Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng sinh học của lá bù dẻ hoa đỏ uvaria rufa bl , annonaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---TRẦN THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LÁ BÙ DẺ HOA ĐỎ - Uvaria rufa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-TRẦN THỊ MINH TÂM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LÁ BÙ DẺ HOA ĐỎ -

Uvaria rufa Bl., Annonaceae

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS HUỲNH NGỌC THỤY

TP Hồ Chí Minh – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Trần Thị Minh Tâm

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2016 – 2018

Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng sinh học của lá

Bù dẻ hoa đỏ - Uvaria rufa Bl., Annonaceae

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy

Học viên thực hiện: Trần Thị Minh Tâm

Mở đầu: Tại Việt Nam, Bù dẻ hoa đỏ đang được sử dụng độc vị trong hỗ trợ điều trị đái

tháo đường tại các phòng khám Bình Dương Đề tài tiếp tục các nghiên cứu về Bù dẻ trên

bộ phận dùng là lá

Đối tượng nghiên cứu:

Lá Bù dẻ hoa đỏ (Uvaria rufa Bl.,) thu hái tại Tân Uyên – Bình Dương vào tháng 10/2016.

Phương pháp nghiên cứu:

Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, thử tinh khiết

Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa trên mô hình DPPH, tác dụng ứcchế α-glucosidase và độc tế bào trên mô hình MTT với ba dòng tế bào MDA-MB 231, RD,HepG2 trên đĩa 96 giếng Phân lập, tinh chế chất tinh khiết

Kết quả:

Xác định nguyên liệu: nguyên liệu là Bù dẻ hoa đỏ đạt các tiêu chuẩn để tiến hành nghiên

cứu

Khảo sát các tác dụng sinh học: thử các cao cồn toàn phần, cao CHCl3, EtOAc, MeOH về

3 tác dụng, cho thấy cao EtOAc mạnh nhất, tiếp đó là CHCl3, tiếp tục tiến hành phân lập

Khảo sát hóa học theo định hướng sinh học:

Từ 5,5 kg lá Bù dẻ, chiết ngấm kiệt thu được 550 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố lỏng –

Từ 100 g cao CHCl3, tiến hành chiết rắn – lỏng thu được 8 phân đoạn, trong đó từ phân đoạn

A4 thu được hợp chất pipoxide chlorohydrin (UR1a-1, 400 mg), từ phân đoạn A6 thu được

hợp chất daucosterol (UR1a-2, 300 mg) Từ phân đoạn A5 (5,8 g) qua sắc ký cột thu được

18 phân đoạn nhỏ hơn, trong đó phân đoạn A5.9 phân lập được hợp chất zeylenol (UR1a-3,

30 mg), A5.13 phân lập được hợp chất uvarirufol A (15 mg) Pipoxide chlorohydrin lần

đầu được báo cáo phân lập từ loài Bù dẻ Uvaria rufa Bl.,

Từ 19,7 g cao EtOAc, thu được phân đoạn B3 có hoạt tính mạnh, từ B3 (6,5 g) qua sắc ký

cột thu được 17 phân đoạn, trong đó phân đoạn B3.9 phân lập được isoquercitrin (UR1b-2,

isoquercetin = 3,33 µM, IC50 rutin = 16,42 µM

Bàn luận: cần tiếp tục các thử nghiệm về tác dụng sinh học trên các chất tinh khiết.

THESIS OF MASTER OF PHARMACY – Course: 2016 – 2018

Major: Traditional Pharmacy – Code: 8720206

BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FROM LEAVES OF Uvaria rufa Bl.,

Annonaceae

Instructor: Huynh Ngoc Thuy, Assoc Prof., Dr

Student: Tran Thi Minh Tam

Introduction:

Uvaria rufa Bl., has been using in supporting treatment diabetes in Binh Duong, Viet Nam.

This study was conducted on leaves

In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant , α-glucosidase inhibitory

and cytotoxic activities were performed on TLC and 96 well plate with MDA-MB 231, RD,HepG2 cell lines

Results

Bio-assay screening :

Screening in vitro antioxidant effect, inhibitory effects of α-glucosidase, cytotoxic on EtOH

Chemical composition :

5,5 kg of leaf powder was extracted with 96% ethanol to yield 550 g extract, which

fractions

100 g CHCl3 extract was blended silicagel and distributed solvent to obtain 8 segments From

A4, pipoxide chlorohydrin (UR1a-1, 400 mg) was isolated, from A6, obtain daucosterol (UR1a-2, 300 mg) From A5 (5,8 g), by column chromatography, zeylenol (UR1a-3, 30 mg) and uvarirufol A (15 mg) were isolated This is the first time pipoxide chlorohydrin was

reported as the constituent of Uvaria rufa Bl.,

From 6,5 g B3 of 19.7 g EtOAc extract), by column chromatography, isoquercitrin

(UR1b-2, 50 mg) and rutin (UR1b-3, 5 mg) were isolated Antioxidant effects DPPH: IC50

isoquercetin = 3,33 µM, IC50 rutin = 16,42 µM

Conclusion

Uvaria rufa has potetial on treatment diabetes and cancers Futher studies about the effect

of constituents from this plant have to be conducted

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về thực vật học 2

1.1.1 Tổng quan họ Annonaceae 2

1.1.2 Tổng quan chi Uvaria 3

1.1.3 Tổng quan loài Bù Dẻ 5

1.2 Tổng quan về hóa học 6

1.2.1 Tổng quan hóa học chi Uvaria 6

1.2.2 Tổng quan hóa học loài Uvaria rufa 9

1.3 Tác dụng dược lý và công dụng 13

Tác dụng chống oxy hóa: 13

Tác dụng ức chế AGEs: 13

Tác dụng điều trị đái tháo đường 13

Tác dụng kháng khuẩn 14

Tác dụng làm giảm tăng sinh tiền liệt tuyến (BPH) 14

1.4 Tổng quan về oxy hóa và các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa 15

1.4.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa 15

1.4.2 Một số phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa: 16

1.5 Tổng quan bệnh đái tháo đường và các phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học định hướng hỗ trợ điều trị đái tháo đường 18

1.5.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường 18

1.5.2 Phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học định hướng hỗ trợ điều trị tiểu đường 19

1.6 Tổng quan về bệnh ung thư và các phương pháp tiến hành sàng học tác dụng độc tế bào 19 1.6.1 Tổng quan về bệnh ung thư 19

1.6.2 Phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng độc tế bào 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 22

2.2 Dung môi, hóa chất, thiết bị: 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 24

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về thực vật 24

2.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Bù dẻ: 24

2.3.3 Thử tinh khiết 24

2.3.4 Phương pháp sàng lọc sinh học 25

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu về hóa học 30

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Xác định nguyên liệu: 33

3.1.1 Đặc điểm hình thái: 33

3.1.2 Khảo sát vi học: 33

3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Bù dẻ hoa đỏ 37

3.3 Thử tinh khiết 38

3.4 Khảo sát tác dụng sinh học của các cao chiết lá Bù dẻ hoa đỏ 38

3.5 Kết quả chiết xuất phân lập theo kết quả sinh học: 41

3.5.1 Quy trình chiết xuất và tách phân đoạn cao lá Bù dẻ hoa đỏ: 41

3.5.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao CHCl 3 42

3.5.3 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao EtOAc 48

3.5.4 Tinh chế, kiểm tra độ tinh khiết các chất 52

3.6 Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập: 59

3.6.1 Hợp chất UR1a-1: 59

3.6.2 Hợp chất UR1a-2: 61

3.6.3 Hợp chất UR1a-3: 63

3.6.4 Hợp chất UR1a-4: 65

3.6.5 Hợp chất UR1b-2: 67

3.6.6 Hợp chất UR1b-3: 69

3.7 Thử tác dụng sinh học của một vài chất phân lập 72

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 74

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 78

PHỤ LỤC 82

PHỔ MS 1

PHỔ NMR 4

SỐ LIỆU THỬ SINH HỌC 83

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 13C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân C13

2 1H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

proton

-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

STT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.Thành phần các chất trong từng mẫu trên đĩa 96 giếng ở thử nghiệm

HTCO 27

Bảng 2.2 Thành phần các chất trong từng mẫu trên đĩa 96 giếng ở thử nghiệm ức chế α-glucosidase 28

Bảng 3.3 Độ ẩm bột dược liệu lá Bù dẻ 38

Bảng 3.4 Độ tro bột lá Bù dẻ 38

Bảng 3.5 Hàm lượng chất chiết được 38

Bảng 3.6 Kết quả HTCO các cao chiết lá Bù dẻ trên đĩa 96 giếng 40

Bảng 3.7 Kết quả ức chế α-glucosidase các cao chiết lá Bù dẻ trên đĩa 96 giếng 40

Bảng 3.8 Kết quả ức chế tế bào của các cao chiết Bù dẻ trên đĩa 96 giếng 41

Bảng 3.9 Kết quả ức chế tế bào của cao chiết EtOAc lá Bù dẻ 41

Bảng 3.10 Kết quả các phân đoạn chiết rắn – lỏng cao CHCl3 43

Bảng 3.11 Kết quả HTCO các cao phân đoạn CHCl3 44

Bảng 3.12 Kết quả tác dụng ức chế α-glucosdase các cao phân đoạn CHCl3 44

Bảng 3.13 Kết quả ức chế tế bào của các PĐ CHCl3 tại nồng độ 100 µg/ml 45

Bảng 3.14 Kết quả ức chế tế bào RD của các phân đoạn cao CHCl3 46

Bảng 3.15 Các phân đoạn sắc ký cột từ phân đoạn A5 47

Bảng 3.16 Các phân đoạn cao EtOAc lá Bù dẻ 48

Bảng 3.17 Kết quả HTCO các phân đoạn cao EtOAc 49

Bảng 3.18 Kết quả tác dụng ức chế α-glucosidase các phân đoạn cao EtOAc 49

Bảng 3.19 Các phân đoạn sắc ký cột của phân đoạn B3 51

Bảng 3.20 Kết quả phân tích UPLC-PDA của các chất phân lập từ lá Bù dẻ 58

Bảng 3.21 Bảng so sánh dữ liệu phổ của UR1a-1 (DMSO-d6) và pipoxide chlorohydrin (CD3OD) 61

Bảng 3.22 Bảng so sánh dữ liệu phổ của daucosterol (DMSO-d6) và UR1a-2 (DMSO-d6) 62

Bảng 3 23.Bảng so sánh dữ liệu phổ của UR1a-3 (DMSO-d6) và zeylenol (CD3OD) 64

Bảng 3.24 Bảng so sánh dữ liệu phổ của UR1a-4 (DMSO-d6) và zeylenol (CD3OD) 66Bảng 3.25 Bảng so sánh dữ liệu phổ của Isoquercitrin (DMSO-d6) và UR1b-2(DMSO-d6) 68Bảng 3 26 Bảng so sánh dữ liệu phổ của UR1b-3 (DMSO-d6) và rutin (DMSO-d6) 71Bảng 3.27 Kết quả HTCO của 4 hợp chất tinh khiết từ Bù dẻ 72Bảng 3.28 Kết quả tác dụng ức chế α-glucosidase của ba hợp chất tinh khiết từ Bù

dẻ 73

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình lá, hoa, quả loài Uvaria rufa 5

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất mẫu thử sinh học lá Bù dẻ hoa đỏ 25

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm thử DPPH trên đĩa 96 giếng 27

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm thử khả năng ức chế α-glucosidase trên đĩa 96 giếng 29

Hình 3.5 Cây Bù dẻ hoa đỏ (a) bụi cây, (b) chồi, (c) cành và nụ, (d) lá, (e) hoa, (f) quả 33

Hình 3.6 Vi phẫu lá Bù dẻ (a) tổng quát, (b) sơ đồ, (c) vi phẫu chi tiết gân lá, (d) phiến lá 34

Hình 3.7 Vi phẫu thân Bù dẻ (a) tổng quát (b) sơ đồ (c) chi tiết 35

Hình 3.8 Vi phẫu rễ Bù dẻ (a) tổng quát, (b) sơ đồ, (c) chi tiết 36

Hình 3.9 Các cấu tử của bột thân, lá, rễ Bù dẻ 37

Hình 3.10 Sơ đồ chiết xuất mẫu lá Bù dẻ hoa đỏ dùng trong thử nghiệm sinh học 39 Hình 3.11 Kết quả ức chế DPPH các cao chiết lá Bù dẻ trên bản mỏng silica gel 39

Hình 3.12 Quy trình chiết xuất, phân tách cao phân đoạn từ lá Bù dẻ hoa đỏ 42

Hình 3.13 Sắc ký đồ các cao phân đoạn lá Bù dẻ 42

Hình 3.14 Sắc ký đồ các phân đoạn chiết rắn – lỏng cao CHCl3 43

Hình 3.15 Biểu đồ HTCO các cao phân đoạn CHCl3 tại nồng độ 0,1mg/ml 44

Hình 3.16 Biểu đồ ức chế α-glucosidase các cao phân đoạn CHCl3 tại nồng độ 0,25mg/ml 45

Hình 3.17 Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký cột A5 48

Hình 3.18 Sắc ký đồ các phân đoạn cao EtOAc 49

Hình 3.19 Biểu đồ HTCO tại 0,1 mg/ml và ức chế α-glucosidase tại 0,25 mg/ml các cao PĐ EtOAc 50

Hình 3.20 Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký cột của phân đoạn B3 52

Hình 3.21 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1a-1 trên SKLM 52

Hình 3.22 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của UR1a-1 53

Hình 3.23 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1a-2 trên SKLM 54

Hình 3.24 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1a-3 trên SKLM 54

Hình 3.25 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của UR1a-3 55

Hình 3.26 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1a-4 trên SKLM 55

Hình 3.27 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của UR1a-4 56

Hình 3.28 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1b-2 trên SKLM 56

Hình 3.29 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của UR1b-2 57

Hình 3.30 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết UR1b-3 trên SKLM 58

Hình 3.31.Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của UR1a-3 58

Hình 3.32 Sơ đồ chiết xuất – phân lập lá Bù dẻ hoa đỏ 59

Hình 3.33 Công thức cấu tạo và một vài tương tác HMBC, COSY của UR1a-1 60

Hình 3.34 Công thức hóa học của UR1a-2 (daucosterol) 62

Hình 3.35 Công thức cấu tạo và một vài tương tác HMBC, COSY của UR1a-3 64

Hình 3.36 Công thức cấu tạo và một vài tương tác HBMC, COSY của UR1a-4 66

Hình 3.37 Công thức cấu tạo và một vài tương tác HBMC, COSY của UR1b-2 68

Hình 3.38 Công thức cấu tạo và một vài tương tác HBMC, COSY của UR1b-3 70

Hình 3.39 Biểu đồ HTCO của UR1b-2 (a) và UR1b-3 (b) 72

MỞ ĐẦU

Những kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng dược liệu giúp việc lựa chọn nhữngcây thuốc có tiềm năng; những thử nghiệm sàng lọc sinh học giúp cho việc xác minhnhững kinh nghiệm sử dụng này Việc kết hợp tri thức bản địa và thử nghiệm khoahọc là con đường nhanh và ít tốn kém hơn trong việc phát triển thuốc mới hiện nay

Qua tìm hiểu thực tế và tham khảo tài liệu, nhận thấy các loài trong chi Uvaria (họ

Na – Annonaceae) từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian Riêng với loài Bù

dẻ hoa đỏ (Uvaria rufa) trong những năm gần đây đang được các cơ sở chữa bệnh ở

Bình Dương dùng độc vị trong điều trị đái tháo đường bên cạnh tác dụng dùng chophụ nữ sau sinh để phục hồi sức khỏe đã được sử dụng lâu năm Ngoài ra, với nhữngkhảo sát sàng lọc do nhóm thực hiện đề tài tiến hành, bước đầu cho thấy dịch chiếtcủa rễ, thân, lá Bù dẻ hoa đỏ đều cho hoạt tính độc tế bào

Năm 2015 nhóm nghiên cứu tại BM Dược liệu, Khoa Dược – Đại học Y Dược TP

Hồ Chí Minh đã tiến hành sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase của lá, thân, rễ Bù

dẻ hoa đỏ cho thấy tiềm năng của cả ba bộ phận trong việc điều trị đái tháo đường,nhóm tác giả cũng đã khảo sát phân lập được 6 chất tinh khiếttừ cao chiết chloroform

có tác dụng của thân cây bù dẻ (thu hái tại Bình Phước) [12] Năm 2017, nhómnghiên cứu đã tiếp tục khảo sát phân lập được 3 flavonoid từ rễ cây Bù dẻ [11]

Để tiếp tục đề tài, chúng tôi đặt vấn đề : “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định

hướng tác dụng sinh học của lá Bù dẻ hoa đỏ - Uvaria rufa Bl., Annonaceae” nhằm

khảo sát thành phần hóa học của lá cây Bù dẻ theo hướng sàng lọc tác dụng sinh học

nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn nguyên liệu này.Đề tài sẽ được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau:

- Sàng lọc in vitro các tác dụng chống oxy hóa, ức chế α-glucosidase, độc tính

tế bào của cao chiết toàn phần, các phân đoạn của lá Bù dẻ hoa đỏ

- Chiết xuất và phân lập các phân đoạn, chất tinh khiết trong lá Bù dẻ hoa đỏtheo định hướng của kết quả sàng lọc sinh học

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng các kỹ thuật phổ NMR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ngọn hay nách lá, kiểu vòng xoắn, đều, lưỡng tính ít khi đơn tính khác gốc hay tạp

tính Đế hoa lồi Bao hoa: thường gồm 3 vòng, mỗi vòng có 3 bộ phận, vòng ngoài

là lá đài, 2 vòng trong là cánh hoa Đài có thể rời hay dính, thường tiền khai van

Cánh hoa to, dày và mềm; đôi khi hoa chỉ có 3 cánh Bộ nhị: nhiều nhị rời xếp theo

một đường xoắn ốc Chỉ nhị rất ngắn Chung đới tận cùng bằng một phụ bộ hình phiếnđứng hay quặp xuống, hình đĩa lồi hay hình nón nhọn giống như một đầu đinh, rộngbằng hay to hơn bao phấn Ô phấn hẹp, mở bằng một đường nứt dọc, hướng ngoài

Bộ nhụy: nhiều lá noãn rời xếp khít nhau, nhưng đôi khi giảm còn 3 hoặc 1 lá noãn,

số noãn thay đổi Vòi nhụy ngắn Quả: thông thường theo 2 kiểu:

– Kiểu Annona: Quả tụ, mỗi lá noãn cho một quả mọng riêng biệt và tất cả các quả

này dính vào nhau

– Kiểu Cananga: Mỗi lá noãn cho một quả mọng có cuống và mỗi hoa cho một chùm quả mọng Mỗi quả mọng mang 2 hàng hạt Ở cây Gié nam (Unona cochinchinensis

Lour.), mỗi lá noãn cho ra một chuỗi hạt thắt lại thành nhiều khúc, mỗi khúc đựngmột hạt

Hạt có vỏ cứng, láng Nội nhũ to, xếp nếp

Cơ cấu học: Tế bào tiết tinh dầu trong tất cả các mô mềm.

Annonaceae là họ lớn nhất của bộ Magnoliales, hiện nay trên thế giới có khoảng 120– 130 chi và trên 2000 loài

Ở Việt Nam có khoảng 29 chi: Alphonsea, Anaxagorea, Annona, Anomianthus, Artabotrys, Cananga (Canangium), Cyathocalyx, Cyathostemma, Dasymaschalon, Desmos (Unona), Drepananthus, Enicosanthellum, Enicosanthum, Fissistigma, Friesodielsia (Oxymitra), Goniothalamus (Becariodendron), Meiogyne, Melodorum Rauwenhoffia, Miliusa (Saccopetalum), Mitrella, Mitrephora, Orophea, Phaeanthus, Polyalthia, Popowia, Pseuduvaria, Sageraea, Uvaria (Uvariella), Xylopia; gần 179

loài

1.1.2 Tổng quan chi Uvaria

Uvaria là một trong những chi lớn nhất của họ Annonaceae, phân bố rộng rãi ở châu

Á, châu Phi và châu Úc Số lượng loài theo các tác giả không thống nhất, chúng biếnđổi từ 100 loài (theo Sinclair, 1956) đến 175 loài (theo Fries, 1959)

Dây leo thân gỗ hay bụi trườn Phần non của cây có lông hình sao Lá thường có gânbên khá rõ ở mặt dưới Trong các tế bào biểu bì lá có tinh thể họp thành khối nhỏ.Hoa lưỡng tính, thường đối diện với lá, mọc đơn độc hoặc họp thành cụm hoa dạngxim Lá đài 3, xếp van, thường họp ở gốc thành đầu và không hiếm khi đài hoàn toànbao kín nụ hoa Cánh hoa thường 6, phần lớn rời nhau, xếp lợp, thành 2 vòng (rất ítkhi cánh hoa 9 và xếp thành 3 vòng); các cánh hoa xòe ra khi hoa nở và gần giốngnhau về hình dạng và kích thước Nhị nhiều, có trung đới dày (dạng uvarioid); màotrung đới hình đĩa hay gần hình cầu (lớn hơn bao phấn) hoặc hình lưỡi nhỏ (hẹp hơnbao phấn); bao phấn hướng ngoài; đôi khi những nhị ngoài không có bao phấn (trởthành nhị lép) và rõ ràng lớn hơn các nhị trong Hạt phấn từ trung bình đến lớn (40 –

80 µm) hình gần cầu, đơn độc, thường đối xứng tỏa tròn và không có miệng; ít khi dicực (heteropolar) và đối xứng hai bên (bilateral), vỏ ngoài lồi lõm Lá noãn nhiều,không có vòi, núm nhụy hình móng ngựa rất đặc sắc Noãn thường nhiều (5 – 30)đính thành 2 hàng, dọc theo đường nối bụng (hiếm khi noãn 1 – 4) Phân quả dạngmọng, thường có cuống rõ (đôi khi cuống rất dài) [2].

Ở Việt Nam có 16 (17?) loài [1]:

- Uvaria cordata (Dun) Wall ex Alston – Bù dẻ lá lớn

- Uvaria microcarpa Champ ex Benth – Bù dẻ trườn

- Uvaria hamiltonii Hook F & Thoms – Bù dẻ hoa vàng

- Uvaria fauveliana (Fin & Gagnep) Ast – Bù dẻ râu

- Uvaria rufa Blume – Bù dẻ hoa đỏ

- Uvaria flexuose Ast – Bù dẻ còng queo

- Uvaria micrantha (A DC.) Hook F & Thoms – Kỳ hương

- Uvaria pierrie Fin & Gagnep – Bù dẻ lá lõm

- Uvaria boniana Fin & Gagnep – Bù dẻ trơn

- Uvaria lurida Hook F & Thoms – Bù dẻ nâu xỉn

- Uvaria grandiflora Roxb Ex Hornem – Chuối con chông

- Uvaria calamistrata Hance – Lá men

- Uvaria sphenocarpa Hook F & Thoms – Bù dẻ gai

- Uvaria dac pierrie Fin & Gagnep – Bồ quả đác

- Uvaria varaigneana Pierrie ex Fin & Gagnep – Bù dẻ varalgn

- Uvaria hirsuta Jack – Bù dẻ lông dài

- Uvaria pachychila Merr ex Ast (?) – Bồ quả phiến dày

Các loài được dùng làm thuốc ở Việt Nam [3]

1.1.2.1 Uvaria calamistrata Hance – Lá men, Bồ quả quăn, Bù dẻ quăn

Dân gian dùng lá chế men rượu, và trước đây cũng thường xuất sang Trung Quốc Vỏcây được sử dụng ở Quảng Tây (Trung Quốc) làm thuốc thu liễm

1.1.2.2 Uvaria cordata (Dun) Wall ex Alston (U macrophylla) – Bù dẻ lá lớn,

Dất lông, Bồ quả lá to, Nam kỳ hương

Lá và rễ được dùng làm thuốc Rễ được xem như có tác dụng chống đau và cầm ỉachảy; lá làm giảm đau và tiêu sưng

Ở Trung Quốc thường được dụng trị: 1 Khó tiêu, đầy bụng, ỉa chảy; 2 Phong thấp,lưng gối đau mỏi, chấn thương bầm dập Thường dùng rễ hoặc lá sắc uống Nếu dùngngoài, dùng lá tươi giã đắp hoặc phơi tán bột rịt.

Đồng bào Tày cũng dùng lá này chế men nấu rượu

1.1.2.3 Uvaria grandiflora Roxb Ex Hornem (U purpurea Blume.) – Chuối

con chông, Bù dẻ hoa toLoài cầy giông (chông) rất thích ăn quả cây này Ở Quảng Tây (Trung Quốc), rễ đượcdùng làm thuốc trị hầu họng sưng đau

1.1.2.4 Uvaria micrantha (A DC.) Hook F & Thoms – Bù dẻ hoa nhỏ, Kỳ hương

Vỏ thân dùng làm thuốc bổ, giúp tiêu hóa Nhân dân ở An Giang thường dùng rễ và

lá làm thuốc thông hơi, lợi tiêu hóa chữa chứng khó tiêu, đầy bụng và làm thuốc giảmđau trị đau lưng, nhức mỏi thường dùng dưới dạng thuốc sắc

1.1.2.5 Uvaria microcarpa Champ ex Benth – Bù dẻ trườn, Bồ quả trái nhỏ

Vỏ cho sợi dùng dệt bao tải Tại Vân Nam, Quảng Tây và nhiều nơi khác ở TrungQuốc, rễ và lá được dùng làm thuốc trị tiêu hóa kém, đầy bụng, ỉa chảy, đòn ngã tổnthương, lưng gối tê đau và phong thấp Thường dùng dạng thuốc sắc Lá có thể giãtươi hoặc phơi khô nghiền thành bột để đắp

1.1.2.6 Uvaria rufa Blume – Bù dẻ hoa đỏ, Bồ quả hoe, Dây dủ dẻ.

Ở Campuchia, rễ cây được dùng nấu nước cho phụ nữ sinh đẻ uống như là thuốc bổdưỡng để hồi phục sức khỏe

1.1.3 Tổng quan loài Bù Dẻ

Hình 1.1 Hình lá, hoa, quả loài Uvaria rufa

Tên khoa học: Uvaria rufa Blume họ Na – Annonaceae.

Tên thông thường: Bù dẻ hoa đỏ, Bồ quả hoe, Dây Dủ dẻ

Mô tả: Dây leo có thể lên rất cao: Lá thuôn, tròn hay hình tim ở gốc, có mũi ngắn,

dài 11 cm, rộng 4 cm, ráp ở mặt trên do có nhiều lông hình sao ngắn, mịn ở mặt dưới

vì có lông mềm màu hung

Hoa đỏ, xếp 1-2 cái ở trên các trục Quả đại chín có cuống dài, hình trụ, vặn, hơi cólông nhung, dài 15 mm Hạt 17, xếp 2 dãy, màu nâu nâu

Sinh thái: mọc rải rác trong rừng thứ sinh, rừng còi, ở độ cao dưới 700 m.

Ra hoa tháng 4 – 8, có quả tháng 6 – 9

Phân bố: Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Đăk Lăk, Tây Ninh,

Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu Còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, TháiLan, Indonesia, Philippin [4]

1.2.1 Tổng quan hóa học chi Uvaria

Từ năm 2009 cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Uvaria tại

Việt Nam bắt đầu được tiến hành và thu được nhiều kết quả:

- Năm 2009, Tống Thị Mai Nhung đã báo cáo trong luận văn thạc sĩ hóa học (Đại học

Vinh) hai hợp chất trong cây Chuối con chồng (Uvaria grandiflora Roxb & Hornem)

ở Hà Tĩnh là pinostrobin và taraxerol [13]

O

OH O

O

HO

- Năm 2010, Đỗ Ngọc Đài, Trần Đình Thắng của trường Đại học Vinh tiến hành

nghiên cứu về thành phần tinh dầu có trong lá Chuối con chồng (Uvaria grandiflora

Roxb & Hornem) ở Hà Tĩnh Kết quả thu được những thành phần chính trong tinhdầu gồm: bicyclogermacen (35,7%), β-caryophyllen (13,9%) và (Z)-β-ocimen(10,7%) [6]

- Năm 2013, Trần Đình Thắng và cs đã công bố thành phần tinh dầu có trong lá và

vỏ thân của loài Uvaria rufa và Uvaria cordata Theo đó, thành phần chính của tinh dầu trong lá U rufa là δ-3-carene (12.8 %), n-hexadecanoic acid (9.1 %), β- caryophyllene (5.9 %), (Z)-β-ocimene (5.7 %) and γ-terpinene (5.4 %), trong khi tinh

dầu vỏ thân chứa phần lớn germacrene D (38.4 %), benzyl benzoate (18.1 %) và eicosane (5.5 %) Trong tinh dầu U cordata, hợp chất chính là n-heneicosane (10.3

n-%), aristolone (9.8 n-%), bicycloelemene (6.5 %) và 2,4-bis(1,1- dimethylethl)-phenol

(6.2 %) trong lá, cùng với n-eicosane (14.8 %), n-heneicosane (9.3 %),

2,6-di-t-butyl-4-methylene-2,5-cyclohexadiene-1-one (6.7 %) và β-caryophyllene (6.6 %) trong vỏthân [22]

- Năm 2015, luận án tiến sĩ hóa học của Hồ Việt Đức, Viện khoa học và công nghệ

Việt Nam đã phân lập được 10 hợp chất từ loài Bù dẻ tía (U grandiflora), 9 hợp chất

từ loài Bù dẻ lá lớn (U.cordata) và 6 hợp chất từ loài Bù dẻ râu (U.fauveliana), trong

đó có các chất mới [7]:

HO OH

HO

O

O O

()-3-O-Debenzoylzeylenone

O HO O OH

MeO HO MeO 0 Me HO HO OH

Ufaside

Trong khi đó, trên thế giới, các loài trong chi Uvaria đã được nghiên cứu từ những

năm 70 của thế kỷ 20 Cho đến nay, rất nhiều công trình đã được tiến hành về hóa

thực vật cũng như tác dụng dược lý của chi Uvaria, nhiều hợp chất mới đã được công

bố, đặc biệt trong nhưng năm gần đây

loài Uvaria tonkinensis var subglabra hai seco-cyclohexenes bão hòa oxy là

uvarisubols A và B, cùng với 7 hợp chất đã biết là zeylenol, 1,6-desoxypipoxide, epizeylenol, uvamalol G, uvarirufol C, uvamalol F và ferrudiol [50]

1 Năm 2011, tại Trung Quốc, Lu Zi1 Ming và cs đã phân lập được một dẫn chất

diphenylmethane mới từ cành và lá của loài Uvaria kurizz[27].

O O HO

R

1 R =

O -O

2 R = -OH

Uvarisubols A (1)Uvarisubol B (2)

O O

O O

O O

O O

O O

O O

OAc HO

MeO

OH OH

- Cũng năm 2015, tại Thái Lan, Wirongrong Kaweetripob và cs đã phân lập được hai

acid béo mạch dài cyclohexene, tên Dulcisenes A và B, từ cành non của loài Uvaria dulcis cùng với 7 chất đã biết [25].

O O

- Năm 2017, tại Philippin, Allan Patrick G Macabeo và cs đã phân lập được một mộthợp chất có hoạt tính oxy hóa cao là dẫn chất của seco–cyclohexene tên valderepoxide

và sáu hợp chất đã biết là uvamalols D và G, grandiuvarone, 20hydroxy 30,40,60

-trimethoxychalcone, valderramenol B and benzoic acid từ lá của loài Uvaria valderramensis [19].

1.2.2 Tổng quan hóa học loài Uvaria rufa

Cây Bù dẻ hoa đỏ (Uvaria rufa) đã được quan tâm nghiên cứu trên thế giới và ngay

tại Việt Nam Từ năm 1968, đã có những nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa họccủa loài này tại Philippin [48] Từ đó đến nay, các nhóm chất chính đã được phân lậptrong Bù dẻ hoa đỏ là tinh dầu, flavonoid, alkaloid và dẫn chất đa oxy hóa củacyclohexen, ngoài ra còn có những nhóm chất phụ khác

Tinh dầu

Năm 2004, Brophy và cộng sự đã xác định thành phần tinh dầu trong lá U.rufa trồng

ở Queensland, Úc giàu sesquiterpen, trong đó α-humulen chiếm 50%, benzyl benzoatchiếm 4% [29]

Năm 2013, Trần Đình Thắng nghiên tiến hành nghiên cứu thành phần tinh dầu trong

lá và vỏ thân U.rufa tại Việt Nam, thành phần chính của tinh dầu trong lá U rufa là δ-3-carene (12.8 %), n-hexadecanoic acid (9.1 %), β- caryophyllene (5.9 %), (Z)-β-

ocimene (5.7 %) and γ-terpinene (5.4 %), trong khi tinh dầu vỏ thân chứa phần lớn

germacrene D (38.4 %), benzyl benzoate (18.1 %) và n-eicosane (5.5 %) [22].

Flavonoid

Năm 2005, những chất chống oxy hóa từ rễ cây Bù dẻ hoa đỏ đã được phân lập vàxác định cấu trúc, sáu flavonoid là: 2,5-dihydroxy-7-methoxy flavanon, tectochrysin,5-hydroxy-7-methoxy flavanon, 6,7-O,O-dimethylbaicalein, 7-O-methylwogonin và2,5-dihydroxy-6,7-dimethoxy flavanon [20]

Năm 2009, 5 flavonol glycosid trong cao ethyl acetat của lá Bù dẻ hoa đỏ đã được

phân lập gồm rutin, isoquercitrin, kaempferol 3-O-β-D-galactopyranosid, astragalin,

and isoquercitrin-6-acetat [18]

Năm 2013, tại Malaysia, Andy Rosandy và cs đã nghiên cứu và phân lập được 4flavonoid từ vỏ thân Bù dẻ hoa đỏ, bao gồm 5-hydroxy-7-methoxyflavon, 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavon, 2,5-dihydroxy-7-methoxyflavanon và 5,7-dihydroxyflavanon.5,7-dihydroxyflavanon lần đầu tiên được báo cáo tìm thấy trong vỏ thân loài này [41]

Năm 2015, luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Ngọc Nhị thực hiện tại trường Đại học

Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 3 flavonoid từ cao phân đoạnCHCl3 của thân Bù dẻ hoa đỏ gồm tectochrysin, 6,7-dimethoxybaicalein và một chất

mới 5-hydroxy-6-acetyl-7-methoxy-dihydrobaicalein [12].

Năm 2017, Nguyễn Hồng Đức tiếp tục đề tài trên và phân lập thêm methoxyflavanon [11]

2,5-dihydroxy-7-O HO

OH O

OH

O OH

Glc

O HO

OH O

OH

O Glc

O HO

H 3 CO

OH O

O HO

5-hydroxy-6-acetyl-7-methoxy-dihydrobaicalein

Alkaloid

Năm 2005, 7 alkaloid cũng được phân lập từ rễ Uvaria rufa và được xác định là:

liriodenin, lanuginosin, oxoanolobin, roemerin, anonain, xylopin và roemerolin [20].Những alkaloid này sau đó cũng được phân lập trong một nghiên cứu khác vào năm

2010 [47]

Năm 2010, Allan Patrick G Macabeo và cs đã tìm ra một số chất chuyển hóa của

benzoylated trong lá loài Uvaria rufa thu hái tại Philippin là kweichowenol B,

microcarpin A, microcarpin B và anabellamid, trong đó ananellamid là một alkaloid

thuộc dẫn chất của N-benzoylated phenylalanin [34].

N O

O

O

N O

O

O

OCH 3

N O

O

O

OH

O NH

O O

H O

N O

3

H

N O

O

H

NH O

O

H

OCH 3

Dẫn chất đa oxy hóa cyclohexen (polyoxygenated cyclohexene – PC)

Đây là nhóm hợp chất đặc trưng cho chi Uvaria và có sự đa dạng về cấu trúc nhờ vị

trí của nối đôi trong vòng cyclohxen và các nhóm thế gắn trên vòng

Năm 2006, bốn dẫn chất đa oxy hóa cyclohexen mới gồm uvarirufon A, uvarirufol A

– C cùng 10 hợp chất đã biết gồm tonkinenin A,

2-O-benzoyl-3-O-debenzoylzeylenon, uvarigranol B, zeylenol, uvarigranol F, 1-epizeylenol,grandifloracin, grandifloron, 1,6-desoxypipoxyd và tingtanoxyd được phát hiện từ

loài U rufa bởi Zhang và cộng sự [51].

Năm 2007, tại Đức, Florie A Tudla và cs đã phân lập được nhóm dẫn chất cyclohexan

từ lá loài Uvaria rufa là (+)-zeylenol, ellipeiopsol B và ferrudiol [48].

BzO

OH

HO BzO

O HO

HO

OBz

HO HO BzO

OBz

OH O OBz

OH

BzO

HO HO BzO

OBz

BzO

HO HO BzO

Các nhóm chất khác

Acetogenin: mặc dù đã phân lập được nhiều hợp chất acetogenin từ các loài khác

trong chi Uvaria, nhưng năm 2016, Phạm Thị Phương Thúy mới lần đầu phân lập

được Uvaricin B từ thân của loài Bù dẻ hoa đỏ [14]

O O OH

OH

OH

Chất chuyển hóa benzoylated: trong lá loài Uvaria rufa có kweichowenol B,

microcarpin A, microcarpin B và anabellamide [34]

O O

Lignan: một lignan glycosid đã được phân lập trong phần trên mặt đất của Bù dẻ

hoa đỏ tên là ufaside [36]

O OH

OMe OH OMe

MeO HO MeO 0 Me HO HO OH

Ngoài ra, còn một số hợp chất khác như caryophyllene oxide, glutinol trong vỏ thân[41], asperphenamat, glut-5(6)-en-3-on trong phân đoạn CHCl3 của thân Bù dẻ hoa

đỏ [12] cũng đã được báo cáo

Lan, dịch chiết butanol của Uvaria rufa đã thể hiện tiềm năng chống oxy hóa tốt Kỹ

thuật sắc ký lớp mỏng với thuốc thử 2,2-diphenyl-1-[2,4,6-trinitrophenyl] hydrazy(DPPH) được dùng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa quét gốc tự do của các dượcliệu và các phân đoạn chiết từ dược liệu Từ dịch chiết butanol của rễ Bù dẻ hoa đỏ

đã phân lập được 6 flavonoid có khả năng chống oxy hóa, trong đó 6,7-dimethoxy flavanone có hoạt tính cao nhất trên DPPH ở nồng độ 0,16 và 1,03mg/ml [20]

2,5-dihydroxy-Tác dụng ức chế AGEs:

Tăng đường huyết kéo dài ở bệnh nhân đái tháo đường sẽ dẫn tới sự hình thành cácsản phẩm chuyển hóa gây hại là AGEs (advanced glycation end-products), đây lànhững chất góp phần vào sự tiến triển các biến chứng đái tháo đường cũng như đẩynhanh quá trình lão hóa Năm 2009, Deepralard và cs khi tiến hành sàng lọc sơ bộ tác

dụng ức chế sự tạo thành AGEs đã nhận thấy phân đoạn ethyl acetat của lá Uvaria rufa Blume (họ Annonaceae) có hoạt tính này Phân đoạn chiết xuất có 5 flavonol

glycosid trong đó isoquercitrin và dẫn chất 6-acetate của nó tương đương vớipositivecontrol, quercetin, trong khả năng ức chế sự hình thành AGEs trong xétnghiệm glucose huyết thanh bò (BSA), có nồng độ ức chế 50% (ICs50) tương ứng là8,4, 6,9 và 10,9 μM [18]

Tác dụng điều trị đái tháo đường

Năm 2015, luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Ngọc Nhị thực hiện tại trường Đại học

Y Dược đã tiến hành sàng lọc in vitro tác dụng ức chế alpha-glucosidase của các cao

phân đoạn CHCl3, EtOAc và MeOH của thân Bù dẻ hoa đỏ thu hái tại Bình Phước,Việt Nam Kết quả cho thấy ở nồng độ 0,025 mg/ml, tỷ lệ ức chế lên tới 90% và kếtquả có sự lặp lại, ổn định cao [12]

Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2012, Allan Patrick G Macabeo và cs đã tiến hành thử nghiệm in vitro tác dụng

của dịch chiết CHCl3 của lá Uvaria rufa thu hái tại Philippin về hoạt tính ức chế Mycobacterium tuberculosis H37RV Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng ức chếtrực khuẩn lao ngay ở nồng độ 8 µg/ml [35]

Tác dụng làm giảm tăng sinh tiền liệt tuyến (BPH)

Năm 2016, Wararut Buncharoen và cs đã tiến hành khảo sát khả năng làm giảm tăng

sinh tiền liệt tuyến của thân Uvaria rufa thu hái tại Thái Lan thông qua khả năng ức

chế 5α-reductase (enzyme xúc tác phản ứng tạo dihyrotestosterol (DHT) từtestosterol, khi sự sản sinh DHT tăng quá mức sẽ dẫn tới sự tăng lên của tế bào biểu

mô mà gây phì đại tiền liệt tuyến) và chống oxy hóa (stress oxy hóa được coi là yếu

tố thúc đẩy nhanh quá trình tăng sinh tiền liệt tuyến)

Các nghiên cứu in vitro đã kiểm tra hiệu quả ức chế 5α-reductase (5αR) và hoạt động

chống oxy hoá của phân đoạn ether dầu hỏa, ethyl acetate, ethanol và nước từ thân

U rufa Sau đó, phân đoạn ethyl acetate (UR-EtOAc) của U rufa được sử dụng để đánh giá hiệu quả điều trị trong mô hình in vivo BPH được gây ra bằng cách tiêm

dưới da testosterone propionate (3 mg/kg) cho chuột đực trong 30 ngày Sau 30 ngàyuống UR-EtOAc liều 10 và 20 mg/kg và finasteride ở liều 1 mg/kg, khối lượng tuyếntiền liệt, chỉ số prostate (PI), testosterone và mức độ thụ thể androgen (AR) được xácđịnh để đánh giá sự thay đổi mô học của tuyến tiền liệt Ngoài ra, tình trạng oxy hóa

và độc tính cũng được đánh giá Kết quả in vivo cho thấy, dịch chiết EtOAc thân Uvaria rufa làm giảm đáng kể khối lượng tuyến tiền liệt, PI và AR ở tất cả các nhóm

được điều trị khi so sánh với nhóm chứng BPH (p < 0,001) Ngoài ra, nhóm điều trịUR-EtOAc và finasteride đã làm tăng mức testosterone trong tuyến tiền liệt và huyếtthanh khi so sánh với nhóm chứng BPH Nghiên cứu mô học của tuyến tiền liệt cũng

hỗ trợ các kết quả trên UR-EtOAc tăng các enzyme chống oxy hoá và làm giảm mứcmalondialdehyde ở chuột do BPH gây ra Hơn nữa, điều trị UR-EtOAc ở tất cả các

liều lượng không gây độc tính lên các cơ quan nội tạng và các chỉ số sinh hóa khác[24].

hóa

1.4.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa

[45]Stress oxy hóa là kết quả của sự mất cân bằng giữa các gốc tự do và các chấtchống oxy hóa Khi các gốc tự do được tạo ra trong hệ thống cơ thể của con người nógây ra một loạt các rối loạn trong hoạt động của tế bào và dẫn đến nhiều bệnh lý khácnhau như AIDS, lão hóa, viêm khớp, hen suyễn, bệnh tự miễn, ung thư, rối loạn timmạch, đục thủy tinh thể, tiểu đường, Parkinson, Alzheimer’s Các nghiên đã chỉ rarằng lượng chất chống oxy hoá thích hợp sẽ giúp giải quyết tất cả những gốc tự dokhông thể tránh khỏi trong cơ thể và do đó cải thiện sức khoẻ bằng cách giảm nguy

- Các chất chống oxy hoá thứ hai trong cơ thể bao gồm glutathione (GSH),vitamin C, albumin, vitamin E, carotenoid, flavonoid

- Các chất chống oxy hoá thứ ba bao gồm một nhóm các enzym phức tạp để sửachữa DNA bị hư hỏng, các protein bị hư hỏng, lipid bị oxy hóa và peroxide

Ví dụ: lipase, protease, enzym sửa chữa DNA, transferases, methioninesulphoxide reductase

Những ứng dụng của chất chống oxy hóa trong nghiên cứu và điều trị:

Vai trò của chất chống oxy hóa trong bệnh đái tháo đường:

Các nghiên cứu khác nhau cho thấy bệnh đái tháo đường có liên quan đến sự hìnhthành các gốc tự do và làm giảm khả năng chống oxy hoá, dẫn tới các rối loạn vềlipid, protein và acid nucleic

Lượng ascorbate, glutathione và superoxide dismutase ở bệnh nhân đái tháo đườngthấp hơn bình thường Những dược liệu với hàm lượng cao các hợp chất chống oxy

hóa mạnh có vai trò quan trọng trong việc cải thiện các rối loạn liên quan đến stressoxy hóa đái tháo đường, từ đó giúp kiểm soát đường huyết tốt hơn.

Chất chống oxy hóa là những chất chống ung thư tiềm năng:

Các nghiên cứu khác nhau đã tiến hành cho đến nay đã khẳng định vai trò của cácchất chống oxy hoá như selen, flavonoids, lycopene và glutathione như là các hợpchất chống ung thư

Flavonoids từ thực vật được coi là nhưng chất có khả năng dọn dẹp các gốc tự domạnh Khoảng 28 flavonoid đã cho thấy tiềm năng chống bệnh bạch cầu Bên cạnh

đó, flavonoid cũng được báo cáo có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, kháng virus

và chống ung thư

Lycopene được sử dụng phòng chống ung thư và ức chế sự tiến triển của bệnh ungthư, làm giảm đáng kể nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới, ngăn ngừa ung thưtuyến tụy, ruột kết, trực tràng, thực quản Lycopene còn các tác dụng bảo vệ tim vàngừa ung thư da

Selen, một chất chống oxy hóa tự nhiên trong cơ thể, được báo có vai trò trong việcphòng ngừa ung thư cũng như trong việc kiểm soát suy tim

Chất chống oxy hóa là những yếu tố bảo vệ gan:

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chất chống oxy hóa được sử dụng để điều trị nhiềubệnh trên gan (cynarin trong Actiso, sylimarin trong Cúc gai) Một số thử nghiệmlâm sàng đã khẳng định hiệu quả của các chất chống oxy hoá như vitamin C, vitamin

E trong điều trị bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

Chất chống oxy hóa và hệ thần kinh:

Tiểu não là nơi điều khiển các vận động của cơ thể và cũng là nơi chịu tác động lớncủa các gốc tự do Một số chất chống oxy hóa đã được báo cáo có tác dụng điều trịcác bệnh về thần kinh như bệnh Alzheimer’s, bệnh Parkinson và chứng mất thínhgiác do tiếng ồn

Như vậy, sàng lọc các dược liệu có tác dụng chống oxy hóa là một định hướng đểtiến hành các thử nghiệm sinh học sâu hơn như kháng viêm, bảo vệ gan, điều trị đáitháo đường, điều trị ung thư

1.4.2 Một số phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa:

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để đánh giá khả năng chống oxy

của dược liệu, dưới đây là một số phương pháp in vitro thông dụng dựa vào kỹ thuật

đo quang (Kỹ thuật đo quang dựa vào phản ứng của các gốc, gốc cation hay phức hợpvới một phân tử chống oxy hóa có khả năng cho một nguyên tử hydro) [40]:

Phương pháp DPPH:

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do ổn định, hình thành sự mấtelectron tự do trong toàn bộ phân tử Do đó, DPPH không có sự dimer hoá như thườngxảy ra với hầu hết các gốc tự do DPPH cho màu tím trong dung dịch với bước sónghấp thu tối đa khoảng 520nm

Khi DPPH phản ứng với một chất cho hydro, số lượng phân tử DPPH giảm, cùng với

sự giảm màu tím Do đó, sự giảm hấp thu tại bước sóng quy định phụ thuộc trực tiếpvào hàm lượng chất oxy hóa Trolox được sử dụng làm chất chống oxy hóa tiêu chuẩn

Phương pháp ABTS:

Thành phần cation ABTS (ABTS + +) hấp thụ ở bước sóng 743 nm (tạo ra màu xanh

lá nhạt) được hình thành bởi sự mất điện tử của nguyên tử nitơ của ABTS (2,2'-azino-bis (3-etylbenzthiazolin-6-sulfuric acid)) Với sự có mặt của Trolox (hoặc một chấtchống oxy hóa hydro khác), nguyên tử nitơ được cho một nguyên tử hydro, tạo radung dịch có màu giảm

ABTS được oxy hóa bởi kali sulfat hoặc mangan dioxit, làm tăng lượng cation ABTS(ABTS + +) có sự giảm hấp thụ ở 743 nm với sự có mặt của Trolox được chọn là chấtchống oxy hóa tiêu chuẩn

Phương pháp FRAP (ferric reducing antioxidant power)

Phương pháp FRAP dựa vào việc giảm các chất chống oxy hoá của phức hợp ion sắt-TPTZ (2,4,6-tri (2-pyridyl) -1,3,5-triazin) Việc gắn Fe2 + với phối tử tạo ra mộtmàu xanh rất mạnh Độ hấp thụ có thể được đo để kiểm tra lượng sắt bị giảm và cóthể tương quan với lượng chất chống oxy hoá Trolox hoặc acid ascorbic có thể được

sử dụng như chất đối chứng

Phương pháp ORAC (oxygen radical absorption capacity)

ORAC là phương pháp định lượng các chất chống oxy hóa bằng cách đo khả nănghấp thu các gốc tự do peroxy, gây ra bởi 2,2'-azobis- (2-amidino-propan)dihydrochloride (AAPH), ở 37 oC Fluorescein được sử dụng làm đầu dò huỳnhquang Sự mất huỳnh quang cho biết mức độ phân hủy, từ phản ứng của chất chốngoxy hóa với gốc peroxyl

1.5 Tổng quan bệnh đái tháo đường và các phương pháp tiến hành sàng lọc

tác dụng sinh học định hướng hỗ trợ điều trị đái tháo đường

1.5.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường đang ngày một gia tăng trên thế giới, không chỉ ở các quốc giagiàu có mà ngay cả ở các quốc gia có thu nhập trung bình Bệnh đái tháo đường làmột bệnh mãn tính nghiêm trọng xảy ra khi cơ thể không sản xuất đủ lượng insulincần thiết hoặc không đáp ứng tốt với insulin Đây là một trong bốn bệnh không lâynhiễm đang được quan tâm hàng đầu của các quốc gia trên thế giới [38]

Trên toàn thế giới, ước tính khoảng 422 triệu người trưởng thành mắc bệnh đái tháođường trong năm 2014, so với 108 triệu người vào năm 1980 Tỷ lệ mắc bệnh toàncầu (theo tuổi) của bệnh đã tăng gần gấp đôi kể từ năm 1980, tăng từ 4,7% lên 8,5%

ở người trưởng thành Điều này phản ánh sự gia tăng các yếu tố nguy cơ liên quannhư thừa cân hoặc béo phì Trong thập kỷ qua, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường đã tăngnhanh hơn ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình so với ở các nước có thunhập cao

Có 1,5 triệu người chết do đái tháo đường vào năm 2012 Đường huyết cao hơn mứctối đa gây ra thêm 2,2 triệu người tử vong, do tăng nguy cơ bệnh tim mạch và cácbệnh khác 43% trong tổng số 3.7 triệu ca tử vong này xảy ra trước 70 tuổi và nhiềuhơn ở các nước có thu nhập thấp đến trung bình

Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân quan trọng gây mù lòa, suythận, mất chi dưới và các hậu quả lâu dài khác ảnh hưởng đáng kể đến chất lượngcuộc sống

Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra dịch tế học bệnh đái tháo đường toàn quốc năm

2012 do Bệnh viện Nội tiết Trung ương tiến hành, tỷ lệ hiện mắc đái tháo đường trêntoàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tỷ lệ đái tháo đường chưa được chẩn đoántrong cộng đồng là 63,6% Tỷ lệ hiện mắc đái tháo đường tăng dần theo nhóm tuổi,

muốn khi sử dụng lâu dài Trong những năm gần đây, các hợp chất từ thiên nhiên cókhả năng ức chế α-glucosidase giúp hỗ trợ cho bệnh nhân đái tháo đường đang rấtđược quan tâm và đẩy mạnh nghiên cứu.

1.5.2 Phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học định hướng hỗ trợ điều

trị tiểu đường

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase:

Các thuốc tổng hợp có tác dụng ức chế α-glucosidase gồm: acarbose (Glucobay 50 –

100 mg), Voglibose (Basen 0,2 – 0,3 mg), miglitol (Gliset 25 – 50 – 100 mg)

Cơ chế tác dụng: α-glucosidase ở ruột non là enzyme thủy phân tinh bột và

disaccharid (sucrose) thành monosaccharid có thể hấp thu Các thuốc trên ngăn cảnhấp thu hầu hết carbohydrat ở ruột non (trừ lactose có nối β), vì vậy làm chậm haylàm giảm đỉnh đường huyết sau bữa ăn nên tiết kiệm insulin, không gây tai biến hạđường huyết Tác dụng hạ đường huyết nhẹ (giảm HbA1c 0,5 – 1 %, giảm đườnghuyết lúc đói 20 – 30 mg/dl), chủ yếu tác dụng trên đường huyết sau bữa ăn, ít tácdụng trên đường huyết lúc đói [8]

Qui trình tiến hành phản ứng:

Khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-glucosidase của các cao chiết từ thực vậtđược thực hiện theo phương pháp của Zhi-Wei Wang và cs, (2013) sẽ được mô tả cụthể trong thiết kế thí nghiệm [23]

dụng độc tế bào

1.6.1 Tổng quan về bệnh ung thư

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là một trong những nguyênnhân hàng đâu trên thế giới gây bệnh tật và tử vong trên toàn thế giới, với khoảng 14triệu trường hợp mắc mới vào năm 2012 Số ca bệnh mới được dự đoán sẽ tăng 70%trong vòng 2 thập kỷ tới Ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng thứ hai trên toàncầu với 8,8 triệu ca tử vong vào năm 2015 Khoảng 1/6 số người tử vong trên thế giới

là do ung thư [17]

Việc chẩn đoán trễ và phương pháp điều trị không phù hợp là tình trạng phổ biến,gánh nặng của ung thư lên nền kình tế ngày càng gia tăng Tổng chi hàng năm chobệnh ung thư được ước tính xấp xỉ 1,16 triệu USD vào năm 2010 Chỉ có 1/5 các nước

có thu nhập thấp đến trung bình có các dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách

về ung thư [21]

Tại Việt Nam, số người mắc ung thư ngày càng tăng trong những năm gần đây Theoghi nhận ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, ước tính mỗi năm cókhoảng 150.000 người mới mắc và khoảng 50 – 70 nghìn người chết vì ung thư [9].Hiện nay, có nhiều phương pháp để điều trị ung thư, tuy nhiên rất tốn kém và cầnphải cân nhắc nhiều do tác dụng phụ gây ra lớn Xu hướng sử dụng các thuốc từ thiênnhiên trong hỗ trợ và điều trị ung thư đã thu được nhiều kết quả khả quan Ngày càngnhiều những hợp chất tinh khiết từ tự nhiên được tìm thấy và đưa vào sử dụng nhưtaxol từ thông đỏ hay viblastin từ Dừa cạn Đây là một con đường nhiều triển vọng

để mang đến những biện pháp điều trị hiệu quả, kinh tế và an toàn hơn

1.6.2 Phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng độc tế bào

Một số dòng tế bào dùng trong thử nghiệm độc tính tế bào:

Hep-G2 (ung thư gan), HL-60 (ung thư máu cấp tính), KB (ung thư biểu mô), LNCaP(ung thư tuyến tiền liệt), MCF-7 (ung thư vú), MDA-MB-231 (ung thư vú), HAK (tếbào thận của chuột), LU-1 (ung thư phổi), MKN-7 (ung thư dạ dày), , SK-Mel- 2 (ungthư da), SW-480 (ung thư ruột kết) và 3T3 (tế bào thường)

Các phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào:

Phương pháp LDH:

Sự dung giải của các tế bào khối u sẽ tiết lactate dehydrogenase (LDH) vào môitrường nuôi cấy Hoạt tính LDH được xác định bằng sự oxy hóa NADH hoặc giảmINT trong một khoảng thời gian xác định, được giới hạn bằng cách dừng phản ứngenzym với chất ức chế oxamat Các sản phẩm phản ứng sau đó đã được khảo sát trêndĩa 96 giếng

Có hai cách để đánh giá hoạt tính LDH: cách thứ nhất dựa vào sự oxy hóa NADH khipyruvat chuyển thành lactat Sự giảm NADH có thể được kiểm tra khi đo sự thay đổi

độ hấp thu ở bước sóng 340 nm; cách thứ hai dựa vào sự giảm NAD+ do sự chuyểnlactac thành pyruvat [30]

Phương pháp MTT

Sự phân cắt của muối tetrazolium MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) thành một sản phẩm có màu xanh (formazan) bởi enzymsuccinate-dehydrogenase trong ty thể sẽ giúp đánh giá khả năng sống sót và tăng sinh

tế bào Việc chuyển đổi này chỉ diễn ra trong các tế bào sống và lượng formazan tạo

ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào hiện diện [31]

Phương pháp này dựa trên hoạt động của enzym succinate dehydrogenase của ty thểtrong các tế bào sống Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng Sau khi ủ 24 giờ, tế bàođược xử lý với thuốc ở những nồng độ khác nhau trong 48 giờ Sau đó, dung dịchMTT 0,5 mg/ml và isopropanol-HCl (1:1) lần lượt được thêm vào Số lượng formazantạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570

nm, sẽ cho biết số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy

Phương pháp Sulforhodamin B (SRB)

Đây là phương pháp để đo hàm lượng protein tế bào có trong môi trường nuôi cấytrong khay 96 giếng Các tế bào nuôi cấy được cố định với acid tricloacetic (TCA)được nhuộm màu trong 30 phút với dung dịch sulforhodamin B 0,4% (khối lượng/thểtích) hòa tan trong acid acetic 1% Vào cuối giai đoạn nhuộm, SRB đã được loại bỏ

và môi trường được rửa bốn lần với acid acetic 1% để loại bỏ thuốc nhuộm khôngdính Acit acetic được đổ trực tiếp vào các giếng chứa môi trường Thao tác này chophép rửa sạch nhanh chóng để không còn thuốc nhuộm gắn protein Sau khi rửa sạch,các môi trường được sấy khô bằng không khí cho đến khi hết ẩm Thuốc nhuộm bámdính được hòa tan với 10 mM unbuffered Tris base (pH 10,5) trong 5 phút trên máylắc Mật độ quang (OD) đã được đo bước sóng khoảng 490-530 nm tùy từng dòng tếbào khác nhau Tùy vào lượng mẫu thử được đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào mà

có kết quả khác nhau [46]

Phương pháp đỏ trung tính (red neutral)

Xác định sự tích tụ của thuốc nhuộm màu đỏ trung tính trong lysosome của các tế bàosống không bị tổn thương

Tế bào tiếp xúc với CdCl2 được ủ trong 2 giờ với thuốc nhuộm màu đỏ trung tính(100 µg/ml) hòa tan trong môi trường không có huyết thanh (DMEM cho dòng tế bàoHTC và MEM cho HepG2) pH của dung dịch màu đỏ trung tính được điều chỉnhtrong tất cả các thí nghiệm đến 6.35 với việc bổ sung KH2PO4 (1M) Các tế bào sau

đó được rửa bằng dung dịch đệm muối Phosphate (PBS) và thêm 1ml chất rửa giải(EtOH / AcCOOH, 50% / 1%), sau đó lắc nhẹ trong 10 phút để đạt được sự hòa tanhoàn toàn Một phần của các dung dịch thu được đã được chuyển sang các dĩa 96giếng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm[32]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Lá cây Bù dẻ hoa đỏ (trong bài gọi tắt là Bù dẻ) Uvaria rufa Blume., Annonaceae

được thu hái tại Tân Uyên, Bình Dương vào tháng 10/2016 Nguyên liệu được địnhdanh dựa trên hình ảnh, tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn với các cây khác.Thân, rễ cũng được thu hái cùng cây để sử dụng trong các khảo sát vi học

Dược liệu được lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược thànhphố Hồ Chí Minh

Xử lý nguyên liệu: Lá được phơi khô, sấy ở 50 OC đến khô, xay dược liệu để có bộtthô dùng trong chiết xuất và khảo sát hoạt tính sinh học Riêng bột dược liệu dùng đểsoi bột thì xay mịn theo quy định Thân, rễ được phơi, sấy ở 50 OC đến khô, xay dượcliệu để có bột mịn theo quy định dùng soi bột

Dung môi, hóa chất dùng chiết xuất, phân lập

Dung môi chiết xuất: cồn 96% của Việt Nam

Các dung môi hữu cơ: ether ethylic, ether dầu hỏa, n-hexan, chloroform, ethylacetat, aceton,n-butanol, methanol, ethanol, acid formic, acid acetic đều dùng loại PA do Trung Quốc vàViệt Nam sản xuất

Các hóa chất: acid sulfuric, acid hydroclorid, natri hydroxyd, amoniac, natri sulfat khan, cácthuốc thử định tính chung, vanillin sulfuric, FeCl3 10%/cồn

SKC dùng silicagel kích thước 15-40, 40-63, 63-200 µm của Merck

SKRPT dùng sephadex LH-20

Dung môi sắc ký thay đổi tùy theo điều kiện cụ thể

Dung môi, hóa chất thử hoạt tính sinh học

Yeast’s α-glucosidase (Sigma)

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNPG) (Sigma)

Acarbose dược dụng độ tinh khiết 98%

Dimethyl sulfoxid (DMSO) dược dụng, nước khử ion

Muối kali monophosphat, muối kali diphosphat (Sigma)

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma)

Methanol thử sinh học (Merck)

Quercetin tinh khiết

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma)

Isopropanol, HCl

Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM

Dòng tế bào MDA-MB-231, RD, HepG2 do bộ môn Dược lý cung cấp

Paclitaxel (Sigma)

Trang thiết bị

Phần thực nghiệm của khóa luận đã sử dụng máy móc và trang thiết bị của bộ mônDược Liệu và Trung tâm hóa học các hợp chất tự nhiên, bộ môn Dược lý – KhoaDược, ĐH Y Dược TP.HCM, Phòng Dược lý – Viện Kiểm nghiệm thuốc và mỹ phẩm

TP HCM

Trang thiết bị dùng phân tích hóa học:

Bình ngấm kiệt

Kính hiển vi quang học Olympus CX-21

Cân xác định độ ẩm MA-45 (Satorius)

Lò nung Carbolite CSF-1200 (Anh)

Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (Bandelin)

Đèn UV 254/365 nm Vilber Lourmat LC-15

Tủ sấy Memmert hiệu số U-500

Nồi cách thủy Memmert WB-14

Máy cô quay chân không Buchii Rotavapor R-300 kèm bộ sinh hàn tự động HAAKE K-20.Cân phân tích Sartorius độ nhạy 0,1mg BP-221S

Máy sấy chân không (Jeiotech, model OV-12)

Máy đông khô Martin Christ Alpha 1-4 LD

Máy hút chân không Panasonic GP-125JP

Bình sắc ký , cột sắc ký bằng thủy tinh cùng các dụng cụ trong phòng thí nghiệm

Trang thiết bị dùng trong khảo sát sinh học:

Máy đo quang phổ tử ngoại UV-1700 Pharma Spec (Shizuma – Nhật)

Máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis RA-XT Technicon (Bayer)

Micropipet 1 ml; 0,1 ml; multipipet 10-100 µm

Hộp nhựa T-25, T-75, tiệt trùng dùng một lần để nuôi cấy tế bào

Khay thử Costar USA 15×8×1 cm có 96 giếng nhỏ, đường kính lỗ 0,8 cm, thể tích tối đa là0,3 ml.

Máy ly tâm Biofuge Pico (Heraeus)

Tủ cấy UniMat-Bs; Tủ ấp có máy lắc Leec Compact incubator

Máy đọc microplate MultiskanTM ThermoScientific

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về thực vật

Khảo sát hình thái học:

Quan sát hình dáng bên ngoài của mẫu dược liệu tươi, so sánh với các mô tả và hìnhảnh ở các tài liệu thực vật học để có thể nhận dạng được dược liệu Bù dẻ hoa đỏ

Khảo sát vi phẫu:

Vi phẫu lá lấy đoạn 1/3 từ cuống lá vào, vi phẫu thân và rễ cắt đoạn không quá non,

vi phẫu được cắt bằng dao lam và được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép(Carmin và Lục Iod) Chụp ảnh vi phẫu bằng máy kỹ thuật số Olympus CX-21 quathị kính

Khảo sát các cấu tử đặc trưng:

Lá, thân, rễ được xay khô đến kích thước quy định và tiến hành soi bột theo DĐVN

IV [15]

2.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Bù dẻ:

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá Bù dẻ hoa đỏ theo phương pháp củaCiuley [10]

Chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độphân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cáchchiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol, nước Xác địnhcác nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

2.3.3.2 Xác định độ tro:

Xác định tro không tan trong acid hydrocloric, tro toàn phần theo Phụ lục 9.7 và 9.8

(trang PL-128 và PL-129)

2.3.3.3 Xác định phần trăm các chất chiết được:

Xác định các chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng và chiết

nguội theo Phụ lục 12.10 với dung môi là cồn 96%.

Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bìnhcủa 3 lần thử độc lập, có kết quả ổn định

2.3.4 Phương pháp sàng lọc sinh học

2.3.4.1 Chuẩn bị mẫu:

Mẫu cao toàn phần và cao phân đoạn: Tiến hành chiết nóng 10-100 g bột lá Bù dẻ

hoa đỏ đã được xay tới kích thước bột thô với cồn 96% tới kiệt, cô thu hồi dung môithu được cao cồn toàn phần, phân tán cao cồn vào nước và tiến hành lắc phân bố lỏng– lỏng lần lượt với các dung môi chloroform, ethylacetat và methanol thu được cáccao lỏng, cô thu hồi dung môi thu được cao khô chloroform, ethyl acetat và methanoltheo sơ đồ hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất mẫu thử sinh học lá Bù dẻ hoa đỏ

Các cao cồn, chloroform, ethyl acetat và methanol được pha ở các nồng độ thích hợp

để có mẫu thử sinh học

Mẫu phân đoạn nhỏ phân tách từ các cao phân đoạn: chiết theo sơ đồ hình 2.2 ở

trên với khối lượng dược liệu từ 5 đến 10 kg để thu các cao chloroform, ethyl acetat

và methanol Các cao này tiếp tục được phân tách để thu được các cao phân đoạn nhỏhơn và các chất tinh khiết.

Các cao phân đoạn nhỏ và các chất tinh khiết được pha ở các nồng độ thích hợp để

có mẫu thử sinh học

2.3.4.2 Thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa

Thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của Kulisic et al (2004) [33], được bổ sung bởi Obeid et al (2005) [37].

Nguyên tắc: các chất nghiên cứu được xác định hoạt tính chống oxy hóa (HTCO)

bằng cách cho tác dụng với một gốc tự do ổn định là DPPH, sự giảm DPPH được xácđịnh bằng cách đo quang dựa trên sự giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm, thực hiệntrên bản mỏng và đĩa 96 giếng

Trên bản mỏng:

- Thuốc thử DPPH pha trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml

- Mẫu thử được pha trong MeOH để có dung dịch mẹ với nồng độ 1 mg/ml,dung dịch này sau đó được pha loãng trong MeOH để thu được dãy nồng độ0,25; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01; 0,005 mg/ml dùng trong thử nghiệm

- Chấm lên bản mỏng silicagel F254các mẫu thử của cao cồn, chloroform, ethylacetat và methanol đã được pha thành dãy nồng độ riêng biệt với thể tích mỗimẫu chính xác 5 µl Sau đó nhúng với thuốc thử DPPH 1 mg/ml, để trong tối

5 phút và ghi nhận kết quả: mẫu thử có khả năng ức chế DPPH khi các vếtchuyển từ màu tím sang vàng, sự mất màu tím càng rõ thì HTCO càng mạnh

Trên đĩa 96 giếng:

Chuẩn bị hóa chất dùng trong thử nghiệm:

- Pha thuốc thử DPPH nồng độ 0,04 mM trong MeOH

- Dung dịch đệm kali phosphat (K2HPO4/KHPO4) 50 mM, pH 6,8 trong nướccất 2 lẩn

- Dung dịch A: DMSO 10% trong đệm kali phosphat 50 mM, pH 6,8

- Mẫu thử được pha trong dung dịch A để thu được dung dịch mẹ có nồng 2mg/ml để sau khi bơm vào giếng thử đạt nồng độ 1 mg/ml Các nồng độ thấphơn được pha loãng với dung dịch A trực tiếp từ dung dịch mẹ để thu đượcdãy nồng độ dùng khảo sát

- Chứng dương là quercetin được pha tương tự mẫu thử trong dung dịch A