Khảo Sát Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Khả Năng Sinh Tổng Hợp Protease Của Vi Khuẩn Bacillus Subtilis Nat

Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau .... Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT

ThS PHAN TRUNG HẢI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ MINH TRANG MSSV: 1211100022 Lớp: 12DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS Nguyễn Như Nhứt và ThS Phan Trung Hải Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình

TP Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực tập

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được

sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có

cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho công việc sau này

Em xin chân thành biết ơn:

- Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em có cơ hội được đi thực tập

- Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình

- Em xin cảm ơn ThS Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thành đồ án này

Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của:

Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống

Sinh viên thực tập

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Kết quả đạt được 3

7 Kết cấu đề tài nghiên cứu 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis Natto 5

1.1.1 Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto 5

1.1.2 Lịch sử phát hiện 5

1.1.3 Phân bố 7

1.1.4 Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto 7

1.2 Enzyme protease 10

1.2.1 Khái niệm về protease 10

1.2.2 Phân loại 11

1.2.3 Nguồn thu nhận 12

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis 14

1.4 Ứng dụng của protease 18

1.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease 19

ii

1.5.1.Trên thế giới 19

1.5.2 Tại Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm 22

2.1.1 Địa điểm 22

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu thí nghiệm 22

2.2.1 Nguồn vi sinh vật 22

2.2.2 Cơ chất dùng trong thí nghiệm 22

2.2.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 23

2.3 Môi trường nuôi cấy 23

2.3.1 Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) 23

2.3.2 Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) 23

2.3.3 Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) 24

2.3.4 Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) 24

2.4 Phương pháp tiến hành 25

2.4.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25

2.4.2 Phương pháp tăng sinh 25

2.4.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào 25

2.4.4 Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease 26

2.4.5 Phương pháp nuôi cấy bán rắn 27

2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn 27

2.4.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 27

2.4.8 Phương pháp tủa enzyme protease 30

2.4.9 Phương pháp xử lý thống kê 30

2.5 Phương pháp nghiên cứu 30

2.5.1 Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease cao 30

iii

2.5.2 Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus

subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau 30

2.5.3 Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto 31

2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng Bacillus subtilis Natto 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Sàng lọc chủng B subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao 33

3.2 Khảo sát hoạt độ protease của chủng B subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau 35

3.3 Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B subtilis Natto BN2.1 37

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease 37

3.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease 39

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease 41

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B.subtilis Natto BN2.1 43

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC

pI Điểm đẳng điện của protein

P roquerti Penicillium roqueforti

SPSS Phần mềm xử lý thống kê (Statistical Package for the Social Science) TLPT Trọng lượng phân tử

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B subtilis 8

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 15

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 16

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 17

Bảng 2.1 Danh sách các chủng nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn Tyrosine 28

Bảng 2.3 Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu 29

Bảng 2.4 Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn 31

Bảng 3.1 Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B subtilis Natto 34

Bảng 3.2 Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau 35

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 38

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease 40

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease 41

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease 43

vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sản phẩm Natto 6

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto 7

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide 10

Hình 1.4 Cấu trúc không gian enzymeprotease 11

Hình 3.1 Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto 33

Biểu đồ 3.1 Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B subtilis Natto 34

Biểu đồ 3.2 Hoạt độ enzyme protease của chủng B subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau 36

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 38

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease 40

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 42

Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease 43

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và

được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40] Bacillus subtilis Natto là

một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên Chúng có khả năng phát triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase, protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu Khi ủ ấm với hạt đậu nành, chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54] Nhiều nghiên cứu về B subtilis Natto

đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như nattokinase[33]

, elastase[32], bacillopeptidase F [45]… Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa nhiều Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”

Ý nghĩa đề tài nghiên cứu:

- Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của

Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế

phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam

- Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease, giúp đa dạng hóa sản phẩm

2

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn

được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu:

- Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme

protease từ vi khuẩn B subtilis Natto Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2%

maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat Sau khi tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat Đã xác định được phân đoạn này có khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5]

- Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh

dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B subtilis Natto NLSSE Kết

quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27]

- LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi

khuẩn B subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3%[24]

- Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B

subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như:

Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO…

3 Mục tiêu nghiên cứu

Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme

protease cao từ các chủng nghiên cứu

3

Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B subtilis Natto sinh

tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất

Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B

subtilis Natto

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto

khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy

Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng

Bacillus subtilis Natto

5 Phương pháp nghiên cứu

Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử

Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0

Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài:

- Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

- Phương pháp tăng sinh

- Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc)

- Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease

- Phương pháp nuôi cấy bán rắn

- Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn

- Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson)

- Phương pháp tủa enzyme protease

6 Kết quả đạt được

Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và

BN3 Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng

sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại Môi trường nuôi cấy thích

4

hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp Với các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất là 60% Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng

Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7

7 Kết cấu đề tài nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương:

Chương 1: TỔNG QUAN

- Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease

- Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong

và ngoài nước

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU

- Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

- Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

- Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài

5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis Natto

1.1.1 Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto

Phân loài Bacillus subtilis Natto

“Nguồn: Keith H Steinlraus (2004)”

1.1.2 Lịch sử phát hiện

B subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của

Nhật Bản Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt

tên là Bacillus Natto Sawamura Kể từ đó B subtilis Natto được chấp thuận để dùng

cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968, thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996 Và hiện đang thu hút

sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55]

Khi mới được phát hiện ra, B subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B subtilis của

Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [28], [50], các khóa phân loại đã xếp B subtilis Natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả

năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]

Trong dòng B subtilis Natto còn có nhiều loại như B subtilis Natto B – 12 [21], B subtilis Natto OK2 [47], B subtilis Natto NRRL

3666 [39]…

6

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc

chín và lên men với vi khuẩn B subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng

14 - 18 giờ[25],[46] Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được

hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt

đặc trưng và vị ngọt Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình

qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B subtilis

Natto Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh dưỡng của nó Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi

khuẩn B subtilis Natto[46]

Hình 1.1 Sản phẩm Natto

(Nguồn: healthplus.vn)

Chức năng của B subtilis Natto[55]:

- Tăng cường vi khuẩn có lợi

- Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại

- Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột

- Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B

7

1.1.3 Phân bố

B subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn

truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật B subtilis Natto có nhiều

trong rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương Vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [40]

1.1.4 Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto

1.1.4.1 Đặc điểm hình thái

B subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào

tử hình que có kích thước dưới 1μm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn

và hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23]

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần)

“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”

1.1.4.2 Đặc điểm sinh lý

B subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể

phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3% B subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt

độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

1.1.4.3 Đặc điểm sinh hoá

B subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose, saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển

của vi khuẩn là protein và amino acid B subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid

glutamic, arginin, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [23]

Bảng 1.1 Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả

1.1.4.4 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis Natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis Natto có khả năng sinh

tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ–transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo Yamane K năm 1974 [31]

; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [29], Shimizu M năm

1992 [36]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [48]; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53]

Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B subtilis Natto như sau:

o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay subtilisin BSP Kí hiệu: EC 3.4.21.62 Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có

275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử TLPT: 27,7 kDa đến

29 kDa [21],[33] Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học

o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42] Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32]

o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His, Asp[45]

o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là 55o

C, pI = 3,9 Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [49],[53]

10

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide

“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”

“

1.2 Enzyme protease

1.2.1 Khái niệm về protease[1]

Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este

và vận chuyển amino acid

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:

 Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit

 Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase

 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit

 Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc

11

điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

1.2.2 Phân loại [9]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:

12

o Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH

hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus

Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20,000 – 27,000 Dalton Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme

của Pelicillium cyoneo-fulvum (44,000), Asp, oryzae OUT 5038 (52,000) Trọng

lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33,800 – 48,400) Protease thiol và nhiều protease - acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30,000 - 40,000 Dalton

1.2.3 Nguồn thu nhận

Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở

vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và

xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

13

Enzyme protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật do enzyme thu nhận từ nguồn thực vật và động vật thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:

 Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm

 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

 Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều

 Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp

 Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được

 Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền

và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác

 Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau[9]

14

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis[7],[16]

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ thông khí và thành phần môi trường…

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp, mỗi loài có nhiệt độ thích hợp khác nhau Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao

hơn nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ tối ưu của Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme

protease là 37oC

 Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật Điều này thể hiện rất

rõ ở các loài thuộc chi Bacillus pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng

hoặc trong quá trình phát triển của vi sinh vật pH tối ưu cho sự phát triển và sinh

tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0

 Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật Trong một số trường hợp:

+ Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinh tổng hợp protease

+ Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976)

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thông thường hoạt tính của protease có thể

Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là

tinh bột với nồng độ khoảng 8% Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% sẽ làm giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn carbon Hoạt tính protease (U/ml) Trisodium citrate 0,00

“Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008)[37] ”

 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối vô

cơ Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3

+ Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các

16

nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp

+ Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006) Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên

khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã

dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4,

NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác Kết quả là sự phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là 0,038 UI/ml so với các nguồn khác

+ Khi cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, hoạt lực enzyme protease tăng 22 - 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml)

17

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml)

“Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]”

 Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó

 Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như NaCl và vitamin… cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease

 Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực

protease của chủng đột biến A.oryzae 251 - 90 đến 6 - 9% và nguyên chủng

A.oryzae 132 - 63 tới 7 - 24% Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp

enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus

megaterium 60% Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid ức chế trong quá

trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu…

 Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường bổ sung các chất cảm ứng, các chất này thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp Casein thuộc nhóm

18

protein chủ yếu có trong sữa và thường dùng làm chất cảm ứng cho vi khuẩn sản xuất protease[5]

1.4 Ứng dụng của protease [4]

 Trong Y học: Sử dụng nhiều protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu

cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương

 Trong chế biến thủy sản: Trong chế biến nước mắm sử dụng enzym protease

thực vật ( bromelain, papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm

 Trong công nghiệp sữa : Sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của

chúng

Ví dụ : Renin, Pepsin, và một số protease vi sinh vât: A candidus, P roquerti,

B mensentericus…

 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy: Protease làm giảm thời gian

đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

 Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc, protease của A oryrae dùng thủy phân protease trong hạt ngủ cốc tạo

điều kiện xử lý bia tốt hơn

 Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ da

khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen thành phần

làm da dị ứng Protease được sử dụng tách từ vi khuẩn (B mensertericus,

B.subtilis), nấm mốc và xạ khuẩn…

 Trong công nghiệp dệt: Đây là protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy

tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatine) để sợi được được bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

 Một số ứng dụng khác:

+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm …

+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh…

1.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease

1.5.1.Trên thế giới

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 - 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của Xạ khuẩn

Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996)

Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng

cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B subtilis Natto NLSSE Khảo sát

các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat, casein, pepton từ đậu nành

và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20g/l Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO4.7H2O,

KH2PO4.3H2O, cao nấm men và CaCl2 Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1,300U/ml

20

với thành phần môi trường tối ưu (g/l) : pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [27]

Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng

hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Các nhân tố được chọn để khảo sát:

glucose, pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ Hoạt tính đạt 3,194U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [51] Weng và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cải thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E.coli bằng đột biến điểm: thay thế Methioni tại vị trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này[35]

1.5.2 Tại Việt Nam

Các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế

“Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy

phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang Qua nghiên

cứu cho thấy protease B subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn

toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung

protease từ B subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy

phân ở 50oC

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006 Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích

ly và tinh sạch enzyme protease từ ruột cá Basa Dịch chiết protease kiềm thu được

từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/g CKNT (chất khô nội tạng) trong điều

21

kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút[3]

Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus

sp 7.2 và Bacillus sp NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase 470FU/g

trên môi trường đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay

từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Sinh học nhiệt đới

và phân lập từ thực phẩm Natto[13]

22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm

BN 1 Bacillus subtilis Natto 1

BN 2.1 Bacillus subtilis Natto 2.1

BN 2.2 Bacillus subtilis Natto 2.2

BN 2.3 Bacillus subtilis Natto 2.3

BN 3 Bacillus subtilis Natto 3

2.2.2 Cơ chất dùng trong thí nghiệm

Bã đậu nành, cám bắp, cám mì, cám gạo và đậu xanh được cung cấp bởi chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương

- Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, bình định mức, erlen…

- Thiết bị thí nghiệm: tủ sấy, tủ lạnh, máy lắc, máy đo OD, lò viba, bể ổn nhiệt, máy li tâm…

2.3 Môi trường nuôi cấy

Công thức môi trường:

Công thức môi trường:

Giá đậu 100g

Glucose 50g

Pepton 10g

Nước cất đủ 1000 ml

24

Cách thực hiện:

 Làm tương tự như MT1 nhưng không bổ sung agar

 Đong 200 ml môi trường vào các chai nước biển, đem hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút

Công thức môi trường:

 Nấu cách thuỷ Casein trong 50ml đệm Sorensen cho đến khi tan

 Hoà dung dịch trên vào môi trường đã bổ sung các chất khoáng và định mức cho đủ 1000 ml Sau đó hoà tan agar vào dung dịch và đun cho tới khi agar tan

 Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút

Công thức môi trường:

 Trộn bã đậu nành và cám bắp lại với nhau rồi cho 30g vào erlen Bổ sung 37

ml nước đã hoà tan các khoáng chất vào các erlen Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút

2.4 Phương pháp tiến hành

 Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn cấy vào môi trường thạch nghiêng và ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó đem đi bảo quản lạnh

 Cấy chuyền hàng tháng

 Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chứa môi trường nườc chiết giá đậu đường pepton Nuôi cấy lắc với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ ở

37oC Dịch giống có màu vàng nâu, thơm ngái đặc trưng

2.4.3.1 Chuẩn bị:

Đổ môi trường MT1 đã hấp khử trùng vào các đĩa petri vô trùng Để 2 - 3 ngày cho bề mặt môi trường khô ráo

Dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,85%): hòa tan 0,85 g NaCl trong 1000

ml nước cất thành, phân vào mỗi ống nghiệm 9 ml Khử trùng ở áp suất 1 atm trong

30 phút

2.4.3.2 Cách tiến hành:

 Dùng nước muối sinh lý vô trùng pha loãng mẫu tuần tự thành các nồng độ thập phân (10-1, 10-2, 10-3, ) Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển dịch chứa giống đã pha loãng vào bề mặt đĩa petri chứa môi trường MT1

26

 Sử dụng que trang trải cho dịch khuẩn đều trên bề mặt môi trường thạch khô

Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ Sau khi ủ tiến hành quan sát và đếm khuẩn lạc Đếm các đĩa có khuẩn lạc từ 30 đến 300

Số vi khuẩn A trên gam hoặc ml đươc tính theo công thức:

Với:

A: là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc, CFU) vi khuẩn trong 1ml mẫu

Ni: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa tại nồng độ i

ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i

V: là thể tích dịch mẫu cấy vào trong môi trường đĩa (ml)

fi: là độ pha loãng tương ứng

2.4.4.1 Nguyên tắc

Khi protease tác dụng lên cơ chất casein trong môi trường thạch, Casein bị phân giải làm cho độ đục của môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt

2.4.4.2 Cách tiến hành:

 Chuẩn bị các đĩa petri có chứa khoảng 20 ml môi trường thạch Casein đã

được đục lỗ với đường kính 12 mm Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được nuôi cấy lắc tăng sinh cho vào lỗ đã đục ở đĩa petri Sau 48 giờ ủ ở 37oC, tráng dung dịch Lugol Quan sát vòng phân giải tạo thành Nếu thấy xuất hiện vòng phân giải trong suốt

xung quanh lỗ thạch, tức là Casein đã bị phân giải Như vậy, chủng Bacillus subtilis

Natto có khả năng sinh tổng hợp protease

 Đo đường kính vòng phân giải (ký hiệu D) và lỗ khoan (ký hiệu d) Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng vi khuẩn được tính bằng đường kính vòng phân giải (ΔD) Các giá trị (ΔD) càng lớn thì khả năng sinh enzyme của các chủng càng mạnh

A (CFU/ml) = (N1/(n1.V1.f1) + N2/(n2.V2.f2) + … + Ni/(ni.Vi.fi))/i

27

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

Cấy 1 ml dung dịch tăng sinh Bacillus subtilis Natto có mật độ tế bào

106CFU/ml vào môi trường bán rắn, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ

Canh trường được sấy ở 40 - 45oC đến độ ẩm 5 – 8%

Cân 10 g canh trường đã sấy khô hoà trong 100 ml nước cất, đem lắc ở tốc

độ 200 vòng/phút trong 15 phút

Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, ta có dịch enzyme pha loãng

10 lần Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính protease

2.4.7.1 Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các Tyrosine và Tryptophan hoà tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng Tyrosine và Tryptophan hoà tan bởi thuốc thử Folin

28

 Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thuỷ 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100 ml

 Dung dịch TCA 10% : hoà tan 10 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

 Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

 Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:2)

 Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HClđđ với nước cho vừa đủ 250 ml

 Dung dịch Tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500ml

 Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml

Vẽ đường chuẩn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (µM) và OD (OD = ODTT – ODTK)