Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno-xenluloza

Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno-xenluloza

I.Mở đầu

Cuộc sống ngày càng phát triển theo hớng tiến bộ với những thành tựu

về mặt khoa học kỹ thuật, cũng nh những lợi ích to lớn về kinh tế xã hội.Nhng bên cạnh những gì mà con ngời đợc hởng thụ thì chúng ta cũng đang

đối diện với một vấn đề hết sức nghiêm trọng Đó chính là sự ô nhiễm môitrờng do các thành tựu mà chúng ta đã sáng tạo ra Ô nhiễm môi trờng đãkéo theo sự mất cân bằng sinh thái cũng nh phá huỷ môi trờng tự nhiên, đedoạ sức khoẻ con ngời cũng nh các loại động thực vật khác

Bên cạnh các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trờng nh cháy rừng, khaithác rừng bừa bãi, chảy dầu, các nhà máy điện hạt nhân, dò rỉ phóng xạ .thì một nguyên nhân hết sức to lớn trong việc gây ô nhiễm môi trờng chính

là rác thải mà trong đó rác thải hữu cơ chiếm thành phần chủ yếu Rác thảihữu cơ có khả năng phân huỷ, chuyển hoá thành các dạng khác nhau Saumột thời gian chuyển đổi, các chất hữu cơ từ các vùng sản xuất nông nghiệptại các vùng nông thôn lại quay về làm ô nhiễm không chỉ thành phố mà cònlàm ô nhiễm các vùng nông thôn lân cận thành phố Chính vì nó có khảnăng phát tán nhanh chóng, gây ô nhiễm trong diện rộng nên nếu không đợcthu gom và xử lý triệt để thì rác thải hữu cơ sẽ gây hậu quả rất nghiêmtrọng Trong lợng rác thải hữu cơ thu gom đợc, các chất ligno-xenluloza lạichiếm một lợng hết sức lớn Đối với động vật và con ngời, các chất ligno-xenluloza này thờng không có mấy giá trị dinh dỡng Trong các phế phẩmnông nghiệp, phần không đợc sử dụng chiếm đến 50% tổng sinh khối Khốilợng này đợc thu gom và thải vào thiên nhiên, vừa gây lãng phí lại vừa gây ônhiễm môi trờng Tuy nhiên, để có thể giải quyết đợc vấn đề ô nhiễm dorác hữu cơ gây nên, chúng ta vấp phải một vấn đề phức tạp là làm cách nào

để có thể tăng khả năng thu gom và xử lý rác thải nhanh chóng nhằm đẩynhanh vòng tuần hoàn của rác, không để tồn đọng và gây ô nhiễm môi tr-ờng trong khi lợng rác thải của chúng ta ngày càng tăng lên mà các cơ sở xử

lý lại có hạn

Hiện nay có rất nhiều phơng pháp xử lý rác nh phơng pháp đốt, phơngpháp chôn lấp thành những bãi chứa Tuy nhiên, các phơng pháp này đềukhông mang lại những hiệu quả cao do lãng phí diện tích chôn lấp, thời gian

xử lý dài gây ô nhiễm thứ cấp Trong khi đó, phơng pháp xử lý rác bằngcông nghệ vi sinh vật tỏ ra có nhiều u điểm nhất cả về hiệu quả kinh tế lẫn

kỹ thuật, tạo ra sản phẩm phân bón hữu cơ dùng cho sản xuất nông nghiệp.Mặc dù vậy, việc phân huỷ rác dựa trên các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong

đống rác ủ còn gặp nhiều hạn chế nh thời gian phân huỷ quá lâu, quá trìnhphân huỷ cha triệt để Do đó, chúng ta cần tuyển chọn những chủng visinh vật thích hợp bổ sung vào bên cạnh những vi sinh vật có sẵn để có thểgiúp cho quá trình xử lý đạt kết quả tốt hơn

Với mong muốn có thể tham gia vào quá trình phân lập và tuyển chọncác chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ rác thải cao phù hợp với điềukiện Việt Nam dù bằng phần đóng góp hết sức nhỏ bé của mình, tôi đã thực

hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng

đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno-xenluloza”

II Tổng quan2.1 Sơ lợc tình hình và thành phần của rác thải sinh hoạt ở Việt Nam

2.1.1 Sơ lợc tình hình rác thải ở Việt Nam

Rác thải từ sinh hoạt của con ngời, rác thải nông nghiệp và rác thảicông nghiệp chiếm thành phần chủ yếu trong khối lợng rác thải thu gom đợctrên thế giới ở Việt Nam, tuy sản lợng công nghiệp ít và các đô thị chaphải là lớn cho nên rác thải công nghiệp cũng nh rác thải sinh hoạt ở nhữngnơi tập trung dân c còn ít so với các nớc phát triển, nhng do sự quản lý vềmôi trờng còn nhiều thiếu sót, ý thức giữ gìn môi trờng của mỗi ngời dâncha cao nên vấn đề môi trờng nói chung và vấn đề rác thải nói riêng là vấn

đề hết sức nan giải ở Việt Nam, đặc biệt ở các thành phố lớn Hàng ngày,

các thành phố lớn ở Việt Nam thải ra khoảng 9100 m3 rác nhng chỉ thu gom

đợc khoảng 40 – 50%

Chỉ tính ba thành phố lớn ở Việt Nam, lợng rác thải hàng ngày thu gom

đợc là rất lớn Mỗi ngày Hải Phòng thải ra 270 tấn rác, Hà Nội khoảng 1000tấn, Thành phố Hồ Chí Minh khoảng 4000 tấn Đó chỉ là số liệu trên giấy tờ

mà các công ty vệ sinh đô thị thu gom đợc Còn số lợng rác thực tế mà ngờidân thải bỏ thì lớn gấp nhiều lần nh thế [15,16]

Quá trình đô thị hoá nhanh chóng trong khi hệ thống cơ sở hạ tầngcha phát triển tơng ứng sẽ làm tăng thêm các khó khăn hiện nay về tình hình

ô nhiễm môi trờng Cùng với quá trình đô thị hoá thì mức sống của ngời dâncũng đợc nâng lên và kéo theo đó là lợng rác thải ngày càng lớn.Lợng ráctrung bình ở thành phố Hồ Chí Minh tăng khoảng 20% hằng năm trong khilợng rác ở các thành phố lớn trên thế giới chỉ tăng trung bình dới 7%.Tuynhiên lợng rác xử lý vẫn cha đợc bao nhiêu so với các nớc trên thế giới.Mặc dù nớc ta đã quan tâm đến vấn đề này song còn nhiều hạn chế

Rác thải công nghiệp là những thành phần không thể tham gia vào quátrình tạo nên sản phẩm hoặc bán thành phẩm phải loại bỏ khỏi các dâychuyền sản xuất

Rác thải sinh hoạt là những thành phần đợc loại bỏ từ các gia đình khucông cộng hay các chợ, siêu thị

Trong tất cả các loại rác kể trên thì rác thải sinh hoạt là loại chất thảiphức tạp hơn cả Trớc hết thành phần của rác thải sinh hoạt hết sức đa dạng,trong thành phần của chúng các hợp chất hữu cơ mà trớc hết là xenluloza vàlignin chiếm tỷ lệ cao nhất, thông thờng là 40 – 50%, có nhiều trờng hợpchiếm đến 70 – 80% Bên cạnh đó do ý thức của đại bộ phận dân chúngcòn yếu, sự quản lý và các biện pháp xử lý vẫn cha đạt đợc hiệu quả nhmong muốn, đòi hỏi phải phù hợp với mức sống và tập tục của cộng đồng.Ngoài ra mong muốn tận dụng rác thải sinh hoạt để tạo ra các sản phẩm cóích cho xã hội cũng là một yếu tố quan trọng khiến cho việc xử lý rác thảisinh hoạt còn gặp nhiều vấn đề nan giải [2, 12, 14]

Là một nớc nông nghiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên rác thảisinh hoạt của Việt Nam có những đặc điểm riêng về thành phần và tính chất

Độ ẩm trong rác thay đổi theo mùa trong năm - độ ẩm trung bình vào mùa

khô từ 40 – 45% và vào mùa ma từ 50 – 80%, lợng rác mỗi ngày tăng lênmột cách nhanh chóng

Do đó việc nghiên cứu, tuyển chọn ra những chủng vi sinh vật cónhững khả năng phân giải xenluloza mạnh, có thể áp dụng vào công nghệ xử

lý rác bằng vi sinh vật ở Việt Nam là rất cần thiết và cần đợc quan tâm hơn

2.1.2 Thành phần của các rác thải sinh hoạt ở Việt Nam

Khác với rác thải công nghiệp, rác thải sinh hoạt là một tập hợp không

đồng nhất Sự không đồng nhất thể hiện ngay ở sự đầu vào của nguyên liệuban đầu dùng cho sinh hoạt và thơng mại Sự không đồng nhất này tạo ramột số đặc tính rất khác biệt trong thành phần của rác thải sinh hoạt

2.1.2.1 Thành phần cơ học

Đặc điểm rõ thấy nhất ở rác đô thị của Việt Nam là thành phần cácchất hữu cơ có trong đó Số lợng này thờng chiếm rất cao, khoảng 55 –65% Trong thành phần rác thải đô thị, các cấu tử phi hữu cơ (kim loại, rácxây dựng ) chỉ chiếm khoảng 11 – 15%, phần còn lại là các cấu tử khác.[5]

Bảng 1: Thành phần rác sinh hoạt ở Hải Phòng,

Hà Nội, TP Hồ Chí MinhThành phần rác (%) Hải Phòng Hà Nội TP Hồ Chí Minh

Lá cây, vỏ hoaquả,

xác thực vật

Chúng ta nhận thấy rằng thành phần rác thải hữu cơ chiếm một tỷ lệlớn trong rác thải sinh hoạt của Việt Nam So với các nớc phát triển trên thếgiới thì tỷ lệ rác hữu cơ của nớc ta khá cao.[5]

Bảng 2 Thành phần rác sinh hoạt của một số nớc

đánh giá các tác động đến môi trờng nếu không đợc xử lý.[5]

Ta nhận thấy rằng tuỳ thuộc vào các chất khác nhau mà thành phần cáccấu tử hữu cơ có trong các chất dao động thay đổi trong khoảng rộng Kếtquả này đợc minh hoạ qua bảng 3 dới đây

Bảng 3: Thành phần hoá học của các cấu tử hữu cơ trong

rác thải sinh hoạt

Các chất

Thành phần(%)

sự lựa chọn tối u nhất Nếu chúng ta kiểm soát đợc quá trình xử lý rác thải

đô thị tạo ra nguồn phân hữu cơ thì đây chính là nguồn dinh dỡng lớn, vừatạo ra đợc sự cân bằng về sinh thái, lại vừa tránh đợc nguy cơ gây ô nhiễmmôi trờng

2.2 Các phơng pháp xử lý rác bằng vi sinh vật

2.2.1 Bản chất của phơng pháp

Bản chất của quá trình xử lý rác nhờ vi sinh vật chính là quá trình phânhuỷ rác của các vi sinh vật có sẵn trong rác cũng nh các vi sinh vật đợc bổsung vào Nhờ có các vi sinh vật này mà rác đợc phân huỷ thành các thànhphần nhỏ hơn, tạo ra sinh khối các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật vàcác loại khí nh CO2, CH4 [4]

Các quá trình chuyển hoá này có thể xảy ra trong điều kiện yếm khíhoặc hiếu khí

- Quá trình ủ hiếu khí là quá trình phân giải các chất hữu cơ nhờ sự cómặt của oxy tạo ra sản phẩm cuối cùng là CO2, NH3, nớc, nhiệt và sinh khối

vi sinh vật

- Quá trình ủ yếm khí là quá trình phân giải các chất hữu cơ vi sinh vậtnhng không có oxy sản phẩm cuối cùng là CH4, CO2, NH3 một lợng nhỏ cácloại khí khác, axit hữu cơ và sinh khối vi sinh vật.

Trong quá trình ủ rác sẽ diễn ra một loạt các quá trình chuyển hoákhác nhau Các quá trình này có thể theo những hớng có lợi, cũng nh hớngkhông có lợi Do đó phải làm sao kiểm soát đợc quá trình xử lý, hạn chếnhững mặt có hại cho quá trình xử lý, phát huy tối đa những mặt tích cựcvới mục tiêu đặt ra là:

- Làm ổn định thành phần rác thải sau quá trình xử lý:

Chất thải hữu cơ khi đợc đa vào môi trờng sẽ còn đợc chuyển hoá liêntục, vì thế nó cha ổn định Quá trình lên men sẽ ổn định chúng bằng phảnứng sinh hoá Sản phẩm cuối cùng của quá trình này sẽ đợc ổn định khichúng ta sử dụng chúng

- Tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh:

Trong rác thải thờng chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh Trong quá trình ủrác thì các vi sinh vật này sẽ bị tiêu diệt ở các nhiệt độ khác nhau.[6]

E.coli hầu hết chết ở 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 15-20 phút

Shigella sp chết ở 55oC trong 1 giờ

Các vi sinh vật gây bệnh thờng bị tiêu diệt ở trong khoảng nhiệt độ từ45-60oC trong khoảng thời gian ngắn

- Cải tạo chất lợng dinh dỡng của rác thải:

Nhờ có các vi sinh vật mà các chất dinh dỡng thờng tồn tại ở dạng hữucơ đã đợc chuyển hoá thành các chất vô cơ và rất thích hợp cho cây trồng.Sau khi lên men, các chất dinh dỡng này đợc chuyển hoá thành NO3 hay

P2O5 là những chất có tác dụng làm tăng dinh dỡng của đất có lợi cho câytrồng Cây trồng không thể sử dụng nitơ ở dạng hữu cơ mà chỉ có thể sửdụng ở dạng vô cơ.[5]

Tuy nhiên việc ủ rác cũng có nhiều hạn chế Do các vi sinh vật cần córất nhiều thời gian để phân huỷ đống ủ cho nên việc ủ rác thờng kéo dài, kéotheo một loạt những vấn đề về kinh tế xã hội Ngoài ra các đống ủ nếukhông đợc kiểm soát kỹ thì chính chúng sẽ trở thành nguồn gây ô nhiễm ramôi trờng xung quanh

2.2.2 Các phơng pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật

Có rất nhiều phơng pháp khác nhau để xử lý rác thải sinh hoạt cóchứa xenluloza và các chất hữu cơ khác Ngời ta thờng tóm tắt chúng vàocác nhóm sau:

- Phơng pháp sản xuất khí sinh học từ rác (Biogas)

- Phơng pháp chôn lấp rác (landfill)

- Phơng pháp ủ rác (composting)

Tuỳ theo điều kiện kinh tế, xã hội và thành phần tính chất của rác màngời ta áp dụng phơng pháp này hay phơng pháp kia cho phù hợp để có thểtận dụng hết các u điểm của từng phơng pháp [6,10,11]

2.2.2.1 Phơng pháp sản xuất khí sinh học (Biogas)

Cơ sở của phơng pháp này là nhờ sự hoạt động của các vi sinh vật màcác hợp chất khó tan (xenluloza, lignin, hemixenluloza, tinh bột và các hợpchất phân tử khác) đợc chuyển hoá thành các chất dễ tan Sau đó lại đợcchuyển hoá thành các chất khí trong đó chủ yếu là metan (chiếm tuyệt đại

đa số >64%)

Ưu điểm của phơng pháp này là ta có thể thu đợc một loạt khí có thểcháy đợc và cho nhiệt lợng cao, không gây ô nhiễm môi trờng, sử dụng chonhiều mục đích Chất thải sau lên men đợc chuyển hoá thành phân hữu cơ

có chất lợng dinh dỡng cao Tuy nhiên phơng pháp này có một số nhợc

điểm:

- Khó lấy các chất thải sau lên men

- Là quá trình kỵ khí bắt buộc vì vậy việc thiết kế bể ủ rất phức tạp, tốnkém và đòi hỏi vốn đầu t lớn

2.2.2.2 Phơng pháp chôn lấp (landfill) _ phơng pháp ủ rác yếm khí

Chôn lấp là phơng pháp xử lý lâu đời, ở nhiều nơi ngời ta đào một hốsâu để đổ rác xuống và lấp lại Đây cũng chính là u điểm của phơng phápnày, rất dễ thực hiện Sau một thời gian khoảng 2-3 năm rác đợc lên men vàchuyển hoá thành mùn Nh vậy phơng pháp này ít tốn kinh phí, dễ thực hiệnnhng vẫn còn có rất nhiều khiếm khuyết Đó chính là:

- Đòi hỏi thời gian rất dài để phân huỷ

- Đòi hỏi nhiều diện tích đất, tốn diện tích bề mặt

- Làm giảm thể tích rác ít

- Các chất hữu cơ trong rác khi phân huỷ sẽ tạo ra các khí độc hại nh

H2S, CH4 Ngoài ra lợng nớc rác rỉ ra khó có thể kiểm soát gây ô nhiễmcho các nguồn nớc xung quanh đặc biệt là các nguồn nớc ngầm

- Chịu ảnh hởng của thời tiết

2.2.2.3 Phơng pháp ủ rác hiếu khí (aerobic composting).

Các phơng pháp ủ rác hiếu khí rất phong phú, đợc phân chia thành cácnhiều phơng pháp khác nhau:

- Phơng pháp ủ rác thành đống lên men tự nhiên có đảo trộn (Windrowcomposting): Phơng pháp này là một phơng pháp cổ điển tuy rất dễ thựchiện nhng ngợc lại rất mất vệ sinh, gây ô nhiễm mạnh nguồn nớc, khôngkhí

- Phơng pháp ủ thành đống không đảo trộn có thổi khí (Aerated staticpile composting): phơng pháp này có u điểm là tiến hành nhanh hơn, nhiệt

độ của đống rác đợc ổn định và phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật

- Phơng pháp lên men trong các thiết bị (Vessel Composting Unit):

ph-ơng pháp này có quá trình lên men nhanh hơn và dễ kiểm soát hơn nhờ các

vi sinh vật đợc chọn lọc kỹ khi đa vào lên men, bổ sung cho các vi sinh vật

tự nhiên có trong rác thải Ngoài ra phơng pháp này còn giúp chúng ta kiểmsoát chặt chẽ lợng khí và lợng nớc thải trong quá trình lên men

- Các hệ thống xử lý rác công nghiệp (Commercial compostingsystems): phơng pháp này có tính tự động hoá cao, phân huỷ rác tốt nhng bùlại để có thể vận hành dây chuyền xử lý thì lại rất tốn kém

Các phơng pháp xử lý hiếu khí dễ kiểm soát, đem lại hiệu quả xử lý vàbảo vệ môi trờng khá cao Tuy nhiên phơng pháp này đòi hỏi phải có vốn

đầu t lớn cùng với các thiết bị máy móc hiện đại

Trong các phơng pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật kể trên,phơng pháp ủ hiếu khí có u điểm hơn phơng pháp ủ yếm khí vì có thể rútngắn quá trình phân hủy rác, dễ cơ giới và tự động hoá Đây là phơng pháp

có khả năng áp dụng tốt trong điều kiện kinh tế, xã hội của Việt Nam hiệnnay và cũng phù hợp với trào lu công nghệ trên thế giới

2.3 Sự phân bố và cấu trúc của xenluloza trong

tự nhiên

2.3.1 Sự phân bố của xenluloza trong tự nhiên

Sinh khối thực vật của trái đất ớc tính khoảng 1,8.1012 tấn Trong đóxenluloza chiếm khoảng 4.1010 tấn Sản lợng xenluloza đợc tổng hợp hàngnăm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác

Dới dạng phế thải, xenluloza có trong các phế liệu nông nghiệp chănnuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinhhoạt từ nhà bếp, đờng phố Sự phân bố đa dạng với khối lợng lớn ở khắpnơi của xenluloza có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo

vệ môi trờng, do đó để thu gom và xử lý triệt để lợng chất thải hữu cơ này

đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực,từng vùng.[3,5,11,20]

Bảng 4 Hàm lợng xenluloza có trong một số nguyên liệu.

Nguyên liệu Xenluloza

(%)

Nguyên liệu Xenluloza

(%)Kiều mạch

Vỏ hạtSợi

Gỗ thôngGiấy báoRơmLúa mì

Lúa mạch

60.091.041.040-8044.030.534.0

Trấu lúa mì 30.5 Bông 91.0

2.3.2 Cấu trúc của xenluloza.

Xenluloza là thành phần cơ bản của tế bào thực vật Thông thờng,xenluloza của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái

đất của chúng ta Ngời ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu nh khônggặp xenluloza ở dạng tinh khiết mà nó thờng tồn tại ở dạng kết hợp vớinhững chất khác nh hemixenluloza, lignin, pectin các chất này liên kết vớinhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là ligno-xenluloza.Trong đó, xenluloza và hemixenluloza chiếm tỷ lệ cao nhất Hai chất này đ-

ợc bao bọc bởi một lợng lignin.Các thành phần này thờng có tỷ lệ khác nhautrong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loạithực vật

Về mặt cấu tạo hoá học, xenluloza là một polime mạch thẳng, cóthành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranoza Các gốc này nối vớinhau nhờ liên kết β-1,4-glucozit glucozit Mức độ polime hoá của phân tửxenluloza thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000

Các đơn phân glucoza trong xenluloza thì có cấu trúc dạng ghế bành(hình 1).Trong công thức phối cảnh, ngời ta biểu diễn glucoza số chẵn, quaygóc 180o so với glucza số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳngnằm ngang[11,17]

Hình 1: Cấu trúc của phân tử xenluloza

Dùng phơng pháp phân tích của Rơngen, ngời ta đã chứng minh đợcrằng phân tử xenluloza có dạng sợi Các sợi này của xenluloza lại gắn vớinhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin (hình2A) Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thờng có hai vùng (hình2B)

-Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, vì thế nó rất bền vững với tác

động bên ngoài

-Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vữnghơn

H O

O H

HO

O CH2OH

H OH

O

H

OH H

HO

H

H H

Hình 2: Cấu trúc bậc cao của xenluloza trong tự nhiên

A - Bó sợi xenluloza song song với nhau nhờ liên kết hydro

B – Lát cắt bên của một sợi

Do có cấu trúc nh thế, vùng vô định hình của xenluloza có thể hấp thụnớc và trơng lên Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lới liên kết hydrogenngăn cản sự trơng này ở vùng kết tinh, enzym chỉ tác dụng lên bề mặt cácsợi.[5]

Xenluloza là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững Nókhông tan trong nớc, không đợc tiêu hoá trong đờng tiêu hoá của ngời và

động vật có dạ dày một túi Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại vàtrong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh sản xenlulaza,

là enzym thuỷ phân xenluloza

Cấu trúc của xenluloza là một cấu trúc phức tạp, chặt chẽ Chính vì vậy

mà xenluloza rất bền trong tự nhiên Các thành phần hợp thành xenluloza cócấu tạo và tính chất rất khác nhau Do đó, việc phá vỡ cấu trúc này đòi hỏiphải có sự hiểu biết sâu sắc đặc tính riêng của từng phần tạo ra chúng Từ đótìm ra những biện pháp, những chủng vi sinh vật thích hợp để phân giảichúng Bên cạnh đó,xenluloza là thành phần có số lợng và cấu tạo phức tạphơn cả trong ligno-xenluloza Sự tồn tại của hai vùng kết tinh và vô địnhhình của xenluloza cũng đòi hỏi phải có những biện pháp hoàn toàn khácnhau Chính vì thế, quá trình thuỷ phân xenluloza trong tự nhiên thờng diễn

Vùng vô

định hình

Vùng kết tinhA

B

ra rất chậm chạp Vấn đề xử lý các chất thải có chứa xenluloza là vấn đềkhông dễ dàng.[11]

2.4.Hemixenluloza

Trong tế bào thực vật, hemixenluloza đứng thứ hai về khối lợng.Hemixenluloza là nhóm polisacarit có phân tử lợng nhỏ hơn rất nhiều so vớixenluloza Thông thờng chúng chỉ có 150 gốc đòng Các gốc đòng đợc nốivới nhau bằng liên kết β-1.4, β -1.5, β -1.6 glucozit Chúng tạo thành mạchngắn và phân nhánh

Do đó, so với xenluloza thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽbằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng Đôi khihemixenluloza còn bị phân giải trong nớc nóng và chúng dễ dàng bị phângiải bởi enzym hemixenlulaza

Hemixenluloza tồn tại chủ yếu ở các phần nh hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ,trấu Trong các loại hemixenluloza thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên.Trong đó nhiều nhất là ở rơm, rạ (chiếm hơn 30%) kế đến là cây lá rộng (20– 30%) ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 – 17%).[5,10,20]

Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic; 14% cumarylic và 6%cynapylic Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò nhchất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chốngthấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng nhcác tác dụng khác từ bên ngoài

Lignin không hoà tan trong nớc, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc

kể cả axit Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, ligninmới mới lại bị phân giải từng phần

Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzym Do đó trong câylignin chỉ đợc tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất.

Ba cấu tử xenluloza, hemixenluloza, lignin tạo nên ligno-xenluloza.Thành phần lignin, xenluloza, hemixenluloza trong các loại thực vật có sựkhác biệt lớn Sự khác biệt này quyết định sự khác nhau giữa các loại thựcvật về tính chất vật lý và thành phần hoá học Chính vì thế đòi hỏi phải cóbiện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau.[5,20]

2.6.Cơ chế chuyển hoá ligno-xenluloza

Từ các yếu tố trên ta thấy rằng ligno-xenluloza là một chất rất khóchuyển hóa và chuyển hoá rất chậm trong điều kiện tự nhiên Đặc tính khóchuyển hoá này do một số nguyên nhân:

Ligno-xenluloza là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polimecao, khó tan trong nớc, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzym

Các cấu phần hợp thành nên ligno-xenluloza đợc liên kết chặt chẽ vớinhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặtchẽ

Do thành phần cấu tạo của ligno-xenluloza rất đa dạng và phức tạp nên

để có thể thuỷ phân đợc chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệenzym tơng ứng Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thểsinh tổng hợp một phức hệ enzym phong phú và đa dạng nh vậy Muốnchuyển hoá đợc ligno-xenluloza cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinhvật khác nhau

2.6.1.Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza

a) Enzym thuỷ phân xenluloza: xenlulaza

Xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã đ ợcmột số tác giả tổng kết khá chi tiết Đây là phức hệ enzym thuỷ phânxenluloza tạo ra các đờng đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât Nhiều tácgiả cho rằng phức hệ enzym xenlulaza bao gồm ba enzym chủ yếu sau: -Exo-β(1,4)-glucanaza (Avicelaza) hay xenlobiohydrolaza (1,4 β-D-glucanxenlobiohydrolaza E.C.3.2.1.91)

Enzym này phân cắt chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng

ra xenlobioza Enzym này không thuỷ phân xenluloza kết tinh cũng nh xenluloza hoà tan (caboxymetyl xenluloza) nhng có thể thuỷ phân đợc xenluloza đã bị cắt ngắn mạch Có lẽ vai trò chính của enzym này là giúp cho enzym endoxenlulaza tác động lên đợc xenluloza kết tinh

-Endoglucanaza hay Endoxenlulaza (1,4 β-D-glucano-hydrolazaE.C.3.2.1.4)

Enzym này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết β 1,4-glucozit trong phân

tử xenluloza một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobioza

và glucoza Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza vô định hình nhnglại tác dụng yếu trên xenluloza kết tinh và không phân giải đợc xenlobioza.Chính nhờ sự phân cắt trớc của endoxenlulaza, đã tạo ra các đầu khôngkhử làm dễ dàng enzym xenlobio-hydrolaza, do đó mà thuỷ phân đợcxenluloza kết tinh Còn thứ tự ngợc lại thì hiện nay ngời ta cha biết

-Enzym β-glucozit 1,4-glucozidaza hay xenlobiaza

Đây là những enzym rất đặc hiệu β-glucozidaza làm thuỷ phânxenlobioza và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucoza

Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân xenluloza phụ thuộc chặt chẽvào quá trình hoạt động của xenlobiaza Tuy nhiên theo một số tác giả cơchế thuỷ phân xenluloza bởi phức hệ enzym trên diễn ra theo một trật tựkhác nhau

b)Cơ chế thuỷ phân xenluloza

Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzym “tiền tố thuỷ phân” hay làkhông đặc hiệu Các enzym này chỉ có tác dụng làm trơng xenluloza tựnhiên Các xenluloza tự nhiên sẽ đợc chuyển thành các xenluloza hoạt độngtrơng nở có mạch ngắn hơn Các chuỗi này sẽ đợc enzym Cx tiếp tục phâncắt tạo thành đờng tan (xenlobioza) và sau cùng thành glucoza[11]

Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzymendoglucanaza tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt xenluloza, cắtcác liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đóexoglucanaza sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobioza Kết quả tạo thànhxenlo-oligosacarit mạch ngắn,xelobioza, glucoza Cuối cùng enzymxenlobiaza thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucoza.

Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình vềenzym C1 và Cx Theo ông thì C1 có tác dụng làm trơng nở xenluloza kếttinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra xenluloza biến tính Sau đó enzym

Endoglucanaza

Vùng vô định hình

endoglucanaza tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobioza Ông cho rằng sựthuỷ phân xenluloza là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cảendoglucanaza, enxoglucanaza và xenlobiaza.

Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phânxenluloza nhng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân xenluloza vẫn cha hoàntoàn thồng nhất

2.6.2 Enzym và cơ chế thuỷ phân hemixenluloza

Khi nghiên cứu hemixenluloza, ngời ta nhận thấy có nhiều điểm giốngnhau giữa hai thành phần này.Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzymhemixenlulaza cũng có nhiều điểm tơng đồng với xenlulaza ví dụ nh cơ chếtác động Tuy nhiên, giữa hemixenlulaza và xenlulaza vẫn còn nhiều điểmkhác biệt:

- Hemixenluloza có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản vàkém bền hơn so với xenluloza

- Hemixenluloza là cơ chất dễ đồng hoá hơn xenluloza do đóhemixenlulaza thờng đợc tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinhvật

Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemixenluloza thờng diễn ra songsong với quá trình phân giải xenluloza.[5]

2.6.3 Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin

Có nhiều quan điểm trái ngợc nhau về cơ chế phân giải lignin Một sốtác giả cho rằng, lignin có tác dụng nh một nguồn cảm ứng để tổng hợp raligninaza Nhng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin

là một quá trình trao đổi chất thứ cấp Chúng chỉ xảy ra khi môi trờng thiếucác nguồn dinh dỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ Nếu thêmnitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzym thamgia vào quá trình thuỷ phân lignin Ligninaza không thuỷ phân lignin thànhcác tiểu phần hoà tan nh phân giải xenluloza và hầu hết các polime khác, vìlignin chứa một số lợng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ Mặt khácligninaza lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó chophép tiếp xúc với lignin Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiệnphản ứng hoá học sau:

-Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan

2.7.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza

Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vôcùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn

2.7.1.1 Nấm sợi

Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenlulaza thìnấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp xenlulaza mạnh nhất Chúng lànhững vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếusống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trờng một lợng lớn enzym chuyểnhoá các tàn d của thực vật thành những chất dinh dỡng cung cấp cho cây vàlàm cho đất trở nên màu mỡ hơn.[11]

Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năngsinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzym cần cho quá trình chuyển hoáxenluloza đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một

vài loại enzym nào đó mà thôi Các loại nấm đáng chú ý nhất là:Alternaria

tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger [10]

Các nấm a nhiệt cũng đợc chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzymbền nhiệt hơn, chúng sinh trởng và phân giải nhanh xenluloza nhng hoạttính xenlulaza của dịch lọc lại thấp Nấm có khả năng sinh trởng và sản xuấtxenlulaza cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6.[11]

2.7.1.2 Vi khuẩn

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số visinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza Những năm đầu thế kỷXX(1903) G.Van Iterson phân lập đợc các vi khuẩn hiếu khí cũng có khảnăng này Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza, niêm vi khuẩnchiếm một vị trí quan trọng, chúng thờng có hình que nhỏ bé hơi uốn cong,

có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống

Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium Niêm vi khuẩn nhận đợc năng

l-ợng khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải xenluloza thành CO2 và

H2O.[11]

Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng

phân huỷ xenluloza Trong điều kiện kỵ khí, các loài a ấm hoặc a nhiệt

thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải xenluloza Chúng

phát triển yếu trên môi trờng chứa đờng đơn Khi phân giải xenluloza thànhglucoza và xenlobioza, chúng sử dụng các đờng này nh nguồn năng lợng vànguồn cacbon cũng thờng kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và

H2O

Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt.Chúng có khả năng phân giải xenluloza thành các sản phẩm.Các vi sinh vật

đó thờng là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio

fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium

- Xạ khuẩn a ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C

- Xạ khuẩn a nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C

Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất Xenlulaza của xạkhuẩn là enzym ngoại bào.[5]

Hungater phân lập đợc loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân

xenluloza

Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dỡng Nhiềunhóm đòi hỏi nguồn dinh dỡng cao Các môi trờng có dịch chiết nấm men,pepton, dịch thuỷ phân cazein thờng thuận lợi cho sinh trởng xạ khuẩn th-ờng sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thờng Bào tửcủa xạ khuẩn thờng có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic,canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng Cácxạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dỡng Việc hình thànhcuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lợng [11]

Veigia và cộng sự đã phân lập đợc 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnhLacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợpxenluloza và sinh trởng tốt trong môi trờng chứa 3,5% NaCl Mandels vàcộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzym xenlulaza của hai chủng

Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp 0143 với cơ chất là CMC,

nhiệt độ tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9.[11]

2.7.2 Vi sinh vật phân giải hemixenluloza

Hemixenlulaza là enzym ít ngời nghiên cứu ngoại trừ xylanaza vìxylan là một loại hemixenluloza phổ biến trong tự nhiên.Các tác giả chorằng nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả xenlulaza đồng thời tổng hợp

cả hemixenlulaza Khả năng này thờng thấy ở vi khuẩn dạ cỏ nh Bacillus,

Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium.

Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp

xylanaza Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus

oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, ,T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium

2.7.3 Vi sinh vật phân giải lignin

Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷrất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm Các vi sinh vật phân giải lignin

thờng là các loại nấm mục xốp nh Paocylimyces,Allescheria, Pseussis,

Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites Ngoài ra còn có các loại nấm trắng

nh Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium,

Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus

2.7.4 Các yếu tố ảnh hởng tới sinh tổng hợp enzym xenluloza của

khác nhau.[11] Nấm sợi Trichoderma lignorum và Trichodema koningi

tổng hợp rất nhiều enzym C1 và enzym Cx khi cho vào môi trờng dinh dỡng

nguồn cacbon giấy lọc Còn T.reesei lại rất thích hợp trong môi trờng gồm

cám bã và củ cải đờng Một số nguồn cacbon khác lại gây ức chế quá trìnhsinh tổng hợp xenlulaza nh glucoza, xenlobioza Khi nuôi cấy nấm trênmôi trờng chứa giấy lọc và tăng dần lợng glucoza lên, ngời ta nhận thấy khiglucoza tăng lên đến 2-3% sẽ xảy ra sự ức chế việc sinh tổng hợp xenlulaza

Với Pyrenochaeta terrestris là 0,001% với Fusarium culmorum là 2%

Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở rất nhiều nấm

sợi nh: Aspergillus, Fusarium, Trichoderma.

Muối amôn thờng làm ức chế sinh tổng hợp enzym xenlulaza ở

Aspergillus, Trichoderma và một số nấm khác Nguyên nhân có thể là do

muối amôn làm giảm pH của môi trờng, làm bất hoạt một số enzym và làm

cho các enzym này nằm trong khuẩn ty của nấm mà không thoát ra ngoài ợc.

đ-Các nguồn nitơ hữu cơ thờng có ảnh hởng không giống nhau đến các

loài vi sinh vật Pepton làm kích thích sinh tổng hợp ở Helminihosporium,

Penicillium oxalicum Nhng pepton lại ức chế quá trình sinh tổng hợp ở Myrothecium, các loài nấm sợi Aspergillus, Chaetomium Pepton có ảnh h-

ởng tốt đối với Trichoderma lignorum.[5,11]

Urê làm giảm khả năng sinh tổng hợp của một loài các vi sinh vật.Cao ngô với lợng 0,5% sẽ làm kích thích sự sinh tổng hợp xenlulaza

của T.koningi, A.niger, nhng lại ức chế sự sinh tổng hợp xenlulaza ở nấm

chịu nhiệt

Một số axit amin có ảnh hởng rất rõ rệt đến quả trình tổng hợpxenlulaza của một số nấm Khi bổ sung 0,01% valin và axit aspartic vào môi

trờng có thể làm tăng quá trình tổng hợp của Trichoderma

Đối với Aspergillus, một số axit amin nh arginin, leuxin, histidin,

cystein làm tăng khả năng sinh tổng hợp xenlulaza Nhng các axit aminkhác lại làm giảm khả năng này.[5,11]

2.7.4.3.ảnh hởng các nguyên tố vi lợng tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật

Trong các nguyên tố vi lợng, các nguyên tố sau có ảnh hởng kích thích

đến sinh tổng hợp xenlulaza: Fe, Mn, Co Nồng độ thích hợp cho tuyệt đại

đa số các loài nấm là: Zn từ 2-10 mg/l, Fe tử 3,4-27,2 mg/l Các nguyên tố

vi lợng khác từ 0,11-2,2 mg/l

2.7.4.4.ảnh hởng pH môi trờng tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật

Đại đa số các loài nấm sợi phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza mạnh

ở pH=4-6 Tuy nhiên cũng có một số loài nấm sợi phát triển và phân huỷ

xenluloza ở pH=1,8-2,0 nh Fusarium oxysporum, Trichoderma koning

2.7.4.5.ảnh hởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật

Nhiệt độ ảnh hởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của các loài nấmrất khác nhau Đại đa số chúng phát triển ở nhiệt độ 28-320C Nhng các loài

a nhiệt có thể phát triển đợc tới 650C Các chủng A fumigatus a nhiệt thích

hợp sinh trởng và hình thành enzym phân giải xenluloza ở 650C

Những nghiên cứu của các tác giả trên về các vi sinh vật có khả năngsinh tổng hợp xenlulaza cho thấy khả năng phân huỷ ligno-xenluloza tậptrung chủ yếu ở hai nhóm nấm sợi và vi khuẩn Cả hai nhóm nấm sợi và vikhuẩn đều có khả năng phân huỷ ligno-xenluloza trong điều kiện tự nhiên Các loài vi sinh vật thờng không có khả năng sinh tổng hợp cùng mộtlúc tất cả các enzym trong phức hệ enzym xenlulaza Phân huỷ ligno-xenluloza trong thiên nhiên đợc thực hiện bởi hàng loạt các vi sinh vật Các

vi sinh vật này thay phiên nhau phân huỷ các thành phần hữu cơ chứa xenluloza, tạo nên một chuỗi phản ứng liên tục cho đến khi nguyên liệuligno-xenluloza đợc chuyển hoá hết Enzym xenlulaza là một loại enzymcảm ứng Xenluloza là cơ chất cảm ứng của enzym xenlulaza Tuy nhiêntính chất cảm ứng của xenluloza không chặt chẽ.Tính không chặt chẽ này có

ligno-lẽ phụ thuộc nhiều vào cấu tạo của cơ chất xenluloza Trong đó tỷ lệxenluloza kết tinh và xenluloza vô định hình có tính chất quyết định đặc tínhnày Chính vì thế có loài nấm sợi phát triển tốt trên giấy lọc, loại khác lạikhông thể phát triển tốt đợc

Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hởng tốt đến quá trình sinh tổng hợpxenlulaza của sinh vật là nitơ từ các muối nitrat Các nguyên tố vi lợng nh

Fe, Mn, Co; pH của môi trờng trong khoảng 4-6; nhiệt độ nuôi cấy trongkhoảng 28-32oC thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật phân giải ligno-xenluloza

III Nguyên vật liệu và phơng pháp

nghiên cứu3.1 Nguyên vật liệu

- Vi sinh vật: Các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

xenlulaza đợc phân lập đợc từ mẫu rác đợc lấy từ xí nghiệp xử lý chất thảiCầu Diễn-Hà Nội

- Dụng cụ: Máy so màu; Máy ly tâm; Kính hiển vi; Máy đo pH; Máy

lắc; Cân điện; Tủ sấy; Nồi hấp; Tủ ấm

- Hoá chất: Các hoá chất dùng để làm môi trờng phân lập và môi trờng

nuôi cấy, xác định hoạt lực enzym có tại phòng thí nghiệm tại Viện Khoahọc và Công nghệ Môi trờng ĐH Bách khoa HN

- Các môi trờng nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy và giữ

các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza, chúng tôi sửdụng các môi trờng sau:

- Môi trờng 1: Để giữ giống nấm, chúng tôi sử dụng môi trờng Czapek

- Môi trờng 2: Để phân lập và giữ giống vi sinh vật chúng tôi sử dụng

môi trờng Hutchinson-Clayton có thành phần nh sau

- Môi trờng 3: Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi

khuẩn và nấm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng dịch thể có thànhphần nh môi trờng 2 nhng không có Agar

ấm 300C trung bình 2 ngày cho khô mặt thạch và kiểm tra mức độ vô trùngcủa môi trờng Chỉ những đĩa không bị nhiễm mới dùng để phân lập

Mẫu rác lấy về phòng thí nghiệm đợc nghiền nhỏ rồi pha ở các độloãng khác nhau bằng cách lấy 1g rác đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giácchứa 99 ml nớc vô trùng, lắc đều rồi dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù từbình sang ống nghiệm chứa 9 ml nớc vô trùng Cứ nh vậy pha loãng tớinồng độ mong muốn

Hút ở mỗi độ pha loãng 104, 105, 106 ra 0,1 ml dịch huyền phù và nhỏvào các đĩa petri chứa môi trờng 2 đã vô trùng Dùng que trang dàn đều dịchtrên bề mặt môi trờng Đậy nắp hộp lại, bao gói và nuôi trong tủ ấm ở 300C.Phía dới giá nuôi vi sinh vật đặt một khay nớc để tạo ẩm không khí thíchhợp Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong 5 - 7 ngày

Từ môi trờng phân lập, chọn các khuẩn lạc phát triển mạnh, mọcriêng rẽ dùng que cấy đầu tròn cấy dích dắc vào ống thạch nghiêng chứamôi trờng 2 đã vô trùng Nuôi ở tủ ấm 300C trong 7 ngày cho vi sinh vậtphát triển tốt rồi đa các ống giống vào bảo quản lạnh trong tủ lạnh 40C

Số lợng vi sinh vật hiếu khí đợc tính theo công thức sau: