Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng hoạt tính chống oxy hóa của cây rau đắng đất (glinus oppositifolius (l ) dc molluginaceae)

Phương pháp nghiên cứu 1 Chiết xuất các hợp chất trong Rau đắng đất bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70% và tách các phân đoạn từ cao cồn bằng phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng với eth

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

-

HÀ MỸ NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT

(Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

TP HCM – NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

-

HÀ MỸ NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT

(Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae)

Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: DS Nguyễn Thị Thu Hiền

TP HCM – NĂM 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến cô DS Nguyễn Thị Thu Hiền, người đã luôn

bên cạnh em, hướng dẫn cho em từng bước đi, giải thích cặn kẽ cho em những điều

em còn chưa nắm rõ và là người truyền động lực rất nhiều cho em, luôn động viên

an ủi mỗi khi em gặp khó khăn, giúp em tìm hướng giải quyết để em có thể thực hiện được khóa luận một cách tốt nhất

Em chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua Khuyên bảo có, la mắng có nhưng em biết rằng những điều thầy cô nói đều là muốn em tốt hơn và không ngừng cố gắng để đạt được kết quả ngày hôm nay Cảm ơn thầy cô luôn bên cạnh chúng em, luôn quan tâm chia sẽ để chúng em luôn cảm thấy gần gũi, luôn có người bên cạnh ủng hộ và động viên Mai này, dù mỗi người chúng em sẽ mỗi nơi nhưng em tin rằng trong ký ức mỗi người sẽ mãi nhớ về thầy cô

Cảm ơn các bạn, các em cùng làm khóa luận Sẽ nhớ mãi những buổi trưa cùng ăn cơm với nhau, cùng vui, cùng buồn, nhớ mãi những buổi tối cùng nhau ở lại cùng nhau làm khóa luận chờ nhau cùng về, nhớ mãi những buổi họp mặt cùng các bạn và thầy cô Học hết mình và chơi cũng hết mình

Và con xin cảm ơn gia đình, những người luôn đứng sau lưng ủng hộ từng bước đi của con và luôn là chỗ dựa vững chắc để con bước tiếp con đường mà con đã lựa chọn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của

DS Nguyễn Thị Thu Hiền

Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Hà Mỹ Nhân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về Rau đắng đất 2

1.1.1 Tổng quan về thực vật 2

1.1.2 Tổng quan về thành phần hóa học 5

1.1.3 Tổng quan về tác dụng dược lý 9

1.1.4 Các bài thuốc cổ truyền 12

1.1.5 Các chế phẩm trên thị trường 13

1.2 Gốc tự do và một số mô hình thử tác dụng chống oxy hóa 14

1.2.1 Gốc tự do 14

1.2.2 Một số mô hình thử tác dụng chống oxy hóa 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Dung môi, hóa chất 17

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Chiết xuất và loại tạp 18

2.2.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên các phân đoạn trên mô hình TLC-DPPH 18 2.2.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất trong cao EtOAc 18

2.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết 18

2.2.5 Xác định cấu trúc hóa học 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Chiết xuất 20

3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên các phân đoạn trên mô hình TLC-DPPH 21

3.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao EtOAc 22

3.3.1 Phân lập và tinh chế 22

3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của G-3, G-4 và G-7 bằng SKLM 26

3.4 Xác định cấu trúc G-3, G-4, G-7 28

3.4.1 Xác định cấu trúc của G-3 28

3.4.2 Xác định cấu trúc của G-4 32

3.4.3 Xác định cấu trúc của G-7 37

3.5 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của G-3, G-4, G-7 trên mô hình TLC-DPPH 40

3.6 Bàn luận 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

4.1 KẾT LUẬN 42

4.2 ĐỀ NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH MỤC PHỤ LỤC 1

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization

Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear single quantum correlation

n-BuOH n- Butanol

SGOT Serum glutamat oxaloacetat transaminase

SGPT Serum glutamat pyruvat transaminase

VS Vanillin sulfuric

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Rau đắng đất 4

Hình 1.2 Hoa thức, hoa đồ 5

Hình 1.3 Cấu trúc các flavonoid có trong cây Rau đắng đất 6

Hình 1.4 Câu trúc các saponin có trong cây Rau đắng đất 8

Hình 1.5 Các chế phẩm có thành phần Rau đắng đất trên thị trường 13

Hình 1.6 Phản ứng của các chất có khả năng chống oxy hóa với DPPH 15

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất Rau đắng đất 20

Hình 3.2 Sắc ký đồ các cao chiết xuất từ cây Rau đắng đất 21

Hình 3.3 Sắc ký đồ kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 21

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân đoạn EtOAc 22

Hình 3.5 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được sau khi lên cột nhanh 23

Hình 3.6 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đươc sau khi lên cột pha đảo 24

Hình 3.7 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đươc sau khi lên cột sephadex 25

Hình 3.8 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-3 26

Hình 3.9 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-4 27

Hình 3.10 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-7 27

Hình 3.11 Sơ đồ phân lập và tinh chế 28

Hình 3.12 Phổ MS của G-3 28

Hình 3.13 Công thức cấu tạo và một số tương tác trên phổ HMBC, COSY của G-3 32

Hình 3.14 Phổ MS của G-4 32

Hình 3.15 Công thức cấu tạo của spergulagenin A 33

Hình 3.16 Công thức cấu tạo và một số tương tác trên phổ HMBC, COSY của G-4 37

Hình 3.17 Phổ MS của G-7 37

Hình 3.18 Công thức cấu tạo và một số tương tác HMBC, COSY của hợp chất G-7 40

Hình 3.19 Sắc ký đồ kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của G-3, G-4, G-7 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chế phẩm có Rau đắng đất trên thị trường 13

Bảng 3.1 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột nhanh 23

Bảng 3.2 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột pha đảo 24

Bảng 3.3 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột sephadex 26

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-3 30

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-3 và Glinosid C 31

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-4 34

Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-4 và Spergulacin A 35

Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-7 38

Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của G-7 và Trifolin 39

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC-NĂM 2014-2019

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG HOẠT TÍNH

CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT

(Glinus oppositifolius (L) DC Molluginaceae)

Sinh viên thực hiện: Hà Mỹ Nhân Hướng dẫn khoa học: DS Nguyễn Thị Thu Hiền

Mở đầu:

Rau đắng đất là một loại cây thân thuộc với đời sống của người dân Nam Bộ Trên thị trường, các chế phẩm có chứa thành phần Rau đắng đất được sử dụng phổ biến như Boganic, BAR, Livonic, … được sử dụng do có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị viêm gan Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Rau đắng đất ở nước ta Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng hoạt

tính chống oxy hóa của cây Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae)”

Đối tượng

Toàn cây Rau đắng đất tươi được thu hái tại Cần Thơ, được so sánh hình thái với các tài liệu

mô tả thực vật [2], [5], sau đó được làm sạch và phơi khô trong bóng râm

Phương pháp nghiên cứu

(1) Chiết xuất các hợp chất trong Rau đắng đất bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70%

và tách các phân đoạn từ cao cồn bằng phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng với ethyl acetat,

n-Butanol và thu hồi dung môi để thu được các cao tương ứng (2) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các cao trên mô hình TLC-DPPH (3) Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột nhanh, cột đảo C-18, sephadex LH-20 (4) Xác định cấu trúc các chất phân lập dựa trên dữ liệu phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-NMR, 2D-NMR) và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố

Kết quả: Từ 3 kg toàn cây Rau đắng đất ngấm kiệt với cồn 70%, sau khi thu hồi dung môi

thu được 3 lít cao lỏng Chiết phân bố thu được 30 g cao ethyl acetat và 45 g cao n-Butanol

Thử nghiệm TLC-DPPH cho kết quả cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn Từ

30 g cao EtOAc tiến hành phân lập bằng sắc ký cột nhanh thu được 5 phân đoạn Phân đoạn

4 được phân lập bằng cột đảo C-18 thu được 2 hợp chất tinh khiết là G-3(102 mg) và G-4 (52 mg).Phân đoạn 5 tiếp tục được phân tách trên cột sephadex LH-20 thu được G-7 (22 mg) Dựa vào số liệu phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-NMR, 2D-NMR) và

so sánh với các tài liệu tham khảo đã xác định được G-3 là glinosid C, G-4 là spergulacin A

và G-7 là trifolin Thử nghiệm TLC-DPPH cho kết quả G-7 ( trifolin) có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình này

Kết luận: Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra Với

những kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây Rau đắng đất sau này

Từ khóa: Glinus oppositifolius, Rau đắng đất, TLC-DPPH, chống oxy hóa, glinosid C

FINAL ESSAY FOR THE DREGREE OF B.Sc PHARM

ACADEMIC YEAR 2014-2019 THE STUDY ON PHYTOCHEMICAL CONSTITUENTS ORIENTED

ANTIOXIDANT ACTIVITY OF GLINUS OPPOSITIFOLIUS MOLLYGINACEAE

Author: Ha My Nhan Scientific instructor: M.S Pharm Nguyen Thi Thu Hien

Background: Glinus oppositifolius Molluginaceae is one of popular herb in the life of

Southerners There are many products were made from this extract, such as Boganic, B.A.R and Livonic…, which was an effective prevention and treatment of liver disease Because of the lack of chemical composition researchs of this herb, we conduct the study on

phytochemical constituents oriented antioxidant activity of Glinus oppositifolius

Materials: Whole fresh plant of Glinus oppositifolius which had collected from Can Tho

city, were made a morphological characteristic comparison with plant documentary [2], [5] After that, these were cleaned and dried in the shade

Methods: (1) Using percolation method with Ethanol 70% to extract phytochemical

constituents from Glinus oppositifolius Splitting the segment by liquid-liquid extraction with Ethyl acetat (EtOAc) and n-Butanol and then collecting the extracts (2) Evaluating

antioxidant activity of the extract by TLC-DPPH test (3) Isolating compounds by flash column, C-18 reverse phase column and sephadex LH-20 column chromatography (4) Determining the structure of isolated compounds by both Mass Spectrometry (MS), 1D and 2D-Nuclear Magnetic Resonace (NMR) documentary and comparison with previous references (5) Conducting antioxidant activity survey from extracted compounds by TLC-DPPH test

Result and discussion: After using percolation method, got 3 liters of ethanol 70% extract

from 3 kg of whole plant Then, conducted fractional extraction and collected 30 grams of

EtOAc and 45 grams of n-butanol extracts The result of TLC-DPPH showed that the

antioxidant activity of EtOAc extract was better than the others And so 30 grams of EtOAc extract were isolated by fast column and collected 5 segments The 4th segment was isolated

by C-18 reverse phase column and gained 2 pure compounds were G-3(102 mg) and G-4 (52 mg) The 5th segment was isolated by sephadex LH-20 column and gained G-7 (22 mg) According to MS, 1D and 2D-NMR documentary and comparison with previous references, determined G-3, G-4 and G-7 were glinosid C, spergulacin and trifolin, respectively TLC-DPPH result revealed that G-7 (Trifolin) had the antioxidant activity

Conclusion and suggestion: By the experimental research, this study was met the proposed

objectives This result had become a premise for future studies about phytochemical

constituents and pharmacological effects of Glinus oppositifolius

Key words: Glinus oppositifolius, slender carpet weed, TLC-DPPH, antioxidant, glinosid C

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gốc tự do là một thuật ngữ từ lâu đã quen thuộc với giới y khoa Hiện nay, thuật ngữ này càng được quan tâm nghiên cứu vì đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến các bệnh như viêm khớp, parkinson, suy giảm trí nhớ và đặc biệt là ung thu [22] Nhiều nghiên cứu cho thấy các cây thảo dược có tác dụng chống lại các gốc tự do mạnh mẽ, trong đó Rau đắng đất cũng là loài cây được chứng mình có tiềm năng trong tác dụng này

Rau đắng đất là một loại cây thân thuộc với đời sống của người dân Việt Nam đặc biệt là người dân Nam Bộ Theo y học cổ truyền cây có tác dụng lợi tiêu hóa, nhuận gan, ích mật, thanh nhiệt, lợi tiểu, giải độc Trong các nghiên cứu gần đây, Rau đắng đất còn có tác dụng dược lý như khả năng chống oxy hóa [7] , bảo vệ gan [17], chống ung thư [12], giảm đau, kháng viêm [18]…

Tuy nhiên, hiện nay Rau đắng đất mới chỉ được quan tâm với tác dụng bảo vệ gan

mà chưa được sử dụng với tác dụng chống oxy hóa một trong những tác dụng tiềm năng của cây Vì vậy, với mong muốn tìm hiểu đầy đủ hơn về cây Rau đắng đất đặc biệt là về hoạt tính chống oxy hóa và thành phần hóa học nhằm làm tiền đề cho các nghiên cứu sau này và đưa thêm tiêu chuẩn hóa học làm cơ sở cho công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng đất trong sản xuất thuốc từ dược liệu, nên chúng tôi tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng hoạt tính chống oxy

hóa của cây Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) DC Molluginaceae)” với

các mục tiêu cụ thể:

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn trên mô hình TLC-DPPH

- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được trên mô hình TLC-DPPH

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Rau đắng đất

1.1.1 Tổng quan về thực vật

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật của họ Rau đắng (Molluginaceae)

Cây thân thảo hằng năm hoặc lâu năm hay cây bụi lùn; phân nhánh kiểu chùm hoặc kiểu xim Lá mọc đối, mọc so le hoặc gần như mọc vòng; không có lá kèm hoặc lá kèm nhỏ và sớm rụng Hoa đều, lưỡng tính, ít khi đơn tính, mọc đơn độc hay thành

xim 4-5 lá đài rời hay liền ở gốc, lợp, tồn tại; cánh hoa nhỏ hay không có; 3-5 hoặc nhiều nhị, chỉ nhị rời hay dính nhau ở gốc, bao phấn 2 ô mở bằng kẽ nứt dọc; không

có đĩa mật, hoặc có đĩa mật hình vòng Bầu thượng hiếm khi bầu trung, vòi nhụy hoặc đầu nhụy dạng rời, hiếm khi dính Bầu hợp lá noãn, thường nhiều ô, số vòi hay

đầu nhụy bằng số ô; noãn cong hay đảo Quả nang nứt dọc, thường được bao quanh

bởi đài tồn tại; hạt thường hình thận, đôi khi có một lớp áo hạt nhỏ; phôi cong, ngoại nhũ tinh bột; nội nhũ ít hoặc không có Họ này thường mọc ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nhiều loài ở châu Phi [1],[25]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Glinus

Trước đây, chi Glinus được xếp trong họ Aizoaceae (thuộc bộ Caryophyllales) nhưng

sau này đã được tách sang họ Molluginaceae do một vài đặc điểm khác biệt về thành phần hóa học Họ Molluginaceae có chứa anthocyanin trong khi họ Aizoaceae chứa nhóm hợp chất betalain Ngoài ra về hình thái thực vật học Aizoaceae khác với Molluginaceae như là các lá đài dính liền nhau thành ống, chỉ nhị dính với bầu và cây thường có lá mọng nước [8]

Chi Glinus có một vài đặc điểm hình thái: Cây cỏ mọc hằng năm hay lâu năm, thường

rạp xuống, không lông hay có lông xám Lá có cuống ngắn mọc đối hay gần mọc vòng, hình bầu dục, thuôn, hình trái xoan, thường nguyên Cụm hoa ở nách lá, thành

bó ít hoa, có cuống Các mảnh bao hoa thường không bằng nhau, có mép dạng vảy, nhị 3–30, rời hoặc hợp thành bó khi có nhiều nhị, bầu thượng hình trái xoan hay thuôn

có 3–5 ô nhiều noãn, đầu nhụy thẳng hay cong Quả nang mở ô 3–5 ô, hạt có mồng

kéo dài quấn lấy hạt [2]

1.1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của Rau đắng đất

Tên nước ngoài: Kaeng khom (Lào); Slender carpet weed (Anh) [1], [2], [4]

Theo danh lục thực vật (1978) của Vườn Kew (Anh Quốc) do M.L Gonçalves soạn, loài

Glinus oppositifolius L DC Molluginaceae còn có 12 đồng danh sau đây:

Mollugo oppositifolius L

Mollugo spergula L

Glinus mollugo Fenzl

Pharnaceum mollugo L

Mollugo denticulata Guill

Mollugo hirta Hiern

Glinus denticulatus Guill

Glinus spergula L

Pharnaceum oppositifolium L

Mollugo glinoides A

Mollugo parviflora Ser

Mollugo serrulata Sond

b) Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) vị trí loài Glinus

oppositifolius L DC được xếp như sau: [39]

Rau đắng đất thuộc chi Glinus, tuy nhiên có tác giả xếp loài này vào chi Mollugo,

thuộc 2 chi trong 12 chi của họ Molluginaceae bao gồm: [9]

Cuống lá ngắn Cụm hoa: từ 3-7 hoa mọc ở nách lá, cuống hoa hình sợi dài, màu

xanh, có lông Hoa màu lục nhạt lưỡng tính, mẫu 5, vô cánh, nhụy có 3 vòi nhụy

Quả: nang, hạt nhỏ, nhiều, hình thận, có màu nâu đỏ [4], [6]

Hình 1.2 Hoa thức, hoa đồ

d) Nguồn gốc và phân bố sinh thái

Cây thường được tìm thấy ở những vùng cát ẩm ướt hoặc các khu vực ẩm xung quanh

ao hồ trên khắp các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á, các nước ở độ cao thấp như Ấn Độ, Pakistan, Phillipines, Mali, Thái Lan và Trung Quốc Cây cũng mọc

ở Tây Phi, từ Sénégal đến Nam Nigeria [9]

Ở Việt Nam, Rau đắng đất phân bố dọc theo các tỉnh ven biển, từ Nam Định đến vùng đồng bằng sông Cửu Long Cây thường mọc hoang trên đất cát ẩm ở các bãi sông, ven biển và trong những thửa ruộng, bãi trống ở nhiều vùng đồng bằng Do khả năng phân nhánh nhanh và khỏe, nên cây mọc thành đám dày và lan rộng [4]

e) Bộ phận dùng

Bộ phận dùng: Toàn cây

Mùa hoa, quả: Tháng 4-7

Có thể thu hái quanh năm, tốt nhất lúc cây chưa có hoa, rửa sạch, phơi khô [4]

1.1.2 Tổng quan về thành phần hóa học

Các nghiên cứu trước đây cho thấy Rau đắng đất có nhiều thành phần hóa học khác

nhau như: flavonoid, saponin triterpen, các hợp chất thơm, steroid, dẫn chất acid acylamin, nucleosid và một vài hợp chất khác Trong đó, saponin và flavonoid là hai thành phần chủ yếu trong cây [14]

Flavonoid

Từ dịch chiết methanol toàn cây Rau đắng đất, các nhà khoa học Thái Lan (2014) đã

phân lập được các flavonoid: Kaempferol 3-O-galactopyranosid (1),

isorhamnetin-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1  2)-β-D-galactosid (2), vitexin (3), vicenin-2 (4) [38]

Và một vài flavonoid khác được tìm thấy trong cây như: Iso-vitexin (5), trihydroxyflavonol (6), 6,8-dimethyl-5,7,4’-trihydroxyflavon (7), 3-hydroxy-5,7- dimethoxy-6,8-dimethylflavon (8)

5,7,4’-Dưới đây là công thức 1 số flavonoid chính có trong cây:

Gal: β-D-galactopyranosyl Xyl: β-D-Xylopyranosyl Glu: β-D-Glucopyranosyl

Hình 1.3 Cấu trúc các flavonoid có trong cây Rau đắng đất

Saponin

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Rau đắng đất trước đây cho thấy đa phần saponin trong cây là saponin triterpen khung hopan [24], [26], [40]

Traore F và cộng sự (2000) đã công bố hai saponin triterpen mới là glinosid A (9)

(16-O-(β-arabinopyranosyl)-3-oxo-12, 16β, 21β, 22-tetrahydroxyhopan) và glinosid

B (10) (16-O-(β-arabinopyranosyl)-3-oxo-12, 16β, 22-trihydroxyhopan) được phân

lập từ phần trên mặt đất của G oppositifolus [40]

Năm 2012, Kumar và cộng sự đã phân lập thêm một saponin triterpen mới glinosid

C (11) (16-O-(-D-glucopyranosesyl)-3, 12, 16 ,21, 22-pentahydroxyhopan) khi đánh giá tác động ức chế -glucosidase của G oppositifolius Ngoài ra còn phân

lập thêm được các saponin triterpen khác như spergulin A (12), spergulin B (13),

spergulagenin A -3-O-β- D xylopyranosyl (14), spergulacin (15), spergulacin A (16)

[26]

Gần đây (6/2019), các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập được 21 saponin triterpen mới, đó là các glinusopposide được chứng minh có tác dụng kháng 2 loại

nấm Microsporum Gypseum và Trichophyton Rubrum: glinusopposide A (17),

glinusopposide B (18), glinusopposide C (19), glinusopposide D (20), glinusopposide

E (21), glinusopposide F (22), glinusopposide G (23) [42]

(9) R=OH (10) R=H

(11)

Hình 1.4 Câu trúc các saponin có trong cây Rau đắng đất

Ngoài các nhóm hợp chất nói trên, Rau đắng đất còn có các hợp chất khác như:

 Các hợp chất thơm: acid methyl 3-(4”-hydroxyphenyl)-(E)-propenoic (24),

4-hydroxy-3,5-dimethoxy benzaldehyd (25)…[38]

 Phytosterol: Spinasterol (26), β-sitosterol, stigmasterol (27) [33]

 Các polysaccharid phân nhóm pectin có tác động lên hệ miễn dịch:

GOA1 [arabinose, galactose, arabinogalactan loại I (AG-I) và loại II (AG-II)];

GOA2 (acid galacturonic, rhamnose, arabinose và galactose) [20]

 Nucleosid: Adenosin [35]

 Năm 2015, các nhà nghiên cứu ở Bangladesh đã phân lập được 2 hợp chất trong

cây là trilinolein (28) và dotriacontyl docosanoat (29) [14]

thoái hóa deoxyribose, ước tính tổng hàm lượng flavonoid, tổng hàm lượng phenol,

tổng hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp thiocyanat, phương pháp

phosphomolybdat, tạo phức với kim loại, làm nhạt màu của -caroten và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được đo bằng cách đo mức độ tổn thương DNA phụ thuộc

bleomycin Trong nghiên cứu này, mô hình ex vivo cũng được các nhà nghiên cứu

thực hiện như phương pháp peroxyd hóa lipid Các kết quả trong cả hai thử nghiệm

in vitro và ex vivo chỉ ra rằng dịch chiết Rau đắng đất có khả năng thu dọn các gốc tự

do, cải thiện tổn thương do quá trình oxy hóa tạo ra, là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên có tiềm năng và hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ [7]

Năm 2011, Nazia Hoque và cộng sự cũng thực hiện 2 thử nghiệm đối với dịch chiết của Rau đắng đất nhận thấy trong mô hình DPPH, giá trị IC50 của dịch chiết được tìm thấy là 1000 μg/ml (ascorbic acid, IC50 = 14,45 µg/ml), thử nghiệm nitric oxid (NO) kết quả thu được IC50 = 269 µg/ml (quercetin IC50 = 5,47 µg/ml) Trong thử nghiện nitric oxid lượng tổng flavonoid là 25,46 mg/g tương đương quercetin và tổng hoạt tính chống oxy hóa là 79,48 mg/g tương đương acid ascorbic [19]

Năm 2015, các nhà khoa học Philipin đã sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của Rau đắng đất Các dịch chiết được kiểm tra tính chất chống oxy hóa bằng gốc tự do [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)] Kết quả cho thấy tất cả các bộ phận của cây ( rễ, thân và lá), đều thể hiện tác dụng chống oxy hóa [28]

 Tác dụng chống ung thư

Năm 2017, Tania Chakraborty cùng các nhà nghiên cứu trong nhóm đã sử dụng dịch

chiết methanol của G oppositifolius thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác

nhau cho thấy hiệu quả chống tăng sinh được so sánh với các tế bào đơn nhân máu

ngoại vi (PBMCs) bình thường Qua đó, thấy rằng G oppositifolius là một nguồn

nguyên liệu từ thiên nhiên có tiềm năng lớn trong việc sản xuất các loại thuốc chống ung thư mới trong tương lai [12]

 Tác dụng bảo vệ gan

Năm 2007 các nhà khoa học Ấn Độ đã thực hiện thử nghiệm so sánh tác dụng bảo vệ

gan của dịch chiết methanol của cây Rau đắng đất (Glinus oppositifolius) và cây Sam biển (Trianthema decandra) chống lại tổn thương gan gây ra bởi paracetamol Các

dịch chiết này được sử dụng qua đường uống với liều dùng 250 mg/kg và 500 mg/kg

và được so sánh với silymarin Dựa vào các chỉ số sinh hóa về tổn thương gan (như SGPT, SGOT, ALP và bilirubin trực tiếp) cho thấy, tác dụng bảo vệ gan của cả hai dịch chiết phụ thuộc vào nồng độ, đều có tác dụng đáng kể, trong đó dịch chiết Rau đắng đất có hiệu quả hơn so với Sam biển Ở liều dùng 500 mg/kg của Rau đắng đất

có hiệu quả trị liệu gần tương đương với silymarin [17]

Natarajan và cộng sự (2010) thực hiện nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết methanol rễ Rau đắng đất đối với tổn thương gan gây ra bởi CCl4 (0,5 ml/kg)

ở chuột albino Kết quả cho thấy đối với liều dùng 200 mg/kg và 500 mg/kg các chỉ

số sinh hóa về tổn thương gan (như SGPT, SGOT, ALP và bilirubin trực tiếp) đều giảm Tuy nhiên, liều dùng500mg/kg cho thấy khả năng bảo vệ tốt hơn 200mg/kg và hiệu quả trị liệu tương đương với silymarin [31]

 Tác dụng kháng khuẩn

Lá và thân cây được chiết xuất bằng chloroform, ethanol và methanol đã được các nhà nghiên cứu Philippin (2015) sử dung trong thử nghiệm Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết được đánh giá thông qua sự khuếch tán trên đĩa, nồng độ ức chế

tối thiểu, nồng độ diệt khuẩn đối với Staphylococcus aureus kháng methicillin,

Enterococcus kháng vancomycin, Enterobacteriaceae kháng carbapenem, Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) và Acinetobacter baumanii (A baumanii)

sản xuất metallo-β-lactamase Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá của Rau đắng đất có

thể được sử dụng như là nguồn kháng sinh mới, thay thế chống lại các chủng vi khuẩn

Gram âm Escherichia coli, P aeruginosa và A Baumanii [29]

 Tác dụng giảm đau, kháng viêm

Năm 2011, Hoque và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm tác dụng giảm đau của Rau đắng đất trên chuột với mô hình gây đau quặn bằng acid acetic với dịch chiết methanol của Rau đắng đất ở 2 liều là 200 mg/kg và 400 mg/kg, hiệu quả giảm đau đáng kể so

với lô chứng Tác dụng kháng viêm được thử nghiệm trên mô hình gây phù chân ở chuột bằng carrageenan, ở liều dùng 500 mg/kg làm giảm phù chân chuột Những kết quả này cho thấy rằng Rau đắng đất có tác dụng giảm đau, kháng viêm [18]

 Tác dụng an thần, giải lo âu

Nghiên cứu của Moniruzzaman cùng các nhà nghiên cứu trong nhóm (2016) đã cho thấy tiềm năng an thần giải lo âu của dịch chiết ethanol lá Rau đắng đất trong các mô hình quan sát hành vi khác nhau ở chuột gồm: thử nghiệm thăm dò mê cung (EPM)

và hộp tối (LDB) ở chuột với liều 50, 100 và 200 mg/kg Kết quả nghiên cứu này cho thấy tác dụng an thần giải lo âu của Rau đắng đất là đáng kể, có thể ứng dụng trong điều trị các chứng bệnh rối loạn tâm thần bao gồm cả chứng mất ngủ [30]

 Tác dụng kháng nấm

Gần đây, Dongdong Zhang và các cộng sự (06/2019) đã tiến hành thử nghiệm hoạt

động chống lại Microsporum Gypseum và Trichophyton Rubrum của các triterpen và

glycosid có trong cây Rau đắng đất Kết quả cho thấy có nhiều hoạt chất có tác dụng

ức chế mạnh đối với cả hai loại nấm này, trong đó, 30-O-methyl spergulagenat

3-O-β-D-xylopyranosid cho kết quả tốt khi MIC50 đối với M.gypseumlà 6,8 μM và MIC50

đối với T.rubrum là 11,9 μM Nghiên cứu này cũng chứng minh hiệu quả của các bài

thuốc truyền thống sử dụng Rau đắng đất trong việc điều trị các bệnh da liễu [42]

1.1.4 Các bài thuốc cổ truyền

 Thanh can giải độc

Rau đắng đất 6g, Nhân trần (hoặc Bồ hồ) 5g, Dành dành 5g, Cỏ xước 6g, Rau má 6g, Ké đầu ngựa 6g, dây Khổ qua 6g, Cỏ mực 8g, Muồng trâu 6g, Rễ tranh 6g, Sài đất 6g, Cam thảo 3g Sắc nước uống hoặc tán bột, luyện thành viên uống (theo Lương y

Ðỗ Văn Tranh, An Giang)

 Trị bệnh vàng da, khó tiêu

Dây Cứt quạ 1 thúng, Rau đắng đất 1 thúng, hai thứ nấu chung cho nhừ, lược bỏ xác, nấu nước thành cao, thêm đường hay mật cho đặc, để lâu được Mỗi sáng, trưa, tối 1 muỗng cà phê Cao thuốc trị các bệnh vàng da, chậm tiêu, nổi u nhọt, mày đay [5]

Không chỉ ở Việt Nam mà ở các quốc gia khác Rau đắng đất đã được sử dụng từ rất lâu Tại Anh thân cây khô và bột lá của cây được sử dụng để điều trị vàng da và đau bụng [10], bột mịn của các bộ phận trên mặt đất của cây được sắc và sử dụng trong điều trị sốt rét ở Pháp [16], còn ở Na Uy cây giã nát với dầu hoặc nước được sử dụng trong điều trị vết thương [15]

1.1.5 Các chế phẩm trên thị trường

Trên thị trường hiện nay Rau đắng đất được phối hợp với Actiso và Bìm bìm biếc đã

có hai chế phẩm được sản xuất là Boganic (Traphaco) và B.A.R (Pharmedic) Ngoài

ra, chế phẩm Liverbil (OPC) phối hợp thêm Diệp hạ châu Các bài thuốc trên đều có tác dụng nhuận gan, ích mật, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu

Hình 1.5 Các chế phẩm có thành phần Rau đắng đất trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm có Rau đắng đất trên thị trường Tên sản

Actisô 400 mg Bìm bìm biếc 400 mg Rau đắng đất 400 mg Diệp hạ châu 400 mg

Tá dược vừa đủ 1 viên

- Phòng và hỗ trợ điều trị viêm gan, suy giảm chức năng gan

- Thanh nhiệt, giải độc gan và bảo vệ gan

- Điều trị các triệu chứng: đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, dị ứng, mụn nhọt, mẫn ngứa, mề đay do rối loạn chức năng gan, viêm gan gây ra

B.A.R

Viên nén bao đường

Bột Bìm Bìm 75 mg Actiso 100 mg Rau Đắng Đất …… 75 mg

Tá dược…… vừa đủ 1 viên

- Điều trị các chứng bệnh thuộc về gan như: mụn, nhọt, gứa, nổi mề đay, viêm gan cấp và mãn tính, vàng da

- Giúp thông tiểu, nhuận trường (chống táo bón)

- Giúp ăn ngon

BOGANIC

Viên nang mềm

Actiso 170 mg Rau đắng đất 128 mg Bìm bìm 13,6 mg

- Bổ gan, dùng phòng và hỗ trợ điều trị suy giảm chức năng gan, đặc biệt

do dùng nhiều bia, rượu; viêm gan

do thuốc, hóa chất

- Làm giảm các triệu chứng của bệnh viêm gan gây mệt mỏi, vàng da, ăn kém, khó tiêu, bí đại tiểu tiện, táo bón

- Điều trị dị ứng, mụn nhọt, lở ngứa, nổi mề đay do bệnh gan gây ra

- Phòng và hỗ trợ điều trị vữa xơ động mạch, mỡ trong máu cao

1.2 Gốc tự do và một số mô hình thử tác dụng chống oxy hóa

1.2.1 Gốc tự do

Gốc tự do là một phân tử hóa học bị mất đi một electron, nói một cách đơn giản, phân

tử đó bị “mất cân bằng” Khi bị mất cân bằng, nó sẽ có xu hướng lấy electron của phân tử khác để trở về trạng thái cân bằng, điều này rất nguy hiểm vì có thể phá hủy các phân tử khác, đặc biệt là các phân tử cấu tạo nên thành phần của tế bào Khi gốc

tự do tấn công vào các tế bào, cơ thể sẽ có biện pháp phù hợp để loại bỏ chúng Tuy nhiên, nếu có quá nhiều gốc tự do tồn tại trong cơ thể, bộ máy bên trong cơ thể không thể tự loại bỏ hết được Và nếu một lỗi nhỏ không được khắc phục, thì hậu quả sẽ ngày càng lớn và cuối cùng sức khỏe, sự sống sẽ bị đe dọa Một số loại gốc tự do nguy hiểm bao gồm: superoxid, ozon, hydrogen peroxid, peroxy lipid, gây ra nhiều tổn thương tế bào, được cho là một trong những nguyên nhân gây nên nhiều căn bệnh

nghiêm trọng Vì vậy, cơ thể rất cần được cung cấp và bổ sung thêm chất chống gốc

tự do hay còn gọi là chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là chất có khả năng bắt giữ các gốc tự do, nhờ đó nó giúp ức chế sự lan truyền của các phản ứng của gốc tự

do và giúp bảo vệ cơ thể khỏi những bệnh như tim mạch, viêm khớp, hen suyễn và đặc biệt là ung thư [22], [34]

1.2.2 Một số mô hình thử tác dụng chống oxy hóa

Hiện nay, việc nghiên cứu và tìm ra các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật

và ứng dụng vào dược phẩm là một trong những hướng đi đầy triển vọng Vì vậy, các

mô hình thử tác dụng chống oxy hóa ngày càng được quan tâm và phát triển nhằm phục vụ cho quá trình nghiên cứu

1.2.2.1 Thử nghiệm DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

DPPH là một gốc tự do ổn định, độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi các chất chống oxy hóa hiện diện trong dịch chiết của cây, chúng thu dọn gốc tự do bằng cách chuyển hydro, màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng do chuyển thành 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazin dẫn đến làm giảm độ hấp thu [7], [13], [41]

Hình 1.6 Phản ứng của các chất có khả năng chống oxy hóa với DPPH

Thử nghiệm này được thực hiện đơn giản, nhanh chóng, chỉ cần máy quang phổ UV-Vis cho kết quả chính xác với độ nhạy cao [32]

1.2.2.2 Thử nghiệm FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Đây là thử nghiệm dựa vào khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ của các chất chống oxy hóa dưới sự hiện diện của 2,4,6-tri(2-pyridyl)-s-triazin (TPTZ), tạo thành phức Fe2+-PTZ

có màu xanh dương đậm với độ hấp thu cực đại ở 593 nm Phản ứng này phụ thuộc vào pH, tối ưu ở pH 3,6 Sự giảm xuống của độ hấp thu tỉ lệ với hàm lượng các chất chống oxy hóa [13]

Thử nghiệm FRAP đơn giản, rẻ tiền, nhanh chóng và không yêu cầu thiết bị chuyên biệt [32]

1.2.2.3 Thử nghiệm ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)

Thử nghiệm ORAC đo lường khả năng của các chất chống oxy hóa ức chế gốc

peroxyl được sinh ra bởi sự oxy hóa và do đó, làm gãy chuỗi gốc tự do bằng sự chuyển dịch hydro Trong thử nghiệm, gốc peroxyl phản ứng với một chất chỉ thị huỳnh quang để tạo thành sản phẩm không phát huỳnh quang

β-phycoerythrin (β-PE) được sử dụng như là chất chỉ thị huỳnh quang trong các

nghiên cứu trước đây Tuy nhiên, hiện nay người ta ưu tiên sử dụng fluorescein hoặc diclorofluorescein vì chúng cho kết quả ổn định hơn Chất đánh dấu huỳnh quang mặc dù nhạy, nhưng lại yêu cầu có máy đo huỳnh quang để phát hiện; do đó, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được thử nghiệm này [32]

1.2.2.4 Thử nghiệm ABTS

Là thử nghiệm đánh giá khả năng ngăn chặn sự tạo thành sản phẩm oxy hóa có màu (743 nm) của muối ABTS [2,2-azisbonis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) diammonium] của các chất thử nghiệm

Mức độ làm giảm cường độ hấp thu ở 734 nm nói lên khả năng chống oxy hóa của chất thử nghiệm [37]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Toàn cây Rau đắng đất, thu hái vào tháng 07, năm 2018 tại Cần Thơ Dược liệu thu

về được so sánh hình thái với các tài liệu mô tả thực vật [3], [4], sau đó được làm sạch và phơi khô trong bóng râm

2.1.2 Dung môi, hóa chất

 Cồn 96%, loại cồn thực phẩm dùng cho chiết xuất cao cồn từ Rau đắng đất

 Acetolnitrile labscan là dung môi phân tích dùng cho cột đảo

 Chroloform, ethyl acetat, n-butanol, methanol (Trung Quốc)

 Thuốc thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhdrazyl) của Sigma Aldrich sử dụng trong khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

 Thuốc thử vanillin sulfuric (VS) (Merck ): Pha vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric 5% trong cồn tuyệt đối theo tỉ lệ 1:1 trước khi dùng

 SKLM dùng bản silicagel 𝐹254 tráng sẵn trên nền nhôm ( Merck, Art,…)

 Silica gel cỡ hạt 40-63 μm (Merck) dùng cho sắc ký cột nhanh

 Silica gel pha đảo cỡ hạt 40-63 μm (SiliaBondR C-18-Canada) dùng cho sắc ký cột pha đảo

 Sephadex LH-20 (Pharmacia) dùng cho sắc ký cột rây phân tử (lọc qua gel)

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

 Các dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm

 Bếp cách thủy Memmert (Đức)

 Đèn UV Spectroline Model CM-10A (Mỹ)

 Cân phân tích Sartorius (Đức)

 Cân kỹ thuật Electronic Scale G&G

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Máy siêu âm Hwashin Technology Power sonic 410 (Hàn Quốc)

 Máy cô quay chân không Heidolph Hei-VAP Advantage (Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất và loại tạp

Dược liệu được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng với cồn 70% Thu hồi dung môi ở áp suất giảm để thu được cao lỏng, sau đó sẽ được chiết phân bố

bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: Ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol

(n-BuOH), thu hồi dung môi để thu được các cao tương ứng

2.2.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên các phân đoạn trên mô hình TLC-DPPH

Thuốc thử DPPH pha loãng trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml

Các mẫu thử của từng phần đoạn được hòa trong methanol và được chấm bằng ống mao quản có khắc vạch, lấy đồng lượng các mẫu thử Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và 365 nm Nhúng bản mỏng vào thuốc thử DPPH, ủ trong tối 5 phút Quan sát bản mỏng, dựa vào số vết và độ chuyển màu trên sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá mức độ chống oxy hóa [11], [21]

2.2.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất trong cao EtOAc

Sau khi xác định được phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với thuốc thử DPPH, tiến hành chiết xuất trên lượng mẫu lớn

Sử dụng các kỹ thuật sắc ký khác nhau như sắc ký cột pha thuận, sắc ký cột pha đảo, sắc ký cột sephadex nhằm thu được các phân đoạn mong muốn

 Phương pháp kết tinh phân đoạn

Phân đoạn sẽ được tinh chế bằng phương pháp kết tinh phân đoạn với dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp với lượng tối thiểu Khi có kết tinh, tiến hành lọc lấy tinh thể trên phễu thủy tinh xốp và rửa bằng dung môi thích hợp, sấy, hút ẩm, cân xác định khối lượng hoặc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột phù hợp

2.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết

Chất phân lập được sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng Chấm đậm trên

ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Nếu cả 3 sắc kí đồ đều cho một vết gọn trong vùng 𝑅𝑓=0,25-0,75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu là một chất tinh khiết

2.2.5 Xác định cấu trúc hóa học

Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ, bao gồm: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), so sánh đối chiếu với các dữ liệu phổ MS, NMR của các chất tương tự đã công bố trong tài liệu

 Phổ khối lượng (MS) được đo trên máy đo khối phổ (Micromass Quattro micro

TM API – Water) Tại Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp HCM

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tại Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam – Hà Nội Mẫu được hòa tan trong dung môi phù hợp với TMS là chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) được đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125 MHz Độ dịch

chuyển hóa học được tính theo thang ppm với chất chuẩn nội là TMS (δC = 0.00) Các

hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Chiết xuất

Rau đắng đất (3 kg) được ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng với cồn 70% thu được dịch chiết cồn (25 lít), thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được cao lỏng (3 lít)

Lắc phân bố cao lỏng thu được với EtOAc (3 lít x 5 lần), lớp EtOAc được cô giảm áp thu được cao EtOAc (30 g)

Lớp dịch nước còn lại sẽ tiếp tục được lắc phân bố với n-BuOH bhn (3lít x 7 lần), cô

giảm áp thu được cao n-BuOH (45 g)

Các phân đoạn EtOAc và n-BuOH được kiểm tra trên SKLM ( Hình 3.2 )

Quy trình chiết xuất được tóm tắt như sau:

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất Rau đắng đất

CHCl 3 - MeOH - H 2 O (65:35:10; lớp dưới)

UV 254 UV 365 VS

Hình 3.2 Sắc ký đồ các cao chiết xuất từ cây Rau đắng đất

3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên các phân đoạn trên mô hình TLC-DPPH

Tiến hành như phần phương pháp nghiên cứu (mục 2.2.2) Kết quả được trình bày

trong Hình 3.3

CHCl 3 - MeOH - H 2 O (65:35:10; lớp dưới)

UV 254 UV 365 VS DPPH

Hình 3.3 Sắc ký đồ kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

Nhận xét: Sau khi thực hiện nhúng thuốc thử DPPH và quan sát trên sắc ký lớp mỏng

thì cao EtOAc và cao n-BuOH đều xuất hiện các vết màu vàng trên nền tím của thuốc

thử DPPH, chứng tỏ cả hai cao đều có tác dụng chống oxy hóa Tuy nhiên, trên cao EtOAc xuất hiện nhiều vết vàng sáng hơn, cho thấy tác dụng chống oxy hóa cao hơn

3.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao EtOAc

3.3.1 Phân lập và tinh chế

Sau khi khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên các phân đoạn qua mô hình DPPH, nhận thấy cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn nên tiếp tục tiến hành phân lập các hoạt chất có trong phân đoạn tiềm năng này

TLC-3.3.1.1 Phân tách các phân đoạn của cao EtOAc bằng sắc ký cột nhanh

 Thăm dò hệ phân tích

Sau khi khảo sát các hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi CHCl3 – MeOH

được chọn làm hệ phân tích các thành phần phân đoạn EtOAc (Hình 3.4)

CHCl 3 : MeOH (8:2)

UV 254 UV 365 VS

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân đoạn EtOAc

 Tiến hành sắc ký cột nhanh

Điều kiên sắc ký cột nhanh:

 Cột sắc ký: Cột thủy tinh 8×60 cm (đường kính×chiều dài) ,rửa sạch, sấy khô

 Pha tĩnh: 300 g Silica gel hạt trung bình (40 -63 μm)

 Pha động: Khai triển cột bằng hệ dung môi CHCl 3 -MeOH với độ phân cực tăng dần từ (100:0)  (90:10 )

 Mẫu: 30 g cao EtOAc đã được hoạt hóa với silica gel

 Thể tích hứng phân đoạn: 500 ml

 Kiểm tra và gộp các phân đoạn: Các phân đoạn sẽ được kiểm tra bằng SKLM khai

triển bởi hệ dung môi CHCl 3 -MeOH (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp chung các phân đoạn có sắc kí đồ tương đương, cô thu hồi dung môi và

cân xác định khối lượng Kết quả được trình bày trong Hình 3.5 và Bảng 3.1

CHCl3-MeOH (8:2)

UV 254 UV 365 VS

Hình 3.5 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được sau khi lên cột nhanh

Bảng 3.1 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột nhanh

- Phân đoạn 5 tiếp tục được tiến hành phân tách tiếp trên cột sephadex ( mục 3.3.1.3)

3.3.1.2 Phân lập phân đoạn 4 bằng SKC pha đảo C-18

Điều kiện sắc ký cột pha đảo C-18

 Cột sắc ký: cột thủy tinh 3× 60 cm (đường kính × chiều dài), rửa sạch, sấy khô

 Pha tĩnh: 100 g SiliaBondR C-18 ( 40 – 63 μm )

 Pha động: Khai triển cột bằng hệ dung môi CH 3 CN-H 2 O với tỉ lệ CH 3 CN tăng dần (0:100)  (22:78)

 Mẫu: 1,8 g cao phân đoạn 4

 Thể tích hứng phân đoạn: 100ml

 Kiểm tra và gộp các phân đoạn: Các phân đoạn sẽ được kiểm tra bằng SKLM khai

triển bởi hệ dung môi CHCl 3 -MeOH (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp chung các phân đoạn có sắc kí đồ tương đương, thu hồi dung môi và cân

xác định khối lượng Kết quả được trình bày trong Hình 3.6 và Bảng 3.2

CHCl3: MeOH (8:2)

UV 254 UV 365 VS

Hình 3.6 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đươc sau khi lên cột pha đảo

Bảng 3.2 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột pha đảo

MeOH lạnh, thu được bột vô định hình màu trắng Kiểm tra trên SKLM với 3 hệ dung môi cho thấy chỉ có 1 vết duy nhất, đặt tên là G-3 (102 mg)

 Phân đoạn 4.4 (170 mg) hầu như chỉ có một vết nâu tím với thuốc thử VS, được hòa trong một lượng tối thiểu MeOH, lọc và để lạnh cho kết tinh Lọc và rửa bằng MeOH lạnh, thu được bột vô định hình màu trắng Kiểm tra trên SKLM với 3 hệ dung môi cho thấy chỉ có 1 vết duy nhất, đặt tên là G-4 (52 mg)

3.3.1.3 Phân lập phân đoạn 5 bằng sắc ký cột sephadex LH-20

Điều kiện sắc ký cột Sephadex LH-20:

 Cột sắc ký: cột thủy tinh 2,5 x 70 cm (đường kính × chiều dài), rửa sạch, sấy khô

 Pha tĩnh : 50 g sephadex LH-20 (Pharmacia.)

 Pha động: MeOH 100%

 Mẫu: 100 mg

 Kiểm tra và gộp các phân đoạn: Các phân đoạn sẽ được kiểm tra bằng SKLM

khai triển bởi hệ dung môi CHCl3 – MeOH (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp chung các phân đoạn có sắc kí đồ tương đương, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được những cắn tương ứng Tiến hành lặp lại trên 5 cột

sephadex trong cùng điều kiện Kết quả được trình bày trong Hình 3.7 và Bảng 3.3

𝐶𝐻𝐶𝑙3: MeOH (8:2)

UV 254 UV 365 VS

Hình 3.7 Sắc ký đồ các phân đoạn thu đươc sau khi lên cột sephadex

Bảng 3.3 Các phân đoạn thu được sau khi lên cột sephadex

Nhận xét: Phân đoạn 5.3 (53 mg) hầu như chỉ có một vết vàng với thuốc thử VS,

được hòa trong một lượng tối thiểu MeOH, lọc và để lạnh cho kết tinh Lọc và rửa bằng MeOH lạnh, thu được bột vô định hình màu vàng Kiểm tra trên SKLM với 3

hệ dung môi cho thấy chỉ có 1 vết duy nhất, đặt tên là G-7 (22 mg)

3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của G-3, G-4 và G-7 bằng SKLM

Kiểm tra tinh khiết G-3 (Hình 3.8), G-4 (Hình 3.9) và G-7 (Hình 3.10) bằng SKLM

với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau:

CHCl3 – MeOH ( 8:2 )

UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS

Hình 3.8 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-3

Nhận xét: G-3 không tắt quang trong UV 254, không phát quang trong UV 365 và cho

màu tím với thuốc thử VS Vết của G-3 trên 3 bản mỏng gọn và không xuất hiện vết nào khác, sơ bộ kết luận G-3 là chất tinh khiết

CHCl 3 -MeOH-H 2 O

( 65:35:10, lớp dưới )

EtOAc-MeOH-H 2 O ( 100:17:13 )

CHCl 3 -MeOH ( 8:2 )

UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS

Hình 3.9 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-4

Nhận xét: G-4 không tắt quang trong UV 254, không phát quang trong UV 365 và

cho màu nâu tím với thuốc thử VS Vết của G-4 trên 3 bản mỏng gọn và không xuất hiện vết nào khác, sơ bộ kết luận G-4 là chất tinh khiết

CHCl 3 - MeOH - H 2 O

( 65:35:10; lớp dưới )

EtOAc - MeOH - H 2 O ( 100:17:13 )

CHCl 3 – MeOH ( 8:2 )

UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS UV 254 UV 365 VS

Hình 3.10 SKLM kiểm tra độ tinh khiết của G-7

Nhận xét: G-7 tắt quang trong UV 254, không phát quang trong UV 365 và cho màu

vàng với thuốc thử VS Vết của G-7 trên 3 bản mỏng gọn và không xuất hiện vết nào khác, sơ bộ kết luận G-7 là chất tinh khiết

Quá trình phân lập được tóm tắt trong sơ đồ ở Hình 3.11:

Hình 3.11 Sơ đồ phân lập và tinh chế

19,9; 17,1; 26,7; 27,5 ppm (tướng ứng lần lượt với các tín hiệu dưới dạng pic đơn δH

1,20; 0,98; 0,71; 0,86; 1,08; 1,30; 1,52; và 1,53 ppm) là những tín hiệu đặc trung của

khung saponin triterpen, ngoài ra xuất hiện các tín hiệu của 7 nhóm carbon bậc 4 CIV,

8 nhóm -CH2, 7 nhóm -CH-

Phổ 1H-NMR của G-3 cho thấy các tín hiệu ở vùng trường thấp H3 (δH 3,42), H12 (δH 4,42) và H16 (δH 4,47) tương ứng lần lượt với các tín hiệu C3 (δ 78,2), C12 (δ 66,9) và C16 (75,4) cho thấy sự xuất hiện của nhóm oxymethin (-O-CH-) trong cấu trúc

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của đường D- glucose với δC 101,7;

75,8; 78,7; 72,5; 78,2; 63,5 ppm Carbon anomer của đường có δC 101,7 cho thấy đây

là một O-glycosid.Kết hợp với phổ HMBC, H1’ tương tác với C16 của aglycon và

H16tươngtác với C1’ cho thấy đương D - glucose gắn vào C16của khung aglycol và H1’ có δH 5,07 d (7,5 Hz) cho biết cấu hình  - D - glucose (H1’ và H2’ đều hướng axial với mặt phẳng vòng)

Các tương tác của các proton kế cận ghi nhận được từ dữ liệu phổ COSY của hợp

chất G-3 cho phép gán các vị trí của các proton này trong cấu trúc ( xem Bảng 3.4)