau như tính đặc hiệu

cơ chất, vị trí hoạt động cũng như cơ chế xúc tác, nhiệt độ và pH tối ưu, sự ổn định… Nét đặc trưng của các enzyme thủy phân protein là chúng phụ thuộc vào bản chất của các amino acid và các nhóm chức khác có liên kết với những liên kết bị thủy giải

Theo sự phân loại của Ủy ban enzyme (Enzyme Commission, EC), protease thuộc nhóm 3 (hydrolase, EC 3), phân nhóm 4 (thủy phân các liên kết peptide, EC 3.4) Protease có thể được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase Exopeptidase được chia thành hai nhóm nhỏ dựa trên vị trí tác động trên mạch polypeptide Aminopeptidase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid ở đầu C- Và carboxypeptidase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid ở đầu N-

Endopeptidase được chia thành 4 nhóm dựa trên tâm hoạt động và tính nhạy cảm với các chất ức chế khác nhau Aspartic protease hay carboxyl protease (EC 3.4.23) chứa aspartate hoặc cysteine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi pepstatin Cysteine protease hay thiol protease (EC 3.4.22) chứa aspartate hoặc cysteine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi

indoacetamide, p-chloromercuribenzoic acid (p-CMB) Metallo protease (EC 3.4.24) chứa

phenylalanine hoặc leucine ở tâm hoạt động và bị ức chế bởi các chất ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)… Serine protease (EC 3.4.21) chứa serine hoặc histidine và aspartate ở tâm hoạt động, bị ức chế bởi các chất phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), Diisopropyl fluorophosphate(DIFP), EDTA, indole, phenol, triamino acetic acid, các dung dịch đệm phosphate

Hình 2.2 Sơ đồ phân loại protease

Protease cũng được phân biệt dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của các nhóm tích điện ở những vị trí nhạy cảm và cũng được phân loại dựa vào một số cách như: nơi hiện diện (có protease ngoại bào và protease nội bào), pH tối ưu (có các protease acid, trung tính hay kiềm), sự đặc hiệu về cơ chất (có collagenase, keratinase, elastase…), dựa vào

nguồn thu nhận protease (có protease động vật, protease thực vật và protease vi sinh vật 2.1.3 Ứng dụng

Protease là enzyme rất đa dạng về chức năng, có nhiều ứng dụng quan trọng thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học Chúng là một trong 3 nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp da, công nghiệp thực phẩm…

2.1.3.1 Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa

Protease nói chung và protease kiềm nói riêng là thành phần quan trọng không thể thiếu trong các chất tẩy rửa Chúng có mặt ở hầu hết các chất tẩy rửa như kem đánh răng, thuốc tẩy kính, bột giặt… Việc sử dụng protease trong thành phần bột giặt đã có lịch sử gần 100 năm và là loại chất tẩy rửa sử dụng nhiều protease nhất (Nguyễn Tiến Thắng, 2008) Các chất tẩy rửa có protease sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn, đặc biệt loại bỏ

dễ dàng vết máu từ vải cotton (Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005) Các loại protease bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để có thể tẩy sạch nhiều loại chất bẩn có nguồn gốc khác nhau Ngoài protease, người ta còn bổ sung vào thành phần bột giặt nhiều loại enzyme khác như: cellulase, lipase… Enzyme sử dụng trong sản xuất bột giặt thường ở dạng hạt chứa 0,1 – 2 đơn vị Anson (Nguyễn Tiến Thắng, 2008)

2.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm (A Sumantha và ctv, 2006)

Protease được sử dụng trước nhất trong ngành công nghiệp sữa như renin, pepsin,

là yếu tố đông tụ sữa trong sản xuất phó mát, sữa đông tụ Ngoài ra, protease được ứng dụng rộng rãi trong các ngành chế biến thực phẩm khác như: sản xuất nước mắm, tương, chao… Một số sản phẩm protease sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như: Alcalase®, Neutrase®, Esperase®, Protamex™ và Novozym® FM Những protease có nguồn gốc vi sinh vật này được sử dụng để cải thiện dinh dưỡng và mùi vị của những thức ăn giàu protein Chúng có tác dụng làm mềm thịt, dậy mùi phó mát, cải thiện kết cấu bột, hương vị và màu sắc của bánh qui

2.1.3.3 Trong công nghiệp da

Trong công nghiệp da, protease được sử dụng để loại bỏ lông, làm mềm da nhờ thủy phân collagen của da, thành phần làm cho da bị cứng Quá trình thủy phân này phải được kiểm soát để tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng da Trong đó, quá trình tẩy lông được thực hiện trong khoảng pH từ 8-10 (Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005) Protease sử dụng trong công nghiệp chế biến da gồm: protease tuyến tụy, protease acid, trung tính, kiềm từ vi khuẩn và nấm mốc, papain và bromelain từ thực vật (Nguyễn Tiến Thắng, 2008) Thông thường các phương pháp thuộc da trước đây thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường Việc sử dụng enzyme protease thay thế cho phương pháp sử dụng các hóa chất truyền thống đã làm tăng chất lượng da, đồng thời làm giảm lượng hóa chất độc hại thải ra ngoài môi trường (P Mitra và P K Chakrsbartty, 2005)

2.1.3.4 Trong các lĩnh vực khác

Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như: dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật và sản xuất huyết thanh miễn dịch (Đồng Thị Thanh Thu, 1996), trong y học, xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để thu hồi bạc, làm thức ăn gia súc, dùng trong các loại mỹ phẩm để loại bỏ các tế bào già (Mohsen Fathi Najafi và ctv, 2005)… Sản phẩm protease thương mại Clear-Lens Pro®của Novozymes (Đan Mạch) là thành phần của các chất rửa kính sát tròng

2.1.4.2 Thực vật

Bromelin, Papain và Ficin là 3 loại protease được thu nhận từ thực vật Bromelin được thu từ quả và chồi của cây dứa Chúng có nhiều ở phần chồi trên quả Papain là loại enzyme được thu từ nhựa của lá, thân và quả đu đủ Trong thành phần quả đu đủ có 2 thành phần protease chiếm khối lượng lớn là papain và chymopapain Những enzyme này

được ứng dụng nhiều trong công nghệ làm mềm thịt Từ dịch ép lá và thân của cây sung

(Ficus glomerata), người ta thu được một loại protease có tính chất giống papain là ficin

2.1.4.3 Vi sinh vật

Trong các nguồn thu nhận protease thì vi sinh vật là nguồn thu nhận protease đầy hứa hẹn để ứng dụng trong công nghiệp Vì chúng có khả năng tổng hợp được nhiều loại protease với số lượng lớn Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao

như: Bacillus subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae

2.2 Giới thiệu chung về Streptomyces

2.2.1 Hình thái và phân loại Streptomyces

2.2.1.1 Hình thái

Streptomyces là chi được nghiên cứu và mô tả nhiều nhất trong các giống xạ

khuẩn Điển hình là vào tháng 5 năm 2002, Bentley SD và ctv công bố đã giải mã

thành công bộ gen của Streptomyces coelicolor Đại diện của các chi này thường có

khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 – 10 µm, khuẩn lạc thường không có đường kính lớn, khoảng 1 – 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường phủ bởi khuẩn

ty khí sinh dạng nhung dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước Màu sắc của khuẩn

lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này

cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau (Bùi Thị Hà, 2008)

Hình 2.3 Khuẩn lạc Streptomyces

(Nguồn: Phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia Tường)

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng cách sinh bào tử Bào tử được

hình thành trên cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử có các hình dạng khác nhau: thẳng, cong, xoắn lò xo… Bào tử được hình thành từ cuống sinh bào tử theo 2 kiểu: phân đoạn

và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 μm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy (Bùi Thị Hà, 2008; Đoàn Kim Thuận, 2007)

Hình 2.4 Một số loại bào tử xạ khuẩn (a) Bào tử có màng nhẵn;(b) Bào tử có màng khối

u;(c) Bào tử có màng gai; (d) Bào tử có màng nhăn (Alma Dietz và Jonh Mathews, 1971)

2.2.1.2 Phân loại

Theo tổ chức Global Biodiversity Information Facility thì Streptomyces được

phân loại như sau:

Qua nhiều năm, sự phân loại này đã được nghiên cứu và thảo luận bởi vì sự đa dạng và chu trình sống phức tạp của xạ khuẩn Các cá thể được đưa vào trong lớp này được dựa trên sự đặc điểm hóa phân loại, chúng có hàm lượng G + C cao và có trình tự RNA 16S tương đồng

Bằng phương pháp phân loại số (Numerical taxonomy) người ta chia xạ khuẩn

chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất

định (Bùi Thị Hà, 2008)

Dựa vào hình dạng bề mặt màng bào tử, Alma Dietz và John Mathews (1971)

chia Streptomyces thành 5 nhóm: màng bào tử nhẵn, gai, khối u, nhăn và nhóm màng

bào tử có nhiều sợi như tóc

2.2.2 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn Gam dương, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, các cây chết, thậm chí trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Trong mỗi gam đất, nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn Xạ khuẩn thường hoại sinh nhưng có thể kí sinh trên thân cây, gây bệnh ở củ và rễ cây Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố như: khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác, thảm thực vật… và phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường Chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu nhưng rất ít trong các lớp đất kiềm và acid Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon duy nhất Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là

25 - 35 oC, pH tối ưu là 6,5 - 8,0 (Bùi Thị Hà, 2008)

Xạ khuẩn có thể được phân lập từ nhiều loại đất khác nhau, nước và bùn cửa

sông Trong đó, có đến 90% xạ khuẩn được phân lập từ đất thuộc nhóm Streptomyces

(M Anupama và ctv, 2007) Xạ khuẩn có khả năng tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như chất kháng ký sinh, chất kháng ung thư, các enzyme, các kháng sinh, các chất dùng trong nông nghiệp, các chất ức chế miễn dịch Có tới 80% tổng số các sản phẩm kháng sinh hiện được biết trên thế giới có nguồn gốc từ xạ khuẩn (Kavitha and M Vijayalakshmi, 2007) Ngoài ra, một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây ra các bệnh cho người, cho động vật và cho cây trồng

2.2.3 Chu trình đời sống của Streptomyces

Từ một bào tử đơn (spore) nẩy mầm thành sợi có chứa nhiều nhiễm sắc thể (germinating spore) Sợi này kéo dài và phân nhánh đi vào môi trường dinh dưỡng gọi

là khuẩn ty cơ chất (vagetative mycelium) Hệ khuẩn ty này tăng trưởng theo cấp số

mũ Chúng ngày càng cắm sâu vào bên trong môi trường để sử dụng các chất dinh dưỡng dễ hấp thu có sẵn hoặc nhờ vào các enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất khó

hấp thu Khả năng vận động của hệ khuẩn ty cơ chất của Streptomyces là một lợi thế

lớn của chúng so với các loài vi khuẩn ít vận động hơn khi chúng chiếm hữu các cơ chất rắn trong đất Đáp ứng các điều kiện thích hợp, người ta tin rằng bao gồm cả việc cạn kiệt nguồn dinh dưỡng của môi trường xung quanh như oxygen, các sợi phát triển phá vỡ rào cản bề mặt và thành hệ khuẩn ty khí sinh (aerial hyphae) để hấp thụ nguồn oxygen trong không khí Hệ khuẩn ty khí sinh này kéo dài liên tục nhờ tận dụng dưỡng chất của hệ khuẩn ty cơ chất Khi sự phát triển của khuẩn ty khí sinh dừng lại thì chúng trải qua giai đoạn phân ngăn ở các đầu mút của sợi, tạo thành các ngăn chứa cùng các gen giống nhau gọi là tiền bào tử Các ngăn này sau đó sẽ phát triển thành bào tử gọi là ngoại bào tử và được gắn với nhau thành chuỗi khoảng 50 bào tử (spore chain) Các bào tử sau đó sẽ chuyển sang màu xám khi trưởng thành Các bào tử trưởng thành sau

đó sẽ được phát tán và bắt đầu một chu trình sống mới Không giống với nội bào tử

của các vi khuẩn Gram dương khác, ngoại bào tử Streptomyces không có sức đề kháng

với nhiệt độ cũng như pH và ở trạng thái ngủ ngắn hơn, tuy nhiên, chúng có tính kháng tốt khi làm khô

Hình 2.5 Sơ đồ chu trình đời sống của Streptomyces coelicolor

(http://openwetware.org/wiki/Streptomyces:Other_Bits/An_Intro

du-ction_to_Streptomyces)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces

Qua kết quả đã công bố của các tác giả đã nghiên cứu về Streptomyces trước đây, cho thấy có nhiều yếu tố ảnh đến sự sinh tổng hợp protease ở Streptomyces như: thành

phần môi trường và điều kiện nuôi cấy

2.2.4.1 Thành phần môi trường

Các chủng Streptomyces được nuôi cấy ở các môi trường khác nhau thì hoạt tính

của protease cũng khác nhau trong cùng điều kiện nuôi cấy Theo nghiên cứu của

Jignasha T Thumar và Satya P Singh (2007), khi nuôi cấy chủng Streptomyces

clavuligerus trên các môi trường khác nhau nhưng cho hoạt tính protease cao nhất trên

môi trường gelatin broth

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Trong các thành phần môi trường, nguồn nitrogen là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự

sinh tổng hợp protease ở Streptomyces vì nó vừa là nguồn cung cấp nitrogen và vừa là

chất cảm ứng cho sự tổng hợp protease Nghiên cứu của G Vothotini và ctv (2008), trên

Streptomyces roseiscleroticus cho thấy hoạt tính protease cao nhất với nguồn nitrogen là

cao thịt bò so với các nguồn nitrogen gen khác như cao men, casein, pepton hay KNO3 Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Jignasha T Thumar và Satya P Singh (2007), pepton và

gelatin thì thích hợp cho sự tổng hợp protease của Streptomyces clavuligerus

Ảnh hưởng của nguồn carbon

Nguồn carbon cũng ảnh không nhỏ đến sự tổng hợp protease Các nguồn carbon

thường sử dụng trong nuôi cấy Streptomyces trong môi trường dịch thể như: glucose,

sucrose, xylose, lactose, maltose, tinh bột tan Sucrose cho thấy là nguồn carbon cho

hoạt tính protease cao nhất khi nuôi cấy Streptomyces clavuligerus theo nghiên cứu

của Jignasha T Thumar và Satya P Singh (2007)

Ảnh hưởng của các loại khoáng

Tuy cho vào môi trường nuôi cấy với lượng rất ít nhưng các chất khoáng rất quan

trọng tới sự sinh trưởng và tổng hợp protease của Streptomyces Theo nhiều nghiên

cứu trước đây, các loại khoáng khác nhau với các nồng độ khác nhau thì cho khả năng sinh tổng protease khác nhau Theo D S Chahal và S K Nanda (1975), môi trường nuôi cấy có thêm MgSO4.7H2O 0,05%, MnCl2 0,001%, FeCl3 0,001% cho hoạt tính protease cao hơn khi cho thêm riêng lẻ mỗi loại

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

Các điều kiện nuôi cấy như: pH ban đầu, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy… khác

nhau, đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của Streptomyces

Ảnh hưởng của pH

Theo nghiên cứu của Jignasha T Thumar và Satya P Singh (2007), khi nuôi cấy

trong môi trường có pH ban đầu là 9 thì chủng Streptomyces clavuligerus cho hoạt tính

protease cao nhất Trong khi, ở các môi trường có pH ban đầu là 7, 8 và 10 thì lại cho hoạt tính protease thấp hơn Trong quá trình nuôi cấy, do quá trình trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường, pH có thể sẽ dịch chuyển về acid hoặc kiềm, và điều này có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Ở mỗi thời điểm nuôi cấy khác nhau, hoạt tính protease được tổng hợp cũng khác nhau Cũng theo nghiên cứu của Jignasha T Thumar và Satya P Singh (2007), thời

gian nuôi cấy thích hợp nhất cho sự tổng hợp protease của Streptomyces clavuligerus

là 110 giờ Theo thời gian nuôi cấy, hoạt tính protease tăng dần và cao nhất sau 110 giờ rồi giảm dần

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 2 đến cuối tháng 6 năm 2010

- Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia Tường – Chi nhánh tỉnh Bình Dương

3.2.3 Các công thức môi trường

3.2.3.1 Môi trường cấy chuyền và giữ giống Streptomyces

ƒ Môi trường PGA (MT2)

ƒ Môi trường Gauze I (MT1) (Đoàn Kim Thuận, 2007)

3.2.3.2 Môi trường thử khả năng sinh protease (MT3)

(Nguyễn Thị Ngọc Yến, 2009 Tham khảo có sửa đổi)

3.2.3.3 Môi trường tăng sinh dịch thể (MT4)

(Đoàn Kim Thuận, 2007)

3.2.3.4 Môi trường đếm khuẩn lạc: Môi trường ISP4 (MT5)

3.2.3.5 Môi trường nuôi cấy dịch thể sinh tổng hợp protease (MT6)

(Shang-Shyng Yang và Jan-Yi Wang, 1999 Tham khảo có sửa đổi)

(Bã đậu nành nấu lấy dịch chiết)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống

Cấy giống xạ khuẩn từ ống gốc sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường giữ giống (MT1 và MT2) Chủng St 17 phát triển tốt trên MT2 nhưng không phát triển tốt trêm MT1, còn chủng St 32 thì ngược lại Sau khi ủ 5 - 6 ngày, bảo quản lạnh ở 4oC Giống xạ khuẩn được cấy chuyền hàng tháng

3.3.2 Phương pháp định tính khả năng sinh protease của các chủng Streptomyces

Dùng que cấy móc lấy một ít bào tử xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng cấy vào giữa đĩa Petri chứa khoảng 25 ml môi trường thử khả năng sinh protease (MT3) Ủ ở nhiệt độ phòng sau 3 ngày, lấy ra quan sát vòng phân giải bằng thuốc thử TCA (tricloroacetic acid)

Dựa vào kết quả đo đường kính vòng phân giải chọn lọc sơ bộ một số chủng

Streptomyces có khả năng tổng hợp protease cao để tiếp tục khảo sát

3.3.3 Phương pháp tăng sinh

Dùng que cấy vòng, lấy một ít bào tử xạ khuẩn trên môi trường ống thạch nghiêng cấy chuyển vào môi trường dịch thể Gauze I (MT4), nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày Dịch tăng sinh được xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo mục 3.3.4

3.3.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Dịch tăng sinh được pha loãng ở các nồng độ khác nhau 10-2, 10-3, 10-4… bằng dung dịch nước muối sinh lý Hút 0,1 ml dịch huyền phù ở mỗi độ pha loãng vào các đĩa thạch chứa môi trường ISP4 (MT5) Dùng que trang tam giác trãi đều mặt thạch Mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa Petri Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 300 khuẩn lạc, đếm tất cả các khuẩn lạc trên các đĩa và tính kết quả Số lượng tế bào có trong 1 ml dịch tăng sinh được tính theo công thức:

N

n1v1f1 + … + nivi fi

Trong đó:

C : Mật độ bào tử (cfu/ml)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có 25 - 300 khuẩn lạc

ni: số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng đếm được ở mỗi độ pha loãng

vi: thể tích dịch pha loãng cho vào mỗi đĩa (ml)

fi: hệ số pha loãng

3.3.5 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường dịch thể

Phân phối 100 ml môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp protease dạng lỏng (MT6) vào mỗi erlen 250 ml Cấy vào mỗi erlen 1 ml dịch tăng sinh chứa khoảng

105 tế bào Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng và xác định hoạt tính của protease sau thời gian nuôi cấy nhất định

3.3.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme

Canh trường lỏng sau khi nuôi cấy được đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút hoặc lọc qua giấy lọc thu lấy phần dịch trong (dịch enzyme thô) Dịch chiết enzyme thô này được đem xác định hoạt tính protease theo mục 3.3.7

3.3.7 Phương pháp xác định hoạt tính protease (phương pháp Anson)

(Lâm Thị Kim Châu và ctv, 2004)

3.3.7.1 Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong TCA, xác định lượng Tyrosine và Tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin

3.3.7.2 Hóa chất

- Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 5,9690g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ 250 ml

- Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 100 ml

- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 11,5 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6

- Dung dịch casein 1%: pha 1 g casein trong 100 ml dung dịch đệm Sorensen

- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dịch NaOH 0,5 N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

- Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4)

- Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml

- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosine trong dung dịch HCl 0,2 N vừa đủ 500 ml

- Dung dịch Tyrosine chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2 N: pha loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2 N thành 100 ml

3.3.7.3 Dựng đường chuẩn Tyrosine

Từ dung dịch Tyrosine chuẩn 1 µM/l, xây dựng đường chuẩn với dung dịch Tyrosine có nồng độ từ 0,2 -1,0 µM/l

Bảng 3.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn Tyrosine

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm

Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC)

3.3.7.4 Xác định hoạt tính enzyme

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật và 3 ống thử không Và thực hiện các bước sau:

Bảng 3.2 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease

Thử thật Thử không

Giữ ở 35oC trong 5 phút

Lắc đều và giữ ở 35oC trong 20 phút

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5 ml dịch lọc của ống thử thật

và cho vào ống thứ hai 5 ml dịch lọc của ống thử không

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10 ml NaOH 0,5 N và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được µM Tyrosine

3.3.7.5 Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị hoạt tính Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme cần thiết trong điều kiện thí nghiệm (35,5oC, pH 7,6…) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM Tyrosine trong đường chuẩn

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lương mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzyme

µM Tyrosine: lượng µM Tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

3.3.8.2 Hóa chất

- Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1 g albumin pha với nước cất thành

100 ml dung dịch

- Dung dịch NaOH 1/10 N: cân 0,4 g NaOH hòa tan trong nước cất vừa đủ 100 ml

- Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N và định mức thành 100 ml

- Dung dịch Trisodium citrate 1 %: cân 1 g Trisodium citrate hòa tan trong nước cất vừa đủ 100 ml

- Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri 1% và định mức thành 100 ml

- Dung dịch C: pha dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp 2 dung dịch A và B theo tỷ lệ 49:1

- Thuốc thử Folin: pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4

3.3.8.3 Dựng đường chuẩn Albumin

Tiến hành dựng đường chuẩn với dung dịch Albumin chuẩn có nồng độ protein từ

Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn

3.3.8.4 Xác định hàm lượng protein dung dịch mẫu

Tiến hành tương tự như trong phần xây dựng đường chuẩn

Trong đó:

a: hàm lượng protein suy ra từ đường chuẩn

n: hệ số pha loãng

m: khối lượng chế phẩm protease sử dụng (mg)

3.3.9 Phương pháp xác định khối lượng sinh khối Streptomyces

Sau khi nuôi cấy Streptomyces trên môi trường sinh protease, tiến hành lọc canh

trường nuôi cấy qua giấy lọc Phần sinh khối cùng giấy lọc được đem sấy khô và cân Khối lượng sinh khối được tính bằng cách lấy khối lượng giấy lọc cùng sinh khối sau khi sấy khô trừ cho khối lượng giấy lọc ban đầu

3.3.10 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp protease của xạ khuẩn

3.3.10.1 Thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy theo mục 3.3.5 trong các khoảng thời gian: 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày, 7 ngày, 8 ngày, 9 ngày và 10 ngày

Ở mỗi thời điểm, tiến hành thu dịch chiết protease và xác định hoạt tính protease

theo mục 3.3.7 Dựa vào kết quả, chọn ra chủng Streptomyces có hoạt tính cao nhất và

thời gian tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease để tiến hành khảo sát tiếp

3.3.10.2 pH

Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces đã chọn lọc trên môi trường sinh protease

theo mục 3.3.5 ở các giá trị pH ban đầu khác nhau: 5, 6, 7, 8 và 9 với thời gian nuôi cấy thích hợp nhất Xác định hoạt tính protease theo mục 3.3.7 và xác địng khối lượng sinh khối theo mục 3.3.9 Dựa vào kết quả, chọn ra giá trị pH cho hoạt tính protease cao nhất

3.3.10.3 Nguồn nitrogen

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy (MT6) các nguồn nitrogen khác nhau với nồng

độ 1 % Các nguồn nitrogen được bổ sung vào môi trường: cao men, casein, pepton, gelatin Tiến hành nuôi cấy theo mục 3.3.5 Sau đó, xác định hoạt tính protease theo mục 3.3.7 và xác định khối lượng sinh khối theo mục 3.3.9

3.3.10.4 Nguồn carbon

Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên sự sinh tổng hợp protease Môi trường nuôi cấy (MT7) được thay thế nguồn carbon là tinh bột bằng các nguồn carbon khác như: xylose, glucose, lactose, sucrose với nồng độ 1 % Và tiến hành nuôi cấy theo mục 3.3.5 và xác định hoạt tính protease theo mục 3.3.7

3.3.10.5 Các loại muối

Các loại muối khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (MT6): CaCl2, MgCl2, KCl, MnCl2 với nồng độ 0,5 % Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces đã chọn lọc trong thời gian nuôi cấy thích hợp và thu dịch chiết, xác định hoạt tính protease theo mục 3.3.7 và xác định khôi lượng sinh khối theo mục 3.3.9

3.3.10.6 Vai trò của các thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng

hợp protease của Streptomyces

Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces đã chọn trên môi trường với nguồn

nitrogen, nguồn carbon, loại muối cho hoạt tính protease cao nhất với pH ban đầu và thời gian nuôi cấy thích hợp Đồng thời, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của các thành

phần trong môi trường nuôi cấy đã chọn lên khả năng sinh protease của Streptomyces

3.3.11 Phương pháp tinh sạch sơ bộ protease

Nuôi cấy chủng Streptomyces chọn lọc trong môi trường cho hoạt tính protease

cao nhất ở điều kiện nuôi cấy thích hợp rồi thu nhận dịch chiết enzyme thô theo mục 3.3.6 Sau đó, tiến hành tủa với cồn 96 % để thu protease

3.3.11.1 Khảo sát tỷ lệ tủa

Cho từ từ ethanol 96% lạnh vào dung dịch enzyme thô đã làm lạnh theo các tỷ lệ

Venzyme : Vethanol là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, khuấy đều, để yên trong tủ lạnh 30 phút Sau đó đem ly tâm 6000 vòng/phút, thu lấy tủa

Hòa tan tủa thu được với nước cất và định mức thành 10 ml Dung dịch này được xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson và xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry Dựa vào tổng hoạt tính protease và tổng hàm lượng protein suy ra hiệu suất thu hồi, từ đó chọn ra tỷ lệ tủa thích hợp

3.3.11.2 Khảo sát thời gian tủa

Sau khi chọn tỷ lệ tủa thích hợp, tiến hành khảo sát với các thời gian tủa: 10 phút,

20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút và 60 phút Phương pháp tủa được tiến hành tương

tự như mục 3.3.11.1 Dựa vào hiệu suất thu hồi chọn ra thời gian tủa thích hợp

3.3.12 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi hoạt tính protease và hiệu suất thu hồi protein (Đoàn Kim Thuận, 2007)

Nuôi cấy chủng Streptomyces đã chọn lọc trong điều kiện tối ưu như đã khảo sát

Tiến hành xác định hoạt tính protease và định lượng protein của dịch enzyme thô trước khi tinh sạch

Sau khi tinh sạch, xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong chế phẩm

Tổng hoạt độ sau tinh sạch

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) = x 100 Tổng hoạt độ trước tinh sạch

Tổng lượng protein sau tinh sạch

Hiệu suất thu hồi protein (%) = x 100

Tổng lượng protein trước tinh sạch

Tổng hoạt độ sau tinh sạch

Hoạt độ riêng (đvht/mg) =

Tổng lượng protein sau tinh sạch

3.3.13 Phương pháp đánh giá khả năng giặt tẩy của enzyme

(N Vishalakshi và ctv, 2009)

Protease đã tinh sạch sơ bộ được sử dụng như tác nhân hỗ trợ chất tẩy rửa để làm sạch mảnh vải dính máu Ta đặt các mảnh vải dính máu vào các khay riêng và tiến hành thí nghiệm như sau:

Khay 1: 100 ml nước cất + mảnh vải dính máu

Khay 2: 100 ml nước cất + mảnh vải dính máu + 1 ml chất tẩy rửa

Khay 3: 100 ml nước cất + mảnh vải dính máu + 1 ml chất tẩy rửa + protease Khay 4 : 100 ml nước cất + mảnh vải dính máu + protease

Sau 30 phút lấy mảnh vải ra và rửa bằng nước, quan sát vết máu trên mảnh vải

3.3.14 Sơ đồ nghiên cứu

1 Bộ chủng giống

2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease

3 Chọn lọc sơ bộ các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao

4 Tăng sinh chủng chọn lọc

5 Xác định mật độ bào tử trong dịch tăng sinh

6 Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể:

 Thời gian nuôi cấy

9 Thử nghiệm-ứng dụng chế phẩm protease trong

hỗ trợ chất tẩy rửa tẩy vết máu trên vải

8 Tinh sạch sơ bộ protease bằng ethanol 96 %

 Khảo sát tỷ lệ tủa

 Khảo sát thời gian tủa