KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE

CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ

PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: ĐỖ TÔ HOA MAI

Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 7 năm 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE

CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ

PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG ĐỖ TÔ HOA MAI

Tháng 7 năm 2012

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cám ơn các thầy cô ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy, truyền đạt mọi kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ThS Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận Xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị làm việc tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại học Nông Lâm đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tại Viện

Cám ơn các anh chị và các bạn cùng thực tập tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại học Nông Lâm đã khuyến khích, ủng hộ và giúp

đỡ tôi thực hiện tốt khóa luận này

Gửi lời cám ơn đến các bạn bè thân yêu lớp DH08SH và những người bạn thân yêu khác của tôi, các bạn đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ và chia sẻ vui buồn cùng tôi trong suốt thời gian qua

Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ và các thành viên trong gia đình đã quan tâm, chăm sóc, luôn làm chỗ dựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn

Sinh viên thực hiện

Đỗ Tô Hoa Mai

TÓM TẮT

Ngày nay trên thế giới và trong nước, chế phẩm sinh học được các ngành chăn nuôi, trồng trọt quan tâm nhiều, bởi vì chúng giúp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ở vật nuôi, giảm bớt một phần thuốc trừ sâu và chất hóa học sử dụng trong trồng trọt, giúp tận dụng các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp,

và biến đổi chúng thành các sản phẩm có giá trị sử dụng cao Ngoài ra, chế phẩm sinh học giúp các nhà sản xuất thu về lợi nhuận cao chỉ với chi phí đầu tư thấp, người nông dân không cần những kiến thức chuyên sâu về sinh học vẫn có thể dễ dàng sử dụng

Nhằm đáp ứng những nhu cầu sử dụng ngày càng tăng, đa dạng hóa sản phẩm chế phẩm sinh học, nâng cao chất lượng và tính an toàn của sản phẩm, nghiên cứu

“Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase

của vi khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong

chăn nuôi” được thực hiện Các nội dung được thực hiện trong nghiên cứu là định tính

và định lượng enzyme, khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh tổng hợp

enzyme của B subtilis như thời gian nuôi cấy và mật độ giống nuôi cấy, kiểm tra chất

lượng chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản

Ở mỗi enzyme, chủng Bacillus subtilis cho khả năng sinh enzyme cao là chủng Ba

82 (enzyme lipase), chủng Ba 71 (enzyme cellulase), chủng Ba 58 (enzyme protease, phytase, và protease) Thời gian nuôi cấy tối ưu là 36 giờ đối với enzyme lipase và phytase, 42 giờ đối với enzyme cellulase và protease, 66 giờ đối với enzyme amylase Mật độ giống nuôi cấy tối ưu là 108

cfu/g (enzyme lipase, phytase và amylase), 106 cfu/g (enzyme cellulase), 109 cfu/g (enzyme protease) Trong thí nghiệm nuôi cấy thu nhận chế phẩm, dạng nuôi cấy 500 g luôn cho hoạt độ enzyme thấp Thời gian bảo quản 15 ngày quá ngắn, không thấy được sự thay đổi hoạt độ enzyme và mật số vi khuẩn

SUMMARY

Currently, bio-products in livestock, crops are very much interested, because they help limit the use of antibiotics, increasing digestibility and food intake in animals, reduce a pesticide and chemical use in farming, which make use of waste in agricultural products and transform them into products with higher value uses

To meet the demand for increasing diversification of biological products, improving quality and safety of the product, conduct research project "Survey ability biosynthesis

enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase of Bacillus subtilis and

experimental production of biological products used in animal husbandry "

Aim of the study were qualitation and quantitation of enzymes from Bacillus subtilis, surveying the optimal culture conditions for the biosynthesis enzyme of B subtilis such

as culture time and the bacteria density, quality control and storage for the product

In each enzyme, Bacillus subtilis strains capable of high enzyme synthesis are strain

Ba 82 (enzyme lipase), strain Ba 71 (cellulase enzyme), strain Ba 58 (protease enzyme, phytase, and protease), optimal culture time was 36 h for lipase and phytase enzyme, 42 h for cellulase and protease enzyme, 66 hours for the enzyme amylase Density of optimal bacterial culture is 108 CFU/g (enzyme lipase, phytase, and amylase), 106 CFU/g (enzyme cellulase), 109 CFU/g (protease) Type culture pilot (500 g) always has low enzyme activity Shelf life of products in 15 days is too short, do not affect enzyme activity and bacterial density

Keyword: Amylase, Bacillus subtilis, cellulase, lipase, phytase, protease

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình, biểu đồ viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis 2

2.1.1 Lịch sử phát triển 2

2.1.2 Phân loại khoa học và đặc điểm 2

2.1.2.1 Phân loại khoa học 2

2.1.2.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis 2

2.2 Khái quát chung về enzyme 4

2.2.1 Enyme amylase 4

2.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme amylase 4

2.2.1.2 Đăc tính của enzyme amylase 4

2.2.1.3 Ứng dụng của enzyme amylase 5

2.2.2 Enzyme cellulase 6

2.2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase 6

2.2.2.2 Đặc tính của enzyme cellulase 6

2.2.2.3 Cơ chế tác dụng của celllulase 7

2.2.2.4 Ứng dụng của enzyme cellulase 7

2.2.3 Enzyme protease 8

2.2.3.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 8

2.2.3.2 Đặc điểm của enzyme protease 8

2.2.3.3 Ứng dụng của enzyme protease 8

2.2.4 Enzyme lipase 9

2.2.4.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase 9

2.2.4.2 Ứng dụng của enzyme lipase 9

2.2.5 Enzyme phytase 9

2.2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme phytase 9

2.2.5.2 Ứng dụng của enzyme phytase 10

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.3.1 Nghiên cứu trong nước 10

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 12

3.2 Vật liệu 12

3.2.1 Đối tượng khảo sát 12

3.2.2 Các môi trường dùng trong thí nghiệm 12

3.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất sử dụng trong thí nghiệm 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Các bước thực hiện thí nghiệm 14

3.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào 15

3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 15

3.3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Anson, 1938) 15

3.3.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme α-amylase (Heinkel, 1956) 15

3.3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase (Miller, 1959) 15

3.3.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase (Fiske và Subbarow, 1925) 15

3.3.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 16

3.3.4 Phương pháp định tính enzyme 16

3.3.5 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 16

3.3.6 Phương pháp khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng 16

3.3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 16

3.3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy 16

3.3.6 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis, kiểm tra chất lượng chế phẩm 17

3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 17

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

Định tính enzyme của các chủng Bacillus subtilis 18

4.2 Định lượng hoạt độ enzyme của các chủng Bacillus subtilis 19

4.2.1 Định lượng hoạt độ enzyme lipase 19

4.2.2 Định lượng hoạt độ enzyme amylase 20

4.2.3 Định lượng hoạt độ enzyme cellulase 20

4.2.4 Định lượng hoạt độ enzyme phytase 21

4.2.5 Định lượng hoạt độ enzyme protease 21

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp enzyme 22

4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 22

4.3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase 22

4.3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase 23

4.3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 24

4.3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 25

4.3.1.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease 26

4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy 27

4.3.2.1 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase 27

4.3.2.2 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase 28

4.3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 28

4.3.2.4 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase 29

4.3.2.5 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease 29

4.4 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau khi sản xuất và sau thời gian bảo quản 30

4.4.1 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau khi sản xuất 31

4.4.2 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DAP Diammonium phosphate

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Biến thiên đường kính vòng phân giải cơ chất của các enzyme 18

Bảng 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase 19

Bảng 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase 20

Bảng 4.4 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase 20

Bảng 4.5 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase 21

Bảng 4.6 Biến thiên hoạt độ enzyme protease 21

Bảng 4.7 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo thời gian nuôi cấy 23

Bảng 4.8 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo thời gian nuôi cấy 23

Bảng 4.9 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo thời gian nuôi cấy 25

Bảng 4.10 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi cấy 26

Bảng 4.11 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo mật độ giống 27

Bảng 4.12 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo mật độ giống 29

Bảng 4.13 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo mật độ giống 30

Bảng 4.14 Hoạt độ enzyme trong chế phẩm sau khi sản xuất 31

Bảng 4.15 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm sau khi sản xuất 31

Bảng 4.16 Hoạt độ enzyme, mật số vi khuẩn trong chế phẩm sau 15 ngày bảo quản 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 14

Biểu đồ 4.1 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian nuôi cấy 24

Biểu đồ 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo mật độ giống nuôi cấy 28

Biểu đồ 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo mật độ giống nuôi cấy 28

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lương thực, thực phẩm luôn là nhu cầu cấp thiết của con người, do đó các nước trên thế giới đầu tư rất nhiều vào phát triển ngành nông nghiệp nhằm tăng sản lượng và nâng cao chất lượng sản phẩm Bên cạnh việc ứng dụng các tiến bộ khoa học vào phát triển nông nghiệp, việc lạm dụng các chất hóa học độc hại và kháng sinh trong sản xuất gây thiệt hại nghiêm trọng đến môi trường, sức khỏe con người Khi nhận thức được mặt tác hại đó, con người bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu của lĩnh vực Công nghệ sinh học cho phát triển “nền nông nghiệp xanh” như chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây

trồng, nhân giống in vitro sản xuất cây sạch bệnh, chế phẩm sinh học (probiotic) và một

số các thành tự khác.Trong hàng loạt ứng dụng, chế phẩm sinh học được các ngành chăn nuôi, trồng trọt quan tâm nhiều, bởi vì các chế phẩm này giúp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ở vật nuôi, giảm bớt một phần thuốc trừ sâu và chất hóa học sử dụng trong trồng trọt, giúp tận dụng các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp, biến đổi chúng thành các sản phẩm có giá trị sử dụng cao

Từ những vấn đề trên và những lợi ích của chế phẩm sinh học, đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase của vi

khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn

nuôi” được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu của Bacillus subtilis để bước đầu sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi (chăn nuôi gà)

1.3 Nội dung nghiên cứu

Chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh các enzyme: cellulase, amylase,

lipase, phytase, protease tốt nhất Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả

năng sinh tổng hợp các enzyme của các chủng B subtilis trên môi trường bán rắn Từ

đó xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học Đồng thời, kiểm tra

chất lượng chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ

chức y học Nari của Đức Lúc đầu, B subtilis chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh

lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Năm 1949 – 1957, Henry và các cộng

sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó, “Subtilistherapy”

có nghĩa là thuốc subtilis ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa (www.rense.com)

2.1.2 Phân loại khoa học và đặc điểm

2.1.2.1 Phân loại khoa học

Theo khóa phân loại của Bergey (2004), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:

Lớp: Bacilli

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

2.1.2.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

(http://micro.digitalproteus.com)

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương (G+), kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,8 - 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử

Bacillus subtilis là vi sinh vật hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi

trường thiếu oxy Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn là 36 – 50oC, tối

đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt khá cao, pH thích hợp từ 7 - 7,4 Nồng độ muối ăn

làm ngừng sự phát triển của B subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000; trích

dẫn bởi Nguyễn Đức Duy Anh, 2005)

Bacillus subtilis thường có mặt trong nước, đất, không khí, xác bã động vật thối

rữa và cả trong đường tiêu hóa của người và động vật Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g Đất nghèo dinh

dưỡng như vùng sa mạc hay đất hoang, sự hiện diện của B subtilis rất ít Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào B subtilis (Vũ Thị

Thứ, 1996; trích dẫn bởi Bùi Thị Phi, 2007)

Trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, B subtilis có các hình thái đặc trưng khác nhau Trên môi trường thạch đĩa TSA (Trypcase Soya Agar), B subtilis cho

khuẩn lạc tròn, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 - 5 mm, màu vàng xám, tâm sẫm

màu Trên môi trường canh TSB (Trypcase Soya Broth), B subtilis phát triển làm đục

môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vần mây ở đáy, khó tan khi lắc đều

Khuẩn lạc B subtilis phát triển đều, màu vàng hay hồng nâu và có lấm tấm hạt trên

môi trường thạch khoai tây

Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn B subtilis là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi Bào tử B subtilis

hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8

µm Bào tử B subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid,

có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ, có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non (Tô Minh Châu, 2000;

trích dẫn bởi Nguyễn Trường Ngọc Tú, 2009) Ngoài ra, Bacillus subtilis có khả năng

tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để thích nghi và tồn tại ở các điều kiện môi trường khác nhau như amylase, cellulase, protease, phytase Hai đặc điểm

nổi bật này ở B subtilis đã và đang được quan tâm nghiên cứu như gia tăng, tối ưu hóa

việc thu nhận enzyme, ứng dụng sản xuất probiotic

2.2 Khái quát chung về enzyme

Enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học, có bản chất là protein Chúng có trong tế bào của mọi sinh vật, thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật Các loại enzyme đều có những đặc tính sinh học chung như: được tạo ra trong tế bào sinh vật, tham gia phản ứng trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống, tham gia phản ứng trong nhiệt điều kiện nhiệt độ ôn hòa, chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng, phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít

2.2.1 Enzyme amylase

2.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme amylase

Amylase là một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có cả ở thực vật, động vật và vi sinh vật Amylase được tinh sạch từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz Enzyme amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực khác Một số hạt thực vật (hạt nảy mầm) và một số loài vi sinh vật (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) là nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo

2.2.1.2 Đặc tính của enzyme amylase

Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase (hay glucoamylase) thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại Các amylase còn lại là dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside (Nguyễn Đức Lượng, 2010)

 α-amylase

α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột

mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên vẹn Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, glucose, maltose và dextrin phân tử thấp

Thông thường, α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không bắt màu với iodine và một ít maltose

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng α-amylase bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5 – 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 – 5,8), của đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,7 – 5,4), vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 – 7,0)

Độ bền của α-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH Độ bền với acid của α-amylase malt kém hơn so với độ bền của α-amylase nấm mốc Nhiệt độ tối thích của α-amylase là

50oC α-amylase của thóc mầm và malt bền nhiệt hơn, hoạt động tối thích ở 58 – 60oC Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92oC, còn amylase của nấm sợi bị vô hoạt ở

70oC Tình bền nhiệt của amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn, do đó amylase vi khuẩn được

sử dụng để sử lý nguyên liệu ở các công đoạn dùng nhiệt độ cao

 β-amylase

β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm; vi khuẩn không có β-amylase β-amylase cúc tác sự thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch β-amylase hầu như không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn nhưng thủy phân hồ tinh bột mạnh

 Glucoamylase

Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucan Chúng có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucgen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose

2.2.1.3 Ứng dụng của enzyme amylase

 Trong sản xuất bánh mì

Người ta sử dụng β-amylase, α-amylase để thủy phân tinh bột thành đường Nhờ

đó, nấm mem Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2, làm tăng thể tích của bánh, tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh Nguồn enzyme amylase sử dụng trong sản xuất bánh mì thường là malt Nhưng trong những năm gần

 Trong sản xuất rượu, bia, cồn

Vài chục năm trở lại đây, chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae,

Asp awamori) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) thay thế malt

làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia, cồn từ nguyên liệu tinh bột

 Trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa

Các enzyme amylase của vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbohydrate trong quần áo Amylase vi khuẩn được bao lại và phối trộn với các thành phần khác của chất tấy rửa Enzyme này thường chịu được nhiệt độ cao và pH kiềm

 Trong công nghiệp dệt

Người ta dùng amylase để thủy phân nhanh lượng tinh bột thừa trong quá trình

xử lý vải bản đầu Quá trình sử dụng enzyme amylase này còn được gọi là quá trình rũ

hồ vải Trước đây, người ta sử dụng enzyme α-amylase của malt hay pancreatic amylase, sau đó thay thế bằng amylase của vi khuẩn

 Một số ứng dụng khác của enzyme amylase

Ngoài những ứng dụng trên, enzyme amylase còn có nhiều ứng dụng trong y học,

chăn nuôi Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, B subtilis

thêm vào thức ăn giàu tinh bột của động vật (nhất là động vật còn non) làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005)

2.2.2 Enzyme cellulase

2.2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí Cellulose được phân hủy bởi vi sinh vật theo thứ tự, tạo sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và một số trường hợp có cả nấm men; một số vi sinh vật được các nhà khoa học

nghiên cứu kỹ là Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Fusarium culmorum,

Trichoderma roseum, Altenaria tenuis, Penicillium spp

2.2.2.2 Đặc tính của enzyme cellulase

Theo Nguyễn Đức Lượng (2010), enzyme tham gia thủy phân hủy cellulose được phân làm ba nhóm chủ yếu là 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase, 1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase, β-D glucoside glucohydrolase

1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase là enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng Enzyme này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase

1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase là enzyme tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và β-Dglucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose Enzyme này còn có một loạt các tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase

β-D glucoside glucohydrolase là enzyme tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học, chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase

2.2.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Một trong ba loại enyme trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose Mỗi loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần nào đó trong cellulose Trong thiên nhiên, những loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme trong hệ enzyme cellulase, do đó một loại vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật (nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng ezyme), yếu

tố hết sức quan trọng khác là tính đồng bộ của hệ enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi

sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2010)

2.2.2.4 Ứng dụng của enzyme cellulase

Các enyme cellulase được sử dụng rộng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp giấy và sản xuất bột giấy (xử lý bột giấy), công nghiệp dệt (giữ màu vải, làm mềm vải jean), xử lý môi trường, công nghiệp thực phẩm (trong sản xuất nước giải khát, bia), công nghiệp chất tẩy rửa và sản xuất cồn, trong chăn nuôi (bổ sung vào thức ăn)

2.2.3 Enzyme protease

2.2.3.1 Nguồn thu nhận enzyme protease

Cũng như enzyme amylase, enzyme protease có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên, sự phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau Tên gọi của enzyme protease có thể thay đổi tùy vào nguồn thu nhận và vị trí thu nhận

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh

protease như B cereus, B subtilis, xạ khuẩn (Str griseus, Str fradiae), nấm mốc (Asp

oryzae, Mucor, B pusillus, Rh nodous)

2.2.3.2 Đặc điểm của enzyme protease

Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp, các nhà khoa học đã phân các protease vi sinh vật thành bốn nhóm: protease-xerin, protease-thiol, protease-kim loại, protease-acid Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng: protease-kiềm, protease-trung tính, protease-acid Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease-xerin và protease-thiol có khả năng phân giải liên kết ester và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid Ngược lại, các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase amidase đối với các dẫn xuất của amino acid

Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các protease – xerin Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton, trọng lượng phân tử của protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin Protease-thiol và nhiều protease acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton (Nguyễn Đức Lượng, 2010)

2.2.3.3 Ứng dụng của enzyme protease

Trong công nghiệp, protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc da, dệt, phim ảnh Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng và kem bôi mặt Chúng có tác dụng loại bỏ

lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi

Trong công nghiệp dược phẩm và y học, protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông

đường hô hấp và thủy phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Trong chăn nuôi, sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thủy phân giàu đạm bổ

sung vào thức ăn của lợn và gia cầm (Bùi Thị Phi, 2007)

2.2.4 Enzyme lipase

2.2.4.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase

Lipase là enzyme carboxylesterase tham gia thủy phân gluceride Lipase được phân bố rộng trong các loài động vật, thực vật và vi sinh vật Tùy thuộc vào nguồn gốc thu nhận và tính chất, người ta chia enzyme này ra những loại sau: pancreatic lipase, pregastric lipase và lipase từ vi sinh vật

Pancreatic lipase là enzyme được thu nhận từ tuyến tụy của heo, tham gia phân hủy triglyceride tự nhiên, dầu, chất béo, acid béo đơn giản và aryl ester Pregastric lipase được sản xuất từ nguồn động vật (cừu, dê), tham gia quá trình thủy phân acid béo chuỗi ngắn trong chất béo của sữa, được sử dụng nhiều trong sản xuất phomai Nhiều nước trên thế giới sản xuất lipase từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men Vi sinh vật sử dụng để sản xuất lipase theo quy mô công nghiệp là nấm sợi và vi khuẩn Các chế phẩm thương mại này thường chứa lipase và estease (Nguyễn Đức Lượng, 2010)

2.2.4.2 Ứng dụng của enzyme lipase

Ứng dụng enzyme lipase để thủy phân lipid không chỉ trong y học mà còn phát triển mạnh trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất phomai (tạo hương vị đặc trưng) và chế biến nước mắm, trong chế biến dầu và chất béo, trong công nghệ da (xử lý thành phần

lipid trong da động vật), trong sản xuất chất tẩy rửa (phân hủy các vết bẩn từ dầu mỡ)

hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin (Greene và ctv, 1975) Suzuki và ctv (1907) là những người đầu tiên sản xuất chế phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì

 Phytase từ động vật

Collum và Hart (1908) đã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng phát hiện trong máu các động vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển (Rapoport và ctv, 1914) Phytate hoạt động như một nguyên tố kháng dưỡng trong cơ thể động vật nên các nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát hoạt động của phytase trong đường tiêu hóa của nhiều loài động vật

 Phytase từ vi sinh vật

Những vi sinh vật sản xuất phytase có từ nhiều nguồn khác nhau như đất, động vật

dạ cỏ, bột đậu, nước biển, hạt thực vật Điều này cho thấy khả năng thủy phân của phytase

có thể được đóng góp một cách rộng rãi trong hệ sinh thái Được biết là những vi sinh vật

sản xuất phytase bao gồm cả những vi khuẩn hiếu khí (Pseudomonas spp., Bacillus

subtilis, Klebsiella spp.), vi khuẩn kị khí (Escherichia coli, Mitsuokella spp.), nấm

(Aspergillus spp., Penicillum spp.) (uv-vietnam.com.vn)

2.2.5.2 Ứng dụng của enzyme phytase

Enzyme phytase có nhiều tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, giúp làm tăng dinh dưỡng trong thức ăn, giảm thiểu ô nhiễm; trong công nghiệp thực phẩm như làm tăng dinh dưỡng thực phẩm; trong trồng trọt giúp tăng hàm lượng phospho trong rễ cây

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta hiện nay, nhiều nghiên cứu về enzyme từ Bacillus subtilis và hướng ứng dụng của nó đã được công bố Qua những tài liệu tìm được, nghiên cứu về enzyme của Bacillus

subtilis chủ yếu là gia tăng hoạt độ enzyme thu nhận thông qua việc tối ưu hóa điều kiện nuôi

cấy và tách chiết enzyme, ứng dụng enzyme trong sản xuất các sản phẩm trung gian (dextrin), thủy phân các phụ phẩm nông nghiệp, bước đầu thử nghiệm sản xuất probiotic

Các đề tài nghiên cứu khảo sát hệ enzyme của Bacillus subtilis, bước đầu thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học Nguyễn Dức Duy Anh (2005), xác định môi trường tối ưu để

thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus Thử nghiệm sản xuất

chế phẩm sinh học Bùi Thị Phi (2007), phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu

khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh

học Huỳnh Minh Thư (2008), khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase, protease từ các

chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

Nghiên cứu ứng dụng enzyme ứng dụng enzyme trong sản xuất các sản phẩm trung

gian (dextrin), thủy phân các phụ phẩm nông nghiệp Nguyễn Thanh Thủy (2007), nuôi cấy

Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin Nguyễn

Trường Ngọc Tú (2009), nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ Bacillus subtilis và

ứng dụng trong thủy phân phụ phẩm các tra Trần Thị Hồng Nghi (2009), tận thu phụ

phẩm cá tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Singh Manoj và ctv (2010), sản xuất lipase từ Bacillus subtilis OCR – 4 trong lên men bán

rắn sử dụng bánh dầu lạc làm chất nền

Nimkar Mukesh D và ctv (2010), sản xuất α–amylase từ Bacillus subtilis và Aspergillus

niger bằng cách lên men bán rắn sử dụng phụ phẩm nông nghiệp

Geethanjali S và ctv (2011), tối ưu hóa việc sản xuất protease bởi Bacillus subtilis phân lập từ ruột giữa của cá chép nước ngọt (Labeo rohita)

Bai Saraswati và ctv (2012), sản xuất cellulase bằng Bacillus subtilis phân lập từ phân bò

Shamna K.S và ctv (2012), sản xuất phytase ngoại bào bằng một số chủng

Bacillus subtilis bản địa

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2012 đến tháng 6/2012 tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi trường, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng khảo sát

Các chủng Bacillus subtilis được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi

trường, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2.2 Các môi trường dùng trong thí nghiệm

 Môi trường giữ giống Bacillus subtilis

Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1)

Giá đậu 200 g Pepton 10 g Glucose 50 g Agar 20 g Nước vừa đủ 1000 ml

 Môi trường nhân giống Bacillus subtilis

Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2)

Giá đậu 100 g Pepton 10 g Glucose 50 g Nước vừa đủ 1000 ml

 Môi trường cảm ứng tổng hợp các enzyme cellulase, amylase, lipase, phytase, protease (Nguyễn Trường Ngọc Tú, 2009)

Cơ chất cảm ứng: CMC (cellulase), tinh bột tan (amylase), dầu oliu (lipase), acid phytic (phytase), casein (protease)

Cơ chất 5,0 g (NH4)2SO4 1,4 g MgSO4 0,3 g CaCl2 0,3 g Agar 20,0 g Nước vừa đủ 1000 ml

Cellulase: bã mía, bã mì

Amylase: cám bắp, cám gạo

Phytase: cám gạo, bột đậu nành

Protease: cám bắp, bã đậu nành nấu sữa

Lipase: cám gạo, bánh dầu đậu phộng

3.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm: đĩa petri, pipette thủy tinh, micropipette, erlen, becher, ống đong, bình định mức

Một số thiết bị: nồi hấp tiệt trùng (Tomy, Nhật), tủ sấy (Memmert, Đức), máy lắc, lò viba (LG, Việt Nam), máy đo OD (Biorad, Mỹ), tủ cấy, tủ mát (Sanyo), cân điện tử (Thụy Sỹ), máy đo pH (Thermo, Mỹ), bồn ủ nhiệt (Memmert, Đức)

 Hóa chất thí nghiệm

D-glucose (Trung Quốc), pepton (Trung Quốc), agar, (NH4)2SO4, MgSO4, CaCl2, CMC, casein (Ấn Độ), tyrosine, thuốc thử Folin, thuốc thử Lugol, TCA (Trung Quốc)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát điều kiện nuôi cấy

Sấy khô và nghiền nhỏ

Bảo quản, kiểm tra Chế phẩm enzyme thô

3.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa sau thời gian cấy

vi sinh vật cần đếm, trên cơ sở mỗi một khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất (Lê Thanh Mai, 2009)

3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme

3.3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Anson,1938)

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng Tyrosine và Tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin

3.3.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme α-amylase (Heinkel, 1956)

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường

độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod

3.3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase (Miller,1959)

Ở đây xác định hoạt tính cellulase bằng cách xác định hoạt tính của các enzyme C1 và

Cx thông qua việc xác định lượng đường khử theo phương pháp Miller Cho enzyme tác dụng với cơ chất thích hợp trong điều kiện nhất định và xác định lượng đường khử tạo thành

3.3.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase (Fiske và Subbarow, 1925)

Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat

có màu vàng Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh molybdat Độ đậm của màu sắc tỉ lệ với hàm lượng phospho mẫu

Phản ứng được minh họa như sau:

2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O  (MoO2.4MoO3)2 H3PO4 4H2O

Các chất khử thường sử dụng là SnCl2, hydrazin, acid ascobic, FeSO4, quinon, oxalat, sulfit Các chất khử có thể sử dụng đơn độc hay phối hợp với nhau Ví dụ: phối hợp giữa sulfit và quinon Khi cho phytase tác dụng với cơ chất phytate sẽ giải phóng ra phosphate Dựa vào hàm lượng phosphate sinh ra này để đánh giá hoạt tính của enzyme phytase

3.3.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

Lipase là enzyme thuộc nhóm thủy phân, phân nhóm esterase, xúc tác phản ứng thủy phân các nối ester giữa glycerin và các acid béo trong glyceride Nhờ hoạt động của lipase, các acid béo được giải phóng làm tăng độ chua của môi trường phản ứng Lượng acid đó sẽ được chuẩn độ bằng kiềm và chỉ số hoạt động của enzyme lipase sẽ

là lượng cần để trung hòa acid béo mới hình thành (Phạm Thị Ánh Hồng, 2003)

3.3.4 Phương pháp định tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng phân giải

Cấy chấm mỗi chủng B subtilis vào giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng tổng

hợp từng loại enzyme, đem ủ ở nhiệt độ phòng Sau khoảng thời gian nhất định, tiến hành

đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc Thí nghiệm được lập lại 2 lần

3.3.5 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao nhất bằng nuôi cấy bán rắn

Cấy 2 ml dịch tăng sinh B subtilis vào môi trường bán rắn được chuẩn bị (khối

lượng canh trường là 20 g) sao cho đạt mật độ 107

cfu/g môi trường Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau đó, thu nhận dịch chiết enzyme thô và đem xác định hoạt độ enzyme Dựa vào kết quả chọn được chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao nhất Mỗi enzyme thí nghiệm được lập lại 2 lần

3.3.6 Phương pháp khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp các enzyme của các chủng B subtilis trên môi trường bán rắn

3.3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng Bacillus subtilis được chọn ở thí nghiệm định lượng hoạt

độ enzyme trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp enzyme Sau các khoảng thời gian 24,

30, 36 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78 giờ nuôi cấy, xác định hoạt độ enzyme trong môi trường nuôi cấy Dựa vào kết quả chọn được thời gian nuôi cấy tối ưu cho hoạt độ enzyme cao

3.3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng được chọn ở thí nghiệm định lượng hoạt độ enzyme trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp enzyme với các mật độ giống bổ sung ban đầu lần lượt

là 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 cfu/g môi trường Sau thời gian nuôi cấy tối ưu (đã chọn

ở thí nghiệm trên), xác định hoạt độ enzyme Dựa vào kết quả chọn được mật độ giống bổ sung cho hoạt độ enzyme cao Thí nghiệm được lập lại 2 lần

3.3.7 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis, kiểm tra chất lượng chế phẩm

Sau khi chọn được thời gian nuôi cấy và mật độ khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt

nhất, tiến hành nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis Môi trường nuôi cấy

thu nhận chế phẩm được chuẩn bị như môi trường sinh tổng hợp enzyme và được phân vào ba dạng vật đựng chứa khối lượng môi trường khác nhau: nhỏ (20 g môi trường), trung bình (100 g môi trường), lớn (500 g môi trường); tiến hành nuôi cấy thu nhận chế phẩm theo ba dạng trên Kiểm tra hoạt độ, số lượng tế bào vi khuẩn trong chế phẩm vừa sản xuất và sau 15 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng Mỗi dạng nuôi cấy, thí nghiệm được lập lại 3 lần

3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được tính toán và vẽ biểu đồ trên Excel Sử dụng phần mềm MSTATC xử

lý thống kê để so sánh các nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Định tính enzyme lipase, amylase, cellulase, phytase, protease của các chủng

Bacillus subtilis

Tiến hành nuôi cấy 10 chủng Bacillus subtilis trên môi trường thạch đĩa có bổ sung cơ

chất tương ứng Sau 24 giờ, đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng phân giải thông qua khả năng bắt màu của cơ chất với thuốc thử và đường kính khuẩn lạc (bảng 4.1)

Bảng 4.1 Biến thiên đường kính vòng phân giải cơ chất của các enzyme ở 10 chủng B subtilis

Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các ký tự theo sau khác nhau thì sự sai khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01) Riêng cột protease không có ký tự theo sau

do sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05)

Kết quả cho thấy khả năng sinh enzyme của 10 chủng B subtilis không giống nhau

Cụ thể là các chủng có đường kính vòng phân giải lớn nhất và nhỏ nhất không giống nhau

ở mỗi enzyme Ở enzyme lipase, các chủng Ba 80, Ba 71, Ba 82, Ba 58, Ba 74 có đường kinh vòng phân giải lipid lớn nhất và các chủng Ba 02 – rd2, Ba 69 có đường kính vòng phân giải lipid nhỏ nhất Ở enzyme amylase, các chủng có đường kính vòng phân giải tinh bột lớn nhất là Ba 02 – rd2, Ba 80, Ba 43, Ba 58, Ba 49 và nhỏ nhất ở chủng Ba 65 Ở enzyme cellulase, các chủng có đường kính vòng phân giải CMC lớn nhất là Ba 49, Ba

69, Ba 02 – rd2, Ba 71, Ba 74 và nhỏ nhất ở chủng Ba 80 Ở enzyme phytase, các chủng

có đường kính vòng phân giải tinh acid phytic lớn nhất là Ba 02 – rd2, Ba 82, Ba 43, Ba

58, Ba 69 và nhỏ nhất ở chủng Ba 65 Ở enzyme protease, các chủng có đường kính vòng phân giải tinh acid phytic lớn nhất là Ba 02 – rd2, Ba 80, Ba 71, Ba 58, Ba 74 và nhỏ nhất

ở các chủng Ba 65, Ba 69, Ba 49, Ba 43

Kết quả định tính enzyme chỉ cho biết sơ bộ là chủng vi khuẩn nghiên cứu có hay không có khả năng sinh enzyme cần khảo sát và có mạnh không, chưa thể kết luận được chủng nào có khả năng sinh enzyme tốt nhất Do đó ở mỗi enzyme, chọn ra 5 chủng

Bacillus subtilis có đường kính vòng phân giải lớn nhất, sự khác biệt có ý nghĩa với các

chủng có đường kính vòng phân giải nhỏ nhất (P < 0,01) để tiếp tục tiến hành thí nghiệm định lượng hoạt độ enzyme Riêng enzyme protease, kết quả xử lý thống kê cho thấy sai khác không có ý nghĩa (P > 0,05), vì vậy chọn 5 chủng có đường kính vòng phân giải lớn nhất từ trên xuống Vậy 5 chủng được chọn ở mỗi enzyme, enzyme lipase: Ba 82, Ba 80,

Ba 58, Ba 71, Ba 74; enzyme amylase: Ba 02 – rd2, Ba 80, Ba 43, Ba 58, Ba 49; enzyme cellulase: Ba 49, Ba 69, Ba 02 – rd2, Ba 71, Ba 74; enzyme phytase: Ba 02 – rd2, Ba 82,

bán rắn sinh tổng hợp enzyme và tiến hành đo hoạt độ enzyme sau 48 giờ nuôi cấy

4.2.1 Định lượng hoạt độ enzyme lipase

Bảng 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase của 5 chủng Bacillus

subtilis nghiên cứu

Ký hiệu chủng Hoạt độ enzyme lipase (UI/g)

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự khác

biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01)

Kết quả cho thấy chủng Ba 82 có hoạt độ lipase cao nhất trong 5 chủng (75 UI/g), thấp nhất là chủng Ba 58 (15 UI/g) Theo kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt giữa chủng Ba 82 với các chủng còn lại Do đó, chủng Ba 82 đƣợc chọn để tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

4.2.2 Định lƣợng hoạt độ enzyme amylase

Qua kết quả định lƣợng hoạt độ enzyme amylase cho thấy, chủng Ba 58 có hoạt

độ amylase cao nhất trong 5 chủng (147,93 UI/g), thấp nhất là chủng Ba 49 (98,27 UI/g) Do đó chủng Ba 58 đƣợc chọn để tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase của 5 chủng Bacillus

subtilis nghiên cứu

Ký hiệu chủng Hoạt độ enzyme amylase (UI/g)

4.2.3 Định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase

Bảng 4.4 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase của 5 chủng Bacillus

subtilis nghiên cứu

Ký hiệu chủng Hoạt độ enzyme cellulase (UI/g)

4.2.4 Định lƣợng hoạt độ enzyme phytase

Kết quả định lƣợng hoạt độ enzyme phytase cho thấy chủng Ba 58 có hoạt độ phytase cao nhất (198,33 UI/g), thấp nhất là chủng Ba 43 (50 UI/g) Theo kết quả xử

lý thống kê, không thấy sự khác biệt giữa chủng Ba 58 với các chủng Ba 02 – rd2, Ba

69, Ba 82, nhƣng chủng Ba 58 ổn định hơn Vì vậy, chủng Ba 58 thích hợp để tiếp tục tiến hành thí nghiệm khảo sát

Bảng 4.5 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase của 5 chủng Bacillus

subtilis nghiên cứu

Ký hiệu chủng Hoạt độ enzyme phytase (UI/g)

4.2.5 Định lƣợng hoạt độ enzyme protease

Ở thí nghiệm này, chủng Ba 58 có hoạt độ protease cao nhất (19,76 UI/g), thấp nhất là chủng Ba 71 (5,51 UI/g) Theo kết quả xử lý thống kê không thấy sự khác biệt giữa chủng Ba 58 với chủng Ba 74, nhƣng có sự khác biệt với các chủng còn lại Do

đó, chủng Ba 58 đƣợc chọn để tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.6 Biến thiên hoạt độ enzyme protease của 5 chủng Bacillus

subtilis nghiên cứu

Ký hiệu chủng Hoạt độ enzyme protease (UI/g)

Qua 5 thí nghiệm định lượng hoạt độ enzyme, ở mỗi enzyme chọn ra 1 chủng

Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo Chủng

được chọn ở từng enzyme là Ba 82 (enzyme lipase), Ba 71 (enzyme cellulase), Ba 58

(enzyme amylase, protease, phytase) Sự khác nhau giữa chủng Bacillus subtilis được

chọn ở các enzyme có thể do sự khác biệt về đặc điểm sinh lý, sinh hóa nên khả năng phân giải và sử dụng cơ chất khác nhau Sự khác biệt này ở các chủng cũng lý giải một phần cho sự chệnh lệch hoạt độ trong cùng một enzyme giữa các chủng

Ngoài ra, trong một chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra rất nhiều enzyme ,có thể lên đến hàng ngàn nếu nuôi chúng trong môi trường thích hợp Các enzyme đóng vai trò quan trọng trong đời sống vi sinh vật, chúng là chất xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong và ngoài tế bào để phân hủy cơ chất, tổng hợp các vật liệu tế bào nhằm bảo vệ cũng như phát triển Chúng còn tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất trong sinh giới Do đó, phần nào cũng lý giải trong cùng một chủng vi khuẩn có thể tổng hợp nhiều enzyme khác nhau

4.3 Khảo ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp enzyme của

các chủng Bacillus subtilis

4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Các chủng Bacillus subtilis được chọn từ thí nghiệm định lượng hoạt độ enzyme

như chủng Ba 82 đối với enzyme lipase, chủng Ba 58 đối với enzyme amylase, protease, phytase và chủng Ba 71 đối với enzyme cellulase được tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme Các

chủng B subtilis được nuôi cấy và tiến hành đo hoạt độ enzyme ở các thời gian nuôi

cấy khác nhau (24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78 giờ)

4.3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase

Thí nghiệm cho thấy chủng Ba 82 cho hoạt độ enzyme lipase ở 24 giờ và 30 giờ tương đương nhau, ở 36 giờ hoạt độ enzyme lipase tăng cao và đạt cực đại (90 UI/g), sau

đó giảm mạnh đến 78 giờ chỉ còn 7,5 UI/g Theo xử lý thống kê cho thấy, có sự khác biệt hoạt độ lipase giữa 36 giờ và các thời gian nuôi cấy khác rất có ý nghĩa ( P<0,01) Vì vậy, thời gian nuôi cấy tối ưu được chọn để tiếp tục thí nghiệm tiếp theo là 36 giờ

Bảng 4.7 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo thời gian nuôi

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01)

4.3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase

Bảng 4.8 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo thời gian

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01)

Kết quả cho thấy hoạt độ enzyme amylase của chủng Ba 58 thí nghiệm tăng đều bắt đầu từ 24 giờ và ở thời điểm 66 giờ nuôi cấy hoạt độ amylase đạt cực đại (123,74 UI/g), sau đó hoạt độ giảm nhẹ Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự sai khác hoạt độ amylase ở 66 giờ với các thời gian 24, 30, 36 giờ nuôi nhưng không có sự khác biệt với các thời gian nuôi cấy còn lại và ở 66 giờ hoạt độ enzyme đạt cực đại nên thời gian

66 giờ nuôi cấy được chọn để tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

Hoạt độ enzyme amylase của chủng Ba 58 ở thời gian nuôi cấy tối ưu thấp hơn so với kết quả định lượng hoạt độ enzyme (147,93 UI/g) Nguyên nhân có thể do giống bị thoái hóa qua nhiều lần cấy chuyền, sự tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy, hóa chất và môi trường, thao tác thí nghiệm không đồng nhất giữa các lần khảo sát Ngoài ra có thể do ảnh hưởng của máy đo OD không chính xác dẫn đến sai số khá nhiều trong các lần lặp lại Thời gian nuôi cấy để hoạt độ enzyme amylase đạt cực đại không giống với nghiên cứu của các tảc giả khác Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Minh Thư (2008), hoạt độ enzyme amylase đạt cực đại ở thời gian nuôi cấy 60 giờ; kết quả của Nguyễn Thanh Thủy (2007) thì hoạt độ amylase đạt cực đại ở 48 giờ nuôi cấy Nguyên nhân của sự sai khác này có thể do các

chủng Bacillus subtilis đem nghiên cứu khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, điều kiện

thí nghiệm không giống nhau, và có thể do tình trạng của giống đem nghiên cứu

4.3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Biểu đồ 4.1 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian nuôi cấy

Chủng Ba 71 cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao nhất ở thời gian 42 giờ nuôi cấy (3755,08 UI/g) Theo kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có

sự khác biệt hoạt độ giữa 42 giờ nuôi cấy với các thời gian khác rất có ý nghĩa ở mức

P < 0,01, nên thời gian 42 giờ nuôi cấy được chọn để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo của enzyme cellulase ở chủng Ba 71

Hoạt độ enzyme cellulase của chủng Ba 71 ở thời gian nuôi cấy tối ưu thấp hơn nhiều

so với kết quả định lượng hoạt độ enzyme (18707,71 UI/g) Kết quả của Nguyễn Thị Yến Thu (2011) cho thấy hoạt độ cellulase đạt cực đại ở 56 giờ nuôi cấy Nguyên nhân của những thay đổi và khác biệt này cũng được giải thích tương tự như ở enzyme amylase

4.3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase

Bảng 4.9 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo thời gian

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01)

Hoạt độ enzyme phytase ở chủng Ba 58 tăng dần bắt đầu từ 24 giờ nuôi cấy, ở khoảng thời gian từ 30 giờ đến 36 giờ hoạt độ enzyme phytase tăng vọt và đạt cực đại ở

36 giờ nuôi cấy (146,7 UI/g) Sau khi đạt cực đại hoạt độ enzyme phytase bắt đầu giảm, đến 78 giờ nuôi cấy hoạt độ chỉ còn khoảng 11% so với tại thời điểm tối ưu Hoạt độ enzyme phytase của chủng Ba 58 cao nhất ở thời gian 36 giờ nuôi cấy và kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt hoạt độ enzyme giữa 36 giờ nuôi cấy với các thời gian

nghiệm Do cùng một chủng thí nghiệm là chủng Ba 58, sự giảm hoạt độ enzyme phytase

so với thí nghiệm định lượng được giải thích tương tự như thí nghiệm enzyme amylase

4.3.1.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease

Kết quả cho thấy chủng Ba 58 cho hoạt độ enzyme protease cao nhất ở thời gian 42 giờ nuôi cấy (8,52 UI/g) nên thời gian 42 giờ nuôi cấy được chọn để tiếp tục tiến hành thí nghiệm

kế tiếp Giống như thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng Ba 58 ở enzyme amylase và phytase, hoạt độ enzyme protease cũng giảm so với thí nghiệm định lượng (19,76 UI/g) Kết quả đạt được khác so với những nghiên cứu trước, kết quả nghiên cứu của Huỳnh Minh Thư (2008) thì hoạt độ protease đạt cực đại ở thời gian nuôi cấy 60 giờ

Bảng 4.10 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo thời gian

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,01)

Theo Nguyễn Đức Lượng (2010), giữa vận tốc sinh trưởng riêng của vi sinh vật và vận tốc sinh trưởng tổng hợp enzyme có mối tương quan phụ thuộc, và có hai kiểu phụ thuộc Kiểu phụ thuộc thứ nhất là vận tốc sinh trưởng của vi sinh vật hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc sinh tổng hợp enzyme Kiểu phụ thuộc thứ hai là ngoài sự tổng hợp enzyme trong pha sinh trưởng còn có “sự tổng hợp enzyme với thêm” không liên quan tỷ lệ thuận với sinh trưởng của vi sinh vật Đa số quá trình tổng hợp enzyme

của vi sinh vật trong đó có Bacillus subtilis theo kiểu phụ thuộc thứ nhất, tuy nhiên riêng amylase của Bacillus subtilis lại theo kiểu phụ thuộc thứ hai Điều này giải thích

cho sự tăng, giảm hoạt độ enzyme theo thời gian nuôi cấy và sự khác nhau giữa thời

gian nuôi cấy tốt nhất của từng enzyme ở các chủng Bacillus subtilis

Qua 5 thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, thời gian nuôi

cấy tối ưu cho mỗi loại enzyme của các chủng B subtilis đã được xác định Cụ thể,

thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu nhận enzyme lipase ở chủng Ba 82 là 36 giờ, thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu nhận enzyme cellulase ở chủng Ba 71 là 42 giờ, và chủng Ba 58 có thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu nhận enzyme là 66 giờ đối với enzyme amylase, 42 giờ đối với enzyme protease, 36 giờ đối với enzyme phytase

4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy

Sau khi chọn được thời gian nuôi cấy tối ưu cho mỗi loại enzyme, tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy Sau các thời gian nuôi cấy tốt nhất đã chọn ở thí nghiệm trên, tiến hành đo hoạt độ enzyme trong canh trường nuôi cấy

4.3.2.1 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase

Bảng 4.11 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo mật độ

4.3.2.2 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase

Biểu đồ 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo mật độ giống nuôi cấy

Kết quả cho thấy chủng Ba 58 sau 66 giờ nuôi cấy cho hoạt độ enzyme amylase cao nhất tại mật độ giống 108 cfu/g (166,82 UI/g) Theo kết quả xử lý thống kê, sự khác biệt hoạt độ amylase rất có ý giữa mật độ 108 cfu/g so với mật độ giống khác (P < 0,01) Vì vậy, mật độ giống tối ưu được chọn là 108

cfu/g

4.3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Biểu đồ 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo mật độ giống nuôi cấy

Kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt độ cellulase cao nhất tại mật độ giống 106

cfu/g (2638,7 UI/g) Theo kết quả xử lý thống kê, không có sự khác biệt hoạt độ cellulase giữa mật độ 106

cfu/g so với mật độ 105 cfu/g nhưng so với các mật độ giống khác sự sai khác rất có ý nghĩa (P < 0,01) Vì vậy, mật độ giống bổ sung là

106 cfu/g được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

4.3.2.4 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase

Bảng 4.12 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo mật độ

giống ở chủng Ba 58 Mật độ (cfu/g) Hoạt độ enzyme phytase (UI/g)

Các giá trị theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự biểu hiện sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0,05

Kết quả cho thấy chủng Ba 58 sau 36 giờ nuôi cấy cho hoạt độ enzyme phytase cao nhất tại mật độ 108

cfu/g Theo kết quả xử lý thống kế cho thấy không có sự khác biệt hoạt độ giữa mật độ 108 cfu/g với các mật độ giống khác

có ý nghĩa ở mức P < 0,05 Vì vậy, mật độ giống bổ sung là 108 cfu/g được chọn

để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

4.3.2.5 Ảnh hưởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease

Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Ba 58 sau 42 giờ nuôi cấy có hoạt độ enzyme protease tăng dần từ mật độ 104

cfu/g và đạt cực đại ở mật độ 109 cfu/g, đến mật độ

1010 cfu/g thì hoạt độ giảm mạnh Tuy không có sự khác biệt so với các mật độ nuôi cấy khác nhưng mật độ 109

cfu/g cho hoạt độ enzyme protease cao nhất nên mật độ nuôi cấy này được chọn đế tiếp tục thí nghiệm

Bảng 4.13 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo mật độ

Qua thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy, đã chọn được mật độ giống bổ sung tốt nhất cho mỗi enzyme Ở enzyme amylase, lipase và phytase thì mật độ giống bổ sung cho hoạt độ enzyme tốt nhất là 108

cfu/g Ở enzyme cellulase, mật độ giống bổ sung tốt nhất là 106 tế bào/g, và mật độ giống bổ sung tốt nhất ở enzyme protease là 109 cfu/g

4.4 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau khi sản xuất và sau thời gian bảo quản

Tiến hành nuôi cấy thu nhận chế phẩm của từng enzyme riêng biệt theo thời gian nuôi cấy và mật độ khuẩn nuôi cấy cho hoạt độ enzyme tốt nhất đã chọn ở thí nghiệm khảo sát Đối với enzyme lipase, chủng Ba 82 được tiến hành nuôi cấy trong

36 giờ với mật độ giống bổ sung ban đầu là 108 cfu/g Đối với enzyme amylase, chủng Ba 58 được tiến hành nuôi cấy trong 66 giờ với mật độ giống bổ sung ban đầu

là 108 cfu/g Đối với enzyme cellulase, chủng Ba 71 được tiến hành nuôi cấy trong

42 giờ với mật độ giống bổ sung ban đầu là 106 cfu/g Đối với enzyme phytase,