khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng bacillus

Tuy nhiên, protein sẽ bị biến tính làm cho enzyme mất hoạt tính do tác động của các tác nhân như: nhiệt độ cao, MT acid hay kiềm quá cao, các muối kim loại nặng [2], [3].. Giai đoạn này

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012

_

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

Chuyên ngành : Vi sinh vật

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS TRẦN THANH THỦY

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CẢM ƠN

 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người đã

tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến hành đề tài

 Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học

Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi

 Tôi xin cảm ơn em Nguyễn Thị Quỳnh Thương, em Lê Thị Thùy, bạn

Mỹ Nhung, Bích Phương, Tố Nga, Thoại Anh, Thùy Trang đã giúp đỡ và động

viên tôi

 Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Tác giả luận văn

Đỗ Thị Thu Nga

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về enzyme 3

1.1.1 Khái niệm về enzyme 3

1.1.2 Cấu trúc phân tử enzyme 4

1.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme 4

1.2 Protein và enzyme protease 5

1.2.1 Protein 5

1.2.1 1 Khái niệm 5

1.2.1.2 Cấu trúc của protein 5

1.2.1.3 Sự biến tính của protein 6

1.2.2 Protease 7

1.2.2.1 Khái niệm 7

1.2.2.2 Phân loại 7

1.2.2.3 Cơ chế tác dụng của protease 10

1.2.2.4 Nguồn thu protease 10

1.2.2.5 Ứng dụng của protease 13

1.3 Vi khuẩn Bacillus 16

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus 16

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus 18

1.3 2.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng 18

1.3 2.2 Ảnh hưởng của yếu tố MT lên khả năng sinh tổng hợp protease 21

1.3.2.3 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy 22

1.3.3 Thu nhận và tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy 24

1.3.3.1 Thu dịch enzyme 24

1.3.3 2 Thu chế phẩm kỹ thuật 25

1.3.3.3 Thu chế phẩm enzyme tinh khiết 25

1.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme protease của Bacillus ở trong và ngoài nước 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Đối tượng 29

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 29

2.1.3 Hóa chất 29

2.2 Môi trường nghiên cứu 29

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp phân lập 30

2.3.2 Phương pháp cấy truyền giữ giống 31

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 31

2.3.3.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 31

2.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 32

2.3.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử 32

2.3.3.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase 33

2.3.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 33

2.3.5 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp mật độ quang 34

2.3.6 Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) 35

2.3.7 Thu dịch enzyme thô 35

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính thủy phân 36

2.3.9 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 37

2.3.10 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 39

2.3.11 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng VK 40

2.3.11.1 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy 40

2.3.11.2 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng 41

2.3.11.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 41

2.3.11.4 Ảnh hưởng của pH môi trường 41

2.3.11.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 41

2.3.11.6 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 41

2.3.11.7 Ng hiên cứu động học của quá trình lên men 42

2.3.12 Tách và thu nhận chế phẩm protease [20], [28] 42

2.3.13 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease 43

2.3.13.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ CPE protease 43

2.3.13.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ CPE protease 43

2.3.14 Phương pháp xác định đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 43

2.3.15 Phương pháp xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen 44

2.3.16 Phương pháp khảo sát sự thủy phân của các cơ chất protein khác nhau bởi CPE protease 46

2.3.17 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 46

2.3.18 Phương pháp xử lí số liệu 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 48

3.2 Xác định hoạt độ protease của một số chủng VK đã chọn 50

3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng CT3 và CT7 51

3.3.1 Đặc điểm hình thái 51

3.3.2 Xác định khả năng sinh enzyme catalase 53

3.3.3 Sơ bộ định danh 53

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp

protease của hai chủng Bacillus 53

3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 54

3.4.2 Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng 55

3.4.2.1 Xác định hàm lượng nitơ tổng số của các chất cảm ứng 55

3.4.2.2 Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng 55

3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 57

3.4.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu 58

3.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 60

3.4.6 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 62

3.4.7 Động học quá trình lên men 63

3.5 Định danh chủng CT3 đến loài bằng sinh học phân tử 67

3.6 Thu nhận CPE protease thô từ dịch nuôi cấy 68

3.6.1 Tách CPE protease từ dịch nuôi cấy bằng tác nhân tủa khác nhau 68

3.6.2 Hoạt độ protease thu nhận bởi các tác nhân tủa của CPE 69

3.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease thô 70

3.7.1 Ảnh hưởng của pH 70

3.7.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 71

3.8 Khảo sát sự thủy phân của các cơ chất protein khác nhau bởi chế phẩm protease 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CPE Chế phẩm enzyme

CPE B Chế phẩm enzyme của chủng B amyloliquefaciens CT3

DNS Acid 3,5 - dinitrosalicylic

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc chung của acid amin 5

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme protease 8

Hình 3.1 Vòng phân giải casein của 9 chủng VK có hoạt tính protease cao nhất 49

Hình 3.2 Hình thái KL của chủng CT3 và chủng CT7 52

Hình 3.3 Hình thái tế bào của chủng CT3 và chủng CT7 52

Hình 3.4 Bào tử của chủng CT3 và chủng CT7 52

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm và nguồn gốc thu nhận các nhóm protease 12

Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải casein của các chủng VK phân lập 48

Bảng 3.2 Hoạt độ protease của các chủng VK 50

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của hai chủng CT3 và CT7 51

Bảng 3.4 Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CT3 và chủng CT7 53

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 54

Bảng 3.6 Hàm lượng nitơ tổng số của các nguyên liệu 55

Bảng 3.7 Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 56

Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 57

Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 59

Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 61

Bảng 3.11 Ảnh hưởng chế độ lắc đến hoạt độ protease 62

của 2 chủng Bacillus 62

Bảng 3.12 Động học quá trình lên men của 2 chủng Bacillus 64

Bảng 3.13 Hiệu suất thu hồi CPE B bởi các tác nhân tủa khác nhau 68

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE B 69

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B 70

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B 72

Bảng 3.17 Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ chất khác nhau 74

Bảng 3.18 Hiệu suất thủy phân của CPE B theo thời gian trên các cơ chất khác nhau 76

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Biểu đồ 3.1 Hoạt độ protease của một số chủng VK 50

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 54

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 56

Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 58

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 59

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 61

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 63

Đồ thị 3.5 Động học quá trình lên men của chủng CT3 65

Đồ thị 3.6 Động học quá trình lên men của chủng CT7 65

Biểu đồ 3.4 Hiệu suất thu hồi của CPE B bởi các tác nhân tủa khác nhau 68

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B 71

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B 72

Đồ thị 3.9 Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ chất khác nhau 75

Đồ thị 3.10 Hiệu suất thủy phân của CPE B theo thời gian trên các cơ chất khác nhau 77

Protease phân bố ở thực vật, động vật, VSV Tuy nhiên nguồn protease ở VSV phong phú nhất, có ở hầu hết các VSV như VK, nấm sợi và xạ khuẩn Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm được sản xuất bởi các VK

thuộc chi Bacillus (Mabrouk et al., 1999; Mehrota et al., 1999) nhưng tiềm năng hơn cả là các chủng B licheniformis, B subtilis, B amyloliquefaciens, và B

majovensis (R.Gupta et al., 2002) Trong số tất cả các protease, protease kiềm được

sản xuất bởi các loài thuộc chi Bacillus có tầm quan trọng lớn trong ngành công

nghiệp chất tẩy rửa do bền nhiệt, bền pH (Johnvesly và Naik, 2001) Các loài thuộc

chi Bacillus rất phổ biến trong không khí, trong mùn thực vật, đặc biệt là trong đất Chúng có nội bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất diệt khuẩn, chất hút

ẩm (E M El – Safey, U M Abdul-Raouf, 2004) Các loài này có khả năng thích nghi cao, có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết trong quá trình sống để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT (E.El Mayday, 1989) như: amylase, hemicellulase, glucanase, xylanase, protease,…

Ở Việt Nam ngành công nghiệp enzyme vẫn chưa thực sự phát triển, hàng năm nước ta phải nhập một lượng lớn các enzyme để ứng dụng trong công, nông nghiệp và giải quyết ô nhiễm MT Cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu và sử dụng prorease tập trung trên các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiêncứu một số đặc tính của enzyme, tuy nhiên vẫn còn hạn chế do giá thành chế phẩm enzyme còn cao

Cần tiếp tục nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra giải pháp ứng dụng phù hợp điều kiện sản xuất thực tế ở Việt Nam

Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát

khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus.”

 Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp

protease cao

 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng Bacillus phân lập từ các mẫu đất vườn khác

nhau ở phường Hiệp Bình Chánh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

 Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh protease có hoạt độ cao

từ các mẫu đất vườn

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng

đã chọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT đến hoạt độ protease của các

chủng Chọn 1 chủng có hoạt độ protease cao để phân loại tới loài và thu nhận CPE protease bán tinh khiết

- Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố lý hóa lên hoạt tính của CPE protease

- Bước đầu thử nghiệm tác dụng của CPE protease trong việc thủy phân các

cơ chất protein khác nhau: casein, bột cá và bột đậu nành

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về enzyme

1.1.1 Khái ni ệm về enzyme

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp Chúng có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học Chúng không những có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng

vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học [1], [2],[3]

Enzyme là những phân tử protein có khối lượng phân tử lớn Đa số enzyme

có khối lượng phân tử trung bình từ 6000 – 1000000 dalton do vậy enzyme không

đi qua được màng bán thấm [1], [6]

Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung dịch đệm tạo thành dung dịch keo, nhưng enzyme không hòa tan trong các dung môi không phân cực [6] Enzyme bị kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein như muối trung tính, dung môi hữu cơ nên các chất này được dùng thu chế phẩm enzyme Tuy nhiên, protein sẽ bị biến tính làm cho enzyme mất hoạt tính do tác động của các tác nhân như: nhiệt độ cao, MT acid hay kiềm quá cao, các muối kim loại nặng [2], [3]

Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 lớp chính dựa vào kiểu phản ứng do enzyme xúc tác [6]

1) Oxydoreductase: Xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử

2) Transferase: Xúc tác cho phản ứng chuyển vị

3) Hydrolase: Xúc tác cho phản ứng thủy phân

4) Lyase: Xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết không cần H2O hoặc loại

H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi

5) Isomerase: Xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

6) Ligase: Xúc tác cho phản ứng kết hợp 2 phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphotphase khác

1.1.2 Cấu trúc phân tử enzyme

Enzyme là những protein được cấu tạo bởi các L- α amino acid kết hợp với nhau qua liên kết peptid (- CO – NH-)

Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme một thành phần, hoặc là protein phức tạp, gọi là enzyme hai thành phần hay holoenzyme

Enzyme một thành phần thì chỉ được cấu tạo bởi một thành phần hóa học duy nhất là protein, những enzyme này thường xúc tác cho phản ứng thủy phân

Enzyme hai thành phần gồm có:

- Phần protein gọi là apoprotein hay apoenzyme

- Phần phi protein gọi là cofactor (yếu tố phối hợp) có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Các cofactor có thể là các ion kim loại (Cu2+, Zn2+, Fe2+…) [6]

Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme

kết hợp với cơ chất biến đổi cơ chất thành sản phẩm phản ứng Có những enzyme

có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt động [3] Mỗi trung tâm hoạt động thường gồm 2 vùng:

- Vùng gắn với cơ chất: còn gọi là trung tâm tiếp xúc hay trung tâm cơ chất,

là vùng liên quan tới tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất

- Vùng xúc tác: có nhiệm vụ tạo ra khả năng cần thiết nhằm biến đổi chuyển hóa cơ chất đã được gắn vào enzyme, tạo điều kiện chuyển thành sản phẩm dễ dàng

hơn Vùng xúc tác liên quan tới kiểu phản ứng

1.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung Phương trình phản ứng enzyme như sau:

E + S  ES  P + E Trong đó, E: enzyme

S: Cơ chất ES: phức hợp cơ chất P: sản phẩm

Enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme – cơ

chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp

Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá Giai đoạn này xảy ra sự

biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn III: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và tách

khỏi enzyme Enzyme được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu [2]

1.2 Protein và enzyme protease

1.2.1 Protein

1.2.1.1 Khái ni ệm

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các

bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein [90], [30]

1.2.1.2 Cấu trúc của protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân

là các acid amin Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin

(-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất

của acid amin [10]

Hình 1.1 C ấu trúc chung của acid amin

 Có 4 bậc cấu trúc của protein

 Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình

thành nên chuỗi polypeptide Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin

thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng Cấu trúc bậc một

của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide

Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ

đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến

sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein

 Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong

không gian Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hydro giữa những acid amin ở gần nhau

 Cấu trúc bậc ba: các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau

thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm –R trong các mạch polypeptide

Chẳng hạn nhóm –R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S), nhóm – R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp hay

những nhóm – R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay điện hóa

trị có ở giữa các nhóm –R có điện tích trái dấu

 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với

nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro [31]

1.2.1.3 Sự biến tính của protein [31]

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy

cơ học hay tác nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, các cấu

trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc

một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu Đó

là hiện tượng biến tính protein Sau khi bị biến tính, protein thường có các tính chất sau:

- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein

- Khả năng giữ nước giảm

- Mất hoạt tính sinh học ban đầu

- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

- Tăng độ nhớt nội tại

1.2.2.2 Phân loại

 Dựa vào cơ chế xúc tác

Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm:

 Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầu mạch Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase

 Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptidase [39], [2], [3]

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme protease

 Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [16], [53]

Dựa vào cấu trúc nhóm chức ở trung tâm hoạt động, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

 Serin – proteinase (EC 3.4.21): là những protease có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng

 Cystein – proteinase (EC 3.4.22): là các protein có nhóm thiol (-SH) của acid amin cystein ở trung tâm hoạt động Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng Các cyteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

 Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

 Metallo protease (EC 3.4.23): metallo protease là nhóm protease trong

cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở VK, nấm sợi cũng như các VSV bậc cao hơn

Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt động giảm

mạnh dưới tác động của EDTA

 Dựa vào pH hoạt động [3]

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease được chia làm 3 loại:

 Protease acid: pHopt trong khoảng 2 ÷ 5 Loại protease này thường được

thu nhận từ các loại NS đen như: A niger, A awmori, A saitoi

 Protease trung tính: có pHopt trong khoảng hẹp, từ 6 ÷ 7,5, không bền với

nhiệt độ cao Thu nhận chủ yếu từ các loại NS vàng như: A oryzae, A flavus, A

fumigatus, A tericola

 Protease kiềm tính: có pHopt trong khoảng 8 ÷ 11 thường được tổng hợp nhiều bởi nấm men và VK Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử lý chất thải MT

 Dựa vào tính đặc hiệu của chúng với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β- insulin bị oxy hóa [3]

Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốn nhóm

lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β

– Insulin đã bị oxy hóa

 Nhóm I - Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về phía nhóm –CO2 của liên kết peptide, do đó còn được gọi là carbonxyendopeptidase

 Nhóm II - Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặc điểm có cấu tạo của trung tâm hoạt động

 Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía nhóm –NH - của liên kết peptide, do đó còn được gọi là aminoendopeptidase

 Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồn gốc

amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide

1.2.2.3 Cơ chế tác dụng của protease

Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease VSV có khác nhau nhưng chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung

như sau:

E + S → ES → ES’ + P1 → E + P2

Trong đó:

E: enzyme S: cơ chất ES: phức chất enzyme – cơ chất

ES’: phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa (Acyl enzyme)

P1: sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới được tạo thành)

P2: sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành) [16]

1.2.2.4 Nguồn thu protease

Enzyme có trong mọi tế bào sinh vật Sau khi tổng hợp enzyme có thể được tiết ra ngoài tế bào, tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch MT gọi là enzyme ngoại bào Các enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hoà tan trong tế bào chất hoặc trong các thành phần cấu tạo của tế bào chất, và chỉ có thể nhận được enzyme khi phá vỡ tế bào Đa phần enzyme thuỷ phân là enzyme ngoại bào Trong những tế bào của các

cơ quan khác nhau hay các bộ phận dưới tế bào khác nhau thì các enzyme có hàm lượng và thể loại khác nhau Do đó enzyme mang tính đặc trưng [83] Protease có thể được thu từ các nguồn sau:

Ở động vật, protease thường có ở tuyến tiêu hóa: tuyến tụy, niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non [81], [12] Ví dụ: pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa và dịch vị Rennin chỉ có ở ngăn thứ tư của dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, có khả năng làm đông tụ sữa, được sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat Catalase có trong gan bò được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm [12]

Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong quả [71] Ví dụ: papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ, bromelain thu từ quả,

chồi dứa, vỏ dứa [38] Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả [81], [12]

Ở VSV, nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease như VK, xạ khuẩn,

NS Protease có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào MT nuôi cấy [7], [10]

Các VK thông thường dùng trong tổng hợp protease là B subtilis, B cereus,

B brevis, B licheniformis…sinh các protease trung tính B thermophilus tổng hợp

protease chịu nhiệt Xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S griseus, S

rimosus…NS tổng hợp protease gồm có A oryzae, A awamori, A niger, một số loài Penicilium và Rhizopus [17], [22]

Trong ba nguồn sinh vật dùng để khai thác và thu nhận enzyme, nguồn VSV được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì có các ưu điểm sau:

- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzyme từ VSV vì quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzyme của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào điều kiện ngoài

- Chu kì sinh trưởng và phát triển của VSV ngắn do đó việc sản xuất enzyme

từ VSV trong thời gian ngắn từ 36h – 60h

- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzyme từ VSV theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn

- Giá thành của enzyme sản xuất từ VSV thấp MT nuôi cấy VSV thường đơn giản và rẻ tiền

- Các enzyme thu được từ VSV có hoạt tính rất cao

- VSV có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau

Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm và nguồn gốc thu nhận các nhóm protease

Loại protease Carboxyl protease

(Aspartic)

Thiol protease (Cystein)

Protease kim loại

Serine protease

Trọng lượng

Ion kim loại

p-Các tác nhân bắt giữ như EDTA, EGTA

PMSF, DIFP EDTA, chất ức chế trysin đậu nành, indole, phenol, aid triamino acetic

Nguồn thu

nhận chính

Aspergillus, Mucor, Endothia, Rhizopus, Penicilium, Neurospora, dạ dày động vật

Bacillus, Arpergillus, Penicilium, Pseudomonas, Streptomyces

Bacillus, Arpergillus,

ruột động vật

1.2.2.5 Ứng dụng của protease

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [1], [3], [12]

phẩm protease dùng trong sản xuất phomat Một số nước cũng thu được chế phẩm

tương tự từ nấm mốc A candidus, hoặc từ B mensentericus

 Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn bột, giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

 Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân

từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, … [25]

 Trong chế biến thuỷ sản, từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tác dụng của các enzyme tiêu hóa và các enzyme khác có sẵn trong nguyên liệu có tác động tới quá trình thủy phân cá trong sản xuất nước mắm Để tăng hiệu quả quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, làm giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease và cá bằng cách xay nhỏ cá Thêm vào đó, người ta còn bổ sung thêm protease từ bên ngoài vào để làm tăng tốc độ, hiệu quả thủy phân protein cá [61], [1] Còn trong sản xuất bột cá nếu

sử dụng protease sẽ dễ dàng tách da thịt ra khỏi xương, bột cá mịn hơn, hiệu quả kinh tế cao hơn [1]

 Bên cạnh đó, trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng để làm trong bia và nước hoa quả Ngoài ra, protease được sử dụng trong sản xuất rượu, giúp phân giải các protein có tác dụng làm kìm hãm amylase, do đó sẽ làm tăng nhanh quá trình đường hóa tinh bột [39]

 C ông nghiệp nhẹ

 Protease được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, nước lau kính, kem đánh răng và đặc biệt là trong sản xuất bột giặt, nhằm làm tăng khả năng tẩy rửa các vết bẩn có bản chất protein Một số protease kiềm thương mại được sử dụng chất tẩy bột giặt như Alcalase, Everlase, Esperrase do hãng Novo sản xuất [1], [12], [90]

 Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy

phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da [28] Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật

Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B mesentericus, B subtilis), NS (A

oryzae, A flavus ) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp

thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng Một số sản phẩm protease dùng trong công nghệ thuộc da do công ty Novo sản xuất như Greasex, NovoCor, …[39]

 Trong công nghiêp dệt và sản xuất tơ tằm, protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được xử lí bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được được bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp xerisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do

đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

 Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong sản xuất mĩ phẩm và hương phẩm Các hương phẩm thường có tác dụng phục hồi da lão hóa và trong chừng mực nhất định cũng có tác dụng sát trùng Còn các enzyme kiểu keratinase có tác dụng làm mềm lông, tóc Vì vậy, hiện nay một số nước đã sản xuất những loại kem

có chứa enzyme để xoa mặt, xoa da và cạo râu…Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da chết sẽ được tách ra, da non mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, đồng thời sự phát triển của lông (tóc) cũng được làm chậm lại

 N ông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn [39] Có hai cách sử dụng trộn enzyme vào thức ăn trước khi dùng hoặc xử lý thức

ăn với enzyme để chuyển thành dạng dễ tiêu hóa rồi mới cho vật nuôi ăn [12]

Kết hợp sử dụng protease với amylase, cellulase để xử lý các phế liệu nông nghiệp, cải tạo đất phục vụ nông nghiệp

Ngoài ra, protease còn được sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch acid amin làm thức ăn cho ấu trùng tôm [29]

Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực như xử lý phim X- quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc (Fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al.,

1993), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang et al., 2000), xử lý rác thải trong

các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994)…

1.3 Vi khuẩn Bacillus

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus

VK Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio

subtilis ” Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B subtilis (Gordon, 1981) Bacillus là chi lớn và đa dạng thuộc họ Bacillaceae Họ này chia làm 5 chi gồm: Bacillus,

Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của

họ này là hình thành nội bào tử [51]

Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm Thường di động, roi điển hình nằm ở hai thân tế bào Bào tử có khả năng chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào Sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi tiếp xúc không khí Tùy theo loài, bào tử có thế nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không phồng [51], [89] Nhờ khả năng sinh bào tử nên VK

Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau Chúng

rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [33]

Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ

các tế bào trẻ mới chắc chắn là Gram dương Weigel năm 1981 đã cho thấy rằng dưới KHV cấu trúc của vách tế bào, “kiểu Gram”, không hoàn toàn giống như phản ứng nhuộm Gram Tức là, vách tế bào của một sinh vật nhuộm ra Gram âm, có thể

có cấu trúc Gram dương thực sự, một vách tế bào có cấu trúc Gram âm sẽ luôn luôn nhuộm ra Gram âm Tuy nhiên, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương có thể nhuộm ra Gram âm hoặc Gram dương dưới một số điều kiện nhất định

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ Một số VK tự dưỡng không bắt buộc (B

schlegelli) có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO2 Một số loài Baciillus (B

subtilis) có kh ả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác như B

sphaericus, B cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, acid amin) cho sự sinh

dưỡng Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng B thuringiensis, B popllae, B

lentimorbus, B creus, B anthracis (trong đó B creus, B anthracis gây bệnh trên

người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường

VK thông thường như NA, NB [42]

Phần lớn chúng là VK ưa nhiệt trung bình, với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ

30 – 450C, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 650

glucanase, lipase, serine protease, urease Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic

acid, dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin, subtilin có hoạt tính kháng khuẩn B thuringensis được ứng dụng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus sp được dùng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, B subtilis dùng làm chế phẩm phòng và chữa trị viêm tai mũi họng ở người [43], Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzyme, acid amin, vitamin và polysaccharide Các chủng B brevis có khả

năng tiết nhiều protein nhưng không có khả năng tiết protease vào MT nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1-β của bò, hormon tăng trưởng của cá bơn, antigen virus viêm gan B, CGTase, [43]

Các loài thuộc chi Bacillus rất phổ biến trong không khí, trong mùn thực vật,

đặc biệt là trong đất,… Sau đây là một số loài thường gặp và có khả năng sinh tổng

hợp protease cao

B subtilis - KL khô, vô màu hay có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám vào MT thạch Trực

khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi Bào tử hình bầu dục, phân bố lệch tâm, nhưng không chính tâm

B amyloliquenfacien có hình thái KL và t ế bào tương tự B.subtilis Nhưng

khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm, thành phần G + C của B.subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còn

trong chủng B amyloliquenficien là 43,5 – 44,9% Chúng phân bố phổ biến trong

đất, nước có khả năng sinh tổng hợp amylase và protease cao

B licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình ovan phát tán chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc KL nhỏ, màu trắng đục,

bề mặt nhăn nheo.Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt

buộc

B pumilus phát tán r ộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B

subtilis KL nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới Tế bào của nó gần giống tế

bào B subtilis

B megaterium – KL hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn

hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên

mặt Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi Bào tử hình elip, nằm lệch tâm

B polymyxa – KL không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn, bào tử hình

bầu dục

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus

1.3.2.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Số loại và tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng của MT có ý nghĩa quyết định

đến khả năng sinh tổng hợp protease ở VSV nói chung, VK Bacillus nói riêng Để

tăng lượng protease trong MT cần lựa chọn nguồn carbon, nguồn nitrogen, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ thích hợp các thành phần này và đặc biệt là nguồn cơ

chất cảm ứng

 N guồn dinh dưỡng carbon

Nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy VSV là các glucid: mono-, di- và polysaccharide (tinh bột) Tác dụng của nguồn carbon này tuỳ thuộc bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của VSV Nồng độ glucid thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi tuỳ loài VSV Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong nuôi cấy là bột mì, bột gạo, các loại cám hoặc nước chiết của những nguyên liệu này[15]

Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng VK sinh tổng hợp enzyme

protease Ví dụ: VK B subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở MT tinh bột >

8%

Theo Ostroko và cộng sự (1977), glucose, saccharose, maltose, fructose và

sorbitol là nguồn carbon tốt nhất cho sự tổng hợp protease ở VK B subtilis [15]

 N guồn dinh dưỡng nitơ

Nguồn nitơ trong MT nuôi cấy VSV có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat) Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tuỳ thuộc vào khả năng thu nhận nitơ

từ nguồn là NH3

Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease, vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tương Trong số này, peptone ở nồng độ thấp thường là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lượng protease được tổng hợp nhất là khi casein ở nồng độ cao

Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho VK thường là (NH4)2SO4, các muối clorua, sulphate, nitrate amon thường có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease

Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease [12]

 Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng

Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy VSV vì chúng làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất Trong đó, phospho và lưu huỳnh có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease Các photphase

vô cơ có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, KH2PO4thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp do tính chất đệm của nó Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình sinh tổng hợp protease, nó có vai trò điều hòa quá trình tổng hợp protease của VSV [16]

Trong tế bào VSV người ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khoáng như:

magiê, natri, sắt, Các VSV có thể lấy các chất khoáng này từ MT hay được bổ sung vào MT nuôi cấy một số dạng muối khoáng hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha

MT [28]

 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease

Trong số các enzyme do VSV tổng hợp, một số enzyme trong điều kiện thường được tổng hợp với một lượng rất ít, nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào MT nuôi cấy Monob và Cohn (1952) gọi các enzyme này là enzyme cảm ứng Chất gây nên hiệu quả này là chất cảm ứng

Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tương tự như

cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất [42]

Khả năng sinh tổng hợp protease thường được cảm ứng bởi các chất giàu đạm như bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừng hoặc lông vũ Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện không giống nhau Do đó, trong MT nuôi cấy VSV ta có thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lượng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và khoa học [7]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố MT lên khả năng sinh tổng hợp protease

Đa số các VSV tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

 pH môi trường

Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH của MT thường ít làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở VSV vì MT bán rắn có tính đệm cao và hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của VSV Đối với nấm sợi, pHopt

thích hợp cho quá trình tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5 Các VK phát triển tốt

và tạo nhiều enzyme ở pHopt trung tính 6,6 – 7,4 [15]

Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường pH của MT thay đổi sau khi thanh trùng MT và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy, pH ban đầu thích hợp cho phát triển của NS 3,8 – 5,6, với VK 6,2 – 7,4 Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần

MT và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của VSV, mà pH của MT sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm

Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thường chuyển về kiềm Người ta có

thể căn cứ vào pH của MT sau khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease tích lũy trong MT Theo tác giả Lê Ngọc Tú và La Văn Chứ, pH của MT ảnh hưởng tới tỷ lệ

giữa các protease được tổng hợp Do đó, nếu giữ pH của MT ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, VSV sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ưu thế trong MT [30], [44]

 Độ thông khí

Oxy rất cần đối với đời sống VSV hiếu khí Tăng sự thông khí đến giới hạn xác định thì sự phát triển của VSV cũng tăng theo Đối với nhiều VSV, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các VSV khác nhau Trong một

số trường hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của VSV nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp protease [16]

Ở MT bề mặt người ta thường thêm chất tạo xốp như trấu vào, còn ở MT bề sâu (MT dịch thể), thì người ta thường dùng thiết bị sục khí

 Độ ẩm

Độ ẩm MT là lượng nước có trong MT nuôi cấy Nước đóng vai trò quan

trọng trong mọi hoạt động sống VSV Nước tham gia vào thành phần tế bào, tham gia các phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất, là chất dung môi hòa tan

chất dinh dưỡng ở VSV

Độ ẩm là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của VSV khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt và phụ thuộc vào thành phần MT bề mặt Độ ấm MT xốp thích hợp nuôi NS là 50 – 60%, còn đối với VK là 50 – 70% [28]

 Thời gian nuôi cấy

Các chủng VSV khác nhau có tốc độ sinh trưởng khác nhau Tốc độ sinh trưởng VSV thường liên quan đến thời gian nuôi cấy và là yếu tố có vai trò rất quan

trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme Mặt khác, yếu tố thời gian còn quyết định

năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme Thông thường, enzyme được tổng hợp nhiều nhất trong MT nuôi cấy tại một thời gian nhất định nào đó Thời gian lên men còn phụ thuộc vào chủng VSV, thành phần MT, điều kiện nuôi cấy

1.3.2.3 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy

Để thu nhận chế phẩm protease từ VSV cũng như các enzyme khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp nổi)

và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm) [16]

 Nuôi cấy bề mặt

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt kinh

tế hơn Chủng VSV có thể tạo ra một hệ enzyme ngoại bào đa dạng và sản phẩm không cần tinh sạch nên phương pháp nuôi cấy bề mặt được sử dụng nhiều trong sản xuất men tiêu hóa dùng trong chăn nuôi [80]

Nguyên liệu thường được dùng tạo ra MT bán rắn để nuôi cấy NS và một số

VK thường là cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê Để làm tăng độ xốp của MT bán

rắn người ta thường bổ sung trấu hay lõi ngô đã được làm nhỏ (12 - 20%) Mặt khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng người ta thường cho thêm vào MT những cơ chất có tính cảm ứng cho enzyme này

pH trong phương pháp nuôi cấy bề mặt thay đổi theo chủng VSV: 5,6 – 6,2 đối với NS và 6,2 – 7,2 đối với VK ở nhiệt độ duy trì 28 - 300C, độ ẩm không khí

75 – 95% trong thời gian 36 - 72 giờ Đối với mỗi chủng VSV, cần lựa chọn thời gian nuôi thích hợp mà lượng enzyme trong MT lớn nhất Độ ẩm MT nên vào khoảng 58 – 60%

Ưu điểm: nồng độ enzyem tạo thành ở MT bán rắn cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm sau khi đã tách tế bào VSV

Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme, chế phẩm khô, dễ dàng bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng

trực tiếp trong điều kiện không cần enzyme tinh sạch

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt còn có một ưu điểm nữa là không cần thiết bị phức tạp Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trùng tuyệt đối và nếu bị

tạp nhiễm phần nào thì loại bỏ phần đó

 Nuôi cấy chìm

Hiệu suất lên men chìm dễ cơ khí hóa, tự động hóa, ít nhân công và có thể sản xuất liên tục là những ưu điểm lớn mà hiện nay nhiều sản xuất chọn phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất enzyme

Trong phương pháp này, VSV phát triển trong MT lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục Nguồn carbon trong phương pháp này thường là tinh bột, rỉ

đường,… Nguồn nitơ thường là cao ngô Ngoài những nguồn cơ chất và khoáng như trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy chìm, người

ta còn bổ sung thêm các chất cảm ứng cho việc sinh tổng hợp enzyme Các chất cảm ứng này có thể là cơ chất hoặc không phải là cơ chất của enzyme cần phản ứng

Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng MT dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy nên không thích hợp với các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nên cấy trực tiếp VK vào thùng men (chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ đảm bảo MT khỏi bị nhiễm

Protease sản xuất trên MT khuấy trộn và MT rắn có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu tương tự nhau, tuy nhiên việc nuôi cấy trên MT rắn cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn so với nuôi cấy trên MT khuấy trộn [74]

1.3.3 Thu nhận và tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy

Tùy theo mục đích sử dụng mà cần các dạng chế phẩm enzyme khác nhau: một số ngành thực phẩm thì đòi hỏi phải sử dụng chế phẩm enzyme ở dạng sạch, trong dược phẩm thì đòi hỏi các chế phẩm enzyme phải cực kì tinh sạch và phải có hoạt lực đặc hiệu tuyệt đối Trong một số trường hợp, MT nuôi cấy VSV có chứa enzyme được trực tiếp sử dụng dưới dạng thô, không cần tách tạp chất, ví dụ như trong công nghiệp rượu, công nghiệp thuộc da, [21]

1.3.3 1 Thu dịch enzyme

Đối với enzyme ngoại bào người ta tách sinh khối và các chất cặn bã khỏi canh trường bằng phương pháp lọc hay ly tâm Sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomite, than hoạt tính ) hoặc các chất tạo kết tủa để các chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc dễ dàng hơn

Đối với enzyme nội bào thì cần phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp như nghiền trong máy đồng hóa, nghiền với thủy tinh, cát, tự phân dùng tác dụng của siêu âm hoặc áp suất thẩm thấu cao,

Sau đó, có thể chiết suất enzyme bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính, Kết quả ta thu được dịch enzyme và loại bỏ bã sinh khối [4]

1.3.3 2 Thu chế phẩm kỹ thuật (chế phẩm thô)

Chế phẩm kỹ thuật là chế phẩm enzyme chưa được tinh chế có thể chứa một hoặc một vài enzyme chủ yếu ngoài ra trong đó còn có các protein không hoạt động, các tạp chất khác

Để thu được chế phẩm kỹ thuật, người ta tiến hành cô đặc các dịch enzyme trong thiết bị có độ chân không cao Sau đó:

- Hoặc tiếp tục cô đặc ở nhiệt độ cao 40 – 450C để đạt nồng độ chất khô 30

- 35 g/l, bổ sung thêm các chất bảo quản NaCl, glicerol, socbitol, benzoate và thu chế phẩm ở dạng lỏng, có thể bảo quản ở nhiệt độ thường 1 – 2 năm

- Hoặc cho kết tủa enzyme bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn, rồi cho thêm chất ổn định, đem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm

- Hoặc bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30 - 40 g/l rồi đem sấy phun ở nhiệt độ đầu vào khoảng 1200

Cđầu ra khoảng 600

C [21]

1.3.3.3 Thu ch ế phẩm enzyme tinh khiết [21]

Việc tinh chế enzyme có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và qua nhiều giai đoạn khác nhau

Đầu tiên loại các protein không hoạt động ra khỏi dịch enzyme bằng

phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt độ Sau đó, ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa để loại chúng ra Để thu những thành phần có hoạt lực enzyme cao nhất, người ta có thể dùng phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ

kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, hấp thụ chọn lọc, trao đổi ion

Sau khi làm sạch, cần sấy khô các chế phẩm enzyme để có thể sử dụng lâu dài Phương pháp sấy khô thường được áp dụng trong trường hợp này là sấy chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa Bằng phương pháp làm sạch khác nhau

có thể thu được các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu

Việc thu chế phẩm tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể rất khó khăn và tốn kém do đó các chế phẩm enzyme loại này chỉ được dùng trong nghiên cứu và y học

1.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme protease của Bacillus ở trong

và ngoài nước

Năm 1970, Kerry T Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết protease trung tính từ MT nuôi B subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận

thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động,

có pHopt từ 6,5-7,5, topt là 570C Protease này bị ức chế bởi Cu2+

, Ni2+, Hg2+, Pb2+,

Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5-10 [59]

Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease

tách từ B megaterim ATCC 14945 và nhận thấy enzyme này có thể bị kết tủa bằng

ammonium sulphate, có pH thích hợp 7,5, nhiệt độ thích hợp 550C Protease này cần có ion Ca2+và bị ức chế mạnh bởi EDTA [44]

Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các

protease của VK B subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp chiếu

chùm tia electron và chỉ ra rằng protease cố định bền với nhiệt hơn các protease dạng tự nhiên Các protease cố định khi không có cơ chất có thể chịu được nhiệt độ

600C và nếu có cơ chất thì có thể chịu được nhiệt độ lên tới 800

C Ngoài ra, protease

cố định có khoảng pH hoạt động rộng hơn protease ở dạng không cố định [52]

Bên cạnh đó còn có rất nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm protease từ

các loài Bacillus như: B cereus (Sirecka et al., 1998), B sphaericus (Singh et al., 1999), B stearothermophilus (Kim et al., 2002), B subtilis (Yang.et al., 2000), B

mojavensis (Beg và Gypta et al., 2003), B lichieniformis (Mancrzinger et al., 2003,

Sareen et al., 2005)

Alkaline protease lên men từ Bacillus sp JP395 do Kitano và cộng sự

nghiên cứu Protease kiềm này có phân tử lượng khoảng 30KD, pH hoạt động trong khoảng 9 – 11, chịu nhiệt trong khoảng 50 – 650C, điểm đẳng nhiệt 9.5, bị kìm

hãm bởi PMSF, nhưng không bị kìm hãm bởi EDTA Hoạt tính của chúng ổn định

ở 400C trong thời gian 60 phút, ứng dụng chủ yếu trong công nghiệp giặt tẩy [89]

Alkaline protease lên men từ Bacillus sp PD498 do Outtrup và cộng sự

nghiên cứu Enzyme này có khối lượng phân tử 34KD, pHopt từ 9 – 1, chịu nhiệt độ

Protease alkaline variants do Kottwitz, Beatrix và cộng sự nghiên cứu cho

biết protease kiềm này được chiết tách từ thể đột biến B lentus, vị trí các amino

acid đột biến là 61, 199, 211, làm tăng độ phong phú của công nghệ sản xuất enzyme từ VSV [89]

Ở Việt Nam, cũng có nhiều công trình nghiên cứu về protease của Bacillus,

các công trình công bố tập trung trên các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu

một số đặc tính của protease Một số công trình nghiên cứu như:

Năm 1983, Phạm Thị Trân Châu công bố các nghiên cứu về protease của B

pumillus [1], [4] và c ho thấy từ MT nuôi cấy B pumillus có thể thu được hai loại

protease: một protease kiềm điển hình hoạt động ở pH 10,7 và một protease trung tính nhạy cảm cới DFP gọi là serine – matalo – proteinase hoạt động ở pH 7,0

Ngô Thị Mai, Nguyễn Thị Dự và cộng sự (1991) đã dùng protease B

subtilis để thủy phân cá Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng 0,3% chế phẩm

protease B.subtilis, trong điều kiện 500C thì thời gian chế biến nước mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30 - 45 ngày trong điều kiện tự nhiên của mùa hè

Những nghiên cứu trong nước gần đây từ protease của Bacillus sp:

Vũ Ngọc Bội (2004), CPE thu nhận từ B subtilis S5 có hoạt tính 33UI/g,

dùng trong chế biến nước mắm

Âu Thị Bích Phượng (2006), thu nhận protease từ Bacillus sp có hoạt tính

đạt 1,7 UI/g

Lê Văn Việt (2007), thu nhận protease từ canh trường nuôi cấy bán rắn

Bacillus sp có hoạt tính 30,9 (UI/g) được đề nghị sử dụng làm probiotic cho chăn nuôi

Đỗ Trần Ngoan (2007) đã nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng

phương pháp lên men bởi tế bào VK B subtilis cố định

Trần Ngọc Hùng (2010), nghiên cứu chế phẩm protease từ B subtilis để sử

dụng trong chế biến thức ăn gia cầm đã thu nhận protease có hoạt tính đạt 14 (UI/g)

chế phẩm

Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình (2009), nghiên

cứu ứng dụng enzyme protease từ VK (B subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra

Nguyễn Hiền Trang, Đỗ Thị Bích Thủy (2006), tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của

B amyloliquefaciens T9

Đỗ Thị Bích Thủy (2006), nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp VK B subtilis để

loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ phế liệu tôm