Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cây muồng lùn chamaecrista pumila (lam ) k larsen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY MU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO

VỆ GAN CỦA CÂY MUỒNG LÙN

CHAMAECRISTA PUMILA (LAM.) K.LARSEN

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO

VỆ GAN CỦA CÂY MUỒNG LÙN

CHAMAECRISTA PUMILA (LAM.) K.LARSEN

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển

Ths Vũ Thanh Bình

HÀ NỘI 2018

LỜI CÁM ƠN

Luận văn thạc sỹ của em được hoàn thành nhưng còn nhiều thiếu sót, tuy nhiên em luôn trân trọng quãng thời gian thực hiện luận văn này vì nó cho em cơ hội được làm việc và lĩnh hội rất nhiều kiến thức từ các thầy cô, bạn bè

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển là

người Thầy đã hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học, động viên em những lúc khó khăn nhất trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.NCS.Vũ Thanh Bình, người

đã hỗ trợ cho em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và các anh chị em kỹ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền, bộ môn Dược lực, trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn này

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để

em hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này

Lê Minh Hằng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1. CHI CASSIA 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Cassia 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.3. Một số loài thuộc chi Cassia 3

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Cassia 4

1.1.3.2 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi 5

1.2 CÂY MUỒNG LÙN 9

1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái, phân bố 9

1.2.2 Bộ phận dùng: 11

1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Muồng lùn 11 1.2.4. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Muồng lùn: 16

1.2.5 Công dụng của cây muồng lùn 17

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 18

2.1.2 Động vật thí nghiệm 18

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và địa điểm nghiên cứu 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Điều chế mẫu nghiên cứu 19

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết cây muồng lùn 22

2.2.2.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự do của các phân đoạn dịch chiết cây muồng lùn: 22

2.2.1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 24

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết cây muồng lùn 25

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết quả 28

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thành phần hóa hoạc của dịch chiết cây Muồng lùn theo định hướng tác dụng chống oxy hóa 29

3.1.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của cao các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp dọn gốc tự do: 29

3.1.1.1 Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do DPDH 29

3.1.1.2 Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do SOD 30

3.1.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của 3 chất trong phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây muồng lùn 32

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết 35

3.1.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 36

3.2 Tác dụng bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm của dịch chiết cây muồng lùn: 42

PHẦN 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây muồng lùn 51

4.1.1 Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro 51

4.1.2 Về thành phần hóa học 52

4.2 Tác dụng sinh học 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

KẾT LUẬN: 59

KIẾN NGHỊ: 60

TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 61

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C – NMR1H

– NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear

magnetic resonance )Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

NMRNMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ProtonPhổ cộng hưởng từ hạt

nhân (Nuclear magnetic resonance)

ALAT Alanin aminotransferase

ASAT Aspartat aminotransferase

CC Sắc ký cột (Column chromatography)

CCl4PAR Carbon tetrachlorideParacetamol

DEPT Distortion Enhancement by PolarizationTransfer

DMSO Dimethyl sulfoxid

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ESI-MS Phổ khối lượng ion hóa tia điện (Electrospray ionization

mass spectrometry ) EtOAc Etyl acetat

HSQC13C –

NMR

Heteronuclear Single Quantum CoherencePhổ cộng hưởng

từ hạt nhân carbon 13 (Carbon (13) Nuclear magnetic resonance )

IC50 Nồng độ ức chế 50%

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

NMRMS Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic

resonance)Phổ khối (Mass spectrometry) SOD Superoxid dismutase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Cassia ở Việt

Bảng 1.2 Hàm lượng (mg/g khối lượng khô) một số nhóm chất

Bảng 1.3 Định tính một số hợp chất ở các phân đoạn khác nhau

Bảng 3.1 Kết quả tác dụng dọn gốc tự do DPDH 29 Bảng 3.2 Giá trị ức chế 50% (IC50) gốc tự do DPDH của mẫu thử

Bảng 3.3 Kết quả tác dụng dọn gốc tự do SOD 31 Bảng 3.4 Giá trị ức chế 50% (IC50) gốc tự do SOD của mẫu thử

Bảng 3.6 Dữ kiệu phổ NMR của hợp chất TB3.5 39 Bảng 3.7 Dữ kiệu phổ NMR của hợp chất TB12.10 41 Bảng 3.8 Tác dụng của cao Muồng lùn đối với hoạt độ AST trong

Bảng 3.9 Tác dụng của cao Muồng lùn đối với hoạt độ ALT trong

Bảng 3.10 Tác dụng của cao Muồng lùn đối với hoạt độ MDA

Bảng 3.11 Tác dụng của cao Muồng lùn đối với hoạt độ GSH dạng

khử trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 47 Bảng 3.12 Tác dụng của cao Muồng lùn đối với hoạt độ SOD

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện thuận lợi cho hệ sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật phong phú và đa dạng.Trong số đó có rất nhiều các dược liệu quý đã và đang được

sử dụng Tuy nhiên nhiều cây thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu hay nghiên cứu một cách đầy đủ

Vì vậy việc nghiên cứu cây cỏ dùng làm thuốc là điều cần thiết góp phần tạo

cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc trong điều trị bệnh hiện nay

Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại là sự gia tăng của bệnh tật đặc biệt là những bệnh hiểm nghèo Bắt đầu vào năm 1950, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu nguyên nhân gây ra các bệnh như: suy tim, đột quỵ, các bệnh lý về tim mạch, tiểu đường, viêm gan, viêm khớp… đặc biệt là bệnh ung thư ngày càng phổ biến và gia tăng nhanh chóng, mặc dù điều kiện sống ngày càng nâng cao Với sự hỗ trợ của các phương tiện kỹ thuật hiện đại các nhà khoa học đã chứng minh nguyên nhân gây ra các bệnh trên đó chính là “gốc

tự do”

Trong Y học hiện đại đã có nhiều nghiên cứu và phương pháp loại bỏ gốc tự do Nhưng do tính an toàn của thuốc có nguồn gốc từ dược liệu nên hiện nay việc nghiên cứu tìm ra nguồn dược liệu dùng làm thuốc có tác dụng chống gốc tự do là việc cần thiết

Muồng lùn (còn được gọi là Me đất) có tên khoa học là Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen (tên đồng danh là Cassia pumila Lam., Cassia prostrata Roxb Hay Senna prostrata Roxb.), họ Đậu (Fabaceae) [1], [6]

Cây mọc hoang nhiều nơi như Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hóa, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai… Hiện nay, theo kinh nghiệm dân gian thường dùng phần trên mặt đất của cây Muồng lùn đun nước uống giúp mát gan, giải độc trong một

2

số bệnh như xơ gan, viêm gan… Trên thế giới các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Muồng lùn chứng minh cây muồng lùn có nhiều thành phần hóa học thuộc nhóm anthranoid như emodin, chrysophanol, physcion [8]… và một số tác dụng như: kháng khuẩn, an thần [6], [8],.…Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể nào về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của cây Muồng lùn

Vì vậy để góp phần cung cấp thêm thông tin và làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng cây muồng lùn để chữa bệnh gan, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên thực nghiệm của cây muồng lùn” với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu thành phần hoá học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen

2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm của dịch chiết cây muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen

3

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Vị trí phân loại chi Cassia

Chi Cassia, thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Bí (Cucurbitales), lớp Ngọc lan

(Magnoliosida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của cây Muồng

lùn (Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen) được thể hiện như sau [4], [3],

Cây gỗ, cây nhỡ hay cây cỏ không có gai

Lá mọc lông chim rời, trên lá thường có các nốt hình đĩa hoặc tròn, hiếm khi lá trơn; lá chét hình trứng, mọc ngược trở lại Thường không có lá kèm [3] [5]

Cụm hoa chùm ở nách hoặc chùy ở ngọn Hoa lưỡng tính, thường có màu vàng, mẫu 5, 10 nhị thường xếp thành 2 vòng; bao phấn dính lưng hay dính gốc, mở bằng kẽ hay lỗ; Bầu trên chứa nhiều noãn [3] [5]

Quả loại đậu dẹt hay hình trụ [3] [5]

1.1.3 Một số loài thuộc chi Cassia

4

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Cassia

Thảo quyết minh (Cassia tora L.): Cây thảo hay cây bụi nhỏ, cao 30 -

90 cm Thân cành nhẵn Lá kép lông chim, mọc so le, gồm 3 đôi lá chét hình bầu dục, mọc đối, dài 3 - 5 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm, gốc tròn, đầu hơi có mũi nhọn, những lá chét phía trên rộng hơn, hai mặt nhẵn có gân nổi rõ, màu lục nhạt; cuống chung dài 4 - 8 cm; lá kèm hình dùi Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm 1- 3 hoa màu vàng; đài 5 thùy không bằng nhau; tràng 5 cánh hình trứng thắt lại ở gốc thành móng hẹp; nhị 7, gần đều nhau, bao phấn hình bốn cạnh, mở bằng hai lỗ ở đỉnh, chỉ nhị ngắn; bầu không cuống, có lông nhỏ màu trắng nhạt Quả đậu hẹp và dài 12 - 14 cm thắt lại ở hai đầu, hơi thắt lại ở giữa các hạt, chứa khoảng 25 hạt hình trụ xiên, màu nâu vàng bóng [1]

Ô môi (Cassia grandis L f.): Cây gỗ to, cao 10 - 12m Cành non có lông màu gỉ sắt, cành già nhẵn, màu nâu đen Lá kép lông chim chẵn, mọc so

le, gồm 11-13 đôi lá chét mọc đối Cụm hoa mọc ở kẽ lá đã rụng thành chùm dài, hoa màu hồng tươi Quả hình trụ, cong như lưỡi liềm, dài 40 – 60 cm, đường kính 3 – 4 cm, vỏ ngoài màu nâu đen, có ngấn ngang chằng chịt, bên trong có 50 - 60 ô, mỗi ô chứa một hạt dẹt, quanh hạt có một lớp cơm màu nâu hoặc nâu đen, mềm, vị ngọt, mùi hắc, ăn được [1]

Muồng hôi (Cassia hirsuta L.): Cây nhỏ, cao 0,6 – 2 m Thân cành hình trụ, hơi hóa gỗ ở gốc, phân cành nhiều, có lông dày Lá mọc so le, gồm 5 đôi

lá chét mọc đối, hình mác, dài 2,5 – 9 cm, rộng 1,2 – 3 cm, gốc tròn có tuyến nhỏ, đầu nhọn, hai mặt có lông dài; lá kèm hình giùi; cuống chung dài 12cm Cụm hoa mọc ở ngọn thân và đầu cành thành ngù giả có lá; hoa, 2 - 3 cái màu vàng; đài 5 răng, không bằng nhau; tràng 5 cánh mỏng; nhị 10 không đều, 2 cái to có bao phấn hình lưỡi hái, 4 cái nhỏ có bao phấn dẹt và rộng; bầu lệch,

có lông Quả hình lưỡi hái, có lông xù xì, hơi dẹt, chứa nhiều hạt [1]

Muồng trâu (Cassia alata L.): Cây nhỏ, cao l,5 m hay hơn Thân mập, cành nằm ngang, có lông rất nhỏ và có khía.Lá mọc so le, kép lông chim, dài

5

30 – 40 cm, gồm 8 -12 đôi lá chét hình chữ nhật hoặc hình bầu dục trốn ở hai đầu, lá chét dài 5-13 cm, rộng 2,5 – 7 cm, to dần về phía ngọn, hai mặt nhẵn; cuống lá to, hơi có cánh; lá kèm thẳng, nhọn, tồn tại Cụm hoa mọc ở kẽ lá và ngọn thân thành bông to, dài 20 – 30 cm, rộng 3 – 4 cm; lá bắc sớm rụng; cuống cụm hoa mập; hoa màu vàng; lá đài 5 không bằng nhau, thuôn, nhẵn; cánh hoa 5, thắt lại ở gốc thành móng ngắn và hẹp; nhị 6 - 7, 2 nhị to có bao phấn 10mm, những nhị trung bình có bao phấn 5 mm, những nhị nhỏ có bao phấn bằng nhau, dài 4mm; bầu có cuống, vòi nhuỵ ngắn Quả dẹt, có cánh ở hai bên dìa, dài 8 – 16 cm, rộng 1,5 - l,7 cm; hạt nhiều, dẹt, hình quả trám [1]

Phan tả diệp (Cassia angustifolia Vahl.): Cây nhỏ, cao 40-60 cm, mọc thành bụi Thân đứng, nhẵn Lá kép lông chim chẵn, mọc so le, có 10-16 lá chét, hình mác hẹp, dài 3-5 cm, rộng 0,7-0,8 cm, gốc thuôn, có khi lệch, đầu nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới hơi có lông Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm; hoa màu vàng có vân nâu; đài có 5 răng thuôn; tràng có 5 cánh gần bằngnhau; nhị 10, không đều, trong đó có 3 nhị lép; bầu thuôn dẹt, có nhiều noãn Quả đậu dẹt, hình trứng, hơi cong, dài 4-6cm, rộng 1-1,7cm, có lông trắng mềm, màu lục nâu khi còn non, sau nhẵn màu vàng nâu đỏ; hạt 6-8, hình trứng dẹt, màu lục nâu [1]

1.1.3.2 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi

Nhiều cây thuộc chi Cassia có tác dụng chữa bệnh trong Y học cổ truyền, đã

có nhiều nghiên cứu được công bố Các nghiên cứu đã được tiến hành cho

thấy thành phần hóa học của các loài thuộc chi Cassia hay gặp là anthranoid

(như rhein, chrysophanol, physcion, emodin, anthraquinones, …), flavonoid (quercetin, …), tannin, coumarin… ( Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Cassia

1,8-dihydroxy-6-[32], [48]

anthranoid (Chrysoobtusin, aurantio-obtusin, obtusin, alaternin, acid chrysophanic,…), albumin, lipid, chất nhầy, chất màu, tannin

[64], [66]

C

mimosoides

Phần trên mặt đất

Chrysophanol, methoxy-2-methyl anthraquinon, 1,8-dihydroxy-6-methoxy-3-methyl anthraquinon, flavonosid, các loại alcol, acid amin

1,8-dihydroxy-6-[41]

C

occidentalis Hoa

Anthranoid (chrysophanol, emodin, physion, rhein, aloe- emodin, …), flavonoid

(quercetin), tanin

[43]

C.glauca Vỏ cây

C.alata Thân Chrysophanol, aloe-emodin,

flavonoid, acid béo, β-sitosterol [22]

C.shophera Lõi gỗ

Chrysophanol, emodin, 1,2,6-dihydroxy-7,8-methoxy-3-methytanthraquinon; physcion,

[36], [37]

7

sophenarin

C grandis Quả

2-3-methyl anthraquinon-3-O-β-D-glucopyranoside

1,3,4-trihydroxy-6,7,8-trimethoxy-[22]

1.1.3.3 Tác dụng dược lý của chi Cassia

* Theo Y học cổ truyền chi Cassia có nhiều loài được sử dụng trong dân gian

để chữa nhiều loại bệnh [1], [33]:

- Các cây chi Cassia có khả năng chữa các bệnh về tiêu hóa: Táo bón, đầy hơi…, như loài: C.tora, C.absus, C.fistula…

- Chi Cassia chữa một số bệnh về mắt như viêm màng kết mạc cấp tính, viêm võng mạc, quáng gà…, như C.absus, C auriculata, C.tora…

- Ngoài ra chi Cassia còn điều trị các vết thương, vết loét, nhiễm khuẩn ngoài da… như: C.officinalis, C.occidentalis, C.auraculata, C.absus…

- Bệnh gout: Cassia fistula L., Cassia sophera L

- Bệnh thấp khớp, đau thần kinh tọa: Cassia auriculata L., Cassia fistula L., Cassia obtusifolia L., Cassia tora L

* Theo các nghiên cứu hiện đại thì chi Cassia có rất nhiều tác dụng đã được

chứng minh như sau:

a) Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Saganuwan AS, Gulumbe ML trong nghiên cứu của mình năm 2006 đã chứng

minh cao chiết ethanol lá của loài Cassia occidentalis có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều chủng khác nhau như Corynebacterium diphtheriae, Mucor sp., Neisseria sp Salmonella sp., Aspergillus niger [29] đồng thời có khả năng ức chế E coli ở lượng 900-1000 mg Dịch chiết n-hexan với lượng 500-

1000 mg có khả năng ức chế một số chủng như Pseudomonas multocida, Salmonella typhi, S.typhimurium, S pyogenes, S pneumonia [7], [52]

Năm 2000, Mastura M, Khozirah S đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ

dịch chiết hạt của loài Cassia javanica Chứng minh loài Cassia javanica có

8

tác dụng kháng khuẩn trên một số dòng vi khuẩnGram (+) như

Staphylococcus aureus, S epidermidis; một số dòng vi khuẩn Gram(-) như Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia và một số dòng nấm như Candida albicans, Candida glabrata, Microsporumcanis, Trichophyton

mentagrophytes, Trichophyton rubrum [38]

Nghiên cứu trên loài Cassia tora đã chứng minh các anthraquinon và một số

hợp chất nhóm phenolic glycoside có tác dụng kháng khuẩn trên các loài vi

khuẩn: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Các hợp chất như

torachryson, toralacton, aloe-emodin và emodin có tác dụng ức chế với chủng

vi khuẩn Staphylococus aureus kháng methicillin với MIC khoảng 2-64mg/ml

[50]

b) Tác dụng chống viêm, giảm đau

Trong nghiên cứu của Sadique J và các cộng sự trên loài Cassia occidentalis

đã chỉ ra có tác dụng chống viêm với liều 2000 mg/kg trên mô hình gây phù

bàn chân chuột của Carrageenan Nghiên cứu cũng chỉ ra dịch chiết loài C occidentalis có tác dụng hạ lipid máu, ức chế hình thành phospholipase A2 [51]

Vào năm 1998 Maity TK, Mandal SC và các cộng sự đã chứng minh dịch

chiết methanol của loài Cassia tora có tác dụng chống viêm đáng kể so với

carageenin, histamin, serotonin, dextran trên mô hình gây phù nề chân chuột [34]

6-[(α-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl)oxy]-9

rubrofusarin có tác dụng bảo vệ gan tương đương như silymarin phân lập từ

Silybum marianum Gaertn [35]

Cao chiết ethanol lá của loài Cassia sophera đã được nghiên cứu và

chứng minh rằng có tác dụng bảo vệ gan mạnh đối với tổn thương gan do CCl4 trên chuột, nghiên cứu cho thấy có thể có tác dụng này có thể do thành phần flavonoid có trong dịch chiết [40]

Tương tự như vậy, cao chiết ethanol lá của loài Cassia fistula đã được

nghiên cứu và chứng minh rằng có tác dụng bảo vệ gan đối với tổn thương gan do paracetamol gây ra trên chuột [10]

d) Hạ đường huyết và ức chế hoạt tính oxi hóa lipid

Vào năm 2002 Latha M và Pari L đã chứng minh cao dịch chiết hoa

của loài Cassia auriculata khi cho chuột sử dụng trong 30 ngày ở mức liều

0,45 g/kg có tác dụng làm giảm đáng kể lượng đương trong máu, tăng insulin trong huyết tương, tăng hoạt tính của hemoglobin và hexokinase Ảnh hưởng nổi bật hơn so với glibenclamid [46]

Nghiên cứu trên loài Cassia javanica và một số loài khác như Cassia auriculata, Gymnema sylvestre và các cộng sự đã chỉ ra tác dụng hạ mức

glucose trong máu chuột bị tiểu đường khi điều trị liên tục 28 ngày Nghiên cứu còn chứng minh được tác dụng ức chế hoạt tính oxi hóa lipid [25]

e) Độc tính

Loài Cassia occidentalis đã được nghiên cứu độc tính trên một số bộ

phận như cơ, xương, gan, thận và tim khi sử dụng liều 0,05% đến 0,5% dịch chiết hạt trên trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu Một số biểu hiện của độc tính cấp trên gan và thoái hóa cơ bắp đã được phát hiện [44]

1.2 CÂY MUỒNG LÙN

1.2.1 Đặc điểm thực vật, sinh thái, phân bố

10

Muồng lùn (còn được gọi là Me đất) có tên khoa học là Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen (tên đồng danh là Cassia pumila Lam., Cassia prostrata Roxb hay Senna prostrata Roxb.), họ Đậu (Fabaceae) [5], [3], [6]

Muồng lùn mọc hoang ở nhiều nơi như bãi cát ven biển, ven đường đi,

bờ đê, bãi đất hoang, ven các rừng cây; ra hoa tháng 8-9, có quả vào tháng

10-12

Muồng lùn là cây thảo hằng năm có gốc hóa gỗ, mọc nằm, có khi mọc đứng, dài khoảng 40 cm Thân có cạnh, có lông, nâu lúc khô Lá dài 3-7 cm, hình ngọn giáo nhọn, lá kép 1 lần lông chim, có lông mịn [3], [6]

Hoa trên nách lá, đơn độc hoặc xếp 2-3 hoa thành chùm rất ngắn; cuống hoa dài 4-6 mm, có lông mịn; lá đài hình ngọn giáo, nhọn; cánh hoa màu vàng, không đều, thuôn-xoan ngược; nhị 5, gần bằng nhau; bầu có lông mềm [5], [6]

Quả đậu hình dải, dài 2,5-3 cm, rộng 4 mm, có lông mịn; 10-15 hạt, gần hình thoi, màu nâu bóng lúc già

Hình 1.1 Cây muồng lùn tại thực địa

11

Phân bố:

Phân bố: Cây muồng lùn có ở nhiều tỉnh ở nước ta như: Lào Cai, Quảng Ninh, Hải Dương, Bắc Ninh, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Quảng Trị, Huế, Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc,

Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận [5], [3], [6]

Ngoài ra còn sống ở: Ấn độ, Mianma, Trung Quốc, Lào Camphuchia, Thái Lan…

1.2.2 Bộ phận dùng:

Phần trên mặt đất cây Muồng lùn (Chamaecrista pumila Lam.)

1.2.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Muồng lùn

Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Muồng lùn Theo công bố của B.L Sharma và các cộng sự năm 2013, loài Muồng lùn có các thành phần như protein, lipid, phenol, corotenoid (Bảng 2.1)…[55]

Bảng 1 2 Hàm lượng (mg/g khối lượng khô) một số nhóm chất

trong loài Casia pumila

12

Tác giả cũng đã định tính một số hợp chất ở các phân đoạn khác nhau

của Cassia pumila Lamk [56]

Bảng 1.3 Định tính một số hợp chất ở các phân đoạn khác nhau của

Cassia pumila Lamk

Hợp chất Petroleum Benzen Aceton Cloroform Alcohol Nước

sennosid B, sennosid C, sennosid D, rhein-8-O-glycoside … và một số thành

phần khác như alcol béo, flavonoid, phytosterol

Theo nghiên cứu của Ram Avtar Sharma và các cộng sự trong bột quả khô của cây muồng lùn có chứa sennosid A, sennosid B, sennosid C, sennosid

D , rhein-8-O-glycosid [57], [56]

14

Ngoài ra, theo Shoeb A và các cộng sự, toàn cây muồng lùn có emodin, chrysophanol, physcion, diterpene, alcaloid, acid chrysophanic, dihydro xanthyletin, 1- hentriacontanol, 1-hexacosanol, 1-tetratriacontanol[19], [56]

kaempferol-15

Hình 1.13 Kaempferol-7-O-glucosid Hình 1.14 Quercetin

Hình 1.15 Kaempferol Ankita Yadav và các cộng sự, I.W.Southon (1994) đã nghiên cứu và chỉ

ra rằng trong C pumila có chứa các steroid(phytosterol): β-sitosterol,

lanosterol, campesterol, stigmasterol [59], [56]

Hình 1.16 β-Sitosterol Hình 1.17 Lanosterol

16

Hình 1.18 Campesterol Hình 1.19.Stigmasterol

1.2.4 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Muồng lùn:

Hiện nay trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu về tác dụng sinh học

của cây Muồng lùn (C pumila), các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tác

dụng kháng khuẩn và kháng nấm

Vào năm 2012, Ram Avtar Sharma và các cộng sự đã phân lập được một số sennosid và chứng minh tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trên các phân đoạn dược liệu cũng như các hợp chất phân lập được Kết quả cho thấy, phân đoạn cloroform có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm nhưng giá trị MIC cao hơn nhiều lần so với các chất đối chứng như tetracyclin, gentamycin, nystatin Các hợp chất antharnoid phân lập được như sennosid A, B, C, D và

rhein-8-O-glycosid cũng có hoạt tính trên nhưng cao hơn các chất đối chứng

gấp nhiều lần (từ 7 đến 20 lần) Hoạt tính kháng khuẩn mạnh được thấy ở

sennosid D là 140µg/ml kháng S.pneumoniae và sennoside B kháng nấm tại 170µg/ml mạnh nhất kháng R bataticola [57]

Năm 2012, Daulat Singh cùng các cộng sự đã nghiên cứu hàm lượng flavonoid toàn phần có trong các bộ phận khác nhau của cây Muồng lùn Kết quả cho thấy, phần hoa có hàm lượng flavonoid lớn nhất (1,92 mg/g khối lượng khô kiệt) Nghiên cứu cũng chỉ ra, cây Muồng lùn có tác dụng kháng

khuẩn trên một số vi khuẩn như E.coli, S aureus, P aeurinosa, S typhi và một số lại nấm như A flavus, A niger…[58]

17

Theo 1 nghiên cứu khác Ankita Yadav và các cộng sự đã chứng minh hiệu quả kháng khuẩn kháng nấm của phytosterol trong cây muồng lùn

Chamaecrista pumila (Lam.) Trong đó β-sitosterol thể hiện hoạt tính trội hơn

đối với nấm và vi khuẩn và giá trị MIC là 2x103mg/đĩa trong khi giá trị MIC của lanosterol, campersterol và stigmasterol là 3x103mg/đĩa [65]

1.2.5 Công dụng của cây muồng lùn

Theo Võ Văn Chi, bộ phận dùng của cây muồng lùn là hạt gây xổ như

nhiều loài Cassia khác Ở Vân Nam (Trung Quốc), rễ được dùng trị lỵ [6]

Theo y học cổ truyền Ấn Độ, lá cây muồng lùn dùng với sữa có tác dụng chữa đau mắt [33]

Theo kinh nghiệm của đồng bào ở Hòa Bình, cây muồng lùn được sử dụng trong các bài thuốc chữa bệnh về gan Một số thầy thuốc ở Quảng Ninh dùng cây muồng lùn chữa các bệnh đau cơ xương khớp

Như vậy, có thể thấy chỉ có một số ít tài liệu công bố về thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của cây muồng lùn nhưng còn hạn chế

Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của cây muồng lùn

18

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Phần trên mặt đất cây Muồng lùn được thu hái Hòa Bình

- Thu hái mẫu có hoa, quả làm tiêu bản để thẩm định tên khoa học

- Thu hái bộ phận trên mặt đất của cây Muồng lùn tại Hòa Bình rửa sạch, sấy khô ở 50oC (đạt độ ẩm 12%), thái nhỏ, đặt trong 2 lớp nilon kín làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học

vật thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và địa điểm nghiên cứu

❖ Thiết bị, dụng cụ

- Các máy đo các loại phổ: cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực, đo độ pH…

- Bình chạy sắc kí lớp mỏng, cột sắc ký, bếp điện, đèn tử ngoại

- Tủ sấy

- Máy ly tâm

- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

- Các dụng cụ thủy tinh thông thường có tại phòng thí nghiệm

- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức)

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout (Đức)

- Máy đo quang MINI 1240SHIMAZU(Nhật)

- Máy nghiền đồng thể

19

- Máy ly tâm lạnh Sartorius(Đức)

❖ Hóa chất nghiên cứu

- Ethanol 960

- Dichloromethan(DCM), n-hexan, etyl acetat( EtOAc), n-butanol

- Nitroblue tetrazolium (NBT), xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 13 mg protein/ml), xanthin ≥ 99% (Sigma Aldrich)

- Quercetin (90,32%, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

- Na2HPO4, KH2PO4, HCl, NaOH, dimethyl sulfoxid (Merck)

❖ Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm: Bộ môn Dược học cổ truyền - Đại học Dược Hà Nội

- Thử tác dụng sinh học tại Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Nghiên cứu hóa học: Viện hóa sinh biển - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Điều chế mẫu nghiên cứu

Bộ phận trên mặt đất của cây muồng lùn sau khi thu hái ngâm chiết hoạt chất bằng ethanol 960 thu được dịch chiết ethanol Gộp các dịch chiết mang cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol toàn phần của muồng lùn Sau đó, hòa tan cao ethanol toàn phần với nước rồi lắc lần

20

lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần n-hexan,

dichloromethan, ethyl acetat, n-butanol theo tỷ lệ 1:1, lặp lại 3 lần Các phân đoạn n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat, n-butanol và phân đoạn nước còn lại sau công đoạn lắc với n-butanol đem cất quay chân không dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 5 cao tương ứng với từng phân đoạn

21

Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn loài Chamaecrista pumila Lamk

Dược liệu

Dịch chiết ethanol

Cất quay áp suất giảm, sấy

Cao phân đoạn

dichloromethan

Dịch còn lại

dichloromethan, lắc, gạn Cất quay áp suất giảm, sấy

Cao phân đoạn ethyl

Ethyl acetat, lắc, gạn Cất quay áp suất giảm, sấy

Cao phân đoạn

n-butanol

Dịch còn lại

n-butanol, lắc, gạn Cất quay áp suất giảm, sấy

Cất quay áp suất giảm, sấy Cao nước

Cao ethanol

Phân tán với nước lắc phân đoạn với n-hexan

22

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết cây muồng lùn

2.2.2.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp dọn gốc tự

do của các phân đoạn dịch chiết cây muồng lùn:

Phương pháp dọn gốc tự do DPPH:

Nguyên tắc

DPPH là gốc tự do bền, dung dịch màu tím, có bước sóng hấp thu cực đại 517

nm DPPH dùng để thực hiện các phản ứng mang tính sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết các dược liệu.Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ= 517 nm

Cơ chế: Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển

gốc tự do sang trạng thái ổn định Như vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó

sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm

sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek, Mĩ) Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng thay dung dịch gốc bằng dung dịch methanol

Tác dụng dọn gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:

dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình log(inhibitor) vs

normalized response trên phần mềm Graphpad5.0

Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD

Đánh giá tác du ̣ng dọn gốc tự do SOD của mẫu thử theo quy trình được

mô tả bởi Beauchamp C và cộng sự,với một số thay đổi cho phù hơ ̣p với điều kiện thí nghiê ̣m[9] Phản ứng được thực hiện trên đĩa 96 giếng Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm:

+ 40 µl đệm carbonat pH 10,2 (50 mM) có chứa EDTA 0,1 mM

24

+ 20 µl mẫu thử hoặc chất đối chiếu quercetin với các nồng độ thích hợp + 100 µl dung dịch xanthin 200 µM (pha trong đệm carbonat)

+ 20 µl dung dịch NBT 100 µM (pha trong đệm carbonat)

+ 20 µl enzym xanthin oxidase (nồng độ được điều chỉnh để tốc độ thay đổi mật độ quang OD khoảng 0,016/phút)

Theo dõi động học của phản ứng bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 560 nm với tần suất 30 giây/lần trong thời gian 5 phút Song song với các giếng thử, bố trí các giếng chứng, trong đó 20 µl dung dịch thử hoặc chất đối chiếu được thay bằng dung dịch đệm carbonat Tỷ lệ

ức chế gốc tự do SOD của mẫu thử tại một nồng độ được tính theo công thức:

% ức chế SOD = (ΔODchứng/phút –ΔODthử/phút) x 100/ΔODchứng/phút

Xử lý kết quả

Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của mẫu thử và chất đối chiếu dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế tại các nồng độ khác nhau (5-6 nồng độ/mẫu), sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình phù hợp trên phần mềm Graphpad Prism 5

2.2.1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Sau khi tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học trên các phân đoạn cao chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau chiết xuất từ mẫu nghiên cứu, lựa chọn phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất, sử dụng phân đoạn đó để phân lập hoạt chất

Phân lập các hoạt chất chính: Sử dụng chủ yếu 2 nhóm phương pháp là

chiết xuất và sắc ký với sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Các phương pháp sắc ký

- Sắc ký cột: sử dụng phương pháp nhồi cột ướt với sắc ký hấp phụ Nguyên tắc: sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất

25

rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh

Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo

Sắc ký lớp mỏng: được sử đụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình rửa giải Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường và pha đảo

Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Quá trình chạy sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau

Các chất trên sắc ký đồ được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu đặc trưng

Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng việc phân tích các đặc điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực) và kết hợp giữa các phương pháp đo phổ: H1 NMR, C13 NMR, DEPT, HSQC

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết cây muồng lùn

- Tiến hành: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng

paracetamol (PAR), dùng chất đối chiếu dương là silymarin [21],[61]

- Súc vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe

mạnh, trọng lượng 20±2g do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Súc vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ về thức ăn, nước uống, nhiệt độ phòng, chiếu sáng tự nhiên

* Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô (8 động vật/lô):

Lô 1 (chứng sinh lý): uống nướ c cất hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng

26

Lô 2 (chứng bệnh): uống nướ c cất hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng

Lô 3 ( chứng dương): uống sylymarin liều 100 mg/kg cân nặng

Lô 4 (MTP 1): uống cao Muồng toàn phần với liều hàng ngày 250 mg/kg cân nặng

Lô 5 (MTP 2): uống cao Muồng toàn phần với liều hàng ngày 500 mg/kg cân nặng

Lô 6 (MET 1): uống cao Muồng phân đoạn EtOAc với liều hàng ngày

* Thông số đánh giá

Hoạt độ AST, ALT huyết thanh

Hoạt đô ̣ AST, ALT huyết thanh đươ ̣c đi ̣nh lươ ̣ng trên máy sinh hóa bán

tự đô ̣ng TC 3300 Plus, sử du ̣ng bô ̣ kit và quy trình đi ̣nh lượng tương ứng từ Biosystems (Tây Ban Nha)

Hàm lượng MDA trong gan

Định lượng MDA trong dịch nghiền đồng thể gan theo phương pháp

được mô tả bởi Wojciech [69]

Mẫu gan được nghiền đồng thể trong dung dịch KCl 0,15M theo tỷ lệ 1:10 (w/v) ở nhiệt độ 0-4oC Sau khi ly tâm (10000 vòng/phút trong 10 phút,

0oC), tách phần dịch nổi để định lượng MDA Hỗn hợp phản ứng bao gồm:

Ha ̀ m lượng GSH trong gan

Hàm lươ ̣ng GSH trong gan đươ ̣c đi ̣nh lươ ̣ng bằng thuốc thử Ellman[67] Mẫu gan được nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (100 mM,

pH 8) theo tỷ lệ 1:10 (w/v) ở nhiệt độ 0-4oC.Sau khi ly tâm (10000 vòng/phút trong 10 phút, 0oC), trộn đồng lượng phần dịch nổi với dung dịch acid sulfosalicylic 4%, để lắng 1 giờ ở nhiệt độ 0-4oC, sau đó ly tâm để loại bỏ tủa protein Phần dịch trong sau ly tâm được sử dụng để định lượng GSH Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm: 20µl dịch nghiền đồng thể đã loại protein,160µl đệm photsphat và 20 µl dung dịch 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 10 mM Đem đo quang ngay ở bước sóng 412 nm Hàm lượng GSH trong gan (µmol/g mô) được xác định dựa trên giá trị mật độ quang đo được,

sử dụng hệ số hấp thụ phân tử 13,6×103 M-1 cm-1

Ha ̀ m lượng SOD trong gan

Định lượng hoạt tính SOD trong dịch nghiền đồng thể gan theo quy trình được mô tả bởi Takada Y và cộng sự với một số thay đổi[68]

Mẫu gan được nghiền đồng thể trong dung dịch đệm carbonat (50 mM,

pH 10,2) theo tỷ lệ 1:10 (w/v) ở nhiệt độ 0-4oC Sau khi ly tâm (10000 vòng/phút trong 20 phút), 0oC), tách phần dịch nổi để định lượng SOD Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm: 20µl dịch nghiền đồng thể (được pha loãng bằng đệm carbonat với tỷ lệ thích hợp) hoặc dung dịch đệm carbonat (đối với giếng chứng), 140µl dung dịch xanthin 142 mM (pha trong đệm

28

carbonat pH 10,2), 20µl dung dịch xanh Nitrotetrazolium clorid (NBT) và 20µl xanthin oxidase (nồng độ được điều chỉnh để tốc độ thay đổi mật độ quang của giếng chứng khoảng 0,016/phút) Theo dõi động học của phản ứng bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 560 nm với tần suất

20 giây/lần trong thời gian 3 phút ở nhiệt độ 25oC Tỷ lệ ức chế gốc tự do superoxid của mẫu thử được tính theo công thức:

% ức chế superoxid = (ΔODchứng/phút – ΔODthử/phút) x 100/ ΔODchứng/phút Hàm lượng SOD trong gan được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hoạt độ (U)/mg mô, trong đó một đơn vị hoạt độ SOD được định nghĩa là lượng enzym cần để ức chế 50% tốc độ khử NBT

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu – đánh giá kết quả

- Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học

theo thuật toán thống kê t–test Student và test trước–sau

- Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn ( = X  SE).Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi, p< 0,05

29

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thành phần hóa hoạc của dịch chiết cây Muồng lùn theo định hướng tác dụng chống oxy hóa

3.1.1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của cao các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp dọn gốc tự do:

3.1.1.1 Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do DPDH

Tiến hành như mô tả trong mục 2.2.2.1 thu được các kết quả như sau:

Bảng 3.1 Kết quả tác dụng dọn gốc tự do DPDH của mẫu thử

muồng lùn và chất điếu chiếu

Cao phân đoạn Ethyl acetat

Cao phân đoạn

CH 2 Cl 2

Cao phân đoạn n-butanol

Cao nước

- Cao chiết phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao

nhất (IC50= 9,98 μg/ml), cao chiết phân đoạn n-Butanol có hoạt tính dọn gốc

tự do DPPH thấp nhất (IC50= 300 μg/ml)

3.1.1.2 Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do SOD

Cao phân đoạn Ethyl acetat

Cao phân đoạn

CH 2 Cl 2

Cao phân đoạn n-butanol

Cao nước

0.25 12,23

Giá trị IC50 được xác định bằng cách đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành gốc tự do SOD tại các nồng độ thích hợp trong khoảng 0,25 – 100 µg/ml Kết quả được biểu diển trong bảng 3.4