KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus subtilis

Nhằm nghiên cứu ứng dụng protease từ Bacillus subtilis vào lĩnh vực chăn nuôi, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp prot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA

MỘT SỐ CHỦNG Bacillus subtilis

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS Trương Phước Thiên Hoàng Ngô Thị Thanh Nhàn

ThS Nguyễn Như Nhứt

Tháng 9/2008

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nổ lực của bản thân là sự chỉ dẫn tận tình của thầy cô, giúp đỡ của bạn bè và sự động viên từ gia đình

Bằng lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ

nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

 Cô Trương Phước Thiên Hoàng và thầy Nguyễn Như Nhứt đã tận tình hướng

dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian thực hiện khóa luận

 Các anh chị trong Chi nhánh Công ty Gia Tường đã giúp đỡ em rất nhiều trong

công việc cũng như trong quá trình làm quen với môi trường làm việc mới

 Các bạn lớp CNSH 30 đã bên em, động viên, chia sẻ trong thời gian thực tập

cũng như trong suốt bốn năm học vừa qua

 Cha me, cậu và anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ em học tập và

hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Sinh viên thực hiện Ngô Thị Thanh Nhàn

iv

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng

Thời gian: từ 1/3 đến 1/8 năm 2008

Đối tượng nghiên cứu: Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là đối tượng có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao được

sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi và y học Nhằm nghiên

cứu ứng dụng protease từ Bacillus subtilis vào lĩnh vực chăn nuôi, chúng tôi đã tiến

hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp

protease của chủng Bacillus subtilis ở hai điều kiện: nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn

Kết quả thu được như sau:

- Nuôi cấy bán rắn có hoạt tính protease cao hơn nuôi cấy lỏng

- Thành phần môi trường bán rắn tối ưu khi nuôi cấy chủng Bacillus subtilis ở

quy mô phòng thí nghiệm bao gồm: cám bắp – bã đậu nành (tỷ lệ 8 : 2) với

thời gian nuôi cấy tối ưu là 66 giờ

- Canh trường thu nhận được từ nuôi cấy bán rắn, sau khi sấy khô, xay nhuyễn, được xác định sự hiện diện một số enzyme khác và hàm lượng các loại nitrogen Kết quả cho thấy trong canh trường có chứa α – amylase (37.472,399 UI/g), phytase (885,539 UI/g), xylanase (165,61 UI/g), nitrogen formol (0,854

%), nitrogen tổng số (3,644 %) và nitrogen NH3 (0,616 %)

v

SUMMARY

Ngo Thi Thanh Nhan, Nong Lam University of Ho Chi Minh city

Graduating thesis “Surveying the ability of biosynthesizing protease of some

Bacillus subtilis strains” was carried out from March to August, 2008, at the

Laboratory of the branch of limited liability Gia Tương company, Binh Dương province

Bacillus subtilis is able to produce high activity protease which is used widerly in

food industry, livestock and medicine We studied on application of Bacillus subtilis in

field livestock by surveying the influences of environmental factors, cultural

conditions, the ability of producing protease of Bacillus subtilis strains in 2 culture

conditions: broth culture and semi - solid culture

The results obtained shows that:

- Bacillus subtilis cultured in semi - solid culture produces protease which has

higher activity than in broth culture

- Components of optimal semi - solid culture in culturing Bacillus subtilis strain

contain: bran of maize, residue of soya (rate 8:2), with the optimal culturing time is 66 hours

- Semi - solid culture after dried, grinded, was identified the presence of some

UI/g); xylanase (165,61 UI/g), and confirmed nitrogen contents, such as : nitrogen formol (0,854 %); total number of nitrogen (3,644 %) and nitrogen

NH3 (0,616 %)

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis 3

2.1.1 Lịch sử phát triển 3

2.1.2 Phân loại Bacillus subtilis 3

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis 3

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 5

2.1.3.4 Đặc điểm về sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên 6

2.1.4 Tác hại của Bacillus subtilis 6

2.1.5 Ứng dụng của Bacillus subtilis 7

2.2 Sơ lược về protease 7

2.2.1 Lịch sử phát triển 8

2.2.2 Nguồn thu nhận protease 9

2.2.2.1 Từ nguồn thực vật và động vật 9

2.2.2.2 Từ vi sinh vật 9

2.2.3 Phân loại protease 9

2.2.3.1 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm 9

vii

2.2.3.2 Dựa vào tính đặc hiệu với sự phân cắt liên kết peptide 10

2.2.3.3 Dựa vào pH hoạt động 10

2.2.3.4 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme 10

2.2.3.5 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme 10

2.2.4 Cơ chế tác dụng 10

2.2.5 Protease của vi khuẩn 11

2.2.5.1 Chức năng sinh học của protease vi khuẩn 11

2.2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi khuẩn 12

2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật 14

2.2.6.1 Trong công nghiệp dệt 14

2.2.6.2 Trong công nghiệp thuộc da 14

2.2.6.3 Trong chế biến các loại bột giặt 15

2.2.6.4 Trong kỹ nghệ phim ảnh 15

2.2.6.5 Trong y học 15

2.2.6.6 Ứng dụng khác 15

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

2.3.1 Nghiên cứu trong nước 16

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước 16

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1 Vật liệu 17

3.1.1 Giống vi sinh vật 17

3.1.2 Nguyên liệu nuôi cấy: bã đậu nành, bột cá, cám gạo, cám bắp, bột trùn quế 17

3.1.3 Các loại môi trường dùng trong thực nghiệm 17

3.1.3.1 Môi trường cấy chuyền giữ giống Bacillus subtilis (MT1) 17

3.1.3.2 Môi trường tăng sinh Bacillus subtilis (MT2) 18

3.1.3.3 Môi trường đếm khuẩn lạc cao thịt pepton (MT3) 18

3.1.3.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) 18

3.1.3.5 Môi trường nuôi cấy lỏng sinh tổng hợp protease (MT5) 18

3.1.4 Dụng cụ và thíết bị 19

3.1.4.1 Dụng cụ 19

3.1.4.2 Thiết bị 19

3.2 Phương pháp thực hiện 19

3.2.1 Phương pháp Anson để xác định hoạt tính enzyme protease

viii

3.2.1.1 Nguyên tắc 19

3.2.1.2 Hóa chất 19

3.2.1.3 Cách thực hiện 20

3.2.2 Phương pháp trọng tài xác định độ ẩm 21

3.2.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 21

3.2.4 Phương pháp tăng sinh 21

3.2.5 Phương pháp xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 22

3.2.6 Phương pháp nuôi cấy lỏng sinh tổng hợp protease 22

3.2.7 Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy lỏng 22

3.2.8 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất bằng nuôi cấy lỏng 22

3.2.9 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease bằng phương pháp nuôi cấy lỏng 22

3.2.9.1 Khảo sát ảnh hưởng các nguồn carbon 22

3.2.9.2 Khảo sát ảnh hưởng khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau 22

3.2.9.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuối cấy 23

3.2.10 Phương pháp nuôi cấy bán rắn sinh tổng hợp protease 23

3.2.11 Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy bán rắn 23

3.2.12 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất bằng nuôi cấy bán rắn 23

3.2.13 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease bằng phương nuôi cấy bán rắn 23

3.2.13.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cơ chất 23

3.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng khi thay đổi tỷ lệ cơ chất 24

3.2.13.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 24

3.2.14 Phương pháp khảo sát các enzyme khác trong chế phẩm thu được 24

3.2.14.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller 25

3.2.14.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller 25

3.2.14.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo Fiske và Subbarow 25

3.2.14.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller 26

ix

3.2.15 Phương pháp xác định các loại nitrogen trong chế phẩm thu được 26

3.2.15.1 Phương pháp Kjeldahl xác định nitrogen tổng số 26

3.2.15.2 Phương pháp Sorensen xác định nitrogen formol 26

3.2.15.3 Phương pháp xác định nitrogen NH3 27

3.2.15.4 Xác định nitrogen amin 27

3.2.16 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản chế phẩm enzyme thô thu được 27

3.2.17 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28

4.1 Khảo sát khả năng tổng hợp protease của 9 chủng Bacillus subtilis trên môi trường nuôi cấy lỏng 28

4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp protease khi thay đổi các nguồn carbon 29

4.3 Khảo sát khả năng tổng hợp protease của chủng Ba 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau 31

4.4 Khảo sát khả năng tổng hợp protease theo thời gian nuôi cấy 32

4.5 Khảo sát khả năng tổng hợp protease của 9 chủng Bacillus subtilis trên môi trường nuôi cấy bán rắn 34

4.6 Khảo sát và chọn thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 36

4.7 Khảo sát và chọn tỷ lệ thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn 37

4.8 Khảo sát và chọn thời gian nuôi cấy tối ưu 39

4.9 Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản 41

4.10 Khảo sát sự hiện diện các enzyme khác (ngoài protease) có trong canh trường sau khi nuôi cấy chủng Ba 01 42

4.11 Khảo sát các nguồn nitrogen có trong chế phẩm 43

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG

Hình 2.1 Hình dạng của Bacillus subtilis 4

Hình 2.2 Cơ chế thủy phân của enzyme protease 8

BẢNG Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 5

Bảng 3.1 Các chủng Bacillus subtilis dùng trong nghiên cứu 17

Bảng 3.2 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn tyrosine 20

Bảng 3.3 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease 20

Bảng 3.4 Các tỷ lệ cơ chất dùng để khảo sát 24

Bảng 4.1 Kết quả hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis 28

Bảng 4.2 Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi thay đổi các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy lỏng 30

Bảng 4.3 Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau trong môi trường nuôi cấy 31

Bảng 4.4 Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi theo thời gian nuôi cấy 32

Bảng 4.5 Hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis trong canh trường nuôi cấy bán rắn 34

Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme protease khi nuôi cấy chủng Ba 01 trên môi trường có các nguồn cơ chất khác nhau 36

Bảng 4.7 Hoạt độ enzyme protease khi thay đổi tỷ lệ cám bắp và bã đậu nành trong môi trường nuôi cấy 37

Bảng 4.8 Sự biến thiên hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy 39

Bảng 4.9 Sự thay đổi hoạt độ protease (UI/g) theo thời gian và nhiệt độ bảo quản 41

Bảng 4.10 Hoạt độ của một số loại enzyme khác có trong chế phẩm 42

Bảng 4.11 Hàm lượng các loại nitrogen trong chế phẩm enzyme 43

xii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ

BIỂU ĐỒ TRANG

Biểu đồ 4.1 Hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis khi nuôi cấy lỏng 29

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh tổng hợp protease của

chủng Ba 61 30

Biểu đồ 4.3 Hoạt độ protease khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau với pepton

trong môi trường nuôi cấy 32

Biểu đồ 4.4 So sánh hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis 35

Biểu đồ 4.5 Sự thay đổi hoạt độ protease khi nuôi cấy chủng Ba 01 trên môi trường có

các nguồn cơ chất khác nhau 37

ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Sự biến thiên hoạt độ protease của chủng Ba 61 theo thời gian nuôi cấy 34

Đồ thị 4.2 Hoạt độ protease ở các tỷ lệ bã đậu nành – cám bắp khác nhau 38

Đồ thị 4.3 Sự biến thiên hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy 40

Đồ thị 4.3 Sự thay đổi hoạt độ protease (UI/g) theo thời gian và nhiệt độ bảo quản 42

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

sinh, những sản phẩm có chứa enzyme protease vào thức ăn gia súc để hỗ trợ tiêu hóa cho vật nuôi đã mang lại kết quả rất thành công: trong phòng chống các bệnh về đường ruột, thúc đẩy sự tăng trọng ở gia súc và giảm chi phí về thức ăn

Ngày nay, protease đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp trên khắp thế giới và ứng dụng ngày càng rộng rãi Riêng ở Việt Nam với chăn nuôi là ngành nghề quan trọng trong nền kinh tế, việc sử dụng sản phẩm chứa enzyme này góp phần mang lại lợi nhuận kinh tế cho người chăn nuôi Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu ứng dụng protease trong lĩnh vực này chưa đầy đủ và vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu Đây là lĩnh vực mới mẻ nhưng có rất nhiều triển vọng ở nước ta

Enzyme protease có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, động vật hay vi sinh vật Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzyme nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này trong đời sống Trong đó, nguồn protease

từ vi sinh vật nhất là từ vi khuẩn Bacillus subtilis là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng vì Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease có hoạt tính cao và ưu thế hơn

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp

protease của các chủng Bacillus subtilis nhằm thu được chế phẩm enzyme protease có

hoạt tính cao

1.3 Yêu cầu

 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của một số chủng

Bacillus subtilis để chọn chủng có khả năng tổng hợp cao nhất ở điều

kiện nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn

 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện ảnh hưởng lên sự tổng hợp protease và thu nhận canh trường có hoạt tính cao, từ đó so sánh kết quả để tìm ra hướng nuôi cấy cho sản phẩm protease có hoạt tính cao

 Xác định một số chỉ tiêu và thành phần của sản phẩm thu được

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis (Âu Thị Bích Phượng, 2006; Bùi Thị Phi, 2007)

2.1.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu, Bacillus subtilis chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lỵ

cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 -

1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ

đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên

rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm

2.1.2 Phân loại Bacillus subtilis

Loài: Bacillus subtilis

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương (G+), dạng hình que, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, vi

khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử Bào tử Bacillus subilis có dạng elip đến hình

cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn được tạo thành ở 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút

ẩm

Hình 2.1 Hình dạng của Bacillus subtilis

(http://images.dailytech.com/nimage/4011_Bacillus%20subtilis.jpg)

Bacillus subtilis khi nhuộm sơ thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non Bacillus subtilis không có không bào khi nuôi cấy trên môi trường thạch có glucose,

chúng chủ yếu gồm các loài sống hiếu khí

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy

Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu thường ở 37 0C

Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển

trong môi trường thiếu oxy

Độ pH: Bacillus subtilis được nuôi cấy thích hợp nhất ở pH = 7,0 - 7,4

Khi cấy Bacillus subtilis sâu dưới mặt thạch gelatin thường hóa lỏng gelatin thành

Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn Bacillus subtilis lạc mọc

tốt, đều, mịn và mật độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành

Trong môi trường lỏng có NaCl, Bacillus subtilis phát triển ở nồng độ từ 10 -12 %

NaCl , một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có nồng độ 17 % NaCl

Khi nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng pepton

hóa một cách chậm chạp

Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc Bacillus subtilis mọc khá phong phú,

uốn nép hay gấp thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu

Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): Bacillus subtilis phát triển làm

đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều

Trong môi trường lỏng sinh khối của Bacillus subtilis tạo màng mỏng có lớp bao

phủ Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium)

Bacillus subtilis có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate Trong điều

kiện kỵ khí, Bacillus subtilis không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate

2.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose –

2.1.3.4 Đặc điểm về sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên

Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất của loài Bacillus mà chúng có thể tạo ra

những quần thể ở nhiều sinh cảnh khác nhau, từ môi trường đất, trên côn trùng và trên

cơ thể con người, chẳng hạn như Bacillus thuringiensis Mặc dù những loài Bacillus

được nghiên cứu nhiều nhất là những trực khuẩn gây bệnh nhưng hầu hết chúng đều là

những vi khuẩn hoại sinh Những loài khác như Bacillus subtilis ký sinh trên rễ, nằm

giữa rễ và vùng đất xung quanh

Người ta đã chứng minh được rằng các loài Bacillus có tập tính ăn thịt lẫn nhau,

chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp

có đời sống giới hạn Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh, sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả những vi khuẩn khác loài và cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót để chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng

Vi khuẩn Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong tự nhiên, thông thường đất trồng

trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu tế bào/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng

đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis

phân bố rộng rãi trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt

này Trong bột mì, Bacillus subtilis chiếm khoảng 75-79 % vi khuẩn tạo bào tử

nguyên vật liệu dùng để sản xuất như: bột mì, bột gạo, muối bột, tới các thực phẩm truyền thống như: mắm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao…

2.1.4 Tác hại của Bacillus subtilis

Do có bào tử chịu nhiệt, Bacillus subtilis có thể gây hỏng một số thực phẩm hộp,

làm đồ hộp có mùi thối chua rất khó chịu Chúng là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa, bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân, nhất là các sản phẩm nói trên được bảo quản ở nơi có khí hậu như Việt Nam Chúng gây bệnh chảy nhớt khoai tây và “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên vào năm 1885 nên từ đó chúng có tên là trực khuẩn khoai tây

Bacillus subtilis không sinh khí hoặc có thể sinh khí trong môi trường có đường

2.1.5 Ứng dụng của Bacillus subtilis

Nhiều loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được xác định là có khả năng chế ngự

mầm bào tử của nấm bệnh Hiện nay các nhà nghiên cứu đang tiến hành các thí nghiệm để nâng cao hiệu quả thực địa của những dòng vi khuẩn chọn lọc Đây là một trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp lysine khá cao từ tinh bột nên được ứng dụng để sản xuất lysine

Ở Nhật, người ta dùng Bacillus subtilis để nuôi cấy đậu nành tạo sản phẩm gọi là

Natto, một món ăn luôn có mặt trong bữa ăn truyền thống của người Nhật vì những công dụng chống mệt mỏi, tim mạch

Trong y tế, Bacillus subtilis được đóng thành ống 10 ml hoặc là gói dạng bột trị bệnh tiêu chảy cho người do Coliform gây ra hoặc dùng để đắp vết thương ngoài da

Bacillus subtilis là vi sinh vật sản xuất ra amylase, xúc tác cho phản ứng thủy phân

các liên kết α - 1,4 glucosid của các polysaccharid như tinh bột, glycogen

Bacillus subtilis còn được bổ sung vào thức ăn gia súc, dùng làm thành phần của

các chế phẩm sinh học chứa các enzyme tiêu hóa giúp cho tiêu hóa tốt các tinh bột và điều trị tiêu chảy

Người ta còn dùng Bacillus subtilis để sản xuất kháng sinh thực vật và ứng dụng trong nông nghiệp, sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây, làm tăng tổng hợp các

peptide kháng khuẩn của vi khuẩn nốt rễ, được ứng dụng trong kiểm soát sinh học

Người ta cũng nhận thấy rằng Bacillus subtilis giúp tăng năng suất mùa vụ mặc dù

chưa hiểu nguyên nhân là chúng ức chế mầm bệnh hay chúng giúp cây trồng phát triển

Bacillus subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình

sống như: amylase, protease, phytase…Do đó người ta còn dùng Bacillus subtilis để

sản xuất ra các loại enzyme này

2.2 Sơ lược về protease

Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học phát triển ngày càng mạnh

mẽ và mang lại kinh tế cao Một trong những lĩnh vực được quan tâm nhiều nhất của công nghệ sinh học là công nghệ sản xuất ra các chế phẩm enzyme trong đó có enzyme protease Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và các polypeptid

Enzyme protease đầu tiên được nghiên cứu không phải protease của vi sinh vật

mà là các protease của động vật (chủ yếu là protease trong hệ tiêu hóa của động vật) Năm 1836, Schwann đã quan sát khả năng của phân giải protein của dịch vị Sau

30 năm, Corvisart mới tách được enzyme này, đây được coi như protease ở dạng chế phẩm đầu tiên trên thế giới về enzyme

Các loại protease của thực vật được nghiên cứu chậm hơn protein động vật Đến năm 1874, Besaner mới công bố kết quả nghiên cứu protease từ đậu

giải protein Sau đó, hàng loạt những nghiên cứu của Wilstaller, Gnassmann, Ambnos (1926) đã được công bố về bromelin, protease ở động vật

của xạ khuẩn Đến những năm 1950, sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch protein, người ta đã thu nhận được những chế phẩm protease tinh khiết hơn Cũng từ đây, các nhà khoa học bắt đầu những nghiên cứu protease từ vi sinh vật Từ đó đến nay

đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này

2.2.2 Nguồn thu nhận protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Papain là loại enzyme của thực vật Papain đuợc khai thác từ quả đu đủ (Carica

papaya) Trong thành phần quả đu đủ, hai thành phần protease chiếm khối lượng lớn là

papain và chymopapain Papain có pH hoạt động tối ưu là 7,5 và nhiệt độ hoạt động là

50 – 60 0C

e Bromelin

Bromelin là một loại protease được khai thác từ cây dứa (Ananas cocosus) Chúng

có nhiều ở đọt dứa phần chồi trên quả Tính chất của bromelin gần giống papain nhưng khác là chúng kém bền hơn papain

f Ficin

Loại enzyme này được tìm thấy ở quả của cây sung (Ficus glomerata) Chúng có

tính chất giống papain về mọi phương diện

2.2.2.2 Từ vi sinh vật

Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều protease như: Bacillus subtilis,

Bacillus cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…

2.2.3 Phân loại protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006; Nguyễn Tiến Thắng, 2004) 2.2.3.1 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm

a Protease nội bào

b Protease ngoại bào

2.2.3.2 Dựa vào tính đặc hiệu với sự phân cắt liên kết peptide

a Endopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở giữa mạch

b Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch

2.2.3.3 Dựa vào pH hoạt động

2.2.3.5 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

a Protease có serin: trypsin, chymotrypsin, substilopeptidase, milk alkaline

c Protease có nhóm α –cacboxi: pepsin, renin…

d Protease có kim loại: carboxylpeptidase A, collagenase

2.2.4 Cơ chế tác dụng (Âu Thị Bích Phượng, 2006)

Trong trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật, ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác tham gia Ví dụ, histidine thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease có serine và protease có nhóm SH; tyrosine là trung tâm hoạt động của các protease có kim loại Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do

2.2.5 Protease của vi khuẩn (Âu Thị Bích Phượng, 2006)

2.2.5.1 Chức năng sinh học của protease vi khuẩn

Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật

a Protease ngoại bào

Tác dụng là phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ Đây là chức năng rõ ràng nhất của protease ngoại bào Quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình tổng hợp chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường có chứa một lượng lớn amino acid Tuy nhiên ảnh hưởng của các dạng đạm đến quá trình sinh tổng hợp protease đôi khi cũng phức tạp, không phải luôn phù hợp với những điều kiện đã nói trên

b Protease nội bào

Thường là peptidase và một số protease, các enzyme này có thể ở dạng tự do trong

tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào chất và chỉ tìm thấy

ở môi trường xung quanh sau khi tế bào bị phá vỡ Cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa được biết rõ hết vai trò của chúng trong tế bào

protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:

 Phân giải các peptid được đưa từ môi trường ngoài vào thành các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường Sự phân giải các peptid phân tử bé còn có vai trò quan trọng ở chỗ loại trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì một số peptid phân tử bé có thể là kháng nguyên gây kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật

 Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme,

điều này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào

tử vi sinh vật

Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptid đã được tổng hợp (Waller, 1963; Pine, 1969) Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân hủy các protein vô dụng, tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005)

2.2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi khuẩn

(Âu Thị Bích Phượng, 2006; Bùi Thị Phi, 2007)

chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường

a Ảnh hưởng của yếu tố môi trường

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt

độ thích hợp có khác nhau Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Ảnh hưởng của pH môi trường

Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Ngược lại, trong phương pháp bề sâu, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật

Điều này thể hiện khá rõ ở các loài thuộc giống Bacillus pH môi trường thường có thể

thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật pH ban đầu thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn là từ 6,2 đến 7,4

Trong quá trình nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường chuyển dần về phía acid hoặc kiềm

Đối với các loài thuộc giống Bacillus, có thể căn cứ vào pH của môi trường sau

khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease được tích lũy trong môi trường Do đó, nếu giữ

pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo một luợng protease xác định, chiếm ưu thế trong môi trường

Ảnh hưởng của độ thông khí

Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo giống vi sinh vật Trong một số trường hợp:

 Thiếu oxy, tuy có kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm

sự tổng hợp protease

 Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976)

b Ảnh hưởng thành phần môi trường

Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ thích hợp của các thành phần này và đặc biệt cần sử dụng chất cảm ứng

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: mono-, di- và cả polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn cacbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật Nguồn cacbon tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng

Ở vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi

nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8 % Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2 % thì sẽ làm giảm một ít hoạt độ quá trình phân giải protein của dịch môi trường nuôi cấy

Theo Ostrosko và cộng sự (1977), tinh bột, glucose, saccarose và maltose là nguồn

carbon có ảnh hưởng nhiều lên quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hũu cơ hoặc các muối vô cơ Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3

protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp

trình tổng hợp protease

Ảnh hưởng của khoáng

protease Nói chung, phosphor vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá tình tổng hợp protease Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó

Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng như: NaCl, vitamin… cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật Các muối chloride, nitrate, ammoni có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease

2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)

Do enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid nên nó được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp như:

2.2.6.1 Trong công nghiệp dệt

Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bông và tách rời các sợi tơ tằm, do đó, làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng

2.2.6.2 Trong công nghiệp thuộc da

Protease được sử dụng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da Ở Mỹ, chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong chế biến da Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số

thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996)

2.2.6.3 Trong chế biến các loại bột giặt

Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên

thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis Và đến gần đây, tất

cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được

sản xuất từ các chủng Bacillus (Rao và cộng sự, 1998), chủ yếu là từ Bacillus subtilis

Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng khoảng 89 % enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa

cung cấp cho toàn cầu hơn 95 % lượng enzyme protease (Gupta và cộng sự, 2002)

2.2.6.4 Trong kỹ nghệ phim ảnh

Rơnghen… Protease có tác dụng phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim

2.2.6.6 Ứng dụng khác

Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc tính bền vững,

hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc

(Fujiwara và cộng sự, 1991; Ishikawa và cộng sự, 1993), làm nước mắm cá (Rebeca và cộng sự, 1991), làm thức ăn gia súc (Cheng và cộng sự, 1995), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang và cộng sự, 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994)

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Nghiên cứu trong nước (Bùi Thị Phi, 2007)

Ở nước ta hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu protease đã được công bố Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Đỗ Văn Ninh (2004), tối ưu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thịt

cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân

Vũ Ngọc Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ

Bacillus subtilis S5

lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis

một số chủng Bacillus subtilis phân lập từ các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi

ở Việt Nam

Lê Văn Việt (2007), khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease,

phytase của một số chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm sản xuất chế phẩm probiotic

sữa của protease từ một số vi sinh vật

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

cứu sản xuất protease từ Bacllus subtilis bằng việc sử dụng cơ chất là đầu cá mòi

điểm của enzyme protease từ Bacillus subtilis

Scares Valeria, Castilho Leda, Bon Elba, Freire Denise (2004), sản xuất protease

từ Bacillus subtilis bằng nuôi cấy bán rắn

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Giống vi sinh vật

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis do

phòng thí nghiệm của Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tại Bình Dương cung cấp

Bảng 3.1 Các chủng Bacillus subtilis dùng trong nghiên cứu

3.1.3.2 Môi trường tăng sinh Bacillus subtilis (MT2)(Âu Thị Bích Phượng, 2006)

3.1.4 Dụng cụ và thíết bị

3.1.4.1 Dụng cụ

Ống nghiệm, becher, erlen, bình định mức, pipet, đĩa petri, micropipet, khay nhựa,

đèn cồn, que cấy, chén sấy, bình hút ẩm, đũa thủy tinh, giá ống nghiệm…

3.1.4.2 Thiết bị

Tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy vortex, lò vi song,

máy ly tâm, máy đo mật độ quang, bể điều nhiệt, máy đo pH, máy lắc, máy cất đạm

Parnas – Wargner…

3.2 Phương pháp thực hiện

3.2.1 Phương pháp Anson để xác định hoạt tính enzyme protease

(Lâm Thị Kim Châu và Nguyễn Như Nhứt, 2006)

3.2.1.1 Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản

phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng

tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thừ Folin

3.2.1.2 Hóa chất

Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa

đủ 250 ml

Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 100 ml

Dung dịch đệm Sorensen 1/15 M, pH 7,6: trộn chung 177 ml dung dịch Na2HPO4

1/15 M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15 M

Dung dịch casein 1 %: đun sôi cách thủy 1 g casein trong dung dịch đệm Sorensen

cho đến khi hòa tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100 ml

Dung dịch TCA 5 %: hòa tan 5 g TCA trong nước cho vừa đủ 100 ml

Dung dịch NaOH 0,5 N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:4)

Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml

Dung dịch tyrosine 20 mM/l: khuấy nghiền 1,8119 g tyrosine trong dung dịch HCl

0,2 N vừa đủ 500 ml

Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N: pha loãng 5 ml

dung dịch tyrosine 20 mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N thành 100 ml

3.2.1.3 Cách thực hiện

a Dựng đường chuẩn tyrosine

Bảng 3.2 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn tyrosine

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất

1 2 3 4 5 6

Lượng tyrosine tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm

Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC) Các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ

ODKC)

b Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu

Bảng 3.3 Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất

1 2

Lắc đều và giữ ở 35,5 0C trong 20 phút

Để yên 20 phút, lấy dịch lọc bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch, đánh dấu là ống TN và ống KC, cho vào ống nghiệm

A 5 ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và cho vào ống B 5 ml dịch lọc từ ống nghiệm 2

Thêm vào mỗi ống 10 ml NaOH 0,5 N và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10

phút, đo OD ở bước sóng 660 nm Tính ∆OD = ODTN - ODKC, dựa vào đồ thị chuẩn

suy ra được µM tyrosine

Hđ P= M tyrosine * V * L/t*m*v

c Cách tính

Định nghĩa đơn vị Anson: Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660 nm tương ứng với

1 µM tyrosine trong đường chuẩn

Trong đó:

3.2.2 Phương pháp trọng tài xác định độ ẩm

Nguyên tắc:

Nguyên liệu sau khi sấy ở 105 0C thì toàn bộ lượng nước tự do trong nguyên liệu

bị bốc hơi Từ đó xác định được độ ẩm của nguyên liệu

3.2.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Sử dụng môi trường MT1ở mục 3.1.3.1.Dùng que cấy vòng cấy giống vào môi trường thạch nghiêng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày Sau đó đem đi bảo quản lạnh 5 – 10 0C

Giống được cấy chuyền hàng tháng

3.2.4 Phương pháp tăng sinh

Dùng que cấy vòng cấy chuyền vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào môi

trường chứa 200 ml dịch tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và nuôi trên máy lắc

Sau 24 giờ kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường MT3ở mục 3.1.3.3

3.2.5 Phương pháp xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Môi trường nuôi cấy lỏng (MT5) được khử trùng và để nguội Cấy 1 ml (khoảng

106 TB/ml) dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trường nuôi cấy Đem lắc trong thời gian 24 giờ

3.2.7 Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy lỏng

Từ dịch nuôi cấy thu được đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme Tiếp theo, pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính protease

3.2.8 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất bằng nuôi cấy lỏng

Cấy 1 ml (khoảng 106 TB/ml) dịch tăng sinh (mục 3.2.4) vào môi trường lỏng sinh tổng hợp protease (MT5) Sau 24 giờ nuôi cấy, ly trích enzyme thô trong canh trường (mục 3.2.7) Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson Dựa vào kết quả chọn được chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao nhất

3.2.9 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease bằng phương pháp nuôi cấy lỏng (Wellingta và Meire, 2004)

3.2.9.1 Khảo sát ảnh hưởng các nguồn carbon

Tiến hành nuôi cấy lỏng chủng Bacillus subtilis đã được chọn (mục 3.2.8) nhưng

thay thế nguồn carbon (trisodium citrate) bằng các cơ chất khác như: tinh bột, casein, glucose, citric acid

Sau 24 giờ nuôi cấy, ly trích dịch enzyme (mục 3.2.7) Dựa vào phương pháp Anson xác định hoạt tính protease Từ đó chọn được nguồn carbon cho hoạt tính protease cao

3.2.9.2 Khảo sát ảnh hưởng khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau

Tiếp tục nuôi cấy lỏng như mục 3.2.6 với nguồn carbon được chọn ở trên và thay thế nguồn nitrogen NH4NO3 bằng các nguồn nitrogen khác là KNO3, (NH4)2SO4,

NH4Cl, cao men, cao thịt Dựa vào kết quả xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson, chọn được nguồn nitrogen cho hoạt tính protease cao

3.2.9.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuối cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng Bacillus subtilis đã được chọn (mục 3.2.8) với nguồn

carbon và nitrogen thích hợp (mục 3.2.9) ở những thời gian khác nhau: 24, 30, 36, 42,

48, 54, 60, 66, 72 và 78 giờ Dựa vào hoạt tính protease thu được xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng chọn lọc

3.2.10 Phương pháp nuôi cấy bán rắn sinh tổng hợp protease

Môi trường nuôi cấy bán rắn (MT4) được khử trùng và để nguội Cấy 1 ml (khoảng 106 TB/ml) dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trường nuôi cấy (75 g/erlen) Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 48 giờ

3.2.11 Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy bán rắn

Cân 1 g canh trường đã sấy khô hòa trong 100 ml nước cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính protease

3.2.12 Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất bằng nuôi cấy bán rắn

Cấy 1 ml (khoảng 106 TB/ml)dịch tăng sinh ở mục 3.2.4 vào môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) Sau 48 giờ nuôi cấy, ly trích enzyme thô trong canh trường (mục 3.2.11) Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson Dựa vào kết quả chọn được chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao nhất

3.2.13 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease bằng phương nuôi cấy bán rắn

3.2.13.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cơ chất

Tiến hành nuôi cấy bán rắn chủng Bacillus subtilis đã được chọn (mục 3.2.12)

nhưng bã đậu nành được thay đổi bằng các cơ chất lần lượt là: bột cá, cám gạo, bột trùn

Sau thời gian nuôi cấy 48 giờ, tiến hành ly trích dịch enzyme thô (mục 3.2.11) và xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson Dựa vào kết quả chọn được

nguồn cơ chất thích hợp cho chủng Bacillus subtilis chọn lọc sinh tổng hợp protease

cao nhất

3.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng khi thay đổi tỷ lệ cơ chất

Tiến hành nuôi cấy chủng được chọn (mục 3.2.12) với cơ chất chọn lọc (mục 3.2.13.1) ở những tỷ lệ khác nhau như bảng 3.2

3.2.13.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy chủng được chọn (mục 3.2.12) trên MT4 với tỷ lệ cơ chất thích hợp (mục 3.2.13.2) Xác định hoạt tính protease có trong canh trường sau những thời gian nuôi cấy 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78 và 84 giờ

Dựa vào kết quả chọn được thời gian thích hợp cho quá trình nuôi cấy

3.2.14 Phương pháp khảo sát các enzyme khác trong chế phẩm thu được

(Lâm Thị Kim Châu và Nguyễn Như Nhứt, 2006)

3.2.14.1 Phương pháp Heinkel để xác định hoạt tính enzyme alpha- amylase

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường

độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme α - amylase:

Một đơn vị hoạt độ của enzyme amylase là lượng enzyme có khả năng phân giải 1

mg tinh bột sau 30 phút ở 30 0C

3.2.14.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller

Ở đây ta xác định hoạt tính cellulase bằng cách xác định hoạt tính của enzyme Cx

thông qua việc xác định lượng đường khử theo phương pháp Miler

Cho enzyme tác dụng với cơ chất thích hợp trong điều kiện nhất định và xác định lượng đường khử tạo thành

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme cellulase:

Một đơn vị hoạt độ enzyme cellulase tương ứng với 1 mg glucose được tạo thành trong 1 giờ ở 40 0C

3.2.14.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller

Sử dụng xylan làm cơ chất, hệ enzyme xylanase tác động lên xylan, phóng thích các phân tử xylose, định lượng xylose tạo thành theo Miller, dựa vào hàm lượng xylose xác định được hoạt tính enzyme xylanase

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme xylanase:

Một đơn vị hoạt độ của enzyme xylanase tương ứng với 1 µg xylose trong thời gian thủy phân cớ chất xylan trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng

3.2.14.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo Fiske và Subbarow

Nguyên tắc:

Khi cho phytase tác dụng với cơ chất phytate sẽ giải phóng ra phosphate Dựa vào hàm lượng phosphate sinh ra này để đánh gia hoạt tính của enzyme phytase

Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat

có màu vàng Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh molybdat Độ đậm của màu sắc tỷ lệ với hàm lượng phospho trong mẫu

Phản ứng được minh họa như sau:

2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 (Mo2.4MoO3)2.H3PO4.4H2O

Các chất khử thường sử dụng là SnCl2, hydrazin, ascorbic acid, FeSO4, quinon, oxalat, sulfit Các chất khử có thể sử dụng đơn độc hay phối hợp với nhau

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme phytase:

Một đơn vị hoạt độ enzyme phytase là lượng enzyme giải phóng 1 nmol phospho

vô cơ trong 1 phút từ sodium phytase ờ 39 0C, pH 5

3.2.14.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase thông qua xác định hàm lượng đường khử theo Miller

Cho enzyme tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là galacturonic acid được hiện màu với thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid) và đem đo mật độ quang

ở bước sóng 575 nm

Định nghĩa hoạt độ enzyme pectinase:

Một đơn vị hoạt độ enzyme pectinase được định nghĩa là lượng enzyme giải phóng

1 µmol D – galacturonic trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (40 0C, pH 4,2)

3.2.15 Phương pháp xác định các loại nitrogen trong chế phẩm thu được

(Lâm Thị Kim Châu và cộng sự, 2004)

3.2.15.1 Phương pháp Kjeldahl xác định nitrogen tổng số (NTS)

2NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2O

3.2.15.2 Phương pháp Sorensen xác định nitrogen formol (NF)

Phương pháp này cho phép ta xác định N có trong amino acid, peptid Trong phân

tử amino acid hay những peptid có 1 đầu nhóm chức – COOH và đầu kia có nhóm chức – NH2, formol sẽ tác dụng lên nhóm –NH2 để tạo thành phức chất metilen (mono, tri hoặc hexametilen)

HOOC – CH – NH2 + HCHO HOOC – CH – N = CH2 + H2O

R R

R – NH4+Cl + HCHO R - N = CH2 + H2O + HCl

tính acid, nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác dịnh một cách gián tiếp được lượng – NH2

3.2.15.3 Phương pháp xác định nitrogen NH3 (NNH3)

Trong nguyên liệu chứa nitrogen thường có một loại nitrogen nằm dưới dạng “vô cơ” (muối ammonium hay những amin dễ bay hơi) Đây là dạng nitrogen tạo thành do

sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của amino acid),

vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại nitrogen này không cần cho cơ thể, nếu có sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất”

Những loại nitrogen này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng mangane (MgO) thì những loại đạm kể trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid Sau đó đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại nitrogen này:

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

4.1 Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của 9 chủng Bacillus subtilis

trên môi trường nuôi cấy lỏng

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 9 chủng Bacillus subtilis trên môi trường MT5 (mục

3.1.3.5) để khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease Cấy 1ml dịch tăng sinh

của các chủng vào môi trường nuôi cấy lỏng nói trên Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành

thu dịch chiết và xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson Kết quả được

trình bày trong bảng 4.1 và biểu đồ 4.1

Bảng 4.1 Kết quả hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis

Chủng Hoạt độ protease (UI/ml) Sai số