Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cây ban (hypericum hookerianum wight arn )

Chiết xuất, sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro từ các phân đoạn dịch chiết phần trên mặt đất cây ban Hypericum hookerianum .... CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ IN VIT

4 -

-‘

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY BAN

(HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT &ARN.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY BAN

(HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN.)

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển (Bộ môn Dược học cổ truyền-Trường Đại học Dược Hà Nội), người đã trực

tiếp hướng dẫn tận tình, chỉ bảo giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Phương Thiện Thương, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, PGS TS Nguyễn Thùy Dương

Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương đã tạo điều kiện cho tôi được học tập

và nghiên cứu trong suốt thời gian qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS ThS Vũ Duy Hồng – Viện Huyết Học, sinh viên Đỗ Thị Thu và Hoàng Thị Lan Anh, những người đã đồng hành, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn Dược lực, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn (Viện Dược liệu), Phòng sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 2 tháng 4 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Hải

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỒNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HYPERICUM 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.1.3 Các loài thuộc chi Hypericum 4

1.1.2 Thành phần hóa học 5

1.1.2.1 Nhóm naphthodianthron và bianthraquinon 5

1.1.2.2 Nhóm phloroglucinol 6

1.1.2.3 Nhóm xanthon 6

1.1.2.4 Nhóm flavonoid 7

1.1.2.5 Các nhóm chất khác 7

1.1.3 Tác dụng dược lý 8

1.1.3.1.Tác dụng chống trầm cảm 8

1.1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 9

1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn 9

1.1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa 10

1.1.4 Công dụng 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ HYPERICUM HOOKERIANUM 12

1.2.1 Thực vật học 12

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật 12

1.2.1.2 Phân bố 12

1.2.2 Thành phần hóa học 13

1.2.3 Tác dụng dược lý 15

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 16

1.2.3.2 Tác dụng chống virus 16

1.2.3.3 Khả năng gây độc tế bào 16

1.2.3.4 Tác dụng chống ung thư 17

1.2.3.5 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương 17

1.2.3.6 Tác dụng kháng khuẩn 17

1.2.4 Công dụng 18

1.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXY HOÁ 18

1.3.1 Nguồn gốc của gốc tự do 18

1.3.2 Stress oxy hóa, tác hại của stress oxy hóa 19

1.3.3 Chất chống oxy hóa 19

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 20

2.1.3 Động vật thí nghiệm 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Chiết xuất, sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro từ các phân đoạn dịch chiết phần trên mặt đất cây ban Hypericum hookerianum 21

2.2.1.1 Chiết xuất cắn toàn phần và các phân đoạn 21

2.2.1.2 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự do DPPH 22

2.2.1.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự do superoxid 24

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 25

2.2.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất hoá học 25

2.2.2.2 Phân lập các hợp chất 29

2.2.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 30

2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan 30

2.2.4 Xử lý số liệu 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ IN VITRO TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY BAN H HOOKERIANUM 35

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 35

3.1.2 Chiết xuất 35

3.1.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa invitro bằng phương pháp dọn gốc tự do

DPPH 37

3.1.4 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp dọn gốc tự do superoxid 37

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 38

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phương pháp hóa học 38

3.2.2 Định tính cắn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng 39

3.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ phần trên mặt đất cây an H hookerianum 40

3.2.3.1 hân lập 40

3.2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được 42

3.2.3.3 Xác định cấu tr c các hợp chất phân lập được 43

3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 50

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 56

4.1 VỀ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ IN VITRO 56

4.1.1 Về chiết xuất 56

4.1.2 Về sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro 56

4.1.2.1 Về đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH 56

4.1.2.2 Về đánh giá tác dụng dọn gốc tự do Superoxid 57

4.2 VỀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 57

4.2.1 Về định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học 57

4.2.2 Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 57

4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN IN VIVO 61

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ……….66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ASAT Aspartat aminotransferase

2 ALAT Alanin aminotransferase

3 BET Cắn phân đoạn ethyl acetat phần trên mặt đất cây ban

5 BTP Cắn phân MeOH toàn phần phần trên mặt đất cây ban

6 CC Sắc ký cột (Column chromatography)

7 13C – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13)

Nuclear magnetic resonance)

8 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

9 DMSO Dimethyl sulfoxid

10 ESI-MS Phổ khối lượng ion hóa tia điện (Electrospray ionization

17 MDA Malonyl dialdehyd

18 Mp Nhiệt độ nóng chảy (Melting point)

19 MS Phổ khối (Mass spectrometry)

20 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hypericum ở Việt Nam 4

2 Bảng 1.2 Các hoạt chất được phân lập từ H hookerianum

3 Bảng 1.3 Các hợp chất được phân lập từ cây ban H

hookerianum (Wight & Arn.) thu hái tại Sapa 15

4 Bảng 3.1 Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết methanol

5 Bảng 3.2 Nồng độ ức chế 50% (IC50) gốc tự do DPPH cúa

6 Bảng 3.3 Nồng độ ức chế 50% (IC50) gốc tự do superoxid của

7 Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm chất hóa học 38

8 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của chất A và astilbin theo tài

9 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của chất B và quercitrin theo tài

10 ảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của chất C và hyperin theo tài

11 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của cao an đối với hoạt độ AST trong

12 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cao an đối với hoạt độ ALT trong

13 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của cao an đối với hàm lượng MDA

14 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cao an đối với hàm lượng GSH

15 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của cao an đối với hàm lượng SOD

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Bụi cây, hoa và quả H hookerianum 13

2 Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng - lỏng 22

4 Hình 3.2 Sắc ký đồ của cắn phân đoạn ethyl acetat (hệ III) ở

5 Hình 3.3 Sắc ký đồ các phân đoạn cắn ethyl acetat phần trên

6 Hình 3.4 Sơ đồ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl

7 Hình 3.5 Sắc kí đồ kiểm tra các chất phân lập đƣợc 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ sinh thái thực vật rất đa dạng và phong phú Việc sử dụng cây cỏ trong việc phòng và chữa bệnh đã được ông cha ta sử dụng từ rất lâu đời Tuy nhiên sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu đầy đủ về liều lượng, độc tính và hiệu quả điều trị

Hiện nay, các bằng chứng khoa học cho thấy sự gia tăng nồng độ các gốc tự

do trong tế bào là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nên các vấn đề bệnh tật như xơ vữa động mạch, tiểu đường, ung thư [45] Vì vậy xu hướng tìm kiếm và nghiên cứu các hoạt chất từ dược liệu có hoạt tính sinh học cao để chống lại gốc tự

do đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Chi Hypericum là một chi lớn thuộc họ Ban (Hypericaceae) gồm hơn 460 loài phân bố ở nhiều nơi trên thế giới [78] Một số loài khá phổ biến như H perforatum,

H patulum, H mysorence, H polyanthenum, H Drummondii được sử dụng để giảm

lo âu, giảm đau và ảo vệ gan [29], [53], [69] Loài Hypericum patulum còn được gọi

là an tròn đã được nghiên cứu tại Việt Nam dùng điều trị viêm gan mạn [1]

Hypericum hookerianum là một loài thuộc chi Hypericum, phân bố chủ yếu ở một số vùng ở Trung quốc, Nepal, Ấn Độ và Việt Nam Tại Ấn Độ loài Hypericum hookerianum được sử dụng trong y học cổ truyền để làm lành vết thương [52], ở

Trung quốc được sử dụng điều trị viêm bàng quang [8] Gần đây trên thế giới đã có một số nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, tác dụng trên thần kinh trung ương, chống virus và chống ung thư của loài ban này [28], [50], [53] Tại Việt Nam loài

H hookerianum mọc khá phổ biến ở Sapa (Lào Cai) tuy nhiên chưa được sử dụng

trong y học, chủ yếu được bà con dân tộc dùng lá chữa đau mắt cho gia súc [4] Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải (2017) đã ước đầu nghiên cứu sơ ộ về đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học, phân lập và xác định được một số hoạt chất

từ loài Hypericum hookerianum [7] Hiện chưa có một nghiên cứu trong nước nào

đánh giá về tác dụng sinh học của loài ban này

Trên cơ sở các nghiên cứu về loài Hypericum hookerianum tại Việt Nam,

nhằm góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng

sinh học, tạo cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và nâng cao giá trị sử dụng loài

Hypericum hookerianum, một cây đặc hữu dễ khai thác của địa phương, chúng tôi

đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng

chống oxy hóa và đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cây ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.)” với các mục tiêu sau:

1 Chiết xuất và sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của các phân đoạn dịch chiết phần trên mặt đất cây ban (Hypericum hookerianum Wight &

Arn.)

2 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2-3 chất trong phân đoạn có tác

dụng chống oxy hóa in vitro

3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm từ phần trên mặt

đất cây ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.)

CHƯƠNG I TỒNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HYPERICUM

1.1.1 Thực vật học

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Vị trí của chi Ban Hypericum trong phân loại thực vật của Armen Takhtajan

được phân loại như sau [16]:

Thực vật bậc cao: Cormobionta

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyda)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dilleniidae)

Liên bộ Đỗ Quyên (Ericanae)

Bộ Ban (Hypericales)

Họ Ban (Hypericaceae) Chi Ban (Hypericum)

Lưu ý: Họ Ban ở Việt Nam có hai chi là Cratoxylum và Hypericum Họ Ban

có đặc điểm thực vật rất gần với họ Măng Cụt (họ Clusiaceae) nhưng cây không có

mủ vàng nên trong hệ thống phân loại Takhtajan (1987) các chi này để chung trong

họ Măng Cụt Nên một số sách xuất bản trước các cây thuộc chi Hypericum có thể được sắp xếp trong họ Clusiacea [3]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây bụi hoặc nửa bụi, sống lâu năm, không có lông hoặc có lông đơn giản Lá mọc đối (hoặc vòng) không cuống hoặc cuống ngắn, gân lông chim hoặc chân vịt (hiếm khi rẽ đôi), mép nguyên hoặc có tuyến ở mép lá Cụm hoa xim, hoa lưỡng tính, hoa hình sao hoặc hình cốc Đài 5, tiền khai hoa năm điểm, hiếm khi bốn, xếp chữ thập, không đều hoặc đều, tràng liền một phần hoặc rời Tràng 4 hoặc 5, xếp xoắn ốc, màu vàng hoặc vàng chanh (hiếm khi trắng) mặt dưới thường màu nhạt, hoặc có gân đỏ, không rụng hoặc sớm rụng sau nở hoa, thường không đối xứng Nhị hoa chùm 4 hoặc 5, rời và dính vào họng tràng, có thể dính với nhau thành 3 hoặc 4

bó nhị dính vào đài hoặc không theo quy tắc hoặc không dính thành cụm chỉ nhị, không rụng hoặc rụng sớm, mỗi bó nhị có thể lên đến 70 nhị, chỉ nhị mảnh, rời nhau

hoặc dính 2/3, bao phấn nhỏ dính lưng hoặc có thể dính gốc, mở dọc, có tuyến liên kết, nhị vô tính bị khuyết (rất hiếm) Bầu nhụy 3-5 khoang, đính noãn trung trụ hoặc chỉ một khoang với 2-3-5 hợp điểm đính noãn ên, mỗi hợp điểm có từ 2 đến nhiều noãn, thân noãn 2 hoặc 3-5, rời nhau hoặc đính một phần đến hoàn toàn, núm nhụy nhỏ, bè hoặc không Quả nang chẻ ô hoặc hiếm khi tự mở, vỏ quả thường chứa dầu Hạt nhỏ, hình chum hoặc có cánh hẹp, vỏ hạt hình dạng đa dạng, không có áo hạt (rất hiếm khi có mồng) Cây mầm nhọn, thẳng với một lá mầm nhọn [78]

1.1.1.3 Các loài thuộc chi Hypericum

Chi Hypericum là một chi lớn, gồm 469 loài khác nhau Theo Thực vật chí Trung Quốc, ở Việt Nam chi Hypericum có 12 loài [78] Tuy nhiên, theo báo cáo của Viện Dược liệu chi Hypericum ở Việt Nam còn có thêm 5 loài nữa, tổng cộng là

17 loài được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1 [12]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hypericum ở Việt Nam

1 H acmosepalum N Robson Ban lá thuôn [12], [78]

16 H uralum Buch Ham ex D Don Ban lá nhỏ [12], [78]

17 H wightianum Wall ex Wight & Arn Ban wight [11], [78]

Ngoài ra, tại Việt Nam còn có loài H perforatum L (Cây ban âu, cỏ thánh

John) đã được nhập nội và đưa vào trồng trọt tại các tỉnh miền núi phía bắc nước ta

từ năm 2004 Ban âu được sử dụng bộ phận trên mặt đất của cây điều trị bệnh trầm cảm, ngoài ra còn được dùng làm thuốc trị bệnh gan, thuốc chống viêm, kháng khuẩn, chữa bỏng, chống virus, chống nghiện rượu [54]

1.1.2 Thành phần hóa học

Hiện nay nghiên cứu về chi Hypericum (Hypericaceae) đã thu hút được sự

quan tâm đặc biệt của khoa học vì các loài trong chi này mang lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao Tại Thổ Nhĩ Kỳ các nhà nghiên cứu đã tìm ra một số hoạt

chất trong 7 loài thuộc chi Hypericum như: hypericin, pseudohypericin, hyperforin,

adhyperforin, acid chlorogenic, acid neochlorogenic, acid caffeic, acid dihydroxybenzoic, 3,8-biapigenin, hyperoside, isoquercitrin, quercitrin, quercetin, avicularin, rutin, (+) - catechin và (-) – epicatechin [23]

2,4-Thành phần hóa học của chi Hypericum được chia thành 5 nhóm chính là

naphthodianthron, bianthraquinon, phloroglucinol, xanthon, flavonoid và các hợp chất khác [79]

1.1.2.1 Nhóm naphthodianthron và bianthraquinon

Có khoảng 12 dẫn chất thuộc nhóm naphthodianthron và ianthraquinon được phân lập từ chi Hypericum [79] Đây là nhóm chất phổ biến và có hoạt tính sinh học cao, điển hình là hypericin (Ia) và hyperforin (I ) được phân lập từ cây H perforatum Hoạt chất này có tác dụng chống trầm cảm, chống ung thư [69]

1.1.2.2 Nhóm phloroglucinol

Các hợp chất thuộc nhóm phloroglucinol đƣợc tìm thấy ở chi Hypericum rất

đa dạng, với 170 dẫn chất, đƣợc chia thành 5 nhóm: dẫn xuất của hyperforin, các sampsonion, các dẫn xuất acylphloroglucinol spirocyclic, các dẫn xuất rottlerin và các dẫn chất đơn giản của phloroglucinol [79] Trong đó đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong y học nhiều nhất là nhóm dẫn xuất của hyperforin

Hiện tại có khoảng 46 dẫn chất của hyperforin đƣợc phân lập từ 4 loài H papuanum, H scabrum, H sampsonii, H perforatum [79] Trong đó đáng chú ý nhất là 2 hợp chất adhyperforin (IIa) và hyperforin (II ) đƣợc phân lập từ loài H perforatum có tác dụng chống trầm cảm do khả năng ức chế mạnh mẽ sự hấp thu

dopamin, serotonin, và noradrenalin [41]

(IIa) = adhyperforin

(IIb) = hyperforin

1.1.2.3 Nhóm xanthon

Các dẫn chất xanthon rất phong phú, có khoảng 126 chất đã đƣợc phân lập từ

các loài thuộc chi Hypericum nhƣ: H ellipticum, H chinense, H scabrum, H beanii, H perforatum, H geminiflorum, H sampsoni Trong đó loài H chinense là

nguồn cung cấp xanthon nhiều nhất với khoảng 48 dẫn chất xanthon đã đƣợc phân lập từ loài này [79]

Hai dẫn chất xanthon đã đƣợc phân lập là: 4-sulfonat (IIIa) và1,3-dihydroxy-5-O-β-D-glycopyranosylxanthon-4-sulfonat

1,3-dihydroxy-5-methoxyxanthon-(IIIb), từ H sampsonii Cả 2 hợp chất này đều có biểu hiện độc tính trên dòng tế

ào ung thƣ P388 [79]

1.1.2.4 Nhóm flavonoid

Có khoảng 18 dẫn chất thuộc nhóm flavonoid được phân lập từ chi

Hypericum Trong đó loài H japonicum đóng góp nhiều nhất với 9 dẫn xuất

flavonoid đã được phân lập Một số flavonoid phổ iến là: quercetin, hyperin, rutin, quercitrin, kaempferol Hàm lượng flavonoid trong cây thường chiếm từ 2-4% [79] Đây là những hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong tự nhiên

(IVa) = quercetin; (IVb) = hyperin

Hơn 20 hợp chất từ vỏ thân loài H riparium đã được phân lập trong đó có 5

dẫn xuất của iscoumarinyl, 2 dẫn xuất của flavon, 2 dẫn xuất của steroid còn lại là

các dẫn xuất của este, acid, ether : 7,7’ Dihydroxy6,6’ biscoumarin (Va), 7,7’ Dihydroxy-8,8’ -biscoumarin (Vb), 7-Methoxy-6,7’ -dicoumarinyl ether (Vc), 2’ - Hydroxy-5’ -(7-methoxycoumarin-6’’-yl)-4’- methoxyphenylpropanoic acid (Vd),

-7,7’ -Dimethoxy-6,6’ - iscoumarin (Ve), 2’–Methoxyflavon, 3’–Methoxyflavon, Stigmast-4-en-3-on, Ergosta-4,6,8,22-tetraen-3-on

Trong đó các hợp (Va), (Vc), (Vd), (Ve) có tác dụng ức chế đáng kể trên dòng

tế ào ung thư tuyến tiền liệt của con người PC-3 và dòng tế ào ung thư đại tràng

HT-29 (thử nghiệm in vitro) Chưa tìm thấy tác dụng gây độc đối với tế ào ình

thường

1.1.3 Tác dụng dược lý

1.1.3.1.Tác dụng chống trầm cảm

Hypericin phân lập từ H perforatum là hoạt chất điển hình được sử dụng rộng

rãi để điều trị chứng rối loạn trầm cảm Cơ chế tác dụng của hợp chất này là ức chế enzym monoaminooxidase (MAO), ức chế thu hồi serotonin, norepinephrin, dopamin, điều hòa recepter serotonin [79]

Dẫn xuất của nhóm phloroglucinol là hyperforin cũng có tác dụng ức chế thu hồi serotonin (5-HT), dopamin (DA), noradrenalin (NA), gamma aminobutyric acid (GABA) và L-Glutamat do đó hoạt chất này cũng có tác dụng chống trầm cảm và một gợi ý cho việc tim kiếm nguyên liệu sản xuất thuốc tác dụng trên hệ thần kinh [20]

Ngoài ra các dẫn xuất thuộc nhóm flavonoid, bao gồm rutin được phân lập từ

H perforatum có tác dụng trên mô hình thử nghiệm chống trầm cảm FST (forced swimming test) [55] Quercetin phân lập từ H hircinum có tác dụng ức chế chọn lọc

monoamin oxidase (MAO có ở não bộ) trong thí nghiệm in vitro với giá trị IC50 là 0,010 µM [22]

1.1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, một số hợp chất được phân lập từ chi

Hypericum có khả năng gây độc trên tế ào ung thư, những hợp chất này là những

chất tiềm năng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư

Sáu dẫn xuất thuộc nhóm polycyllic acylphloroglucinol được đặt tên từ

hyperisampsin H–M (từ 1 đến 6) phân lập từ loài H sampsonii, trong đó

hyperisampsinH–M (3,4 và 6) có tác dụng gây độc một số tế ào ung thư người, đặc biệt là hyperisampsins H–M (3) có tác dụng gây độc trên tế ào ung thư bạch cầu[80]

Hyperisampsin H–M (3)

1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn

Trong một nghiên cứu thử nghiệm cao toàn phần của 50 loài khác nhau thuộc

chi Hypericum bằng cách thử nghiệm độ nhạy cảm trên đĩa Kir y-Bauer với vi khuẩn Paenibacillus (vi khuẩn Gram (+) gây bệnh trên ong mật) Kết quả cho thấy,

14 loài được xác định là có hoạt tính ức chế Paenibacillus Trong đó sáu hợp chất

là: hyperforin, uliginosin B, uliginosin A, 7-epiclusianone, albaspidin AA và

drummondin E có hoạt tính kháng khuẩn ức chế Paenibacillus với MIC dao động từ

0,168-220 μM [38]

Cao methanol toàn phần của loài H humifusum có tác dụng ức chế vi khuẩn

E coli, Pseudomona sp và Bacillus subtilis với giá trị MIC giao động từ (200-250 µg/ mL) [19]

Hai Hypericumxanthon A và được phân lập từ H sampsonii có tác dụng kháng khuẩn trong thử nghiệm in vitro đánh giá khả năng ức chế tụ cầu vàng kháng

methicillin (MRSA) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tương ứng là 16 và 32 μg/

mL Bên cạnh đó Hypericumxanthone còn có tác dụng ức chế 4 dòng tế bào ung thư người là tế ào ung thư vú (MCF-7), hepatoma (HepGa), ung thư ruột (HT-29)

và ung thư phổi (A549)[72]

1.1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa

Chi Hypericum chứa các dẫn xuất flavonoid, xanthon, phloroglucinol, và bezonephenon là những hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa tốt, được chứng minh qua nhiều thử nghiệm

Bốn dẫn xuất xanthon được phân lập từ loài H styphelioides là:

1,3,5-trihydroxy-2-(2′,2′-dimethyl-4′-isopropenyl)cyclopentanylxanthon(1)3,5 –dihydroxybenzophenon – 4 – α – D-glucosid (2), 5 – O - demethylpaxanthonin (3) và3 – geranyl – 1-(3-methyl utanoyl) phloroglucinol (4) được đem thử tác dụng chống oxy hóa trên 2 mô hình thí nghiệm là TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity) và CL (chemiluminescence) Kết quả cho thấy hai xanthon (1) và (3) có tác dụng chống oxy hóa tương đương với 2 chất chống oxy hóa hoá là quercetin và rutin, trong khi hai xanthon còn lại (2) và (4) có tác dụng kém hơn [34]

Năm dẫn xuất thuộc nhóm benzophenon và bốn dẫn xuất thuộc nhóm flavonoid là quercetin, quercitrin, isoquercetin và 3,8´´ - iapigenin được phân lập

từ loài H thasium Griseb Chín hoạt chất này được thử nghiệm hoạt tính chống oxy

hóa bằng mô hình CL (chemiluminescence) Kết quả cho thấy 2 dẫn xuất benzophenon ( A và B) có tác dụng ức chế quá trình sản xuất gốc oxy hóa ngoại

bào, còn quercetin, isoquercetin và 3,8 '' – biapigenin có tác dụng ức chế quá trình sản xuất gốc oxy hóa nội bào [26].

1.1.4 Công dụng

Trên thế giới, đặc biệt ở Ấn Độ và châu Âu, các loài Hypericum đã được sử

dụng để chữa bệnh trong dân gian từ trên 2000 năm Các loài được sử dụng phổ

biến nhất là H perforatum, H mysorence, H patulum, H polyanthenum, H Drummondii dùng điều trị chứng lo âu và giảm đau [42], [70]

H perforatum được sử dụng bộ phận trên mặt đất của cây điều trị bệnh trầm

cảm, ngoài ra còn được dùng làm thuốc chống virus, trị bệnh gan, thuốc chống viêm, kháng khuẩn, chữa bỏng, chống nghiện rượu [69] Ngoài ra các tác dụng ức

chế HIV-1 đã được nghiên cứu trên một số loài Hypericum hircinum, Hypericum roeperianum [30], [32]

Viện Dược liệu (Bộ Y tế) đã chủ trì đề tài cấp Bộ “Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi ” Trong đó

nghiên cứu chế phẩm flavonoid chiết xuất từ lá cây ban tròn (H patulum Thunb ex

Murray) làm thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi được gọi là “cao an tròn” (còn gọi là bột hypatin) Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của bột hypatin cho thấy bột hypatin có tác dụng bảo vệ gan, ức chế quá trình xơ gan, chống oxy hóa, chống viêm, lợi mật [1]

H japonicum dùng để trị rắn cắn [4] Ở Trung Quốc thường dùng để trị viêm

gan cấp, mạn, giai đoạn sớm của xơ gan cổ chướng, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm amygdal, viêm ruột thừa Ở Việt Nam dùng để trị bệnh sởi, sâu răng, hôi mồm, rắn cắn, hoàng đản, tiêu hóa kém, đầy bụng, ho [4]

H ascyron L được sử dụng để trị bệnh ngoài da, lậu, điều kinh, cầm máu, trừ

phong thấp, trị bị đòn ngã tổn thương, quả và hạt được phối hợp với các vị thuốc khác để trị bệnh ngoài da và điều hòa kinh nguyệt [4]

H sampsonii dùng để điều trị kinh nguyệt không đều, chảy máu cam, thổ

huyết, đái ra máu, phong thấp đau nhức, lỵ, ho, ra mồ hôi trộm, nhọt sưng đinh độc, rắn cắn, chốc đầu, bỏng nước sôi [4]

H nepaulense ở Vân Nam, Trung Quốc cây được dùng để trị trẻ em cam tích,

lỵ, loét miệng, hôi răng, trẻ em viêm gan hoàng đản [4]

Tại Việt Nam, đồng bào miền núi thường lấy lá cây H hookerianum vò ra

ngâm nước, để lắng lấy dịch trong dùng rửa mắt cho gia cầm bị đau mắt [4]

1.2 TỔNG QUAN VỀ HYPERICUM HOOKERIANUM

1.2.1 Thực vật học

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật

H hookerianum thuộc loại cây bụi cao đến 1,75m, bụi cây có đỉnh tròn, cành

thẳng đứng có nhiều nhánh, phần thân non có 4 cạnh, trong đó có 2 cạnh sắc hơn, chia đốt dài 1,2 đến 6cm, mỗi đốt không dài quá độ dài của lá Cuống lá dài 1-4mm, phiến lá thuôn dài hình lưỡi mác hoặc hình trứng, mặt dưới lá màu xám hoặc lam nhạt, lá có các vệt hoặc chấm nhỏ thưa dần từ giữa ra rìa lá Phiến lá có từ 3 đến 4 đôi gân chính, không nhìn thấy gân cấp 3 hình lưới, gân lá tạo các hình nêm nhọn hoặc hình trái tim chóp nhọn Ra hoa từ tháng 4 đến tháng 7 Cụm hoa có từ 1 đến 5 hoa mọc ở đầu cành, lá bắc hình lưỡi mác hay thuôn nhọn, cách đài hoa 3-16mm, rụng sớm Hoa có đường kính 3-6cm, hình chén, nụ hoa hình trứng hoặc hình cầu Đài hoa xếp vòng hình trứng ngược hoặc hình thìa, kích thước 5-10×4-8mm, trên đài hoa có những đường gân rõ nét rất đặc trưng, mép đài hoa có răng cưa nhỏ, đều Cánh hoa màu vàng kim đậm đến nhạt, dài gấp 3 lần đài hoa, mép nhẵn, hình trứng đến tròn Nhị hoa xếp thành bó, mỗi bó có 60-80 nhị, nhị dài nhất 5-9mm, độ dài trung bình bằng 0,25-0,35 lần độ dài cánh hoa Bầu nhụy hoa hình trứng, kích thước 5-7×4-8mm, vòi nhụy dài 2-4mm, bằng 0,35-0,7 lần độ dài bầu nhụy, cong dần hướng ra ngoài Quả hình tròn hoặc hình oval, kích thước 0,9-1,7 cm × 7-12 mm Hạt màu nâu đỏ sẫm, kích thước 0,7-1mm, không có gờ, vỏ ngoài có các đường mắt lưới [53], [78]

1.2.1.2 Phân bố

H hookerianum là một loài thuộc chi Hypericum, phân bố ở Nam, Đông Nam

Trung Quốc, angladesh, hutan, Đông Nam và Nam Ấn Độ, Myanmar, Nepal, Bắc Thái Lan và Bắc Việt Nam [52] Ở Việt Nam loài cây này được gọi là Ban hooker, phân bố ở Sapa (Lào Cai) [4], [8]

Hình 1.1 Bụi cây, hoa và quả H hookerianum 1.2.2 Thành phần hóa học

 Trên thế giới

Thành phần hóa học của H hookerianum chưa được nghiên cứu nhiều trên thế giới Theo Wilairat R và Manosroi J có 5 hoạt chất được phân lập từ H hookerianum Wight & Arn là: 5-Hydroxy-2 methoxyxanthon (VIa), 2-hydroxy-3-

methoxyxanthon (VIb), trans-kielcorin (VIc), 4-hydroxy-3-metoxyphenyl ferulat (VId) và Acid 3beta-O-caffeoylbetulinic (VIe) [76]

Các hợp chất trên đã được thử nghiệm chống lại sự phát triển của ba dòng tế

ào ung thư người là MCF-7, NCI-H460 và SF-268 Kết quả cho thấy các hợp chất (VId) và (VIe) thể hiện các dụng ức chế đáng kể 3 dòng tế ào ung thư này Hợp chất (VIc) có ác dụng kém hơn và hai hợp chất còn lại là (VIa) và (VIb) có tác dụng kém nhất Ngoài ra các hợp chất (VId) và (VIe) còn có tác dụng xúc tác cho phản ứng mitogenic giữa tế bào lympho với hemoagglutinin, với giá trị IC50 lần lượt là 26,1 ± 3,6 và 40,8± 4,9 [76]

Bảng 1.2 Các hoạt chất được phân lập từ H hookerianum (Wight & Arn.) trên

thế giới

1

5-Hydroxy-2 methoxyxanthon

2

methoxyxanthon

 Tại Việt Nam

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải (2017) đã ước đầu nghiên cứu loài H hookerianum Wight & Arn thu hái tại Sa Pa và thu được các kết quả sau:

Định tính được các nhóm chất hữu cơ chính trong lá, hoa, quả của loài ban H hookerianum gồm: flavonoid, coumarin, saponin, tanin, đường khử

Định tính được các nhóm chất hữu cơ chính trong thân loài ban H hookerianum gồm: flavonoid, saponin, tanin, đường khử

Tiến hành phân lập, xác định đươc cấu trúc của 03 hợp chất là epicatechin, 3,8’’-biapigenin và piceatannol trên phân đoạn Ethyl acetat [7]

Bảng 1.3 Các hợp chất được phân lập từ loài ban H hookerianum (Wight &

Arn.) thu hái tại Sapa

Trong hai thập kỷ gần đây, đã có một số công bố về nghiên cứu tác dụng dược

lý của H Hookerianum trên các tạp chí khoa học Một số nghiên cứu cho thấy loài

H hookerianum có tác dụng chống oxy hóa, kháng virus, ức chế tế ào ung thư, tác

dụng lên thần kinh trung ương, kháng khuẩn, chữa lành vết thương

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu của H Raghu Chandrashekhar và cộng sự sử dụng cao chiết methanol của lá, rễ, hoa và phần trên mặt đất của cây để khảo sát tác dụng chống

oxy hóa in vitro bằng 8 phương pháp khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 4

cao chiết được thử nghiệm đều có khả năng chống oxy hóa Tuy nhiên, mỗi cao

chiết có khả năng chống oxy hóa khác nhau Sau thử nghiệm in vitro, cao chiết

methanol của lá cho thấy có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất trên tất cả các

phương pháp, vì vậy mẫu này được tiếp tục đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vivo

trên chuột đực al ino đã ị gây độc tế bào gan bằng CCl4 sau đó cho chuột uống cao

chiết methanol của lá H hookerianum với các liều khác nhau có đối chứng bằng

silymarin, phân tích nồng độ của LPO, SOD và CAT trong huyết thanh và dịch ép

gan để đánh giá Kết quả cho thấy cao chiết lá H hookerianum có tác dụng chống oxy hóa in vivo mạnh [58]

Một nghiên cứu khác về tác dụng chống oxy hóa in vitro và in vivo của cao chiết phần trên mặt đất của H hookerianum được Atul Wahile và cộng sự thực hiện

với các phương pháp tương tự nghiên cứu của H Raghu Chandrashekhar cũng cho

kết quả cao chiết bộ phận trên mặt đất của H hookerianum có tác dụng chống oxy

hóa mạnh và bảo vệ tế bào gan bị gây độc bởi CCl4 [50]

1.2.3.2 Tác dụng chống virus

P Vijayan và cộng sự (Đại học Dược JSS, Ootacamund, Tamil Nadu, Ấn Độ)

nghiên cứu cho thấy cao chiết methanol phần trên mặt đất của H hookerianum có

tác dụng kháng virus đối với Herpes simplex virus type I (HSV-1) ở nồng độ không gây độc với tế bào chủ Theo đó, nồng độ ức chế 50% virus (IC50) của cao chiết chiết bằng phương pháp Soxhlet là 50μg/ml [70]

1.2.3.3 Khả năng gây độc tế bào

Vijayan P và cộng sự đã chiết bằng các dung môi khác nhau đối với các bộ

phận khác nhau của cây H hookerianum Các dịch chiết đó được sử dụng cho nhiều

phương pháp thử nghiệm đồng thời để đánh giá khả năng sống của một số dòng tế

ào ình thường và tế ào ung thư thông qua trị số IC50 Kết quả cho thấy cả 3 loại

dịch chiết methanol của lá, thân cây và phần trên mặt đất của H hookerianum đều

có tác dụng gây độc tế ào đối với cả dòng tế ào ình thường và ung thư [71]

1.2.3.4 Tác dụng chống ung thư

Nghiên cứu của Santoshkumar H Dongre (Ấn Độ) và cộng sự cho thấy cao

chiết methanol của H hookerianum được làm khô ở nhiệt độ 40-50oC dưới áp suất thấp được uống liều 100 và 200mg/kg thể trọng mỗi ngày 1 lần, trong 10 ngày làm tăng thời gian sống thêm trung bình lần lượt từ 18,5±0,22 đến 24,33±0,42 và 33,00±1,34 ngày trên chuột thí nghiệm được tiêm tế ào ung thư Dalton’s Lymphoma ascitic (DLA) so với nhóm chứng Thời gian sống thêm trong thử nghiệm này cũng cho thấy tác dụng làm tăng thời gian sống thêm của dịch chiết

methanol của H hookerianum tương đương với liệu pháp điều trị bằng methotrexat

liều uống 3,4mg/kg thể trọng là 26,16±0,36 ngày [28]

1.2.3.5 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Nghiên cứu của Pulok K Mukherjee đã khảo sát cao chiết của hai loài H patulum và H hookerianum với hai liều 200mg/kg và 400mg/kg trên các mô hình

động vật thí nghiệm khác nhau Sau đó nghiên cứu các thông số gồm: hoạt động tự nhiên của chuột, thăm dò hành vi chui đầu, thử nghiệm mê lô chữ Y, tác động đến thời gian ngủ và theo dõi tác động trên thân nhiệt của chuột Tất cả các thử

nghiệm cho thấy dịch chiết của H hookerianum làm tăng hoạt động tự nhiên của

chuột, tăng hành vi thăm dò của chuột, làm giảm thời gian ngủ của chuột được gây

ra bởi pentobarbiton Khi thử nghiệm tác dụng của các cao chiết với thân nhiệt của

chuột, kết quả cho thấy các cao chiết của H hookerianum làm giảm đáng kể thân

nhiệt của chuột được gây sốt, tuy nhiên không ảnh hưởng trên thân nhiệt bình

thường Cao chiết của H patulum không có tác dụng trên thân nhiệt chuột trong thử nghiệm này [53]

và Escherichia coli Kết quả cho thấy tất cả 6 mẫu thử đều thể hiện tác dụng kháng

khuẩn, trong đó cao chiết methanol của lá và thân có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất [51]

Ngoài các tác dụng trên, H hookerianum còn được biết đến có tác dụng chữa

lành vết thương trong y học cổ truyền Ấn Độ Tác dụng này đã được Pulok K Mukherjee và cộng sự khẳng định trong nghiên cứu của mình bằng thử nghiệm

dùng hai cao chiết methanol của lá thân H hookerianum Kết quả đã khẳng định cao chiết methanol phần trên mặt đất của H hookerianum có tác dụng làm lành vết

thương tốt, tác dụng mạnh hơn ở nồng độ cao và cao chiết từ lá có tác dụng mạnh hơn của thân Ngoài ra, cả hai loại cao chiết có hiệu quả tương tự với tác dụng co vết thương, thời gian khép miệng, sức bền kéo dãn, sự tái tạo của các mô ở bề mặt vết thương [52]

1.2.4 Công dụng

Trên thế giới, loài H hookerianum Wight & Arn được dùng ở Trung Quốc để

điều trị viêm bàng quang [8], ở Ấn Độ được dùng để điều trị các vết bỏng, làm lành các vết thương [52], điều trị trầm cảm, kích thích thần kinh trung ương [50]

Tại Việt Nam đồng bào miền núi thường lấy lá cây H hookerianum vò ra

ngâm nước, để lắng lấy dịch trong rửa mắt cho gia cầm đau mắt [4]

1.3 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXY HOÁ

1.3.1 Nguồn gốc của gốc tự do

Gốc tự do có thể được định nghĩa là ất kỳ tiểu phân hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập có chứa một electron chưa ghép cặp trong obitan nguyên tử Electron độc thân này quy định đặc tính chung của gốc tự do Gốc tự do không ổn định và có khả năng phản ứng cao [17]

Gốc tự do được hình thành theo 2 con đường:

- Nguồn ngoại sinh: khói thuốc lá, ô nhiễm môi trường, sự bức xạ, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, dung môi công nghiệp, ozon

- Nguồn nội sinh: hoạt động của ty thể, hoạt động xanthin oxidase, hoạt động của peroxid hóa lipid màng tế bào, quá trình viêm, quá trình thực ào, con đường arachidonat, tập thể dục quá sức, thiếu máu cục bộ [17]

1.3.2 Stress oxy hóa, tác hại của stress oxy hóa

Stress oxy hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng nghiêm trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxy hóa bảo vệ trong cơ thể theo hướng gia tăng gốc tự do

Ảnh hưởng của stress oxy hóa đã được công nhận trong nhiều tiến trình bệnh

lý bao gồm cả xơ vữa động mạch, tình trạng viêm, ung thư và quá trình lão hóa Việc sản xuất quá mức và không kiểm soát của ROS (kết quả của stress oxy hóa), đặc biệt ROS có nguồn gốc ty thể kích thích trực tiếp lên điều chỉnh của các cytokin viêm liên quan với các tình trạng bệnh lý khác nhau trong các bệnh liên quan đến viêm ở người [45]

1.3.3 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một phân tử ổn định có khả năng cho hoặc nhận của gốc tự do một electron để trung hòa gốc tự do này, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó Những chất chống oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy

tế bào chủ yếu là thông qua khả năng dọn gốc tự do của chúng [36]

Các chất chống oxy hóa được chia thành 2 loại [63]:

- Enzym chống oxy hóa: Superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT), và glutathion peroxidase (GSH-Px), glutathion (GSH), hệ thống các enzym của microsome gan (CytP450) Các chất này đặc biệt có nhiều ở gan, nơi chịu trách

nhiệm chính các phản ứng giải độc của cơ thể

- Các chất phi enzym: Là các chất chống oxy hóa không phải là enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể, nhưng rất ít chủ yếu là từ nguồn thức ăn ổ sung Hiện nay các nguồn bổ sung các chất chống oxy hóa nguồn gốc thiên nhiên được quan tâm và sử dụng nhiều do tính an toàn, khả năng hấp thu của nó Phổ biến nhất trong

tự nhiên như: vitmin C, beta-caroten, coenzym Q10, flavonoid

Flavonoid là các hợp chất polyphenolic có trong hầu hết các loài thực vật Vai trò chính của flavonoid đối với sức khỏe con người chủ yếu là hoạt tính chống oxy hóa mạnh Các hoạt chất thuộc nhóm flavonoid đã được báo cáo về tác dụng ngăn ngừa một số bệnh như ung thư, ệnh tim mạch, viêm khớp, lão hóa, đục thủy tinh thể, mất trí nhớ, đột quỵ, bệnh Alzheimer, viêm, nhiễm trùng, bệnh gan [59]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là phần trên mặt đất (gồm cành nhỏ, lá, hoa, quả) của

loài Hypericum hookerianum, họ Ban (Hypericaceae), thu hái tại xã Sa Pả, huyện

Sa pa, tỉnh Lào Cai tại thời điểm tháng 6/2016, được giám định tên khoa học Sau khi thu hái, chia nhỏ các bộ phận, rửa sạch, sấy khô, đóng gói ảo quản nơi khô ráo

để làm thực nghiệm

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

Hóa chất nghiên cứu

- Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: Methanol, n-hexan, ethyl acetat, n- utanol, nước cất Dung môi đo phổ NMR: aceton-d6, CD3OD

- Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

- Hoá chất nghiên cứu để định lượng GSH, SOD trong gan: Thuốc thử Ellman, đệm carbonat, đệm phosphat

- Hoá chất nghiên cứu tác dụng dọn gốc tự do: DPPH, dimethyl sulfoxid (DMSO) (Merck), nitroblue tetrazolium (NBT), xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 13 mg protein/ml), xanthin ≥ 99% (Sigma Aldrich), Quercetin (90,32%, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

- Các hóa chất nghiên cứu để xác định hàm lượng MDA trong gan: Acid thiobarbituric, kali clorid, acid tricloacetic

- Sylimarin 70mg, Paracetamol, bộ kit định lượng Biosystems (Spain)

- Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shella , đèn tử ngoại

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích ình cầu 10 lít, máy cất quay

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR, pipet chính xác

- Máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade

- Máy đo pH (EUTECH), cân phân tích AY 220 (SHIMADZU),

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể ( iotek, Hoa Kì) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

- Máy sinh hoá bán tự động TC 3300 Plus

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 20 ± 2g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật thí nghiệm được chăm sóc làm quen với điều kiện thí nghiệm trước 3-5 ngày nghiên cứu và trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng nuôi động vật thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chiết xuất, sàng lọc tác dụng chống oxy hoá in vitro từ các phân đoạn dịch chiết phần trên mặt đất cây ban Hypericum hookerianum

2.2.1.1 Chiết xuất cắn toàn phần và các phân đoạn

Mẫu dược liệu sau khi được thu hái, sấy khô ở 60°C và xay nhỏ thu được bột thô Sau đó đem ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 15 lít ngâm trong 72 giờ) Dịch chiết được gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (0,8amt, 50°C) thu được cắn toàn phần

Hòa cắn toàn phần với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC Sử dụng phương

pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là hexan, ethyl acetat và

utanol Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn thu được các

cắn tương ứng: n-hexan, ethylacetat, n-butanol Dịch nước còn lại cũng được cô đến

cắn

Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng

2.2.1.2 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự do DPPH Mẫu nghiên cứu: Cắn toàn phần và cắn các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, n- butanol, cắn nước từ phần trên mặt đất cây ban Hypericum hookerianum

Ngâm chiết với MeOH Dịch chiết MeOH

Thu hồi dung môi Cắn MeOH toàn phần

MeOH (sàng lọc tác Tạo hỗn dịch/nước, lắc với n-hexan Thu hồi Hx

Cắn phân đoạn Hx Phân đoạn nước

Chiết phân đoạn với EtOAc Dược liệu

Thu hồi EtOAc

Nguyên tắc:

DPPH (1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, ước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH, cho sản phẩm khử 1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazin có màu vàng Do đó, màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ màu tím sang vàng nhạt và độ hấp thụ của dung dịch tại ước sóng 517nm sẽ giảm

có nồng độ thích hợp

Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH:

Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH được tiến hành trên đĩa 96 giếng theo phương pháp đã được mô tả trước đây [21], [60] Trên mỗi đĩa 96 giếng (Costar 3596 - Corning, Mỹ) gồm có các giếng thử và giếng chứng Lần lượt thêm vào các giếng thử/chứng 20 µl dung dịch thử/methanol và 180 µl dung dịch DPPH (100 µM trong methanol) Sau khi lắc đều, đĩa được giữ trong bóng tối 30 phút Sau

đó, đo độ hấp thụ của các giếng ở ước sóng 517nm, sử dụng hệ thống máy ELISA ( iotek, Mĩ) Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của

chứng và thử được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng thay dung dịch DPPH bằng dung dịch methanol

Tác dụng dọn gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:

Trong đó, ∆ODchứng = ODchứng - ODtrắng; ∆ODthử= ODthử - ODtrắng

Xác định nồng độ có tác dụng dọn 50% gốc tự do DPPH của mẫu thử dựa trên

tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau (5-6 nồng độ/mẫu), sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình sigmoid trên phần mềm Graphpad Prism 5

2.2.1.3 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự do superoxid

Mẫu nghiên cứu: Cắn toàn phần và cắn các phân đoạn hexan, ethyl acetat, butanol, cắn nước từ dịch chiết phần trên mặt đất cây ban (Hypericum hookerianum)

n-Nguyên tắc

Gốc tự do superoxid O 2 được hình thành do enzym xanthin oxydase xúc tác

phản ứng oxy hóa xanthin Gốc O 2 sinh ra được định lượng bằng cách cho phản ứng với nitro blue tetrazolium (NBT), tạo ra sản phẩm có màu tím nhạt, hấp thu cực đại ở 560 nm Mẫu thử có khả năng ức chế gốc tự do superoxid sẽ làm giảm sự hiện diện của sản phẩm này, đo độ hấp thụ tại ước sóng 560nm [15]

Mẫu thử

Mẫu thử được hòa tan trong DMSO để được dung dịch gốc có nồng độ 10000 µg/ml Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng dung dịch đệm carbonat (50mM, pH

10,2) để thu được các dung dịch thử có nồng độ thích hợp

Phương pháp nghiên cứu

Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid của mẫu thử theo quy trình được

mô tả bởi Beauchamp C và cộng sự, với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện

thí nghiệm [18] Phản ứng được thực hiện trên đĩa 96 giếng Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm:

+ 40 µl đệm carbonat pH 10,2 (50 mM) có chứa EDTA 0,1 mM

+ 20 µl mẫu thử hoặc chất đối chiếu quercetin với các nồng độ thích hợp + 100 µl dung dịch xanthin 200 µM (pha trong đệm carbonat)

+ 20 µl dung dịch N T 100 µM (pha trong đệm carbonat)

+ 20 µl enzym xanthin oxidase (nồng độ được điều chỉnh để tốc độ thay đổi mật độ quang OD khoảng 0,016/phút)

Theo dõi động học của phản ứng bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại ước sóng 560 nm với tần suất 30 giây/lần trong thời gian 5 phút

Song song với các giếng thử, bố trí các giếng chứng, trong đó 20 µl dung dịch thử hoặc chất đối chiếu được thay bằng dung dịch đệm carbonat Tỷ lệ ức chế gốc

tự do superoxid của mẫu thử tại một nồng độ được tính theo công thức:

% ức chế superoxid = (ΔODchứng – ΔODthử) x 100/ ΔODchứng

Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của mẫu thử và chất đối chiếu dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau (5-6 nồng độ/mẫu), sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình sigmoid trên phần mềm Graphpad Prism 5

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

-Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít

bột Mg kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5) giọt Để yên một vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam

- Phản ứng với FeCl 3

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện dung dịch màu xanh đen

- Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt

dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa vàng và khi thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm

 Định tính coumarin:

Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành các phản ứng sau:

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết:

Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

Ống 2: để nguyên

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát

Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250

ml, thêm 5 ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi 15 phút Lọc nóng qua giấy lọc Cho 0,5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm trong 30 giây Để yên Quan sát cột bọt sau 15 phút

 Định tính glycosid tim:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bính nón dung tích 250

ml Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 30 ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml, gạn lớp cloroform vào một cốc

có mỏ đã được sấy khô Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natrisulfat khan Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô, cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng sau:

Phản ứng Liebermann – Burchardat

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn Glycosid tim 1 ml anhydrid acetic Lắc đều cho tan hết cắn Nghiếng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

 Định tính tanin

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút, để nguội, lọc, dịch lọc được dùng để làm các phản ứng định tính sau:

Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 2 giọt dung dịch FeCl35% (TT) Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen

Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT)

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông

Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng

 Định tính alcaloid:

Cân 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích

100 ml, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8 ml) đến pH = 9 -

10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml) Gộp các dịch chiết cloroform Loại nước bằng natrisulfat khan Lấy một phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

Ống 1: TT Mayer, phản ứng dương tính nếu có tủa từ màu trắng đến vàng Ống 2: TT Bouchardat, phản ứng dương tính nếu có tủa nâu đến đỏ nâu

Ống 3: TT Dragendoff, phản ứng dương tính nếu có tủa vàng cam đến đỏ

 Định tính anthranoid: Phản ứng Borntraeger

Chiết xuất: Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10 ml) Thêm 5ml

nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, lấy 1 ml dịch chiết

cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu

có anthranoid lớp nước sẽ có màu đỏ sim

 Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính sau:

Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước Thêm

vào 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling Đun cách thủy 10 phút Phản ứng dương tính nếu đáy ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch

Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn cho vào mỗi ống:

Ống 1: 4 ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Quan sát và so sánh hai ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2

Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước Thêm

vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi 10 phút Phản ứng dương tính nếu dung dịch có màu tím hoặc xanh tím

Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4 ml dịch chiết nước Thêm

một ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu có hiện tượng bọt khí sủi lên

2.2.2.2 Phân lập các hợp chất

Sau khi tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của các phân đoạn dịch

chiết trong dung môi có độ phân cực khác nhau chiết xuất từ mẫu nghiên cứu, lựa chọn phân đoạn có hoạt tính tốt cho quá trình phân lập hợp chất tiếp theo Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương pháp sắc kí cột với các chất hấp phụ silica gel pha thuận, pha đảo Sắc ký lớp mỏng được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập [5], [13]

Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu:

 Sắc ký cột:

+ Cột thủy tinh: đường kính thay đổi từ 1-10cm, chiều dài thay đổi từ 30-100cm + Pha tĩnh: thường dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm (dùng cho cột to đường kính khoảng 10 cm) hoặc 40-63 μm (dùng cho cột có đường kính 5 cm trở xuống); silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm

+ Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột:

Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột

+ Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc

2.2.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất

- Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM) được xác định căn cứ vào tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ: phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13

C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu

đã công ố

2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng paracetamol (PAR) [15], [35], [68] Dùng chất đối chiếu dương là silymarin ( iệt dược Legalon 70)

dạng viên nang cứng hàm lượng 54,1mg silymarin trong mỗi viên của hãng MEDA

Pharma (Bỉ)

Nguyên tắc:

Trên người, quá liều paracetamol gây ra tổn thương gan nghiêm trọng và có liên quan đến sự hình thành phức hợp với protein, tổn thương ty thể và ADN [25], [48] Khi vào cơ thể, khoảng 90% paracetamol liên hợp với sulfat hoặc glucuronid thành chất chuyển hóa không có độc tính và được thải trừ qua nước tiểu Khoảng 5- 10% paracetamol được chuyển hóa qua CYP450 tạo thành N-acetyl-p-benzoquinonimin (NAPQI) [49] NAPQI được tạo thành nhanh chóng liên kết với nhóm sulfhydryl của glutathion tạo thành chất chuyển hóa không độc Tuy nhiên, nếu dùng liều cao paracetamol, chất chuyển hóa NAPQI được tạo thành ổ ạt vượt quá khả năng liên hợp với lượng glutathion của gan Khi đó, NAPQI liên kết cộng hóa trị với protein gan dẫn đến hoại tử tế bào gan [66]

Để đánh giá mức độ phá hủy tế bào gan của PAR, đề tài tiến hành định lượng hoạt độ các enzym transaminase trong huyết thanh gồm ASAT (Aspartat aminotransferase) và ALAT (Alanin aminotransferase) [9], [10]

Để nghiên cứu cơ chế tác dụng của dược liệu có liên quan đến quá trình oxy hóa hay không, đề tài tiến hành định lượng đồng thời nồng độ malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm sinh ra do quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào, nồng độ GSH

và hoạt độ của enzym SOD trong gan–các chất tham gia vào quá trình chống oxy hóa trong cơ thể

Mẫu nghiên cứu:

Lựa chọn mẫu nghiên cứu qua quá trình sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro Tiến hành trên cắn toàn phần và cắn phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa tốt

nhất Thí nghiệm với 2 mức liều 250mg/kg và 500mg/kg cân nặng

Tiến hành:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 8 con

- Lô 1 (chứng sinh lý): uống nước cất hàng ngày với thể tích 0,1ml/10 g cân nặng