Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây khúng khéng ở việt nam

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 3 Hình 1.2 Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 4 Hình 3.1 Quả, hạt và cuống mang quả của dược liệu khúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY

KHÚNG KHÉNG Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY

KHÚNG KHÉNG Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sỹ của tôi được hoàn thành tuy chưa được gọi là một công trình khoa học, kết quả còn nhiều thiếu sót, tuy nhiên tôi luôn trân trọng quãng thời gian thực hiện luận văn này vì nó cho tôi cơ hội được làm việc và lĩnh hội rất nhiều kiến thức từ các thầy cô, bạn bè

Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới : TS Bùi Hồng Cường và TS Phương Thiện Thương Sự giúp đỡ, cảm thông của các thầy dành cho tôi không chỉ nằm trong phạm vi của những người thầy đối với học trò, sự tận tụy ấy có lẽ còn xuất phát từ tình người Điều đó khiến tôi nể và phục các thầy hơn cả sự bao la về kiến thức

Những lời tiếp theo tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể cán bộ khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn của Viện Dược Liệu và bộ môn Dược học cổ truyền – Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này

Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2016

Tác giả luận văn

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 1

1.1 Đặc điểm thực vât………1

1.2 Thành phần hóa học của loài Hovenia dulcis ………2

1.3 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis Thunb ……… 5

1.4 Công dụng theo y học cổ truyền và dân gian của Khúng khéng………8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu………10

2.2 Phương tiện nghiên cứu……….………10

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 12

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật……….………… ……… 12

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý ……… …… 12

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học ……… ………… 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 25

3.1 Giám định tên khoa học của dược liệu Khúng khéng và đặc điểm vi học….25 3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái……… ……… 25

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu……… ……… 27

3.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu Khúng khéng………… ……….29

3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý……… 30

3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học………34

3.3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học……… 34

3.3.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng SKLM………36

3.3.3 Kết quả chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ Khúng khéng………38

3.3.3.1 Chiết xuất……….…39

3.3.3.2 Phân lập……… 39

3.3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được……… 41

3.3.3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được……… 43

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN……….50

4.1 Về đặc điểm thực vật……….50

4.2 Về tác dụng dược lý……… 51

4.3 Về thành phần hóa học……… 53

4.4 Về sự liên quan giữa thành phần hóa học và tác dụng dược lý……….54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADH Alcohol dehydrogenase

ALT Alanin amino transferase

AST Aspartat amino transferase

MeOH Methanol

NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin

OD Optical density (Mật độ quang)

UV Ultra violet (Tia cực tím)

γ-GT Gamma glutamyl transferase

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 3.1 Tác dụng của cao khúng khéng đối với hoạt độ AST

trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu

31

Bảng 3.2 Tác dụng của cao khúng khéng đối với hoạt độ ALT

trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu

32

Bảng 3.3 Tác dụng của cao khúng khéng đối với hàm lượng MDA

trong gan chuột ở các lô nghiên cứu

33

Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng 34 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK1 43 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK2 46 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK3 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 3 Hình 1.2 Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 4 Hình 3.1 Quả, hạt và cuống mang quả của dược liệu khúng khéng 26 Hình 3.2 Một số hình ảnh lá và hoa khúng khéng 26 Hình 3.3 Vi phẫu cắt ngang cuống mang quả khúng khéng 27 Hình 3.4 Vi phẫu hạt Khúng khéng 28 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột dược liệu Khúng khéng 29 Hình 3.6 Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (EtOH) và cắn

phân đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng với hệ dung môi 1

37

Hình 3.7 Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (EtOH) và cắn

phân đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng với hệ dung môi 2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây khúng khéng (còn có tên khác là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo) là một loài thực vật được trồng và mọc hoang rải rác tại một số tỉnh phía Bắc (chủ yếu là Lạng Sơn và

Cao Bằng) có tên khoa học là Hovenia dulcis Thunb., họ Táo (Rhamnaceae) [15] Cho

đến nay, đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây khúng khéng được công bố [15],[29],[52] Trong đó tác dụng nổi bật thu hút được sự chú ý nghiên cứu của các nhà khoa học là tác dụng bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc như carbon tetrachloride, D-galactosamine/lipopolysaccharide và rượu (cồn) trong các mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [24],[29] Hiện nay, có rất nhiều sản phẩm giúp giải độc rượu, bảo vệ gan từ dược liệu khúng khéng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Khúng khéng được phát hiện tại nước ta từ những năm 50 của thế kỷ trước Trong y học cổ truyền, người dân thường sử dụng khúng khéng để giải độc rượu, làm giảm những cảm giác khó chịu sau khi uống rượu như buồn nôn, khát nước…[13],[15] Mặc dù đã được sử dụng rất nhiều trong dân gian, nhưng ở Việt Nam có rất ít các công trình nghiên cứu về dược liệu này [2] Do vậy, để chứng minh tác dụng bảo vệ gan, cũng như cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về hóa thực vật học của cây khúng khéng, đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng ở Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu:

- Mô tả được đặc điểm hình thái, vi học và giám định tên khoa học của mẫu dược liệu khúng khéng thu hái tại Việt Nam

- Định tính thành phần hóa học, phân lập và xác định được cấu trúc của 2-3 hợp chất từ khúng khéng

- Đánh giá được tác dụng bảo vệ gan của khúng khéng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại và phân loại chi Hovenia

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [3], vị trí của chi Hovenia như sau:

Theo Thực vật chí Trung Quốc [25], chi Hovenia có 3 loài bao gồm:

- Hovenia dulcis Thunb

- Hovenia acerba Lindl

- Hovenia trichocarpa Chun

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.)

Cây gỗ to hoặc hiếm khi cây bụi, cao khoảng 7-10 m Vỏ thân, cành màu nâu xám hoặc đen - tím, nhẵn Cành non màu nâu hồng, có lông nhỏ và nốt sần Lá mọc so

le, cuống lá dài 3 - 5cm, nhẵn Phiến lá hình trứng, dài 10 - 15cm, rộng 5 - 9cm, cả hai

bề mặt lá nhẵn hoặc có lông bột trên các gân ở mặt dưới Gốc lá tròn, đầu lá nhọn, mép

lá khía răng cưa không đều Ba gân tỏa ra từ gốc lá, 5 - 6 cặp gân phụ khác Mặt trên lục sẫm, mặt dưới nhạt [12],[13],[15],[25]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành xim ngắn hơn lá Hoa màu trắng hoặc lục nhạt, đường kính 6-8mm, cuống hoa nhỏ và nhẵn [15] Đài hoa hình chén khía

5 răng nhỏ kích thước 2,2 - 2,5 × 1,6 - 2 mm, nhẵn Tràng 5 cánh nhọn, hình thìa hoặc hình trứng, kích thước 2,4 - 2,6 x 1,8 - 2,1 mm [25] Đĩa có lông thưa thớt Nhị 5 xếp xen kẽ với cánh hoa Bầu nhụy hình cầu, nhẵn, đường kính 2 - 2,2 mm, bầu có đầu nhụy chia 3 [15]

Quả hạch có 3 hạt, gần hình cầu, nhẵn, khi chín có màu đen hoặc nâu xám, đường kính 6,5 - 7,5 mm Khi chín, cuống quả và những nhánh con mang quả trở nên mọng nước, màu hồng, nhiều thịt và có vị ngọt, ăn được Hạt tròn, dẹt, có màu nâu bóng, đường kính 5 - 5,5 mm [13],[15],[25]

Mùa hoa: tháng 5 - 6, mùa quả: tháng 8 - 10 [15]

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Cây khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) phân bố ở vùng ôn đới ấm và cận

nhiệt đới Đông - Bắc Á bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên Ngoài ra cây còn được tìm thấy ở Nga và cận Himalaya của Ấn Độ Khúng khéng thường mọc trong các thung lũng, gần bờ suối trên các loại đất còn tương đối màu mỡ Ở Việt Nam, khúng khéng mọc hoang và được trồng rải rác ở các tỉnh Lạng Sơn và Cao Bằng [13],[15],[16]

Khúng khéng là cây ưa sáng, thường mọc ở vườn hoặc bờ nương rẫy, ra hoa quả nhiều Xung quanh gốc cây mẹ thường thấy cây con mọc từ hạt Có thể trồng Khúng khéng bằng hạt hoặc bằng cây mọc từ chồi rễ [15],[16]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI HOVENIA DULCIS

- Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, flavonoid [34],[55],[62] và

saponin [18],[58],[60],[61] là 02 nhóm hợp chất chính trong loài Hovenia dulcis Ngoài

ra, dược liệu khúng khéng còn chứa alcaloid [39],[42], các thành phần dinh dưỡng như lipid, protein, đường khử, acid amin, các nguyên tố vi lượng Fe, Ca, Cu, Mn, P, Zn… [15]

1.2.1 Flavonoid

Năm 2000, từ loài khúng khéng Hovenia dulcis, các tác giả Kim H.S và Lee

H.Y đã phân lập được hợp chất hovenodulinol (I) có cấu trúc gần giống với các flavonoid khác trong khúng khéng đã được phân lập trước đó như hovenitin (II),

ampelopsin (III), laricetrin (IV), myricetin (V), (+) gallocatechin (VI) [34] (hình 1.1)

Năm 2013, Wu Long-Huo và cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất từ cây khúng khéng Các hợp chất được xác định là kaempferol, myricetin, dihydromyricetin,

vanillin, β-sitosterol, 5,7-dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon, chrysophanol, ethyl

caffeat, acid 3-hydroxy-4-methoxybenzoic, epicatechin Trong đó 5 hợp chất cuối là

những hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Hovenia dulcis tại thời điểm công bố

[61]

Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng Bên cạnh đó, một số flavonoid khác cũng đã được phân lập từ hạt khúng khéng như: (2R, 3R) 5,7,4',5' tetrahydroxy 3' methoxy dihydro flavonol; (2R, 3S) 5,7,3',4',5' pentahydroxyhydro flavanol; (2R, 3S) 5,7,4',5' tetrahydroxy 3' methoxy dihydro

flavonol [62] Như vậy có thể thấy rằng các flavonoid có trong cây khúng khéng chủ yếu thuộc 02 nhóm chính là flavonol và flavanonol

1.2.2 Saponin

Cùng với flavonoid thì saponin là một trong hai nhóm hoạt chất chính trong cây khúng khéng Các hợp chất saponin chính đã phân lập từ loài này có phần aglycon là jujubogenin, một sapogenin thuộc nhóm dammaran

Năm 1995, hai hợp chất triterpen glycosid mới có hoạt tính ức chế sự giải phóng Histamin được Yosikawa, Masayuki, Ueda Tomishiko phân lập từ khúng khéng Hai

hợp chất được đặt tên là Hovenidulcinosid A1 và A2 [61] (Hình 1.2) Sau đó, một vài saponin đã phân lập từ cây khúng khéng được công bố như 20-O-α-L- rhamnopyranosyl jujubogenin, hodulcin, [15], 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-3-O-β-

D-glucopyranosyl-α-L-arabinopyranosyl) jujubogenin, rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin, và 3-

3-O-(2-O-α-L-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin [60], jujuboside B,

hoduloside I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, hovenoside I, saponin C2, saponin E và

saponin H Đây là các saponin đặc trưng trong các loài thuộc chi Hovenia [18]

Hodulorid I Hovenidulciocosid A1 R=R1; A2 R=H Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng

1.2.3 Alcaloid

Từ hạt của cây khúng khéng, một vài alcaloid đã được phân lập và xác định cấu

trúc như perlorin, perlolyrin, β–carbolin [15],[16],[42]

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HOVENIA DULCIS THUNB

1.3.1 Tác dụng bảo vệ gan

Cắn chiết ethanol, methanol và nước của loài Hovenia dulcis đều đã được được

chứng minh có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm trước các tác nhân gây độc như carbon tetrachloride, D-galactosamine/lipopolysaccharide và rượu trong các

mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [24],[28],[29],[63] Trong đó thành phần mang lại hoạt tính được cho là dihydromyricetin (ampelopsin), một hợp chất có nhiều trong dược liệu khúng khéng [29] Tuy nhiên, các flavonoid khác, các triterpenoid saponin cũng đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ gan [27],[29],[62]

Năm 2006, một nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Y Bắc Kinh cho thấy

dịch chiết nước của loài Hovenia dulcis có khả năng làm giảm nồng độ cồn trong máu

và tăng cường hoạt tính của enzym ADH sau khi uống rượu Như vậy, Hovenia dulcis

có khả năng ngăn cản sự hấp thu rượu ở đường tiêu hóa, tăng chuyển hóa rượu tại gan, phòng chống say rượu và các tác hại do rượu gây ra [20]

Năm 2007, một nghiên cứu khác được thực hiện trên chuột để đánh giá tác dụng

của dịch chiết phân đoạn ethyl acetat của hạt loài Hovenia dulcis lên hệ thống các

enzym chuyển hóa ở gan Cyt P450 Kết quả là phân đoạn dịch chiết này có ảnh hưởng khác nhau lên một số enzym hệ Cyt P450 cụ thể là: hoạt động của enzym khử NADPH-cyt C và erythromycin N-demethylase không bị ảnh hưởng, hoạt động của aminopyrine N-demethylase trong gan đã tăng lên đến 42,4% Các biểu hiện mARN của CYP1A1, CYP2C11 và CYP3A1 đều tăng lên rõ rệt [64]

Năm 2010, nghiên cứu của Du J và các cộng sự cho thấy, dịch chiết từ hạt của

loài Hovenia dulcis có tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm giảm đáng kể hoạt độ

dismutase glutathione S - transferase, glutathione tạo điều kiện cho quá trình chuyển hóa rượu [23]

Ngoài các nghiên cứu kể trên, tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết nước và giấm

lên men từ Hovenia dulcis chống lại những thay đổi sinh hóa ở chuột đực do ethanol

gây ra cũng đã được nghiên cứu Khi cho chuột uống ethanol (50%, v/v, 10 ml/kg) trong 6 tuần, các enzym gan như AST, ALT, γ-GT trong huyết thanh và mức độ peroxid hóa lipid của gan của chuột tăng đáng kể (p < 0,01) Ngược lại, khi sử dụng dịch chiết nước hoặc giấm lên men từ khúng khéng (10 ml/kg) cùng với ethanol cho thấy sự giảm đáng kể (p < 0,05) các enzym (AST, ALT và γ-GT), các chỉ số gan, nồng

độ triglycerid và cholesterol trong huyết thanh Kết quả trên cho thấy, dịch chiết nước

và dấm lên men từ Hovenia dulcis có tác dụng tốt trong việc làm giảm các tác hại của

rượu [56]

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Minchun Wang đã chứng minh tác dụng bảo

vệ gan (do ngộ độc rượu cấp tính) của các thành phần polysaccharid bao gồm

galactose, arabinose, rhamnose và acid galacturonic trong cuống quả Hovenia dulcis Dịch chiết Hovenia dulcis làm giảm đáng kể nồng độ AST, ALT trong huyết thanh,

giảm đáng kể mức độ của MDA trong gan và phục hồi đáng kể các hoạt động của các enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn thương gan do rượu [52]

Gần đây, tác dụng bảo vệ gan của hợp chất myricetin phân lập từ loài Hovenia

dulcis Thunb trên chuột sử dụng nước chứa 3% choline đã được các nhà nghiên cứu

tại trường Đại học Shaanxi Normal (Trung Quốc) công bố Myricetin đã được chứng minh là có tác dụng dọn dẹp các gốc tự do DPPH˙, HO-, và O2˙ Sử dụng liên tục myricetin liều 400 mg/kg và 800 mg/kg ở chuột uống choline có thể làm giảm đáng kể cholesterol trong huyết thanh, triglyceride, lipoprotein tỷ trọng thấp, endothelin, thromboxan A2 cũng như ALT và AST (p < 0,05) Đồng thời, sử dụng myricetin ở liều

400 mg/kg và 800 mg/kg cũng làm giảm MDA gan Báo cáo này cho thấy, hàm lượng

choline cao trong chế độ ăn uống có thể gây tổn thương gan và hợp chất myricetin có trong khúng khéng có thể giảm bớt tác hại này [27]

1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa

Theo một nghiên cứu của Viện Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc, cắn

phân đoạn ethyl acetat thu được từ dịch chiết methanol của loài Hovenia dulcis Thunb

cho thấy khả năng bảo vệ hệ thần kinh khỏi tác nhân gây độc glutamat Tám hợp chất phenolic (1-8) đã được phân lập trong nghiên cứu này bao gồm: acid vanillic (1), acid ferulic (2), 3,5-dihydroxystilben (3), aromadendrin (4), methyl vanillat (5), catechin (6), acid 2,3,4-trihydrobenzoic (7) và afzelechin (8) Trong số các hợp chất phân lập được, hai hợp chất (6) và (8) thể hiện tác dụng bảo vệ hệ thần kinh khỏi tác nhân gây độc glutamat, đồng thời nhóm nghiên cứu đã chứng minh được khả năng dọn dẹp gốc

tự do của 02 chất này Từ các kết quả đó, Lin G và đồng sự cho rằng catechin và afzelechin có khả năng trở thành các chất bảo vệ thần kinh nhờ tác dụng dọn dẹp gốc

tự do của chúng [38]

1.3.3 Tác dụng tăng cường hoạt động thể chất, chống mệt mỏi

Khi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường sinh lực, nhóm chuột được uống

dịch chiết nước từ cuống quả của loài Hovenia dulcis Thunb có thời gian bơi tăng so

với nhóm chuột đối chứng (p<0,05) Nồng độ của acid thiobarbituric trong cẳng chân

chuột được uống dịch chiết nước của Hovenia dulcis (ở hai liều 100 mg/kg và 200

mg/kg) giảm đáng kể so với nhóm chuột đối chứng Ngiên cứu này cũng cho thấy, loài

Hovenia dulcis có khả năng làm tăng đáng kể các tác nhân chống oxy hóa trong gan

như superoxide dismutase Ngoài ra, Hovenia dulcis còn có khả năng làm giảm đáng

kể lượng glucose máu, cholesterol toàn phần và triglyceride Những kết quả trên cho

thấy, Hovenia dulcis là dược liệu có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động thể

chất và chống oxy hóa [40]

1.3.4 Tác dụng tăng cường miễn dịch

Theo một nghiên cứu in vitro đánh giá khả năng tăng cường miễn dịch, các polysaccharid trong cuống quả loài Hovenia dulcis bao gồm rhamnose, arabinose,

galactose và acid galacturonic có khả năng làm tăng cường đáng kể hoạt động thực bào, sản xuất oxit nitric và hoạt động acid phosphatase của các đại thực bào phúc mạc

Có thể xem, Hovenia dulcis là nguồn nguyên liệu tiềm năng giúp điều hòa miễn dịch

[53]

1.3.5 Tác dụng hạ đường huyết

Theo một nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí Dược liệu Trung Quốc năm

2002 cho thấy, dịch chiết của loài Hovenia dulcis có tác dụng hạ đường huyết khi sử

dụng mô hình gây tiểu đường bởi alloxan Glibenclamide được sử dụng làm thuốc đối chứng dương Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ đường trong máu của nhóm chuột

được uống dịch chiết từ loài Hovenia dulcis và glibenclamide thấp hơn đáng kể so với

nhóm chứng sinh học Nồng độ glycogen gan ở nhóm chuột được uống dịch chiết

Hovenia dulcis và glibenclamide được tăng lên đáng kể [31]

1.3.6 Tác dụng chống dị ứng

Bốn hợp chất saponin bao gồm hovenidulcioside A1, A2, B1, B2 được phân lập

từ quả và hạt của loài Hovenia dulcis thu hái tại Trung Quốc đã được chứng minh có

tác dụng ức chế sự giải phóng histamin từ tế bào màng bụng của chuột [60], [61] 1.4 CÔNG DỤNG THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN VÀ DÂN GIAN CỦA KHÚNG KHÉNG

Khúng khéng có vị ngọt, hơi chát, tính bình, có công dụng trừ phiền chỉ khát, chỉ thổ, thanh nhiệt, lợi tiểu và giải độc rượu [16] Khúng khéng còn là vị thuốc bổ dưỡng, điều trị các bệnh về tiêu hóa, chữa nôn mửa, ngộ độc, miệng khô khát [15]

Khi dùng lấy 100 g dược liệu ngâm với một lít rượu 40o Rượu có màu đỏ sẫm như rượu vang Ngày uống 3 lần trước bữa ăn, mỗi lần 30 ml [15]

Ở Trung Quốc, cuống quả được dùng để trị say rượu, miệng khát, nôn mửa, tiểu tiện khó khăn Ngày dùng 6 g, ngâm rượu uống [15], [16] Ở Nhật Bản, hạt khúng khéng là thuốc bổ giải độc chữa ngộ độc rượu, tiểu tiện không thông, cơ thể gầy yếu Ngày dùng 3 - 5 g ngâm rượu uống [13], [15]

Ở Ấn Độ, cao chiết từ quả khúng khéng chứa kali nitrat và kali malat là thuốc có tác dụng lợi tiểu mạnh [15]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cuống mang quả và quả của cây khúng khéng được thu hái tại Cao Bằng vào tháng 10 năm 2014 Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, phơi khô, đựng trong túi PE kín và lưu trữ tại Phòng lưu mẫu, Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

- Mẫu thực vật được Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa

học là Hovenia dulcis Thunb (Phụ lục 1)

- Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu với số hiệu là DL-050515

2.2 Phương tiện nghiên cứu

 Thiết bị dùng cho nghiên cứu:

- Cân kỹ thuật Precisa (độ chính xác đến 0.01g), cân phân tích (độ chính xác đến 0.0001g), bếp đun cách thủy

- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60

- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200

- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng 254 nm và 366 nm)

- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, bình cầu, phễu, giấy lọc…

- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3

- Máy vi tính với phần mềm winCATS

- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) (code: 1.05554.0001)

- Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Human Lyzer 2000

- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU

- Máy nghiền đồng thể

- Máy đo quang phổ UV-VIS 1800 Shimadzu, Nhật Bản

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650 – Perkin Elmer

- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS – Water – API – ISI

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz)

 Hóa chất, dung môi

- Các dung môi: ethanol, methanol (Me), n-hexan (Hx), ethyl acetat (Et), n-buthanol

(Bu), acid formic, cloroform, toluen… đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Các thuốc thử dùng trong phản ứng hóa học: TT Lugol, TT Bouchardat, TT Mayer,

TT Dragendoff, TT Diazo được pha theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam IV

- Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất: hỗn hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), acid sulfuric 10% trong ethanol

- Các thuốc thử tinh khiết dùng trong thử tác dụng bảo vệ gan: KCl, acid

tricloracetic, acid thiobarbituric, HCl 0,1N chuẩn, acid acetic, n-butanol, CCl4, dầu olive

- Các thuốc dùng trong nghiên cứu:

o Silymarin (biệt dược Honymarin) dạng viên nén hàm lượng 70 mg của hãng Alpha Pharma (Hàn Quốc)

o Paracetamol (độ tinh khiết 98%) do Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp

 Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino khỏe mạnh, sử dụng cả chuột đực và chuột

cái, trọng lượng từ 20 ± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103

Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng chăn nuôi, Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày và trong suốt thời gian nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu [10]

- Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [8],[10]

- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [10],[16] :

 Sử dụng các khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu [3]

 Đối chiếu với mô tả trong tài liệu [25]

 So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản của khoa Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý

Mẫu thử:

Bột dược liệu khúng khéng 12,3 kg (độ ẩm 12,1%) (cuống mang quả và quả) được chiết với ethanol 96% (3 lần × 4 giờ/lần) ở nhiệt độ 70oC Gộp tất cả các dịch chiết ethanol, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 70oC thu được cắn ethanol toàn phần, ký hiệu là KKC có khối lượng 2,06 kg Cắn ethanol (1,03 kg) được phân tán trong 1,0 lít nước cất, rồi lắc chiết với ethyl acetat (1 lít × 3 lần) Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 60oC thu được cắn phân đoạn ethyl acetat ký hiệu là KKE có khối lượng 115,8 g (Khối lượng của các mẫu cao là khối lượng khô tuyệt đối)

Các cắn ethanol (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat (KKE) được hòa vào nước cất với các nồng độ khác nhau để phù hợp với yêu cầu của thí nghiệm cho chuột uống

Phương pháp thử: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng

paracetamol (PAR), dùng chất đối chiếu dương là silymarin (biệt dược Honymarin) dạng viên nén hàm lượng 70mg của hãng Alpha pharma (Korea) [14], [26], [47], [49], [54] Cụ thể, các chuột sử dụng cho thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô

15 chuột Các lô chuột được dự kiến cho uống nước và mẫu thử như sau:

 Lô 1 (chứng sinh học): chỉ uống nước cất

 Lô 2 (mô hình): uống nước cất và PAR (liều 220 mg/kg)

 Lô 3 (chứng dương): uống silymarin liều 100 mg/kg và PAR (220mg/kg)

 Lô 4: uống KKC liều 200 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)

 Lô 5: uống KKC liều 500 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)

 Lô 6: uống KKE liều 200 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)

 Lô 7: uống KKE liều 500 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)

Chuột ở các lô được uống nước cất và mẫu thử hoặc silymarin theo liều đã dự kiến liên tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào 9 giờ sáng Ở ngày thứ 8 để chuột nhịn đói 16 -

18 giờ tính đến khi cho uống nước cất và mẫu thử (hoặc silymarin) Sau 1 giờ, gây độc cho chuột ở tất cả các lô (trừ lô chứng sinh lý) bằng việc cho uống PAR liều 220 mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g

Phương pháp đánh giá: 24 giờ sau khi gây độc bằng PAR, lấy máu động mạch cảnh

của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt cổ, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng enzym ALT, AST Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, định lượng MDA dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử

Nguyên lý phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl

dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm

Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol

Nguyên tắc định lượng MDA: Định lượng MDA theo phương pháp Wasowich

và Balahoroglu [54]

Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M Hút 200 μl dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25% pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100oC trong 60 phút Để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều,

thêm vào 3,5 ml n-butanol, ly tâm 3000 v/phút x 10 phút, hút phần n-butanol đo quang

ở bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh (lô

mô hình) sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của mẫu thử

Xây dựng đường chuẩn hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan

Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA: y = 32,455 x – 0,3411

Trong đó: - x là mật độ quang đo được

- y là hàm lượng MDA dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng thể) Sau khi tính được hàm lượng MDA trong dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng thể), suy ra hàm lượng MDA trong gan chuột (nmol/100mg gan)

Phương pháp xử lý số liệu, đánh giá kết quả: Các số liệu thu thập được xử lý bằng

phương pháp thống kê y sinh học theo t-test student, sử dụng phần mềm Microsoft – Excel, để đánh giá mức độ khác nhau giữa các lô Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (μ = X ± SD) Sự khác biệt được xem có

ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.3.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu khúng khéng bằng phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [5],[6],[7]

y = 32,455x - 0,3411 R² = 0,9974

-5 0 5 10

 Định tính flavonoid:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml cồn 90o Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

a Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng

10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5) giọt Để yên một vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam

b Phản ứng với kiềm

Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi

hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng Phản ứng dương tính nếu vết màu vàng đậm lên

Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài

giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa vàng và khi thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện dung dịch màu xanh đen

d Phản ứng với diazo hóa

Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9 g acid sulfanilic trong 9 ml HCl đậm đặc (đun

nóng), pha loãng với nước đến 100 ml Lấy 10 ml dung dịch ngâm trong nước đá rồi cho thêm 10 ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút Dung dịch chỉ pha để dùng ngay

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút) Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm

 Định tính coumarin:

Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành các phản ứng sau:

a Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết:

- Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

- Ống 2: để nguyên

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát

c Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dich NaOH 5% Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại ra Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại, nếu có coumarin sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên Sau vài phút cả hai phần sẽ phát quang như nhau

Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250

ml, thêm 5 ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi 15 phút Lọc nóng qua giấy lọc dịch lọc được đưa vào làm các phản ứng

a Phản ứng tạo bọt:

Cho 0,5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm trong 30 giây Để yên Quan sát cột bọt sau 15 phút

b Phân biệt 2 loại saponin:

Lấy hai ống nghiệm có đướng kính trong bằng nhau:

 Định tính glycosid tim:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bính nón dung tích 250

ml Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 30 ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1

ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml, gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ

đã được sấy khô Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natrisulfat khan

Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô, cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng sau:

a Phản ứng Liebermann – Burchardat (TT phản ứng lên nhân Steroid của glycosid):

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn Glycosid tim 1 ml anhydrid acetic Lắc đều cho tan hết cắn Nghiếng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

b Phản ứng Baljet (TT phản ứng lên vòng butenolic của các glycosid và aglycol thuộc nhóm cardenolid):

Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1%

và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều:

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn, nếu có glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

c Phản ứng Legal (TT phản ứng lên vòng butenolic):

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ một giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn Nếu có Glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

Chú ý: Phản ứng của vòng lacton cho màu sắc không bên cần quan sát màu ngay

sau khi nhỏ thuốc thử

d Phản ứng Keller – Kiliani (TT phản ứng với đường 2-desoxy):

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Nhỏ từ từ theo thành ống 0,5 ml aicd sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có Glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

 Định tính anthranoid (dạng tự do):

Phản ứng Bortraeger:

Chiết xuất: Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10 ml) Thêm 5ml

nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch amoniac 10% Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu có anthranoid lớp nước sẽ có màu đỏ sim

Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn toàn

tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5 ml nước cất bằng 5 ml H2SO4

1N

Phản ứng vi thăng hoa:

Đặt khoảng 3 g bột dược liệu trong một đĩa nhôm Hơ nhẹ trên bếp điện cho bay hết nước trong dược liệu Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên phiến kính đó có

để một miếng bông đã tẩm nước lạnh Để đĩa nhôm trực tiếp trên bếp điện Sau 5 - 10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển vi Nếu có anthranoid thì thấy tinh thể hinh kim màu vàng Sau khi nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính, dung dịch sẽ có màu đỏ

 Định tính tanin:

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để làm các phản ứng định tính sau:

- Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen

- Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông

- Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc Thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng

- Ống 1: TT Mayer, phản ứng dương tính nếu có tủa từ màu trắng đến vàng

- Ống 3: TT Dragendoff, phản ứng dương tính nếu có tủa vàng cam đến đỏ

 Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ

Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội Lọc dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính sau:

Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước Thêm vào

5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 10 phút Phản ứng dương tính nếu đáy ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch

Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn cho vào mỗi ống:

- Ống 1: 4 ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol

- Ống 2: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Quan sát và so sánh hai ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2

Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước Thêm vào

3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi 10 phút Phản ứng dương tính nếu dung dịch có màu tím hoặc xanh tím

Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4 ml dịch chiết nước Thêm

một ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu có hiện tượng bọt khí sủi lên

 Định tính chất béo, sterol, caroten

Cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml Đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:

Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho

bay hơi hết dung môi Phản ứng dương tính nếu quan sát thấy vết mờ trên giấy lọc

Định tính sterol: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô

cách thủy bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc

kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45o, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có vòng tròn màu tím đỏ

Định tính caroten: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô

cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Quan sát: nếu có caroten sẽ thấy dung dịch chuyển sang màu xanh lá đậm

2.3.3.2 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng sắc ký lớp mỏng

Dược liệu được xay nhỏ, chiết nóng hồi lưu bằng dung môi ethanol 96% Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 70oC thu được cao ethanol Cao ethanol được hòa trong lượng nước nhất định, sau đó chiết lỏng - lỏng với ethyl acetat 03 lần (tỷ lệ 1:1; v/v) Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở

60oC thu được cao ethyl acetat

Tiến hành thăm dò trên nhiều hệ dung môi khác nhau để lựa chọn hệ dung môi cho kết quả phân tách tốt nhất Kết quả được quan sát ở bước sóng UV (254nm và 366 nm) với các thuốc thử hiện màu đặc trưng

2.3.3.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Chiết xuất phân lập các hợp chất

Chiết xuất các hợp chất từ dược liệu bằng ethanol 96% theo phương pháp chiết nóng hồi lưu ở 70oC và chiết các phân đoạn bằng dung môi ethyl acetat Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thường, pha đảo RP18 Sắc

ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn chiết, sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập

Xác định cấu trúc các chất phân lập

Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-

NMR, DEPT) sử dụng chất nội chuẩn là TMS (tetramethyl silan) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố trên các tài liệu khoa học

- Điểm nóng chảy được đo trên máy GALLENKAMP (Sanyo, Nhật Bản) tại Khoa Hóa Phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

- Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất được thực hiện trên hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC-20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL-20AHT, detector UV-VIS tại Khoa Hóa Phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

- Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy GX-PerkinElmer (Mỹ) dưới dạng viên nén KBr Phổ khối lượng ion hóa phun điện tử APCI-MS, ESI-MS đo trên máy Agilent

1100 LC-MSD Trap và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) đo trên máy Bruke AM500 FT-NMR tại Phòng Cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA DƯỢC LIỆU KHÚNG KHÉNG VÀ ĐẶC ĐIỂM VI HỌC

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Quan sát và phân tích mẫu cây tại thực địa chúng tôi ghi nhận mẫu nghiên cứu có các đặc điểm sau:

- Cây gỗ to, cao khoảng 10m, cành non màu nâu có lông nhỏ, có nốt sần Lá mọc so

le, cuống lá dài 3-5 cm, phiến lá hình trứng dài khoảng 10cm, gốc lá tròn, đầu lá nhọn, mép lá khía răng cưa không đều, 3 gân tỏa ra từ gốc lá, 5-6 cặp gân phụ khác; mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới nhạt màu hơn

- Cụm hoa mọc ở đầu cành, hoa màu trắng, cuống hoa nhỏ và nhẵn Tràng 5 cánh, hình trứng; đĩa có lông thưa thớt; nhị 5 xếp xen kẽ với cánh hoa; bầu nhụy hình

cầu, nhẵn, bầu có đầu nhụy chia 3 (Hình 3.2)

- Quả hạch có 3 hạt, hình cầu, nhẵn Khi chín cuống mang quả trở nên mọng nước, màu nâu, nhiều thịt, có vị ngọt, ăn được Hạt tròn, dẹt, có màu nâu bóng, đường

kính khoảng 5mm (Hình 3.1)

- Mùa hoa tháng 5-6, mùa quả 8-10

Hình 3.1: Quả (A), hạt (B) và cuống mang quả (C) của dược liệu khúng khéng

Hình 3.2: Một số hình ảnh lá và hoa khúng khéng

Qua các đặc điểm hình thái trên, kết hợp so sánh, đối chiếu với khóa phân loại

chi Hovenia trong tài liệu [25], tên khoa học của cây khúng khéng được giám định là

Hovenia dulcis Thunb (Phụ lục 1) Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa

Tài Nguyên Dược liệu với số hiệu là DL – 050515

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu cuống mang quả khúng khéng

Hình 3.3: Vi phẫu cắt ngang cuống mang quả khúng khéng

Hình ảnh vi phẫu cuống mang quả của cây khúng khéng dưới kính hiển vi thể hiện ở hình 3.3, quan sát vi phẫu thấy có những đặc điểm sau: mặt cắt thường tròn, có mấu lồi, từ ngoài vào trong có:

- Lớp biểu bì hóa bần gồm 3 – 4 lớp tế bào có nhiều mấu lồi

- Mô mềm vỏ gồm nhiều lớp tế bào đa giác thành mỏng

- Bó libe-gỗ: Libe gồm các tế bào nhỏ xếp thành vòng bao quanh mô gỗ Gỗ có các mạch gỗ xếp thành hàng, 2 hàng gỗ xếp hính chữ V trong một bó libe-gỗ

Bó libe-gỗ nằm trong mô mềm

- Trong cùng là các tế bào mô mềm ruột, thành mỏng, hình đa giác, kích thước lớn hơn mô mềm vỏ, không đều nhau

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu hạt khúng khéng

Hình 3.4: Vi phẫu hạt Khúng khéng

1 Biểu bì, 2 Mô cứng, 3 Mô mềm, 4 Nội nhũ, 5 Nhân chứa 2 lá mầm Hình ảnh vi phẫu hạt khúng khéng qua kính hiển vi được trình bày ở hình 3.4, quan sát thấy mặt cắt hình tròn, từ ngoài vào trong có:

- Vỏ hạt có hai lớp tế bào: Bên ngoài là lớp tế bào biểu bì xếp đều đặn, bên trong là lớp tế bào mô cứng hình chữ nhật, thành dày, xếp đứng theo hướng xuyên tâm

- Sát với tế bào mô cứng là lớp tế bào mô mềm thành mỏng, bị ép bẹt, xếp lộn xộn

- Nội nhũ gồm tế bào hình nhiều cạnh, thành mỏng xếp lộn xộn, trong tế bào có những giọt dầu và các chất dự trữ Mặt trong gồm một lớp tế bào hình bầu dục dài

- Trong cùng là hai lá mầm bằng nhau, xếp úp vào nhau

3.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu khúng khéng

Hình 3.5: Một số đặc điểm bột dược liệu khúng khéng Mảnh biểu bì vỏ quả (1), Mảnh mang màu (2,8), Mảnh mạch (3), Mảng biểu bì vỏ hạt (4), Mảnh mô mềm (5,10), Tinh bột (6), Hạt aleuron (7), Mảnh mô hình giậu (9), Khối tinh bột (11), Mảnh nội nhũ (12)

Bột dược liệu (gồm có bột cuống mang quả, quả và hạt) có màu nâu nhạt, thơm mùi đặc trưng, vị ngọt, các hình ảnh quan sát được trình bày ở hình 3.5:

- Mảnh mô mềm vỏ giữa là những tế bào thành mỏng, không đều

- Mảnh vỏ trong gồm tế bào màu vàng, hình nhiều cạnh, thành dày và lượn sóng

- Mảnh nội nhũ gồm các tế bào chứa những hạt tinh bột nhỏ và chất dự trữ

- Mảnh lá mầm gồm những tế bào có nhiều cạnh tương đối đều, thành mỏng, trong

có những giọt dầu rải rác

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

- Mẫu thử: Cắn chiết ethanol toàn phần (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat (KKE) được chuẩn bị như mục 2.3.2 được thử ở 2 liều 200mg/kg và 500mg/kg

- Tiến hành thí nghiệm: theo phương pháp tại mục 2.3.2

- Kết quả thu được lần lượt được trình bày trong các bảng 3.1, 3.2 và 3.3

Bảng 3.1: Tác dụng của cao khúng khéng đối với hoạt độ AST trong huyết thanh

chuột ở các lô nghiên cứu

Lô thí nghiệm N AST (UI/L)

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy hoạt độ AST ở tất cả các mẫu thử khúng khéng

đều giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình Cắn chiết ethanol (KKC) ở các liều

200 mg/kg và 500 mg/kg làm giảm mạnh hoạt độ của AST so với lô 2 (lô mô hình chỉ dùng PAR) lần lượt là 81,2 và 85,7% Ở liều 200 mg/kg, KKE cũng làm giảm mạnh hoạt độ của AST 91,1% có ý nghĩa so với lô 2 Đặc biệt, mẫu cao ethyl acetat (KKE) liều 500mg/kg làm giảm hoạt độ AST 93.7% so với lô 2 (với p< 0,0001), gần đạt tới giá trị của lô chứng sinh học (95.6%) Tất cả các mẫu trên đều có xu hướng tác dụng mạnh hơn silymarin ở liều 100 mg/kg tuy nhiên kết quả chưa có ý nghĩa thống kê