PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG DỤNG

TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

Sinh viên thực hiện : TRẦN TRƯỜNG NHÂN

Thành Phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG

DỤNG TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Trần Trường Nhân

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2009

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, ông bà nội người đã sinh thành, dưỡng dục và hy sinh tất cả để anh em con ăn học nên người Con xin cảm

ơn gia đình là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước qua mọi khó khăn

Em xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Cà Mau đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận này

 PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức quí báo, quan tâm hết lòng giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

 Toàn thể Thầy Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báo

 TS Lê Anh Phụng và ThS Nguyễn Thị Thu Năm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất khóa luận này

 Cám ơn các bạn cùng thực tập tại phòng vi sinh luôn động viên khuyến khích

và nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực tập tại phòng

Cuối cùng anh xin cảm ơn em rất nhiều, người đã luôn chia sẽ, an ủi cùng anh trong những ngày tháng khó khăn nhất của anh

TÓM TẮT

Trần Trường Nhân, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp Hồ

Chí Minh “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với vi khuẩn E

coli và ứng dụng trong sản xuất probiotic” Đề tài được tiến hành tại phòng Thí

nghiệm vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 5 năm 2009 Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Hải

Với đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ phân heo, chúng tôi tiến hành thử đối kháng với vi khuẩn E coli H28 Qua quá trình

thực hiện đề tài chúng tôi có những ghi nhận sau:

Kết quả thí nghiệm đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E coli trên môi trường TSA cho thấy Bacillus subtilis đối kháng mạnh với E coli ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli là 10-3 tại thời điểm 24 giờ ủ trong tủ ấm 370C

Kết quả thí nghiệm thử đối kháng giữa dịch ly tâm từ canh khuẩn Bacillus

subtilis và E coli trên thạch đĩa TSA cho thấy dịch ly tâm canh khuẩn Bacillus subtilis

sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C có khả năng kháng E coli mạnh nhất ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli là 10-2

Kết quả thí nghiệm sau khi nuôi chung giữa Bacillus subtilis với E coli trong môi trường TSB cho thấy số lượng E coli giảm từ 24 đến 48 giờ, còn đối chứng thì số lượng E coli tăng dần

Với chất bảo quản là acid benzoic ở nồng độ 0,1% có nhiều ưu điểm hơn trong

sản xuất chế phẩm dạng lỏng chứa B.subtilis

SUMMARY

Nhan, Tran Truong, “The antagonism of Bacillus subtilis isolated from pig-fecal

to E coli and the probable application in probiotic” Our topic is proceeded from

December, 2008 to May, 2009 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city

In this study, the following results were:

The experiment showed that Bacillus subtilis has well againsted to E coli in the

dilution 10-3 of E coli cultured at 370C for 24 hours

The Bacillus subtilis bacteria cell-free extract after culturing for 24 hours, presented in inhibiting E coli development

The co-culture of Bacillus subtilis and E coli in the Soyabean Casein Digest Medium (Tryptone Soya Broth) showed the total E coli bacteria through a plate count

considerably decreased in comparison with control

As these results, the Bacillus subtilis could inhibite the E coli the development in

some conditions

Benzoic acid at 0,1% could be the more suistable preserver for B subtilis product

in liquid

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng .x

Danh sách các hình xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về E coli 3

2.1.1 Nhắc lại về E coli 3

2.1.2 Đặc điểm E.coli 3

2.1.2.1 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3

2.1.2.2 Cấu tạo kháng nguyên 4

2.1.2.3 Các chất độc do E coli tổng hợp nên 5

2.1.2.4 Các chủng E coli gây bệnh 7

2.1.2.5.Khả năng gây bệnh cho người 8

2.2.1 Định nghĩa 9

2.2.2 Cơ chế tác động 9

2.2.2.1 Tác động kháng khuẩn của probiotic 9

2.2.2.2 Tác động của probiotic lên biểu mô ruột 10

2.2.2.3 Tác động đáp ứng miễn dịch của probiotic 10

2.2.2.4 Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột 10

2.2.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học 10

2.2.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học 11

2.2.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 11

2.3 Sơ lược về Bacillus subtilis 12

2.3.1 Lịch sử phát triển 12

2.3.2 Tìm hiểu về vi khuẩn Bacillus subtilis 12

2.3.2.1 Đặc điểm phân loại 12

2.3.2.2 Đặc điểm phân bố 12

2.3.2.3 Đặc điểm hình thái 12

2.3.2.4 Đặc điểm nuôi cấy 13

2.3.2.5 Đặc điểm sinh hóa 13

2.3.2.6 Khả năng tạo bào tử 13

2.3.2.7 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp 14

2.3.2.8 Tính đối kháng của Bacillus subtilis 15

2.3.2.9 Độc tính của Bacillus subtilis 15

2.3.2.10 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus subtilis 16

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18

3.1.1 Thời gian 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Vật liệu thí nghiệm 18

3.2.1 Đối tượng khảo sát 18

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 18

3.2.3 Hóa chất 18

3.2.4 Môi trường nuôi cấy 18

3.2.5 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo 19

3.4.1.1 Cách lấy mẫu 19

3.4.1.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 20

3.4.2 Đánh giá khả năng đối kháng với E coli 21

3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Thử đối kháng với E coli trên môi trường thạch TSA 21

3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đối kháng .22

3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học 23

3.4.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả 25

4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25

4.1.2 Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E coli 27

4.1.3 Kết quả đối kháng giữa dịch ly tâm canh khuẩn Bacillus subtilis 29

4.1.4 Kết quả đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis và E coli trong .31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis: Bacillus subtilis

E.Agg.E.C: Enteroaggregative Escherichia coli

E coli: Escherichia coli

E.H.E.C: Enterohaemorrhagic Escherichia coli E.P.E.C: Enteropathogenic Escherichia coli E.I.E.C: Enteroinvasive Escherichia coli E.T.E.C: Enterotoxingenic Escherichia coli

LT: Heat labile enterotoxin

ST: Heat stable enterotoxin

TSA: Trypticase Soya Agar

TSB: Trypticase Soya Broth

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E.coli và đối tượng gây bệnh của nó…… 8

Bảng 3.1 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học 24

Bảng 4.2 Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E coli 28

Bảng 4.3 Kết quả đối kháng của dịch ly tâm canh khuẩn từ 5 chủng 30

Bảng 4.4 Số lượng vi khuẩn B subtilis còn sống 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn E coli 3

Hình 2.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn E coli 6

Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 13

Hình 4.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trên môi trường TSA 25

Hình 4.2 Vi khuẩn B.subtilis 26

Hình 4.3 Các phản ứng sinh hóa của B subtilis 27

Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn của Bacillus subtilis đối với E coli 29

Hình 4.5 Vòng kháng khuẩn của dịch canh khuẩn Bacillus subtilis 31

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra B subtilis sau khi lên men .33

Hình 4.7 Sau khi đóng chai chế phẩm B subtilis .33

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 20

Sơ đồ 3.2 Thí nghiệm thử đối kháng với E coli trên môi trường thạch TSA 21

Sơ đồ 3.3 Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm của Bacillus subtilis 21

Sơ đồ 3.4 Khảo sát tính đối kháng giữa Bacillus subtilis với E coli 22

Sơ đồ 3.5 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học……… ……… 23

Biểu đồ 4.1 Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis và E coli biểu thị ở dạng log10 31

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

E coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của

người và động vật Tuy nhiên khi có điều kiện thích hợp thì E coli gây độc tăng sinh

mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc còn non gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi

Do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh của E coli thì việc sử

dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn

đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng Thay vào đó, việc sử dụng probiotic ngày càng phổ biến và được xem như là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh

Probiotic là 1 dạng chế phẩm sinh học bao gồm các vi sinh vật có lợi, có tính đề kháng cao và có khả năng ức chế các vi sinh vật có hại nên đựợc ứng dụng để phòng trừ bệnh tiêu chảy trên heo con

Hiện nay, các dạng chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis đang được sử dụng ngày

càng phổ biến đối với bệnh tiêu chảy trên heo do những ưu điểm thuận lợi cho việc sản

xuất probiotic cũng như tính đối kháng mạnh với E coli Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về Bacillus subtilis đã và đang được tiến hành nhằm tìm ra những chủng

Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với E coli

Được sự phân công môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài

“Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với vi khuẩn E coli và ứng

dụng trong sản xuất probiotic”

1.2 Mục đích của đề tài

 Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở trại heo Trường Đại

Học Nông Lâm TP.HCM

 Chọn lọc được dòng Bacillus subtilis có khả năng kháng khuẩn đối với E coli

 Đánh giá khả năng đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E coli gây bệnh

trong môi trường TSB

 Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học

 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

 Phân lập các chủng Bacillus subtilis từ phân heo và thử đối kháng với E coli gây

bệnh trên môi trường TSA, TSB

 Bảo quản chế phẩm sinh học chứa Bacillus subtilis bằng những chất bảo quản khác

nhau

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về E coli

2.1.1 Nhắc lại về E coli

Giống Escherichia thuộc họ Enterobactericeae, một kí sinh bình thường trong

đường ruột và được phân lập từ phân của động vật hữu nhũ Những giống thành lập nên họ này là những vi khuẩn Gram-, rộng 0,5 - 1µm và dài 1 - 6µm thường di động,

có lông và không sinh bào tử, hiếu khí hay yếm khí tùy nghi(dẫn liệu Lê Thị Mai

2.1.2.1 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp là 35 -

370C pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu nhất là 7,2 – 7,4)

Trong môi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ E coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu

càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường

E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn

lạc dạng S màu xám trắng, tròn ướt, bề mặt láng bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm Trên thạch EMB: E coli tạo khuẩn lạc tím ánh kim

Trên thạch Macconkey: E coli tạo khuẩn lạc đỏ hồng, tròn, lồi

E coli lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như: Lactose,

Glucose, Manitol….Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường Lactose để phân

biệt E coli với một số vi khuẩn đường ruột khác(dẫn liệu Nguyễn Văn Nghĩa, 2002)

 ONPG (+), Urease (-), H2S (-), LDC (+)

 Nghiệm pháp IMViC: I+M+V-C-, indol (+), methyl red (+), VP (-), simmons citrate (-)

2.1.2.2 Cấu tạo kháng nguyên

E coli có đủ 4 loại kháng nguyên O, H, K, F

- Kháng nguyên O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của màng

tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết, kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và

có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ Các E coli có chung tính kháng nguyên

O thường có sự tương tác lẫn nhau và nhiều nhóm kháng nguyên O của Shigelle,

Salmonella

- Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, là các vi nhung

mao của vi khuẩn, tạo nên khả năng di chuyển của E coli, kém chịu nhiệt, có 56 type

(mannose-ressistant – MR) cũng được dùng để phân loại về mặt huyết thanh học Một vài lông bám kháng mannose (ví dụ như K88 và K89) đã từng được coi là kháng nguyên K Về sau khi xác định được thành phần hóa học của những lông bám này có bản chất là protein nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp

vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F

2.1.2.3 Các chất độc do E coli tổng hợp nên

Độc tố của E coli: vi khuẩn E coli tạo 2 loại độc tố đường ruột (Smith và

Oyles, 1970) sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt

- Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin-LT): độc tố LT của E coli là

oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (Cholera

toxin-CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như: cấu

trúc, trình tự acid amine (giống nhau khoảng 80%, tương đồng thụ thể, hoạt tính enzyme và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào)

LT có 2 nhóm chính là LT-I và LT-II, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn

dịch chéo nhau LT-I được biểu hiện trong các chủng E coli gây bệnh trên người và động vật còn LT-II chỉ được tìm thấy trên những chủng E coli phân lập được trên

động vật và một số rất ít chủng phân lập được trên người Tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-II có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập trung chủ yếu vào LT-I

LT-I là một oligopeptde trọng lượng phân tử là 86 kDa, được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng lượng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa 5 tiểu đơn vị B

sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfic LT-I

có 2 loại LTh-I có độc tính trên người và LTp-I có độc tính trên heo, sau khi độc tố đi vào nội bào chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của golgi (golgi vận chuyển) Mục tiêu của LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein lien kết GTP (GTP-binding protein) là

Gs, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào Vì vậy enzyme cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A Enzyme

này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên mằng tế bào biểu mô ruột vượt quá mức bình thường

Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung Do đó hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng làm nước bên trong tế bào kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy

LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm thụ thể thay vì GM1, tuy nhiên như đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của người và động vật

- Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin-ST): ST có trọng lượng phân tử nhỏ, trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố Độc tố này có 2 loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau

là STa và STb

STa là 1 peptide gồm 18 - 19 acid amine với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa,

Sta được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E coli phân lập được trên heo và STb (ST human hay STIb) của E coli phân lập trên người

Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột

Hình 2.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn E coli

STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo cáo vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao 1 phần Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào Tác động của STb trong tế bào không giống như STa thay vì phân tiết clourua (Cl-) nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-) STb không làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài (dẫn liệu Lê Thị Mai Khanh, 2004)

2.1.2.4 Các chủng E coli gây bệnh

(Dẫn liệu của Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007)

Đối với các E coli gây bệnh đường ruột người ta chia làm 5 loại sau đây:

 Enteroaggregative E coli (E.A.E.C hay E.Agg.E.C): E.A.E.C hay E.Agg.E.C là nhóm E coli không sinh enterotoxin E.A.E.C gây tiêu chảy

kéo dài (trên 14 ngày) Trong hầu hết các báo cáo đều mô tả E.A.E.C ở các

ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng E.A.E.C cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch (Keskimaki, 2001)

 Enteroinvasive E coli (E.I.E.C): rất giống với Shigella về mặt kháng nguyên sinh hóa và đặc tính gây bệnh Cả Shigella spp và E.I.E.C đều có

khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết 1 hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998)

 Enterphathogenic E coli (E.P.E.C): số lượng rất ít (chỉ nhóm O45 và O108

là hiện diện trên heo) và thường ít liên quan đến các trường hợp tiêu chảy trên những heo con cai sữa và sau cai sữa (Th Alogninouwa, 1994)

 Enterohaemorrhagic E coli (E.H.E.C): gây tiêu chảy xuất huyết trên cả

thú và người, sản sinh độc tố thần kinh verotoxin (VT) hay độc tố

shiga-like (shiga-shiga-like toxin producing E coli: SLTEC) gây các triệu chứng viêm

ruột xuất huyết và hội chứng viêm huyết niệu (H Lior, 1994)

 Enterotoxigenic E coli (E.T.E.C): nhóm này gồm những E coli tạo ra ít

nhất 1 trong 2 loại độc tố đường ruột là ST và LT Các ST và LT thường có

1 hay nhiều yếu tố kết dính (F4, F5, F6 và F41) cho phép chúng bám vào các

vi nhung mao ruột và định vị trên màng nhày ruột Các nguồn E.T.E.C thường kết hợp với bệnh tiêu chảy trên heo còn bú và thường thuộc các nhóm huyết thanh sau: O8, O9, O138, O141, O147, O149,…(Th Alogninouwa, 1994)

Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E coli và đối tượng gây

bệnh của nó (trích dẫn bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)

K 88 Heo con O8, O45, O138, O141,

O147, O149, O157 s87P Heo con O9, O20, O141

K 99 Cừu, bê O8,O9, O20, O101

K 99 Heo con O64, O101

CFA/1 Người O15, O25, O63, O78

2.1.2.5.Khả năng gây bệnh cho người

 Gây bệnh cho người

E coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hóa Tuy là vi khuẩn sống cộng sinh với người nhưng E coli có thể gây

bệnh cơ hội, chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp và nhiểm khuẩn huyết Nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em

 Gây bệnh thực nghiệm trên thú

Khả năng gây bệnh cho súc vật yếu, phải đưa một lượng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hay đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết cho súc vật

E coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản sinh

2.2 Chế phẩm sinh học (probiotic)

2.2.1 Định nghĩa

Probiotic là những chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật sống có lợi khi đưa vào trong cơ thể của vật chủ sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tạo điều kiện cải thiện tăng trưởng và tăng cường sức đề kháng của vật chủ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Probiotic được sử dụng ngày càng nhiều trong chăn nuôi, nhằm phục hồi và cân bằng hệ vi sinh đường ruột vật chủ bị hư hại do tác động của các yếu tố stress, dinh dưỡng và sử dụng kháng sinh không đúng cách Việc sử dụng probiotic trong chăn nuôi đem lại những hiệu quả sau:

 Tăng suất (thịt, trứng, sữa)

 Cải thiện tiêu tốn thức ăn

 Tăng cường sức đề kháng bệnh

2.2.2 Cơ chế tác động

Tuy đã được sử dụng từ rất lâu nhưng cơ chế tác động của probiotic vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể là:

 Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa

 Cạnh tranh chất dinh dưỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên

cơ chế này chưa được chứng minh 1 cách rõ ràng trong điều kiện in vivo

 Sản xuất chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ, bacteriocin…

 Kích thích hệ miễn dịch

Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột (Trần Thị Dân, 2005)

2.2.2.1 Tác động kháng khuẩn của probiotic

Làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn mầm bệnh, tiết ra chất kháng khuẩn

Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn gram+ và gram-, gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide…Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những vi sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra độc tố Điều này thực hiện bằng cách giảm pH khoang

ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate và butyrate nhất là acid lactic

Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột

Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống của mầm bệnh

2.2.2.2 Tác động của probiotic lên biểu mô ruột

Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa các tế bào biểu mô, giảm việc kích thích bài tiết

và những hậu qủa do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn Đẩy mạnh sự tạo ra các phản

ứng phòng vệ như chất nhầy

2.2.2.3 Tác động đáp ứng miễn dịch của probiotic

Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột, đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để làm giảm đáp ứng viêm Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

2.2.2.4 Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột

Probiotic điều chỉnh thành phần vi khuẩn đường ruột, sự sống sót của của vi khuẩn probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn chỉ định cư một cách tạm thời trong ruột một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic

sẽ giảm xuống

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột.(Đặng Quốc Bảo, 2005)

2.2.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học

Probiotic được sử dụng để phòng và chữa trị các bệnh đường ruột như là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng sinh và dinh dưỡng, bệnh viêm ruột, ngoài ra còn được sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà

cơ thể tiết ra không đủ như sucrase, maltase

Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật có lợi được bổ sung vào thức ăn để nâng cao sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú nuôi Do nó có tác dụng ức

chế các vi sinh vật có hại, làm thay đổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi thông qua việc sinh ra các chất ức chế, chất kháng khuẩn, ức chế trong cạnh tranh dinh dưỡng, tăng cường miễn dịch, tăng hoạt tính đại thực bào

Probiotic giúp thú tăng trọng nhanh hơn trên 1 đơn vị thức ăn do vi sinh vật trong Probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa như amylase, protease làm tăng hệ số chuyển hóa thức ăn của thú (Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)

2.2.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học

Những vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học cần phải thỏa mãn một

số điều kiện sau:

- Có khả năng sống sót trong đường ruột của vật chủ

- Có khả năng bám dính lên biểu mô ruột

- Có khả năng ức chế các loài vi sinh vật gây bệnh

- Có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức đề kháng của vật chủ

- Không gây bệnh và không gây độc

- Có lợi cho quá trình tiêu hóa của vật chủ

- Phù hợp với các yêu cầu sản xuất công nghiệp

- Giữ đặc tính ổn định trong một thời gian tương đối dài ở điều kiện bình thường (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất phải đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng phải đơn giản

2.2.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis

Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic có

nguồn gốc từ Bacillus spp được sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm dạng

này có nhiều ưu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành rẻ, bào tử chịu đựng được các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hoá…

Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống Bacillus thì Bacillus subtilis được tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus sutilis không mang những gene gây độc cho người và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus sutilis được nghiên

cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của

Bacillus sutilis có khả năng nảy mầm trên phần đầu của ruột non Điều này làm cho

việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic được đẩy mạnh

2.3 Sơ lược về Bacillus subtilis

2.3.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các chiến sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Đến năm 1949 - 1957 khi Herry, Albot và các cộng sự tách được các chủng

thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó, “sutilistherapie” có nghĩa là sutilin ra đời trị

các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và đựơc sử dụng rộng rãi

trong chăn nuôi, y học, thực phẩm….(Nguyễn Duy Khánh, 2006)

2.3.2 Tìm hiểu về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng

được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước…

Phần lớn tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100

triệu cfu/g Đất nghèo dinh dưỡng như ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất

hiếm

Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào

sinh dưỡng Bacillus subtilis

không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ….(Tô Minh Châu, 2000)

Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b9/Bacillus_subtillis_Gram.jpg

2.3.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C

Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển

trong môi trường thiếu oxy

Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4

Môi trường thạch đĩa TSA có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi nâu

Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis làm đục môi trường, tạo màng nhăn,

lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên

2.3.2.5 Đặc điểm sinh hóa

Các phản ứng sinh hoá được sử dụng để khẳng định Bacillus subtilis:

Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, abrbinose

2.3.2.6 Khả năng tạo bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử

trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi (dinh dưõng trong môi trường bị kệt quệ, nhiệt độ….) (Tô Minh Châu, 2000)

Bào tử là 1 hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi….Mỗi vi khuẩn chỉ tạo 1 bào

tử Khi gặp điều kiện thuân lợi bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưõng

2.3.2.7 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:

subtilin, subtilosin A, Tas A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, difficidin…

 Subtilin

Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở

pH = 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton

 Subtilosin

Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria

monocytogenes và Bacillus cereus

 Sublancin

Sublancin không tác động với vi khuẩn Gram- nhưng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn Gram+ kể cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử Sublancin là bacterocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thường trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin

 TasA

TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng

khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào

tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách lõi bào tử, TasA giúp Bacillus subtilis

chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm

 Surfactin

Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do nó có tính đối kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động đối với nấm Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp màng lipid kép đồng thời

ức chế hoạt tính của một số enzyme (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)

2.3.2.8 Tính đối kháng của Bacillus subtilis

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc trong đường ruột nên ngoài khả năng

chịu đựng được acid của dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột Chúng còn

có khả năng đấu tranh với các loại vi sinh vật gây bệnh đường ruột

Theo các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết quá trình tạo bào tử của

B subtilis tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi bắt đầu thì

không thể đảo ngược Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt

Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiên diện của Bacillus subtilis với một số

lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưõng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế

Trong môi trường dinh dưõng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng

sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ trước khi tạo bào tử

2.3.2.9 Độc tính của Bacillus subtilis

(Dẫn liệu Nguyễn Nhật Chen, 2008)

 Đối với con người

Một số chủng Bacillus subtilis cũng như họ hàng gần của nó là B

licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một

enzyme có khả năng phá vỡ tế bào của động vật hữu nhũ Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người

Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trường hợp

gây ngộ độc thực phẩm

Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có độc

tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường hô hấp

Bacillus subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme ngoại

bào và là tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người Ngoại trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của người đang

suy yếu Trong một số trường hợp người ta vẫn phát hiện Bacillus subtilis ở những

bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…Tuy nhiên tỉ

lệ các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm Bacillus (trong

1034 ca nhiễm) là do Bacillus subtilis

 Đối với động vật

Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trương hợp bò và cừu sẩy thai Tuy

nhiên Bacillus subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh

Bacillus subtilis nhiễm vào và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây

sốt rét ở Ấn Độ (I Geetha và A M Manonmani, 2008) và được sử dụng như 1 tác nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu về bệnh này

 Đối với thực vật

Bacillus subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharides của mô thực vật dẫn

đến thối củ ở khoai tây Gây những vết viêm loét trên một số cây rừng

2.3.2.10 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus subtilis

 Trong y học và chăn nuôi

Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc B subtilis khi chúng cùng phát triển

trong đất đã được biết đến khá lâu Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng trao đổi

giữa B subtilis và B thurigensis Một số nghiên cứu chỉ ra rằng B subtilis chuyển gen

có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả năng biểu hiện độc tố hay một số thành phần độc trong các vi khuẩn trong các bệnh ho gà, bạch hầu, viêm phổi…Điều này có ý

nghĩa rất lớn đối với y học Tuy nhiên còn tồn tại một vấn đề là B subtilis hoàn toàn

có thể nhận các gen quy định tính độc từ các vi khuẩn độc có quan hệ tương đối gần về mặt di truyền và gây hại

Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thủy Nguyên (là bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B subtilis

đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy

Năm 1958-1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm

Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột

Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế

phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy người

Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Bacillus subtilis

Năm 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm

coli_subtyl (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy

gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

Năm 1949 tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus

subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng và viên nang

Năm 1962, đã phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do

lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả

Ngoài ra B subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men

và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, VEM, BIO-IV…

 Trong nông nghiệp

Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp… Ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản

sau thu hoạch

Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái

phát hiện bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị kháng sinh

Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hóa chất thuộc Bộ Công Nghiệp

Tp HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ B subtilis để phòng trừ các

loại nấm gây bệnh trên rau cải

Năm 1940, Norio Kimura Yokohama đã sử dụng chế phẩm B subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus

paraciticus.( Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007)

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.2.1 Đối tượng khảo sát

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ phân heo (5 chủng)

Chủng vi khuẩn E coli do phòng vi sinh cung cấp (1 chủng H 28 mang gen gây

bệnh tiêu chảy trên heo)

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím…

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo

pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang… Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều được xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút

3.2.3 Hóa chất

Hóa chất cơ bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl…

Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh hóa: NaOH 40%, α-naphton 10%, acid sulfanilic…

Thuốc thử Kowac’s, Methyl red…

Thuốc dùng cho phương pháp nhuộm Gram

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường giữ giống: TSA (Trypticase Soya Agar)

Môi trường khảo sát các đặc điểm sinh hóa: TSB (Trypticase Soya Broth), Clark Clubs, Simon Citrate Agar, môi trường lòng đỏ trứng, môi trường nitrate, môi trường lên men đường…

3.2.5 Nội dung nghiên cứu

Phân lập chủng Bacillus subtilis từ phân heo

Thử đối kháng với E coli trên môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) nhằm xác định một số chủng đối kháng mạnh với E coli

Khảo sát quá trình nuôi chung giữa Bacillus subtilis với E coli trong môi trường

TSB

Khảo sát thời gian bảo quản số lượng vi khuẩn B subtilis nhiệt độ phòng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo

3.4.1.1 Cách lấy mẫu

Lấy 0,2 – 0,3 g phân heo cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều được nồng độ pha loãng 10-1, nung ở nhiệt độ 800C trong 10 phút, pha loãng thành 10-2,10-3,10-4,10-5 dùng pipette hút 0,1 ml cho vào thạch đĩa TSA, mỗi nồng độ trang 2 đĩa, ủ 370C trong 24 giờ

3.4.1.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

cấy giữ giống, quan sát dưới kính

hiển vi kiểm tra phản ứng sinh hóa

TSA giữ giống TSA

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

 Lựa chọn khuẩn lạc

Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram, các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn Sau khi quan sát nếu thấy tiêu bản của vi khuẩn nào phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn

Bacillus subtilis thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định

 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Lecithinase (-),Voges – Proskauer (+), Nitrate (+), Citrate (+), Maltose (-), Catalase (+)

3.4.2 Đánh giá khả năng đối kháng với E coli

3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Thử đối kháng với E coli trên môi trường thạch TSA

Dịch canh khuẩn E coli 370C/24giờ ( nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2, 10-3)

được phết trên đĩa môi trường TSA

Cấy chấm Bacillus subtilis lên đĩa TSA đã phết E coli,

ủ 370C trong 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ

Ghi nhận các chủng cho vòng kháng khuẩn lớn,

giữ giống trên môi trường TSA

Sơ đồ 3.2 Thí nghiệm thử đối kháng với E coli trên môi trường thạch TSA

3.4.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm Bacillus subtilis và dịch canh khuẩn E coli

Cấy Bacillus subtilis trên môi trường TSB trong 24 giờ, 36 giờ, 48giờ

Ly tâm 5000 vòng/10 phút thu lấy dịch trong

Dùng tăm bông vô trùng phết dịch canh khuẩn E coli đã nuôi ở 370C/24giờ

lên đĩa môi trường TSA

Thử khả năng đối kháng bằng phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch TSA

Sơ đồ 3.3 Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm của Bacillus subtili và dịch canh

khuẩn E coli

Thử khả năng đối kháng bằng phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch TSA

như sau: phết lên đĩa môi trường TSA dịch canh khuẩn E coli (370C/24 giờ) không pha loãng (100) và pha loãng 10-1, 10-2 Sau đó dùng đầu típ vô trùng đã cắt ngang

phần đầu có đường kính khoảng 8 mm, ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra những thỏi

thạch bỏ đi Dùng pipette hút dịch chiết ly tâm từ Bacillus subtilis bơm vào các lỗ trên

(50 µl/lỗ), ủ các đĩa này trong tủ ấm (370C/24 giờ) và quan sát vòng kháng khuẩn

3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đối kháng giữa Bacillus subtilis với E coli

trong môi trường TSB

Cấy E coli và Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml môi trường

TSB ủ 370C/24 giờ, hút 1 ml canh khuẩn Bacillus subtilis cho vào mỗi bình tam giác

chứa 50 ml môi trường TSB, sau đó cho vào mỗi bình tam giác 1 ml canh khuẩn E

coli ủ ở 370C Đánh giá số lượng vi khuẩn E coli và Bacillus subtilis ở các khoảng

thời gian 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ bằng phương pháp trang đĩa trên môi trường TSA

Giống Bacillus subtilis Giống E coli

Cấy vào ống 5 ml TSB vào ống 5 ml TSB

ủ 370C/24 giờ ủ 370C/24 giờ

1 ml 1 ml

Nuôi chung trong 50 ml TSB ở 370C/24 giờ

Kiểm tra số lượng E coli và Bacillus subtilis

sau 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ nuôi cấy chung

Sơ đồ 3.4 Khảo sát tính đối kháng giữa Bacillus subtilis với E coli

trong môi trường TSB

3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học

Sơ đồ 3.5 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học

Giống Bacillus subtilis

Tăng sinh trong TSB

370C/ 24h

Tỷ lệ cấy giống 10%

Môi trường mật rĩ đường

Thu hoạch sinh khối và dịch

3.4.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học Bảng 3.1 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học

Thời gian Chất

bảo quản

Nồng độ (%) Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 3 tuần Sau 4 tuần

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo

Sau 24 giờ cấy trang mẫu phân trên môi trường TSA, kết quả được thể hiện ở

Hình 4.1 khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus subtilis có dạng khô, rìa nhăn, nằm sát bề

mặt thạch, màu xám trắng tâm đậm

Khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis

Hình 4.1 Kết quả phân lập Bacillus

subtilis trên môi trường TSA

Bảng 4.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis

Địa điểm lấy

mẫu

Tổng số mẫu Số khuẩn lạc

được chọn trên môi trường TSA

Số khuẩn lạc được chọn sau khi nhuộm Gram

Số khuẩn lạc được chọn sau khi thử phản ứng sinh hóa

Các khuẩn lạc đặc trưng được giữ giống, nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển

vi (độ phóng đại × 1000 lần để khảo sát đặc điểm hình thái) Chúng tôi nhận thấy các

chủng vi khuẩn ngi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis là trực khuẩn bắt màu

Gram+, ngắn, kích thước 0,5 – 0,8 µm, hai đầu tròn, thường đứng riêng lẻ, đôi khi sếp thành chuỗi ngắn từ 3 – 5 tế bào, có bào tử

Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis được chọn để

thử một số phản ứng sinh hóa để khẳng định Kết quả thu được 61 chủng có phản ứng

lecithinase (-) Thu được 5 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có kết quả thử sinh hóa là:

lecithinase (-), Voges - prokauer (+), nitrate (+), citrate (+), maltose (-), catalase (+) (Koneman và ctv,1997)

4.1.2 Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E coli trên môi trường

TSA

Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa 5 chủng Bacillus subtilis với những nồng

độ pha loãng canh khuẩn E coli khác nhau: không pha loãng (100), 10-1, 10-2,10-3 và quan sát khả năng đối kháng sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ ủ trong tủ ấm 370C Kết quả

được thể hiện ở Bảng 4.2

+ + + - - -

+ + + - - -

- - - + + + - - - + + +

Bảng 4.2 Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E coli trên môi trường

TSA

Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) Chủng

B.subtilis

Nồng độ pha loãng canh

khuẩn E coli 24 giờ 36 giờ 48 giờ

Qua kết quả bảng trên cho thấy các yếu tố ảnh hưởng của nồng độ pha loãng canh khuẩn

E coli khi đối kháng với B subtilis trên môi trường TSA, không có ý nghĩa về thống kê

Tuy nhiên qua kết quả xử lý ở trên cũng cho thấy rằng sự khác biệt giữa kích

thước vòng kháng khuẩn đo được ở các nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli 100

(3,28 mm), 10-1 (3,71 mm), 10-2 (3,79 mm), 10-3 (4,95 mm) không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05)

Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn của Bacillus subtilis đối với

E coli trên môi trường TSA của chủng B160 sau 24 giờ

4.1.3 Kết quả đối kháng giữa dịch ly tâm canh khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy

trong 24 giờ/37 0C với E coli trên môi trường TSA

Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa dịch ly tâm canh khuẩn của 5 chủng

Bacillus subtilis với những nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli khác nhau: không

pha loãng (100), 10-1, 10-2 và quan sát khả năng đối kháng sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ ủ trong tủ ấm 370C Kết quả được thể hiện ở Bảng 4.3