Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây xáo tam phân (paramignya trimera) họ rutacea của việt nam”

Do vậy, trong đề tài này, chúng tôitiến hành nghiên cứu và xác định thành phần hóa học, hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan của cây thuốc Xáo tam phân Paramignya trimera họ Rutaceae Việt Na

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành tại phòng Hoạt chất sinh học, ViệnHóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lân Khoa học và Công nghệ ViệtNam

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Mạnh Cường đangcông tác và làm việc tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chấtthiên nhiên – người thầy đã dạy dỗ, chỉ bảo tôi tận tình trong suốt quá trìnhthực hiện đề tài khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị cán bộ trongphòng thí nghiệm đã giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình và tạo điều kiện cho tôitrong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo khoa CôngNghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã truyền cho tôi những kiến thức

bổ ích trong suốt 4 năm học tập tại đây

Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn là điểm tựatinh thần vững chắc, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hẹn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Paramignya 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Paramignya 3

1.1.2 Phân bố của chi Paramignya 3

1.1.3 Phân loại chi Paramignya 3

1.1.4 Tác dụng dược lý của chi Paramignya 6

1.1.5 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Paramignya 7

1.1.5.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 7

1.1.5.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 11

1.2 Tổng quan về cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) 12

1.2.1 Đặc điểm thực vật 12

1.2.2 Phân bố 13

1.2.3 Tác dụng dược lý của Xáo tam phân 13

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu bảo vệ gan 14

1.3.1 Phương pháp gây độc bằng paracetamol 14

1.3.2 Phương pháp xét nghiệm 15

1.3.3 Phương pháp kiêm tra trực quan 15

1.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 15

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 16

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.1.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 16

2.1.2.2 Phương pháp phân lập 16

2.1.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 19

2.1.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 20

2.2 Thực nghiệm 21

2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 21

2.2.2 Thu mẫu và tạo dịch chiết từ thân, rễ cây Xáo tam phân 21

2.2.2.1 Thu mẫu và xử lý mẫu 21

2.2.2.2 Tạo dịch chiết từ thân và rễ cây Xáo tam phân 21

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết clorofom 23

2.2.3.1 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết clorofom khi gây độc bằng paracetamol 23

2.2.3.2 Xét nghiệm 24

2.2.3.3 Làm tiêu bản mô bệnh học gan 25

2.2.3.4 Xử lý số liệu 26

2.2.4 Phân tích sắc ký TLC và phân tách phần chiết clorofom (B) 27

2.2.4.1 Phân tích sắc ký TLC 27

2.2.4.2 Phân tách phần chiết clorofom (B) 27

2.5 Dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 28

2.5.1 Hợp chất MC-390 28

2.5.2 Hợp chất MC-392 29

2.5.3 Hợp chất MC-393 29

2.5.4 Hợp chất MC-424 30

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết clorofom (HCTN106) từ thân và rễ Xáo tam phân 31

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ aminotransferase (AST, ALT) huyết thanh 31

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ protein toàn phần 32

3.1.3.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ cholesterol toàn phần 33

3.1.4 Kiểm tra ảnh hưởng của dịch chiết clorofom đến khối lượng gan 34

3.1.5 Kết quả kiểm tra trực quan của dịch chiết clorofom đến gan 35

3.1.6 Kết quả làm tiêu bản mô bệnh học gan 37

3.2 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết clorofom 39

3.2.1 Cấu trúc hợp chất MC – 390 (Chất mới) 39

3.2.2 Cấu trúc hợp chất MC- 392 (Chất mới) 40

3.2.3 Cấu trúc hợp chất MC–393 42

3.2.4 Cấu trúc hợp chất MC- 424 ( Chất mới ) 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45

HR-ESI-MS High Resolution Electronspray

Ionization Mass Spectrum

Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử

HMBC Heteronuclear Mutiple Bond

Connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear Single-Quantum

Coherence Spectroscopy

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết HCTN Hợp chất thiên nhiên AST Aspartate aminotransferase Enzym chuyển hóa aspartat ALT Alanine aminotransferase Enzym chuyển hóa alanine

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Hiệu suất thu nhận của quá trình chiết 21

Bảng 2.2: Phân tích TLC phần chiết clorofom (B) 25

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ aminotransferase (AST, ALT) huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 29

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ protein toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 30

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của dịch chiết clorofom lên nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=5) 31

Bảng 3.4 Khối lượng gan chuột ở các lô thí nghiệm 32

Bảng 3.5 Quan sát hình thái trực quan gan chuột ở các lô thí nghiệm 33

Bảng 3.6 Bảng tổng hợp kết quả các chất được phân lập 43

DANH MỤC HÌNH V

Hình 1.1: Thân và rễ Xáo tam phân 12

Hình 3.2: Đồ thị biểu hiện khối lượng gan chuột sau thí nghiệm 32

Hình 3.2: Gan chuột sau quá trình thí nghiệm 33

Hình 3.3:Kết quả vi thể gan chuột thí nghiệm quan sát được dưới kính hiển vi 35

Hình 3.4: Tương tác trong phổ HMBC và NOESY của hợp chất MC- 390 37

Hình 3.5: Tương tác trong phổ COSY, HMBC và NOESY của hợp chất 39

MC-392 39

Hình 3.6: Tương tác trong phổ COSY, HMBC, và NOESY của hợp chất 40

MC- 393 40

Hình 3.7: Tương tác trong phổ COSY, HMBC, NOESY của hợp chất MC-424 41

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo dịch chiết phân đoạn từ thân, rễ cây XTP 20

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ phần đoạn Clorofom (B) 26

MỞ ĐẦU

Việc sử dụng thuốc Tây lâu dài hay dùng quá nhiều đều là nguyên nhânlàm cho các cơ quan trong cơ thể chúng ta chịu nhiều tác dụng không mongmuốn Gan và thận chính là những cơ quan có chức năng chuyển hóa và thảitrừ các loại thuốc này sau khi đã hết tác dụng dược lý Chính vì vậy hai cơquan này thường bị ảnh hưởng nhiều nhất dẫn đến việc chức năng của chúng

bị suy giảm

Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết đến những bài thuốc cổ truyền được bàochế từ thảo dược có tác dụng hữu hiệu trong phòng, trị bệnh Tác dụng chữabệnh, tăng cường sức khỏe của thảo dược đối với con người chủ yếu là do cáchợp chất tự nhiên sẵn có mà chúng đã sinh tổng hợp, tích lũy trong quá trìnhsinh trưởng và phát triển Do vậy có thể sử dụng chúng để phòng trị bệnhtrong một thời gian dài mà không gây độc hại cho cơ thể và không xuất hiệnhiện tượng kháng thuốc Đây chính là một trong những ưu điểm nổi bật củanhững vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên

Nhiều bài thuốc không chỉ có tác dụng chữa bệnh mà còn giúp cân bằnglại âm dương Ngoài công dụng chính là chữa những bệnh mạn tính, một sốbài thuốc còn chữa được những căn bệnh cấp tính, nan y như ung thư cổ tửcung, ung thư gan, ung thư đại tràng, viêm gan siêu vi, viêm gan cấp tính…

có hiệu quả cao

Việt Nam có lợi thế nằm trong khu vực nhiệt đới, là một trong nhữngnước có nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời Việc đào sâu tìm kiếm vàphát hiện các cây thuốc, các hoạt chất trong cây thuốc đó có tác dụng hỗ trợ

và điều trị căn bệnh viên gan, ung thư gan đã và đang được các nhà khoa họctrong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu

Gần đây, trên báo điện tử tỉnh Khánh Hòa và một số báo in khác có

đăng tin về một loài cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) ở xã Ninh Vân,

tỉnh Khánh Hòa có khả năng chữa bệnh xơ gan cổ trướng Theo báo chí, một

số người bị bệnh xơ gan giai đoạn cuối đã sử dụng thuốc sắc từ rễ và thân câythuốc trên và chữa được khỏi bệnh [1] Loài cây này chưa từng được nghiêncứu cụ thể cả ở trong nước và ngoài nước Do vậy, trong đề tài này, chúng tôitiến hành nghiên cứu và xác định thành phần hóa học, hoạt chất có tác dụng

bảo vệ gan của cây thuốc Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutaceae

Việt Nam nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển hiệu quả dược liệu này trongviệc điều trị bệnh gan nói riêng và các bệnh khác nói chung

Theo hướng nghiên cứu ấy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) họ Rutacea của Việt Nam”.

Khóa luận gồm những nội dung chính sau:

- Thu mẫu thực vật và tạo dịch chiết các phân đoạn.

- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các dịch chiết thân và rễ cây Xáo

tam phân trên mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằngparacetamol

- Phân lập các hợp chất từ phân đoạn CHCl3 của thân và rễ cây Xáotam phân

- Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập từ phân đoạn

CHCl3 của thân và rễ cây Xáo tam phân

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Paramignya

Chi Paramignya Cựa gà, hay Xáo thuộc họ Cam (Rutaceae) được Robert Wight đặt vào năm 1839 trong tác phẩm Illustrations of Indian Botany, vol 1, dựa trên loài chuẩn là Paramignya monophylla Wight thu được

ở Ấn Độ Ông cho rằng đặc tính “leo” của chi này cho thấy nó gần gũi với chi

Luvunga [2]

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Paramignya

Chi Paramignya là dạng cây gỗ trườn, có gai mọc ở lá nách Lá dạng kép

một lá, mép lá nguyên, có nhiều tuyến tinh dầu.Cụm hoa mọc ở nách lá, hoalưỡng tính màu trắng Đài có 4-5 thùy, thùy dính nhau ở gốc thành hình chén.Tràng hoa có 4-5 cánh, tiền khai lợp Bộ nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị rời nhau, baophấn thuôn dài Cuống bầu ngắn, các lá noãn dính nhau hoàn toàn, bầu 3-5 ô.Quả mọng, hình cầu hoặc trứng, không có lông hình túi nước mọng (tép), vỏquả dày Hạt to, dẹt hai bên, vỏ hạt mỏng, phồng lên [3]

1.1.2 Phân bố của chi Paramignya

Trên thực tế, việc phân loại chi Paramignya, năm 2008 Zhang và các cộng

sự cho rằng chi Paramignya có khoảng 15 loài và chi này phân bố chủ yếu ở

Nam Á, Đông Nam Á và miền Bắc nước Úc [4]

1.1.3 Phân loại chi Paramignya

Theo các dữ liệu thực vật học do nhiều tổ chức nghiên cứu và các nhà thựcvật của Vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh) và Vườn Thực vật Missouri

(Hoa Kỳ), đến năm 2013, có 30 loài được cho là thuộc chi Paramignya.

Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa được thống nhất giữa

các nhà phân loại học thực vật Gần đây, Zhang D X [4] cho rằng chi

Paramignya có khoảng 15 loài và phân bố ở Nam Á, Đông Nam Á và miền

Paramignya andamanica là dạng thân cây gỗ trườn, thân cao 1-4 m, cành

mảnh, khi non có lông, trưởng thành nhẵn, gai đơn, dài Lá chét hình trứngngược, dai, có nhiều tuyến nhỏ, đỉnh nhọn, có mũi, gốc tròn, gân bên 10-12đôi, cuống lá dài, có lông khi non Cụm hoa mọc ở nách lá, có 1-2 hoa, mỗihoa có 2 lá bắc, nụ hoa mảnh, cuống hoa dài hơn cuống lá Đài 5 thuỳ hìnhtam giác tù, nhẵn hoặc mép có lông ngắn Tràng 5 cánh hoa, nhẵn đỉnh tròn

Bộ nhị có 10 nhị, chỉ nhị rời nhau, gốc chỉ nhị nhẵn hoặc có lông thưa, baophấn hình bầu dục thuôn Bầu nhẵn có 5 ô, vòi nhụy mảnh, thuôn, không cólông, đầu nhụy phồng 3 thuỳ Quả hình tròn, khi chín có màu vàng Cây nởhoa vào tháng 8, có quả vào tháng 10 đến tháng 12

Paramignya andamanica phân bố chủ yếu ở Đà Nẵng, Khánh Hoà (Nha

Trang, Phú Hữu), Đồng Nai và trồng ở Nam bộ

Cây còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Andaman, Lào, Campuchia

Ngoài ra, quả của cây ăn được, lá và quả đun sôi uống có thể chữa viêmphế quản, ho [6]

Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa) [5]

Paramignya monophylla là cây gỗ nhỏ, leo hoặc trườn, cành nhỏ, có gai

cong, dài Lá mọc cách, dai, hình thuôn, bầu dục, gốc tròn, mép nguyên,cuống lá dài nhẵn Cụm hoa có một hay vài hoa, mọc ở nách lá Đài 5 thuỳ,hình tam giác tù, dính nhau hình chén, mặt ngoài có lông.Tràng 5 cánh hoa,

gốc có lông, phía trên có lông thưa hoặc nhẵn, đầu nhụy phồng.Quả hình cầu,giống quả cam nhỏ, khi chín có màu vàng.

Xáo một hoa là loại cây ưa sáng, ra hoa vào tháng 6, ra quả tháng 8 đếntháng 10 [7]

Phân bố: Cây phân bố ở Vĩnh Phúc (Phúc Yên), Hà Nội (Ba Vì), Nghệ

An (Pù Mát) Còn có ở Ấn Độ [7]

 Paramignya scandens (Griff) Craib (Xáo leo) [5]

Paramignya scandens là loại cây gỗ nhỏ, thân trườn, cành màu nâu có

lông mịn, có gai dài nhỏ, cong và có lông Lá mọc cách, hình trứng, đỉnh lá cókhía rõ, gốc tròn, cuống lá có lông mịn Đài 4-5 thuỳ nhỏ, hình tam giác nhọn,gốc dính nhau thành hình chén, có lông Tràng 4-5 cánh hoa, hình dải, nhẵn

Bộ nhị có 8-10 nhị, chỉ nhị mảnh, nhẵn hay có lông, bao phấn ngắn hình bầudục, có tuyến nhỏ ở đỉnh Bầu hình bầu dục, nhẵn hay có lông, 5 ô, mỗi ôchứa 2 noãn, vòi nhụy nhẵn hoặc có lông, đầu nhụy phồng Quả hình trứngdài

Xáo leo là cây ưa bóng, ưa ẩm [7]

Mùa ra hoa vào tháng 4- 6, có quả từ tháng 5 đến tháng 8

Cây có ở tỉnh Hà Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng còn

có ở Lào, Thái Lan, Mianma

 Paramignya hispida Pierre ex Guillaum (Cựa gà nhám) [5]

Loài Paramignya hispida là cây gỗ nhỏ, có gai cong xuống, dài đến 1

cm, nhánh mảnh, lúc non có lông Lá phiến to, xoăn tròn dài, đáy hình tim,gân phụ không rõ Hoa đơn, 5 lá đài, có lông mặt ngoài, cánh hoa cao 1cm,tiểu nhụy 10, rời nhau làm thành thư đài, không lông, 5 buồng, 2 noãn vớidạng sáo tròn, trái nhỏ

Paramignya hispida sống theo dạng bụi leo.

Cựa gà nhám được tìm thấy ở Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai [7]

Paramignya griffithii Hook (Xáo Grifith) [5]

Paramignya griffithii là cây tiểu mộc leo Có gai cong, cành mảnh, lá có

phiến bầu dục, rộng ở nửa trên, mỏng, hai mặt nâu lọt lúc khô Gân phụ từnăm đến bảy cặp, cuống dài, hoa có từ một đến ba hoa mọc ở nách lá, cong,mảnh, đài hình đĩa, tiểu nhụy từ 6-10 rời nhau, chỉ ngắn hơn bao phấn, dĩamật, não sào có lông Trái xanh, tròn to

Xáo Grifith phân bố ở Khánh Hoà (Nha Trang), Lâm Đồng [7]

Paramignya petetotii Gruill (Xáo petelot) [5]

Paramignya petetotii là cây dạng tiểu mộc leo, cành già có xám, bì

khẩu nhỏ, nhiều, trăng trắng, gai nhỏ, cong Lá có phiến bầu dục tròn dài, to,hoa mọc ở nách lá, cánh hoa hẹp, tiểu nhụy 10, dài bằng cánh hoa, noãn sào,

có lông, 5 buồng

Xáo petelot sống theo dạng bụi leo, cành già màu xám [7]

Phân bố: Hoà Bình (Dựa suối).

 Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum (Xáo tam phân) [5]

1.1.4 Tác dụng dược lý của chi Paramignya

Hầu hết dược tính của chi Paramignya được biết đến thông qua các nghiên cứu trên loài P monophylla vốn được biết là loài cây thuốc được sử

dụng trong dân gian ở nhiều nước châu Á [8]

Năm 1982, Jayaweera đã đề cập đến loài P monophylla như một loại

thuốc bổ, lá được nghiền sơ dùng đắp bên ngoài vết thương do rắn cắn vàdùng cho vật nuôi ăn khi bị chứng huyết niệu hoặc mất máu từ bụng [9]

Nghiên cứu của Kumar và cộng sự cho thấy trong vỏ rễ của loài này cóchứa các hợp chất thuộc nhóm coumarin (những dẫn chất α- pyron có cấutrúc C6-C3) và nhóm hợp chất này có những hoạt tính sinh học giá trị như đã

nói ở trên Niyaz (1995) khi nghiên cứu các hợp chất hóa học của P monophylla đã phân lập được một số hợp chất coumarin như poncitrin,

nordentatin,… [10]

Ngoài ra, quả của P monophylla chứa flindissone, deoxyfiindissone và

4 hợp chất tirucalladiene như 7,24-dien-23-ol, 7,24-diene-21,23- diol cũng như dẫn xuất 3β-hydroxy của chúng nên cũngcho thấy hoạt tính sinh học khá lý thú của loài này [11]

3-oxotirucalla-Wattanapiromsakul khi nghiên cứu vỏ thân cây P griffithii ở Thái Lan

đã phân lập được 5 hợp chất, điển hình là: Amoradicin [12]

Ngoài ra, Wiart đề cập P scandens có khả năng sinh tổng hợp các

prenylated flavanone như amoradicin Cho đến nay, tính chất dược lý của

nó vẫn chưa được làm rõ Tuy nhiên, flavonoid nói chung có khả năngkháng khuẩn hoặc gây độc tế bào (cytotoxic) Ở Malaysia, rễ của loài nàysắc uống có tác dụng làm giảm đau bụng dưới, còn toàn bộ cây sắc uống

để trị bệnh giang mai [13]

Theo Phạm Hoàng Hộ, các loài thuộc chi Paramignya ở Việt Nam

được dùng trong y học cổ truyền như sau:

Paramignya armata Oliv var andamanica King (Cựa gà) có lá và

quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho…[6]

Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa) chống siêu khuẩn R.D in vitro, trị bạch đái hạ [2].

1.1.5 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi

Paramignya

1.1.5.1.Nghiên cứu về thành phần hóa học

 Một số nghiên cứu trên thế giới

Chi Paramignya được nghiên cứu từ năm 1990, tập trung chủ yếu vào

2 loài P monophylla và P griffithii Hầu hết các hợp chất tách ra từ lá, rễ, vỏ thân và quả Các hợp chất tách ra từ chi Paramignya thuộc các lớp chất phổ

biến như coumarin, flavonoit, tritecpenoit Với các lớp chất phong phú đadạng như vậy, chúng có nhiều hoạt tính lý thú như chống ung thư, tác nhânbảo vệ gan, kháng khuẩn

Từ vỏ thân loài P monophylla, năm 1995 V Kuma và cộng sự đã phân

Từ quả loài này, nhóm tiếp tục phân lập được flindissone (7), và hai

triterpen mới có công thức phân tử là C30H48O2 (7), C30H50O2 (8) [12]

Năm 2000, Wattanapiromsakul khi nghiên cứu vỏ thân cây P griffithii

ở Thái Lan đã phân lập được 5 hợp chất là [12]:

OH OH

 Một số nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Toàn Phan cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất Glycosit từ phần

chiết nước của cây Xáo leo (P scandens) [15].

O HO

OH

O HO

OH

COOMe

O HO

Hình 3: Cấu trúc hóa học 5 hợp chất Glycosit được phân lập từ phần chiết

nước của cây P scandens

Năm 2013, khi nghiên cứu thành phần hoá học, độc tính cấp, tác dụngbảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của cây Xáo tam phân Viện

Dược liệu đã chỉ ra rằng cây có chứa hợp chất có tên là Ostruthin (19), qua

các thử nghiệm lâm sàng trên chuột cho thấy hợp chất này có hoạt tính bảo vệgan tốt nhưng chưa có khả năng ức chế 5 dòng tế bào ung thư [16]

HO

Hình 4: Cấu trúc hóa học cả Ostruthin

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã tìm ra được hai dẫn

xuất tirucalane từ cây Paramignya scandens là paramignyol A (20) và

paramignyol B (21), hai hợp chất này có khả năng ức chế đáng kể các dòng tế bào

ung thư như KB, SK-Mel-2, LU-2 và MCF-7 [17]

O

OMe

HO

H H

Hình 5: Cấu trúc hai hợp chất tirucalane

1.1.5.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Sau khi nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường công bố kết quả ban đầu vềthành phần hóa học rễ cây Xáo tam phân gồm ninhvanin, ostruthin [18], ViệnDược liệu đã công bố trên Tạp chí Dược liệu về nghiên cứu nghiên cứu thànhphần hoá học, độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ungthư của cây Xáo tam phân [16]

Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng loài cây này có chứa hợp chất có tên là

ostruthin (19), qua các thử nghiệm in vitro trên chuột cho thấy hợp chất này có

20 R1 = OMe, R2 = H

21 R1 = H, R2 = OMe

khả năng ức chế trung bình năm dòng tế bào ung thư: ung thư gan Hep-G2, ungthư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8

và ung thư cổ tử cung Hela [16]

Nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự đã công bố kết quả vềthử nghiệm trên các dòng tế bào người KB, SK-Me-2, LU-1 và MCF7 đối với hai

dẫn xuất mới tirucallane, Paramignyol A và B phân lập từ cây P scandens [19].

Paramignyol B cho giá trị IC50 3.55 µM với dòng tế bào SK-Me-2, trong khiParamignyol A cho IC506.02 µM Giá trị IC50 5.25-10.50 µM đối với các dòng

tế bào KB, LU-1 và MCF7 cho cả hai hợp chất

1.2. Tổng quan về cây Xáo tam phân (Paramignya trimera)

Tên gọi khác: Cây thần dược, cây rễ mọi, cây rễ lạ, cây thần xạ

Cây gỗ nhỏ, bụi leo hay trườn, thân dài tới 4-5 m; có gai nhọn, hơi cong hayngang, dài 0.4-1.2 cm Lá mọc so le Phiến lá đơn, dày, hình bầu dục thuôn, kíchthước khoảng 2.3-5 x 1,8-2 cm; đỉnh lá có khía nhỏ, gốc lá tròn, mép lá có khía ởphía trên; mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt và bóng, có 8-10 đôi gân bên; cuống

lá dài khoảng 4-8 mmm, nhẵn Cụm hoa dạng chùm mọc ở nách lá, gồm 2-8 hoa

Hoa mẫu 3; cuống hoa ngắn, nhẵn, có lá bắc; đài tồn tại trên quả, 3 lá đài dínhnhau, có tuyến rõ, mép có lông; 3 cánh hoa nhỏ, dài 4mm; nhị 6, ngắn hơn cánhhoa, chỉ nhị dày và dẹt; bao phấn hình bầu dục; bầu 2-3 ô, mỗi ô chứa 1 noãn,vòi nhụy dày, có tuyến, đầu nhụy dẹt, có 3 gờ Quả gần hình cầu, có đài và vòinhụy tồn tại, đường kính quả chỉ khoảng 1,5cm.

Gỗ thân cứng, màu vàng Rễ màu nâu sẫm hay vàng Lõi rễ màu vàng ngà.Toàn thân chứa tinh dầu, nhất là ở rễ

Cây có mùa hoa quả khoảng tháng 5-10

Hình 6: Thân và rễ Xáo tam phân

1.2.2 Phân bố

Cây thường mọc ở sờn núi đá hoặc núi đất lẫn đá ở nơi khô cằn

Trên thế giới, Xáo tam phân được tìm thấy chủ yếu ở Châu Á Một số quốcgia có sự xuất hiện của Xáo tam phân là: Philippin, Indonesia (Java), ĐôngTimor, Ấn Độ, Australia

Ở Việt Nam, Xáo tam phân được tìm thấy ở các tỉnh: Phan Thiết, TâyNinh, Khánh Hòa (Ninh Vân), Phú Yên và một số đảo dọc bờ biển Nam Trung

Bộ

1.2.3 Tác dụng dược lý của Xáo tam phân

Giữa năm 2012, nhiều tờ báo ở Việt Nam đăng tin về một cây thuốc ở xãNinh Vân, tỉnh Khánh Hòa được người dân sử dụng để trị một số bệnh như xơgan cổ chướng, viêm gan siêu vi, ung thư gan, ung thư đại tràng và ung thư cổ tửcung Dựa trên các thông tin thu thập và một số mẫu vật (cành, lá), các nhà thực

vật học đã xác định rằng đây là loài Paramignya trimera, tức Xáo tam phân, có

trong bộ Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [5]

Xáo tam phân đã được người dân địa phương biết đến và sử dụng từ lâu,

vị thuốc Xáo tam phân được bào chế kết hợp với các vị thuốc khác điều trị nhữngbệnh nan y như ung thư máu, ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại tràng, viêmgan siêu vi và sử dụng để bồi bổ sức khỏe

Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu cho thấy loài P trimera có các

thành phần flavonoit, saponin, ankaloit và chủ yếu là courmarin và triterpenoid cótác dụng ức chế tốt viêm gan cấp ở thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, ức chế, tiêudiệt 5 dòng tế bào ung thư: Ung thư gan Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ungthư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela(ức chế mạnh nhất với ung thư gan Hep- G2 và ung thư cổ tử cung) Thí nghiệmcũng cho thấy với độc tính thấp, Xáo tam phân khá an toàn khi sử dụng [16]

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu bảo vệ gan

1.3.1 Phương pháp gây độc bằng paracetamol

- Tác nhân: Paracetamol liều cao (cấp tính)

- Cơ chế gây tổn thương gan của paracetamol thông qua sự tạo thành quánhiều chất chuyển hóa hoạt động N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI)

+ NAPQI là một sản phẩm chuyển hóa paracetamol do hệ enzymcytochrome P-450 ở gan giải phóng

+ Glutathione của gan là chất chống ôxy hóa chủ yếu, chất này gắn vàtrung hòa NAPQI tạo thành axit mercapturic vô hại và bị thải ra ngoài qua thận.Khi đó NAPQI không gắn được vào màng tế bào gan và không làm tổn thương tếbào

Tuy nhiên, khi sử dụng liều cao paracetamol sẽ gây rối loạn phản ứng trên

Kho dự trữ glutathione bị cạn kiệt dần và khi thiếu hụt mất trên 70% số lượngbình thường thì NAPQI không bị trung hòa và sẽ liên kết với protein và DNA của

tế bào gan, gây tổn thương gan

Sơ đồ 1: Quá trình chuyển hóa paracetamol tạo thành NAPQI

1.3.2 Phương pháp xét nghiệm

Xét nghiệm chức năng gan qua định lượng aminotransferase (AST, ALT),cholesterol toàn phần và protein toàn phần trong huyết thanh chuột được địnhlượng bằng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định lượng sinh hóa bán tựđộng AU680 của hãng Beckman Counter Thực hiện tại Phòng thử nghiệm sinhhọc – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam

1.3.3 Phương pháp kiêm tra trực quan

Kiểm tra trực quan: Sau toàn bộ thí nghiệm và sau khi lấy máu xét nghiệm,chuột được mổ để kiểm tra trực quan Chụp ảnh gan động vật thí nghiệm

1.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’test, F’test

và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (One wayANOVA) và sử dụng hệ số LSD (Least-significant difference) để kiểm tra sự saikhác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với đối chứng paracetamol (PAR), vớiSilymarin Nếu p<0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu p>0.05 sự sai khác làkhông có ý nghĩa thống kê

PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thân và rễ loài Xáo tam phân được thu hoạch vào tháng 2 năm 2013tại xã Ninh Vân – Khánh Hòa Tên khoa học được TS Nguyễn Văn Bách, ViệnSinh Thái và Tài nguyên sinh vật giám định Mẫu tiêu bản (C-499) được lưu tạiPhòng Hoạt chất sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

Mẫu thực vật sau khi thu về được phơi hoặc sấy khô, có thể nghiền nhỏ.Sau đó, được bảo quản trong bao bì ở nơi khô thoáng hoặc điều kiện lạnh, tránh

vi sinh vật hay nấm mốc phát triển, đảm bảo chất lượng mẫu để tiến hành nghiêncứu thực nghiệm

2.1.2.2 Phương pháp phân lập

 Phương pháp chiết dung môi

Rễ Xáo tam phân được chiết bằng hai pha rắn – lỏng với MeOH ở nhiệt độphòng

 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phần chiết MeOH được phân bố giữa nước và các dung môi hữu cơ khácnhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254(Merch, 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở haibước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi nung nóng trên bếp điện ở 250OC đếnkhi hiện màu

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với các chât hấp phụ khácnhau: silica gel pha thường hoặc pha đảo YMC, diaion HP-20, sephadex-LH-20…

Phương pháp sắc ký lớp mỏng là phương pháp hiện đang được sử dụng rấtrộng rãi trong các ngành khoa học hóa học, sinh học, hóa dược với nhiều mụcđích khác nhau do các đặc tính ưu việt như:

- Độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (từ 1 – 100 µg).

- Tốc độ phân tích nhanh.

- Kỹ thuật phân tích dễ thực hiện.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng có thể được dùng để phân tích định tính hayđịnh lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho cácphương pháp sắc ký cột để sác định điều kiện phân tách

Chuẩn bị mẫu phân tích:

Hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp (1mg/ml), sau đó dùng capilla hútdịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dịch mẫu lên trên lớp hấp phụ ở vị trícủa tuyến xuất phát

Dung môi triển khai:

Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại khi sửdụng Các hệ dung môi được pha theo tỷ lệ phù hợp Khi pha phải lắc kỹ cho các

dung môi trong hệ trộn đều rồi cho vào bình triển khai sắc ký Để yên đến khibình bão hòa dung môi mới triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng:

Bản mỏng được cắt có kích thước phù hợp, có hai tuyến dung môi là tuyếntrên và tuyến dưới Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bìnhchạy sắc ký, đậy nắp kín và quan sát vệt dung môi Khi quan sát thấy dung môi

đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiếnhành nhận biết vết chất trên bản mỏng

Phát hiện vệt chất trên bản mỏng:

 Đèn tử ngoại: Bản mỏng được chiếu dưới bước sóng tử ngoại ở λ= 254 nm

và λ= 365nm

 Thuốc thử hiện màu: Bản mỏng được phun các thuốc thử đặc hiệu

Đánh dấu các vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của cácvệt chất Dựa vào vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá sơ bộ số lượng các hợp chất

có trong hỗn hợp, khả năng phân giải của hệ dung môi và định hướng cho phântách sắc ký điều chế

Hình 7: Mô tả sắc ký bản mỏng

 Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ khác nhau (Silica gel, Diaion,Sephadex LH – 20)

Sắc ký cột được thực hiên trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế hấp phụ

và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chấtthiên nhiên

Phân tách hỗn hợp các chất được thực hiện dựa trên sự khác biệt về tốc độ

di chuyển Rf các chất khi pha động đi qua pha tĩnh Pha tĩnh thường là silica gelđược nhồi trong một cột sắc ký và pha động là hệ dung môi chạy cột

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trong lực của dung môi

Hình 8: Mô tả sắc ký cột 2.1.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hoá học của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại một cách chính xác và hiệu quả nhất

Ngày nay, để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ, người ta thường sử dụng các phương pháp đo phổ sau:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều(1D – NMR): proton (1H – NMR), cacbon– 13 (13C – NMR) và DEPT; và 2 chiều (2D – NMR): HSQC, 1H-1H COSY, 1H- 13C HMBC, 1H – 1H NOESY được ghi trên máy Bruker

Avance 500MHz với TMS là chất chuẩn nội tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khổi lượng ion hóa phun sương điện tử (ESI – MS) được ghi trên máy

Agilent 6310 Ion Trap tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng APCI-ESI-MS được ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL

Agilent 1100 series tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Xác định điểm chảy: điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius tại Viện

Hoá học - Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ hồng ngoại (FT- IR): phổ hồng ngoại được đo trên máy IMPACT–410

của hãng Nicolet (Mỹ) tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

2.1.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Nhằm xác định khả năng bảo vệ gan của cao chiết clorofom từ cây Xáo tamphân, chúng tôi đã phân tiến hành thử hoạt tính trên chuột dựa trên mô hình gâytổn thương gan thực nghiệm bằng paracetamol thông qua các chỉ tiêu:

 Nghiên cứu sự thay đổi chỉ số AST và ALT (Sự thay đổi enzyme chứcnăng gan)

- AST và ALT thường liên quan đến viêm và tổn thương tế bào gan, mộttình trạng được coi là tổn thương tế bào gan

- Khoảng trung bình của AST và ALT ở người tương ứng là 0- 40 UI/L và0-45 UI/L

- Tỷ lệ ALT và AST cũng có thể mang lại thông tin có giá trị liên quan đếnmức độ và nguyên nhân bệnh gan Hầu hết các bệnh về gan thì mức tăng ALTcao hơn mức tăng AST nhưng có 2 trường hợp ngoại lệ Xơ gan và nghiện rượuthì mức tăng AST cao hơn mức tăng ALT, thường tỷ lệ này là 2:1

 Nghiên cứu sự thay đổi nồng độ protein tổng số

Xét nghiệm định lượng protein toàn phần, albumin huyết tương có ý nghĩa

để đánh giá chức năng tổng hợp của gan Suy gan nặng, xơ gan làm giảm tổnghợp albumin, từ đó làm giảm protein huyết tương, giảm áp lực thẩm thấu ảnhhưởng đến trao đổi nước, muối giữa huyết tương và dịch gian bào

Nồng độ protein bình thường là nằm trong khoảng 60-80 g/l Chỉ số nàythấp hơn chính là biểu hiện của các bệnh lý về gan như rối loạn gan, xơ gan, viêmgan

 Nghiên cứu sự thay đổi lipit toàn phần

Cholesterol là một loại lipit đặc trưng do gan tổng hợp, este hóa và thảitrừ ra ngoài

Bình thường, nồng độ cholesterol toàn phần nằm trong khoảng 156 ± 20

mg hay < 5,2 mmol/l Chỉ số này càng thấp càng tốt, ngược lại, chỉ số này caodẫn đến nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, gan, thận

 Nghiên cứu trực quan mô bệnh học gan

 Nghiên cứu tiêu bản mô bệnh học gan

- Thiết bị: Cột sắc ký, máy hứng phân đoạn, máy cô quay chân không, máysiêu âm, máy chưng cất dung môi

2.2.2 Thu mẫu và tạo dịch chiết từ thân, rễ cây Xáo tam phân

2.2.2.1 Thu mẫu và xử lý mẫu

Dựa theo đúng nguyên tắc, mẫu Xáo tam phân thu về được rửa sạch, loại

bỏ phần hư hỏng, thái nhỏ, phơi khô, gắn ký hiệu và xay nhỏ, bảo quản trong kho

có máy hút ẩm ở 400C

2.2.2.2 Tạo dịch chiết từ thân và rễ cây Xáo tam phân

Phương pháp chiết có một số ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập cáchợp chất mong muốn Các phần chiết có độ phân cực nhất định được điều chếchọn lọc với các dung môi hữu cơ

Quy trình tạo dịch chiết được trình bày theo sơ đồ sau:

Thân, rễ Xáo tam phân

(5 kg)

Dịch chiết MeOH(300 g)

(1), (2)

Sơ đồ 2: Quy trình tạo dịch chiết phân đoạn từ thân, rễ cây Xáo tam phân

Ghi chú:

(1) Ngâm chiết bằng MeOH (15 lít/lần, 3 lần)

(2) Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

(3) Thêm nước cất

(4) Chiết lần lượt với các dung môi: n- hexan, clorofom, EtOAc

(5) Làm khô và cất loại dung môi dưới áp suất giảm

Thuyết minh quy trình:

Rễ Xáo tam phân (5 kg) sau khi được xay nhỏ và làm khô, được ngâm chiếttrong metanol 3 lần mỗi lần 15 lít dung môi, mỗi lần 3 ngày ở nhiệt độ phòng

Fr EtOAc(11,4 g)

Fr H2O(58 g)

Fr Clorofom(70 g)

Fr n – Hexan

(24,6g)

(3), (4), (5)

Dịch chiết thu được tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy côquay chân không thu được 300g dịch chiết MeOH tổng Phần dịch chiết này đượcthêm nước cất và chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, vớimục đích phân loại các lớp chất có độ phân cực khác nhau Dung môi sử dụng lần

lượt là n-hexan, clorofom, etyl axetat.

Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần dịch chiết tương

ứng: phân đoạn n- hexan thu được 24,6 g (A), phân đoạn clorofom thu được 70 g

(B), phân đoạn etyl axetat 11,4g (C), còn lại là dịch nước 58 g (D)

Ta có:

Bảng 1: Hiệu suất thu nhận của quá trình chiết

STT Tên phân đoạn Khối lượng dịch chiết thu được từ

5 kg mẫu ban đầu Hiệu suất

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết clorofom

2.2.3.1 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết clorofom khi gây độc bằng paracetamol

Sau khi thu được các dịch chiết phân bố, chúng tôi đã tiến hành kiểm trahoạt tính của chúng bằng phương pháp gây tổn thương gan thực nghiệm dưới tácdụng của paracetamol