Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của cây ban (hypericum hookerianum wight arn )thu hái tại sapa, lào cai

Các loài thuộc chi Hypericum đã được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian làm thuốc chữa thuốc chống virus, trị bệnh gan, thuốc chống viêm, kháng khuẩn, rắn cắn, hoàng đản, tiêu hóa ké

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ LAN ANH

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA CÂY BAN (HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN.) THU

HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ LAN ANH

Mã sinh viên: 1301006

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA CÂY BAN (HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN.) THU

HÁI TẠI SAPA, LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận, em xin được gửi lời cảm

ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển- Trưởng bộ môn Dược học cổ

truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, DS Nguyễn Thị Hải học viên cao học

CH21, đã tận tình hướng dẫn, bảo ban, truyền đạt lại những kiến thức quý báu để

em hoàn thành được khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phương Thiện Thương- Trưởng

Khoa hóa phân tích và tiêu chuẩn, Viện dược liệu, NCS Vũ Duy Hồng cùng các

anh chị, các bạn công tác và làm đề tài tại Viện dược liệu, các thầy cô công tác tại

bộ môn Dược học cổ truyển đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người

luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ em trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Hoàng Thị Lan Anh

MỤC LỤC

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỒNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HYPERICUM 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3 Tác dụng sinh học 7

1.1.4 Công dụng 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN 10

1.2.1 Thực vật học 10

1.2.2 Thành phần hóa học 12

1.2.3 Tác dụng sinh học 14

1.2.4 Công dụng 16

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG 17

2.2 THIẾT BỊ, DUNG MÔI, HÓA CHẤT 17

2.2.1 Thiết bị 17

2.2.2 Dung môi hóa chất 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 20

3.1 KẾT QUẢ 20

3.1.1 Chiết xuất: 20

3.1.2 Phân lập các thành phần hóa học 20

3.2 BÀN LUẬN 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

KẾT LUẬN 35

KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ddd Double of double of doublet

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO-d 6 Dimethyl sulfosid – d 6 - (CD3)2SO

ESI-MS Phổ khối lượng ion hóa tia điện

EtOAc Ethyl acetat

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bụi cây, hoa và qu H hookerianum 11

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất á phân đoạn 20

Hình 3.2 Sắ ý đồ cắn ethyl acetat (h III) ở á điều ki n quan sát 21

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat c a

loài ban (H hookerianum Wight & Arn.)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Hypericum là một chi lớn với 469 loài [48] Ở Việt Nam đã ghi nhận được 17 loài Các loài thuộc chi Hypericum đã được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian làm thuốc chữa thuốc chống virus, trị bệnh gan, thuốc chống viêm, kháng khuẩn, rắn cắn,

hoàng đản, tiêu hóa kém, đầy bụng, ho, [1], [3],[24] Theo các tài liệu đã công bố

trước đây, thành phần hóa học chủ yếu của chi Hypericum là naphthodianthron,

bianthraquinon, phloroglucinol, xanthon, flavonoid và các hợp chất khác [26] Các loài thuộc chi này đã được nghiên cứu, đánh giá nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chống trầm cảm [26], tác dụng kháng khuẩn [25], tác dụng chống oxy hóa [36],…

Loài ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.) thuộc chi Hypericum phân

bố chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan và phía Bắc Việt Nam [48] Ở Trung

Quốc, loài H hookerianum Wight &Arn được dùng để điều trị viêm bàng quang [5],

ở Ấn Độ được dùng để điều trị các vết bỏng, làm lành các vết thương [39], điều trị trầm cảm, kích thích thần kinh trung ương [12] Tại Việt Nam, đồng bào miền núi

thường lấy lá cây H hookerianum vò ra ngâm nước, để lắng lấy dịch trong rửa mắt

cho gia cầm đau mắt [3] tuy nhiên loài cây này vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong

y học cổ truyền nước ta Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu công bố về thành

phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.) như tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan [19], tác dụng chống virus

[37], tác dụng kháng khuẩn [38], tác dụng chống ung thư [44],…

Trong nước, nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải (2017) về loài Hypericum hookerianum Wight & Arn đã bước đầu nghiên cứu về đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học, phân lập được 3 hợp chất là epicatechin, piceatanol, 3,8’’-biapigenin [4] Nghiên cứu của Đỗ Thị Thu (2017) tiếp tục phân lập thành phần hóa học của loài

ban (H hookerianum) đã phân lập được thêm 2 hợp chất mới là astilbin và quercitrin

[7]

Dựa vào những cơ sở trên, nhằm nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của

loài ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.), đề tài “Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của cây ban (Hypericum hookerianum Wight & Arn.) thu hái tại Sapa,

Lào Cai” được thực hiện với 2 mục tiêu như sau:

2

1 Tiếp tục phân lập một số hợp chất từ phần trên mặt đất của loài ban

(Hypericum hookerianum Wight & Arn)

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Vị trí của chi Ban Hypericum trong phân loại thực vật của Armen Takhtajan

được phân loại như sau [11]:

Thực vật bậc cao: Cormobionta

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyda)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dilleniidae)

Liên bộ Đỗ Quyên (Ericanae)

Bộ Ban (Hypericales)

Họ Ban (Hypericaceae)

Chi Ban (Hypericum) Lưu ý: Họ Ban ở Việt Nam có hai chi là Cratoxylum và Hypericum Họ Ban có đặc điểm thực vật rất gần với họ Măng Cụt (họ Clusiaceae) nhưng cây không có mủ

vàng nên trong hệ thống phân loại Takhtajan (1987) các chi này để chung trong họ

Măng Cụt Nên một số sách xuất bản trước các cây thuộc chi Hypericum có thể được sắp xếp trong họ Clusiaceae [2]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây bụi hoặc nửa bụi, sống lâu năm, không có lông hoặc có lông đơn giản Lá mọc đối (hoặc vòng) không cuống hoặc cuống ngắn, gân lông chim hoặc chân vịt (hiếm khi rẽ đôi), mép nguyên hoặc có tuyến ở mép lá Cụm hoa xim, hoa lưỡng tính, hoa hình sao hoặc hình cốc Đài 5, tiền khai hoa năm điểm, hiếm khi bốn, xếp chữ thập, không đều hoặc đều, tràng liền một phần hoặc rời Tràng 4 hoặc 5, xếp xoắn ốc, màu vàng hoặc vàng chanh (hiếm khi trắng) mặt dưới thường màu nhạt, hoặc có gân

đỏ, không rụng hoặc sớm rụng sau nở hoa, thường không đối xứng Nhị hoa chùm 4 hoặc 5, rời và dính vào họng tràng, có thể dính với nhau thành 3 hoặc 4 bó nhị dính vào đài hoặc không theo quy tắc hoặc không dính thành cụm chỉ nhị, không rụng hoặc rụng sớm, mỗi bó nhị có thể lên đến 70 nhị, chỉ nhị mảnh, rời nhau hoặc dính 2/3, bao phấn nhỏ dính lưng hoặc có thể dính gốc, mở dọc, có tuyến liên kết, nhị vô tính bị khuyết (rất hiếm) Bầu nhụy 3-5 khoang, đính noãn trung trụ hoặc chỉ một khoang với

4

2-3-5 hợp điểm đính noãn bên, mỗi hợp điểm có từ 2 đến nhiều noãn, thân noãn 2 hoặc 3-5, rời nhau hoặc đính một phần đến hoàn toàn, núm nhụy nhỏ, bè hoặc không Quả nang chẻ ô hoặc hiếm khi tự mở, vỏ quả thường chứa dầu Hạt nhỏ, hình chum hoặc có cánh hẹp, vỏ hạt hình dạng đa dạng, không có áo hạt (rất hiếm khi có mồng) Cây mầm nhọn, thẳng với một lá mầm nhọn [53]

1.1.1.3 Các loài thuộc chi Hypericum:

Chi Hypericum là một chi lớn, gồm 469 loài khác nhau.Theo Thực vật chí Trung Quốc, ở Việt Nam chi Hypericum có 12 loài [53] Tuy nhiên, theo báo cáo của Viện Dược liệu, chi Hypericum ở Việt Nam còn có thêm 5 loài nữa, tổng cộng là 17 loài [6] Ngoài ra, tại Việt Nam còn có loài H perforatum L (Cây ban âu, cỏ thánh John)

đã được nhập nội và đưa vào trồng trọt tại các tỉnh miền núi phía bắc nước ta từ năm

2004 Ban âu được sử dụng bộ phận trên mặt đất của cây điều trị bệnh trầm cảm, ngoài

ra còn được dùng làm thuốc trị bệnh gan, thuốc chống viêm, kháng khuẩn, chữa bỏng,

chống virus, chống nghiện rượu [8]

1.1.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của chi Hypericum gồm 5 nhóm chính là

naphthodianthron, bianthraquinon, phloroglucinol, xanthon, flavonoid và các hợp chất khác [26]

1.1.2.1 Nhóm naphthodianthron và bianthraquinon

Có khoảng 12 dẫn chất thuộc nhóm naphthodianthron và bianthraquinon được

phân lập từ chi Hypericum [26] Đây là nhóm chất phổ biến và có hoạt tính sinh học

cao, điển hình là hypericin (Ia) và hyperforin (Ib) được phân lập từ cây H perforatum

Hoạt chất này có tác dụng chống trầm cảm, chống ung thư [24]

1.1.2.2 Nhóm phloroglucinol

5

Các hợp chất thuộc nhóm phloroglucinol được tìm thấy ở chi Hypericum rất đa

dạng, với 170 dẫn chất, được chia thành 5 nhóm: dẫn xuất của hyperforin, các sampsonion, các dẫn xuất acylphloroglucinol spirocyclic, các dẫn xuất rottlerin và các dẫn chất đơn giản của phloroglucinol…[26] Trong đó được nghiên cứu và ứng dụng trong y học nhiều nhất là nhóm dẫn xuất của hyperforin

Hiện tại có khoảng 46 dẫn chất của hyperforin được phân lập từ 4 loài H papuanum, H scabrum, H sampsonii, H perforatum [26] Trong đó đáng chú ý nhất

là 2 hợp chất adhyperforin (IIa) và hyperforin (IIb) được phân lập từ loài H

perforatum có tác dụng chống trầm cảm do khả năng ức chế mạnh mẽ sự hấp thu

dopamin, serotonin, và noradrenalin [10]

1.1.2.3 Nhóm xanthon

Các dẫn chất xanthon rất phong phú, có khoảng 126 chất đã được phân lập từ

các loài thuộc chi Hypericum như: H ellipticum, H chinense, H scabrum, H beanii,

H perforatum, H geminiflorum, H sampsonii… Trong đó loài H chinense là nguồn

cung cấp xanthon nhiều nhất với khoảng 48 dẫn chất xanthon đã được phân lập từ loài này [26]

Hai dẫn chất xanthon đã được phân lập là: 1,3dihydroxy5 methoxyxanthon

-4-sulfonat (IIIa) và 1,3-dihydroxy-5-O-β-D-glycopyranosylxanthon 4-sulfonat (IIIb),

từ H sampsonii Cả 2 hợp chất này đều có biểu hiện độc tính trên dòng tế bào ung thư

P388 [26]

Ngoài 4 nhóm dẫn xuất chính nêu trên, chi Hypericum còn có một số nhóm chất

khác như terpenoid, coumarin, chromon [26]

Hơn 20 hợp chất từ vỏ thân loài H riparium đã được phân lập trong đó có 5

dẫn xuất của biscoumarinyl, 2 dẫn xuất của flavon, 2 dẫn xuất của steroid còn lại là

các dẫn xuất của este, acid, ether : 7,7’ Dihydroxy6,6’ biscoumarin (Va), 7,7’ Dihydroxy-8,8’ -biscoumarin (Vb), 7-Methoxy-6,7’ -dicoumarinyl ether (Vc), 2’ - Hydroxy-5’ -(7-methoxycoumarin-6’’-yl)-4’- methoxyphenylpropanoic acid (Vd), 7,7’ -Dimethoxy-6,6’ -biscoumarin (Ve), 2’–Methoxyflavon, 3’–Methoxyflavon, Stigmast-

-4-en-3-on, Ergosta-4,6,8,22-tetraen-3-on

7

Trong đó các hợp chất (Va), (Vc), (Vd), (Ve) có tác dụng ức chế đáng kể trên

dòng tế bảo ung thư tuyến tiền liệt của con người PC-3 và dòng tế bào ung thư đại

tràng HT-29 ( thử nghiệm in vitro) Chưa tìm thấy tác dụng gây độc đối với tế bào

bình thường

1.1.3 Tác dụng sinh học

1.1.3.1 Tác dụng chống trầm cảm

Hypericin phân lập từ H perforatum là hoạt chất điển hình được sử dụng rộng

rãi để điều trị chứng rối loạn trầm cảm Cơ chế tác dụng của hợp chất này là ức chế enzym monoaminooxidase (MAO), ức chế thu hồi serotonin, norepinephrin, dopamin, điều hòa recepter serotonin [26]

Dẫn xuất của nhóm phloroglucinol là hyperforin cũng có tác dụng ức chế thu hồi serotonin (5-HT), dopamin (DA), noradrenalin (NA), gamma aminobutyric acid (GABA) và L-Glutamat do đó hoạt chất này cũng có tác dụng chống trầm cảm và một

gợi ý cho việc tìm kiếm nguyên liệu sản xuất thuốc tác dụng trên hệ thần kinh [46]

Ngoài ra các dẫn xuất thuộc nhóm flavonoid, bao gồm rutin được phân lập từ

H perforatum có tác dụng trên mô hình thử nghiệm chống trầm cảm FST (forced swimming test) [52] Quercetin phân lập từ H hircinum có tác dụng ức chế chọn lọc

monoamin oxidase (MAOA có ở não bộ) trong thí nghiệm in vitro với giá trị IC50 là 0,010 µM [17]

1.1.3.2 Hoạt tính gây độc

8

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, một số hợp chất được phân lập từ chi Hypericum

có khả năng gây độc trên tế bào ung thư, những hợp chất này là những chất tiềm năng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư

Sáu dẫn xuất thuộc nhóm polycyllic acylphloroglucinol được đặt tên từ

hyperisampsin H–M (từ 1 đến 6) phân lập từ loài H sampsonii, trong đó

hyperisampsin H–M (3, 4 và 6) có tác dụng gây độc một số tế bào ung thư người,đặc biệt là hyperisampsins H–M (3) có tác dụng gây độc trên tế bào ung thư bạch cầu [21]

Hyperisampsins H–M (3)

1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn

Trong một nghiên cứu thử nghiệm cao toàn phần của 50 loài khác nhau thuộc

chi Hypericum bằng cách thử nghiệm độ nhạy cảm trên đĩa Kirby-Bauer với vi khuẩn Paenibacillus (vi khuẩn Gram (+) gây bệnh trên ong mật) Kết quả cho thấy, 14 loài được xác định là có hoạt tính ức chế Paenibacillus Trong đó sáu hợp chất là:

hyperforin, uliginosin B, uliginosin A, 7-epiclusianone, albaspidin AA và drummondin

E có hoạt tính kháng khuẩn ức chế Paenibacillus với MIC dao động từ 0,168-220 μM

Chi Hypericum chứa các dẫn xuất flavonoid, xanthon, phloroglucinol, và

bezonephenon là những hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa tốt, được chứng minh qua nhiều thử nghiệm

Bốn dẫn xuất xanthon được phân lập từ loài H styphelioides là:

3,5-dihydroxybenzophenon-4-α-D-glucosid (1),

1,3,5-trihydroxy-2-(2′,2′-dimethyl-4′-isopropenyl)cyclopentanylxanthon(2), 5-O-demethylpaxanthonin (3) và (3-methylbutanoyl) phloroglucinol (4) được đem thử tác dụng chống oxy hóa trên 2

3-geranyl-1-mô hình thí nghiệm là TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity) và CL

(chemiluminescence) Kết quả cho thấy hai xanthon (2) và (3) có tác dụng chống oxy

hóa tương đương với 2 chất chống oxy hóa là quercetin và rutin, trong khi hai xanthon

còn lại (1) và (4) có tác dụng kém hơn [16]

Năm dẫn xuất thuộc nhóm benzophenon và bốn dẫn xuất thuộc nhóm flavonoid

là quercetin, quercitrin, isoquercetin và 3,8´´-biapigenin được phân lập từ loài H thasium Griseb Chín hoạt chất này được thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng mô

hình CL (chemiluminescence) Kết quả cho thấy 2 dẫn xuất benzophenon ( A và B) có tác dụng ức chế quá trình sản xuất gốc oxy hóa ngoại bào, còn quercetin, isoquercetin

và 3,8 '' – biapigenin có tác dụng ức chế quá trình sản xuất gốc oxy hóa nội bào [36]

1.1.4 Công dụng

Trên thế giới, đặc biệt ở Ấn Độ và châu Âu, các loài Hypericum đã được sử

dụng để chữa bệnh trong dân gian từ trên 2000 năm trước để điều trị chứng lo âu và

kháng khuẩn, chữa bỏng, chống nghiện rượu [24]

Viện Dược liệu (Bộ Y tế) đã chủ trì đề tài cấp Bộ “Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B” Trong đó nghiên cứu

chế phẩm flavonoid chiết xuất từ lá cây ban tròn (H patulum Thunb ex Murray) làm

thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B được gọi là “cao ban tròn” (còn gọi là bột hypatin), kết quả thử các tác dụng dược lý của bột hypatin được báo cáo các tác dụng bảo vệ gan, ức chế quá trình xơ gan, chống oxy hóa, chống viêm, lợi mật [1]

H japonicum dùng để trị rắn cắn [3] Ở Trung Quốc thường dùng để trị viêm

gan cấp, mạn, giai đoạn sớm của xơ gan cổ chướng, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm amygdal, viêm ruột thừa Ở Việt Nam dùng để trị bệnh sởi, sâu răng, hôi mồm, rắn cắn, hoàng đản, tiêu hóa kém, đầy bụng, ho [3]

H ascyron L được sử dụng để trị bệnh da, lậu, điều kinh, cầm máu, trừ phong

thấp, trị đòn ngã tổn thương, quả và hạt được phối hợp với các vị thuốc khác để trị bệnh về da và điều hòa kinh nguyệt [3]

H sampsonii dùng để điều trị kinh nguyệt không đều, chảy máu cam, thổ

huyết, đái ra máu, phong thấp đau nhức, lỵ, ho, ra mồ hôi trộm, nhọt sưng đinh độc, rắn cắn, chốc đầu, bỏng nước sôi [3]

H.nepaulense ở Vân Nam Trung Quốc cây được dùng để trị trẻ em cam tích,

lỵ, loét miệng, hôi răng, trẻ em viêm gan hoàng đản [3]

Tại Việt Nam, đồng bào miền núi thường lấy lá cây H hookerianum vò ra

ngâm nước, để lắng lấy dịch trong rửa mắt cho gia cầm đau mắt [3]

1.2 TỔNG QUAN VỀ HYPERICUM HOOKERIANUM WIGHT & ARN

1.2.1 Thực vật học

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật

H hookerianum Wight & Arn thuộc loại cây bụi cao đến 1,75m, bụi cây có

đỉnh tròn, cành thẳng đứng có nhiều nhánh, phần thân non có 4 cạnh, trong đó có 2 cạnh sắc hơn, chia đốt dài 1,2 đến 6cm, mỗi đốt không dài quá độ dài của lá Cuống

lá dài 1-4mm, phiến lá thuôn dài hình lưỡi mác hoặc hình trứng, mặt dưới lá màu xám

11

hoặc lam nhạt, lá có các vệt hoặc chấm nhỏ thưa dần từ giữa ra rìa lá Phiến lá có từ 3 đến 4 đôi gân chính, không nhìn thấy gân cấp 3 hình lưới, gân lá tạo các hình nêm nhọn hoặc hình trái tim chóp nhọn Ra hoa từ tháng 4 đến tháng 7 Cụm hoa có từ 1 đến 5 hoa mọc ở đầu cành, lá bắc hình lưỡi mác hay thuôn nhọn, cách đài hoa 3-16mm, rụng sớm Hoa có đường kính 3-6cm, hình chén, nụ hoa hình trứng hoặc hình cầu Đài hoa xếp vòng hình trứng ngược hoặc hình thìa, kích thước 5-10×4-8mm, trên đài hoa có những đường gân rõ nét rất đặc trưng, mép đài hoa có răng cưa nhỏ, đều Cánh hoa màu vàng kim đậm đến nhạt, dài gấp 3 lần đài hoa, mép nhẵn, hình trứng đến tròn Nhị hoa xếp thành bó, mỗi bó có 60-80 nhị, nhị dài nhất 5-9mm, độ dài trung bình bằng 0,25-0,35 lần độ dài cánh hoa Bầu nhụy hoa hình trứng, kích thước 5-7×4-8mm, vòi nhụy dài 2-4mm, bằng 0,35-0,7 lần độ dài bầu nhụy, cong dần hướng ra ngoài Quả hình tròn hoặc hình oval, kích thước 0,9-1,7 cm × 7-12 mm Hạt màu nâu đỏ sẫm, kích thước 0,7-1mm, không có gờ, vỏ ngoài có các đường mắt lưới

[30], [37]

1.2.1.2 Phân bố

Hypericum hookerianum Wight & Arn là một loài thuộc chi Hypericum, phân

bố ở Nam, Đông Nam Trung Quốc, Bangladesh, Bhutan, Đông Nam và Nam Ấn Độ, Myanmar, Nepal, Bắc Thái Lan và Bắc Việt Nam [39] Ở Việt Nam loài cây này được gọi là ban hooker, phân bố ở Sapa (Lào Cai) [3], [5]

Hình 1.1 ụi â , ho v qu H hoo ri num Wight & Arn

12

1.2.2 Thành phần hóa học

 Trên thế giới

Thành phần hóa học của H hookerianum Wight & Arn chưa được nghiên cứu

nhiều trên thế giới Theo Wilairat R và Manosroi J có 5 hoạt chất được phân lập từ

H hookerianum Wight & Arn là: 5-Hydroxy-2 methoxyxanthon (VIa),

2-hydroxy-3-methoxyxanthon (VIb), trans-kielcorin (VIc), 4-hydroxy-3-metoxyphenyl ferulat (VId) và Acid 3 beta-O-caffeoylbetulinic (VIe) [42]

Các hợp chất trên đã được thử nghiệm chống lại sự phát triển của ba dòng tế bào ung thư người là MCF-7, NCI-H460 và SF-268 Kết quả cho thấy các hợp chất

(VId) và (VIe) thể hiện các dụng ức chế đáng kể 3 dòng tế bào ung thư này.Hợp chất (VIc) có ác dụng kém hơn và hai hợp chất còn lại là (VIa) và (VIb) có tác dụng kém nhất Ngoài ra các hợp chất (VId) và (VIe) còn có tác dụng xúc tác cho phản ứng

mitogenic giữa tế bào lympho với hemoagglutinin, với giá trị IC50 lần lượt là 26,1 ± 3,6 và 40,8± 4,9 µM [42]

13

 Tại Việt Nam:

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải (2017) đã bước đầu nghiên cứu loài H

hookerianum Wight & Arn thu hái tại Sa Pa và thu được các kết quả sau:

 Định tính được các nhóm chất hữu cơ chính trong lá, hoa, quả của loài ban

(H.hookerianum Wight & Arn.) gồm: flavonoid, coumarin, saponin, tanin, đường khử

 Định tính được các nhóm chất hữu cơ chính trong thân loài ban

(H.hookerianum Wight & Arn.) gồm: flavonoid, saponin, tanin, đường khử

 Tiến hành phân lập, xác định đươc cấu trúc của 3 hợp chất là epicatechin, 3,8’’-biapigenin và piceatannol trên phân đoạn ethyl acetat [4]

VIe

14

Nghiên cứu của Đỗ Thị Thu (2017) tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học

của loài ban (H hookerianum Wight & Arn.) đã phân lập được thêm 2 hợp chất trên

phân đoạn ethyl acetat là astilbin và quercitrin [7]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Trong hai thập kỷ gần đây, đã có một số công bố về nghiên cứu tác dụng dược

lý của H hookerianum trên các tạp chí khoa học Một số nghiên cứu cho thấy loài H hookerianum có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng virus, ức chế tế bào ung

thư, kháng khuẩn, chữa lành vết thương, tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan

Nghiên cứu của H Raghu Chandrashekhar và cộng sự sử dụng cao chiết methanol của lá, rễ, hoa và phần trên mặt đất của cây để khảo sát tác dụng chống oxy

hóa in vitro bằng 8 phương pháp khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 4 cao

chiết được thử nghiệm đều có khả năng chống oxy hóa Tuy nhiên, mỗi cao chiết có

khả năng chống oxy hóa khác nhau Sau thử nghiệm in vitro, cao chiết methanol của

lá cho thấy có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất trên tất cả các phương pháp, vì vậy

15

mẫu này được tiếp tục đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vivo trên chuột đực albino

đã bị gây độc tế bào gan bằng CCl4 sau đó cho chuột uống cao chiết methanol của lá

H hookerianum với các liều khác nhau có đối chứng bằng silymarin, phân tích nồng

độ của LPO, SOD và CAT trong huyết thanh và dịch ép gan để đánh giá Kết quả cho

thấy cao chiết lá H hookerianum có tác dụng chống oxy hóa in vivo mạnh [19]

1.2.3.2 Tác dụng chống virus

P.Vijayan và cộng sự (Đại học Dược JSS, Ootacamund, Tamil Nadu, Ấn Độ)

nghiên cứu cho thấy cao chiết methanol phần trên mặt đất của H hookerianum có tác dụng kháng virus đối với Herpes simplex virus type I (HSV-1) ở nồng độ không gây độc với tế bào chủ Theo đó, nồng độ ức chế 50% virus (IC50) của cao chiết chiết bằng phương pháp Soxhlet là 50μg/ml [37]

1.2.3.3 Khả năng gây độc tế bào

Vijayan P và cộng sự đã chiết bằng các dung môi khác nhau đối với các bộ

phận khác nhau của cây H hookerianum Wight & Arn Các dịch chiết đó được sử

dụng cho nhiều phương pháp thử nghiệm đồng thời để đánh giá khả năng sống của một số dòng tế bào bình thường và tế bào ung thư thông qua trị số IC50 Kết quả cho

thấy cả 3 loại dịch chiết methanol của lá, thân cây và phần trên mặt đất của H hookerianum Wight & Arn đều có tác dụng gây độc tế bào đối với cả dòng tế bào

bình thường và ung thư [45]

1.2.3.4 Tác dụng chống ung thƣ

Nghiên cứu của Santoshkumar H Dongre (Ấn Độ) và cộng sự cho thấy cao

chiết methanol của H hookerianum được làm khô ở nhiệt độ 40-50o

C dưới áp suất thấp được uống liều 100 và 200mg/kg thể trọng mỗi ngày 1 lần, trong 10 ngày làm tăng thời gian sống thêm trung bình lần lượt từ 18,5±0,22 đến 24,33±0,42 và 33,00±1,34 ngày trên chuột thí nghiệm được tiêm tế bào ung thư Dalton’s Lymphoma ascitic (DLA) so với nhóm chứng Thời gian sống thêm trong thử nghiệm này cũng

cho thấy tác dụng làm tăng thời gian sống thêm của dịch chiết methanol của H hookerianum tương đương với liệu pháp điều trị bằng methotrexate liều uống

3,4mg/kg thể trọng là 26,16±0,36 ngày [44]

1.2.3.5 Tác dụng lên hệ thần kinh trung ƣơng

Nghiên cứu của Pulok K Mukherjee đã khảo sát cao chiết của hai loài H patulum và H hookerianum với hai liều 200mg/kg và 400mg/kg trên các mô hình

16

động vật thí nghiệm khác nhau Sau đó nghiên cứu các thông số gồm: hoạt động tự

nhiên của chuột, thăm dò hành vi chui đầu, thử nghiệm mê lộ chữ Y, tác động đến

thời gian ngủ và theo dõi tác động trên thân nhiệt của chuột Tất cả các thử nghiệm

cho thấy dịch chiết của H hookerianum Wight & Arn làm tăng hoạt động tự nhiên

của chuột, tăng hành vi thăm dò của chuột, làm giảm thời gian ngủ của chuột được

gây ra bởi pentobarbitone Khi thử nghiệm tác dụng của các cao chiết với thân nhiệt

của chuột, kết quả cho thấy các cao chiết của H hookerianum Wight & Arn làm

giảm đáng kể thân nhiệt của chuột được gây sốt, tuy nhiên không ảnh hưởng trên

thân nhiệt bình thường Cao chiết của H patulum không có tác dụng trên thân nhiệt

chuột trong thử nghiệm này [30]

1.2.3.6 Tác dụng kháng khuẩn

Nghiên cứu của Pulok K Mukherjee và cộng sự đã dùng ba loại dung môi là

methanol, aceton và chloroform lần lượt chiết lá và thân cây tạo ra 6 cao chiết dược

liệu để thử tác dụng kháng khuẩn với 6 chủng vi khuẩn là Pseudomonas cepacia,

Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Staphylococcus aureus và

Escherichia coli Kết quả cho thấy tất cả 6 mẫu thử đều thể hiện tác dụng kháng

khuẩn, trong đó cao chiết methanol của lá và thân có tác dụng kháng khuẩn mạnh

nhất [38]

Ngoài các tác dụng trên, H hookerianum còn được biết đến có tác dụng chữa

lành vết thương trong y học cổ truyền Ấn Độ Tác dụng này đã được Pulok K

Mukherjee và cộng sự khẳng định trong nghiên cứu của mình bằng thử nghiệm dùng

hai cao chiết methanol của lá thân H hookerianum Kết quả đã khẳng định cao chiết

methanol phần trên mặt đất của H.hookerianum có tác dụng làm lành vết thương tốt,

tác dụng mạnh hơn ở nồng độ cao và cao chiết từ lá có tác dụng mạnh hơn của thân

Ngoài ra, cả hai loại cao chiết có hiệu quả tương tự với tác dụng co vết thương, thời

gian khép miệng, sức bền kéo dãn, sự tái tạo của các mô ở bề mặt vết thương [39]

1.2.4 Công dụng

Trên thế giới, loài H hookerianum Wight &Arn được dùng ở Trung Quốc để

điều trị viêm bàng quang [5], ở Ấn Độ được dùng để điều trị các vết bỏng, làm lành

các vết thương [39], điều trị trầm cảm, kích thích thần kinh trung ương [12]

Tại Việt Nam đồng bào miền núi thường lấy lá cây H hookerianum Wight &

Arn vò ra ngâm nước, để lắng lấy dịch trong rửa mắt cho gia cầm đau mắt [3]

Wight & Arn được thu hái vào tháng 6/2016 và đã được giám định tên khoa học

Nguyên liệu là phần trên mặt đất gồm thân, cành, lá, hoa, quả, được thu hái, rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô và bảo quản nơi khô ráo để làm thực nghiệm

2.2 THIẾT BỊ, DUNG MÔI, HÓA CHẤT

 Bếp cách thủy ( Memmert, WB – 14 LO)

 Cân phân tích ( Sartorius, BP – 221S)

 Cân kĩ thuật điện tử (Kern, EW – 600 – 2M)

 Tủ sấy ( Memmert, ULM 500)

 Đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm, 366nm ( Vilber lourmat, CN-15-LC)

 Bản mỏng silica gel GF254 ( Merck) tráng sẵn pha thuận, pha đảo

 Bột silicagel pha thuận cỡ hạt 40-60 µm, bột silica gel pha đảo cỡ hạt 30-50

µm, bột rây phân tử sephadex LH 20

 Cột sắc ký: các loại cột có đường kính từ 1 – 10 cm, dài từ 30-100 cm

 Hệ thống hứng mẫu tự động CF-2 Fraction Collector

 Hệ thống chấm mẫu CAMAG Linomat 5

 Bình chạy sắc ký có gờ CAMAG

 Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade

 Máy quang phổ đo UV-VIS Cary 1E

 Máy đo phổ khối MS : HP 5989B

 Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

18

2.2.2 Dung môi hóa chất

- Các dung môi công nghiệp: ethanol, methanol, n-hexan, aceton, ethyl acetat,

dichloromethane, nước cất

- Dung môi đo phổ NMR: CD3OD đạt tiêu chuẩn phân tích

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn:

Dược liệu thu hái được được rửa sạch, chia nhỏ và sấy khô ở 60oC, sau đó xay thành bột thô Bột dược liệu được đem ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng, chiết 3 lần, mỗi lần 72 giờ Dịch chiết được gộp lại và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần methanol Cao methanol được hòa trong lượng nước nóng nhất

định, sau đó chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat, n-butanol Tách riêng các dịch chiết phân đoạn, cô thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm, thu được cắn tương ứng

 Phân lập các hoạt chất chính:

Phân lập hoạt chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thuận, pha đảo và bột rây phân tử sephadex LH-20 Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn trên cột và kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được

Sắ ý ột:

Chuẩn bị cột: Chọn cột thủy tinh đường kính thích hợp ( cột có đường kính thay đổi từ 1-10 cm, chiều dài từ 30-100 cm) Chèn bông thủy tinh ở đáy cột để giữ pha tĩnh

Pha tĩnh: thường dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm, silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm, hạt sephadex LH-20

Nạp cột: Hạt silica gel được hòa cùng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải và được đổ nhẹ nhàng lên cột, mở khóa cho pha tĩnh ổn định và cho dung môi chảy liên tục Pha động rửa giải được chọn lựa dựa vào sắc ký lớp mỏng Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột hoặc mẫu phân lập được hoà tan trực tiếp với pha động rửa giải để đưa lên cột

Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

19

 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được:

Xác đinh cấu trúc của các hợp chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng) được xác định căn cứ vào tính chất hóa

lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ: phổ khối (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố trước đó

20

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, ÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Chiết xuất:

Dược liệu là loài ban (H hookerianum Wight & Arn.) được thu hái, rửa sạch,

thái nhỏ, sấy khô, sau đó xay thành bột thô Bột dược liệu được đem ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng, chiết 3 lần, mỗi lần 72 giờ Dịch chiết được gộp lại và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ khoảng 60oC thu được cao toàn phần methanol (508,03g) Cao methanol được hòa trong lượng nước cất nóng vừa đủ, sau đó

chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexan, ethyl acetat, n- butanol với thể tích thích hợp,

mỗi dung môi chiết 3 lần Tách riêng các dịch chiết phân đoạn, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ khoảng 60o

C thu được cắn tương ứng: cắn n-hexan (104,45g), cắn ethyl acetat ( 80,62g), cắn n-butanol (92,04g) và cắn nước

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất á phân đoạn.

21

- Mẫu thử: cắn EtOAc hòa tan trong methanol

-Bản mỏng silica gel pha thuận và pha đảo hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ

-Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển:

+ Hệ I: Toluen - ethyl acetat – Aceton - Acid formic (5:2:2:1) (TEAF)

+ Hệ II: n-Hexan- Aceton (4:1)

+ Hệ III: Ethyl acetat – Aicd acetic- Acid formic - Nước (25:1:1:1)

-Thuốc thử hiện màu: vanillin/H2SO4 10%

-Tiến hành: Chấm dịch chấm sắc ký lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra, sấy khô, quan sát dưới UV254nm, UV366nm Sau đó phun thuốc thử, sấy ở 110oC, quan sát tiếp dưới ánh sáng trắng

-Sau khi thăm dò 3 hệ dung môi trên thấy hệ III cho kết quả tách rõ ràng và nhiều vết nhất Hình 3 trình bày sắc ký đồ của cắn ethyl acetat khi khai triển với hệ dung môi III

và quan sát ở các điều kiện khác nhau:

Hình 3.2 Sắ ý đồ ắn th t t (h III) ở á điều i n qu n sát

Chú thích: (a): Không phun TT, UV254nm (b): Phun TT, ánh sáng thường

(c): Phun TT, UV366nm

Nhận xét:

- Ở UV254nm, quan sát thấy 7 vết màu nâu đen, trong đó có 2 vết rất rõ

-Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở UV366nm, thấy 8 vết, trong đó có 4 vết phát quang màu xanh lam rõ

-Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở ánh sáng thường thấy 7 vết, trong đó có 4 vết rõ

22

màu vàng

3.1.2.2 Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

Cắn ethyl acetat được phân lập trên cột sắc ký silica gel pha thuận đã được nhồi cột và luyện dung môi trước đó ( 600g silica gel pha thuận nhồi cột, cột đường kính

10 cm, chiều dài 80 cm) Dung môi rửa giải là hệ n-hexan : aceton tỷ lệ 2:1 (v/v) và tỷ

lệ aceton tăng dần đến 100% Hứng dịch rửa giải và dựa vào sắc ký lớp mỏng chấm dịch rửa giải, dồn các ống có cùng thành phần thu được 10 phân đoạn khác nhau từ

PĐ1 đến PĐ10

Phân đoạn 3 (0,5g) được phân tách bằng cột silica gel pha thuận (80g silica gel,

cột có đường kính 2 cm; chiều dài 70 cm) rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với các tỷ lệ (20/1; 10/1; 5/1; v/v) thu được 5 phân đoạn

(PĐ 3.1 đến PĐ 3.5) Phân đoạn 3.2 cô bay hơi dung môi thu được 50 mg tinh thể hình kim màu vàng (chất A)

Phân đoạn 5 (0,7g) được phân tách bằng cột silica gel pha thuận ( 100g silicagel,

cột đường kính 2 cm, chiều dài 70 cm) rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với tỉ lệ 20/1; 15/1; 10/1; v/v (tỉ lệ MeOH tăng dần) thu

được 6 phân đoạn ( PĐ 5.1 đến PĐ 5.6) Phân đoạn 5.4 được đưa phân tách bằng cột

silica gel pha đảo (70g silica gel, cột đường kính 2cm, chiều dài 100cm), rửa giải bằng

hệ dung môi MeOH : H2O với tỉ lệ 1: 1,8 thu được 3 phân đoạn ( PĐ 5.4.1 đến PĐ

5.4.3) Phân đoạn 5.4.2 được tinh chế bằng cột sephadex đường kính 3cm, chiều dài

60cm, rửa giải bằng MeOH thu được 2 mg hợp chất dạng bột, màu trắng (Chất B) Phân đoạn 8 (2g) được phân tách bằng cột sắc kí pha thuận (200g silica gel, cột

có đường kính 3 cm; chiều dài 80 cm) rửa giải gradient bằng hệ dung môi

n-hexan/aceton với các tỷ lệ (1/1; 1/1,5; 1/2; v/v) thu được 11 phân đoạn (PĐ 8.1 đến

PĐ 8.11) Phân đoạn 8.10 được tinh chế bằng cột sephadex kích thước 3cm x 60 cm,

dung môi rửa giải là methanol thu được 15mg hợp chất dạng bột, màu vàng nhạt (chất

C)

23

Hình 3.3: Sơ đồ phân ập á hợp hất từ phân đoạn th t t o i ban

(H hookerianum Wight & Arn.)

 Thử độ tinh khiết của các chất phân lập được:

Hai hợp chất A, B và C phân lập được từ cắn ethyl acetat được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng với cao phân đoạn ethyl acetat

Nồng độ mẫu thử 1mg/ml, cao phân đoạn EtOAc 10mg/ml

PĐ 5.4

Sephadex MeOH

Chất B Chất C

Sephadex MeOH

PĐ 5.4.2

Chất A

Chú thích: E : phân đoạn ethyl acetat A, B,C: 3 chất phân lập được

a Không phun TT, UV254nm b Không phun TT, UV366nm

c Phun TT, ánh sáng thường d Phun TT, UV366nm

25

H nh 3.6: Chất ảng 3.1: i u ph hất v qu r tin th o t i i u th m h o [15]

8,5)

121,68 7,53 (1H, dd, J=2,2; 8,6) 119,9

δ*: đo ở CD3OD ; δ#: đo ở DMSO-d 6

Phổ khối ESI-MS có đỉnh ion tại m/z: 301 [M-H]- cho biết khối lượng phân tử của chất A là M 302 tương ứng với công thức phân tử C15H10O7

Chất A thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, khi triển khai sắc kí lớp mỏng và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn thấy xuất hiện màu vàng nên dự đoán là một flavonoid Dự đoán được khẳng định dựa vào phổ 1

H-NMR của chất A đặc trưng cho cấu trúc của một flavonoid với ba tín hiệu proton của vòng thơm B cộng hưởng dạng ABX tại vùng trường thấp δH 6,90 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5’),

26

7,65 (1H, dd, J=8,5;2,0 Hz, H-6’), 7,75 (1H, d, J=8,0, H-2’) Ở vùng trường cao hơn, 2

tín hiệu δH 6,02 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6) với 6,41 (1H, d, J=2,5 Hz, H-8) được nhận

định là proton thuộc về vòng A, ghép cặp meta cho thấy vị trí C-5, C-7 đã bị thế Sự có

mặt của 15 tín hiệu carbon trên phổ 13C-NMR và DEPT tương ứng với 5 nhóm methin

và 10 carbon bậc 4 của vòng thơm là hoàn toàn phù hợp với dự đoán trên Sau khi so sánh các số liệu phổ của chất A với tài liệu tham khảo, đi đến kết luận chất A là quercetin có công thức phân tử là C15H10O7 (Hình 3.7) Hợp chất này là một flavonoid rất hay gặp trong nhiều loại cây tuy nhiên đây là lần đầu tiên được công bố trên cây

ban (Hypericum hookerianum)

Hình 3.7 Cấu trú hó họ v ph hợp hất

28

δ*: đo ở CD3OD

Hợp chất B thu được dưới dạng bột màu trắng Phổ khối ESI-MS có đỉnh ion

tại m/z: 391 [M+Na]+ cho biết khối lượng phân tử của chất B là M 368 tương ứng với công thức phân tử C17H20O9 Phổ 13C-NMR cho thấy có 8 carbon nằm trong vùng chuyển dịch của vòng thơm hoặc liên kết đôi Hai nguyên tử carbon của nhóm carbonyl tại δC 175,44 và 168,29 Phổ 1H-NMR có 03 tín hiệu proton nhân thơm đặc trưng cho hệ ABX là δH 7,06( 1H, d, J=2,0 Hz; H-2’); 6,97(1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H- 6’); 6,80(1H, d, J 2,0Hz, H-5’) 02 proton dạng doublet tại δH 7,54 và 6,23 (J 16,0

Hz) đặc trưng cho 02 proton olefinic trans (H-7’,8’) 01 nhóm methyl tại δH 3,72 đặc trưng cho nhóm OCH3 Những tín hiệu này của hợp chất B được nhận định phù hợp với khung của acid ferulic (Hình 3.9)

Hình 3.9: Acid ferulic Hình 3.10 Acid quinic

Những tín hiệu còn lại cho thấy hợp chất B có thể là ester của acid ferulic Phần alcol của chất B trên phổ carbon có chứa một nhóm carboxylic tại δC 175, 44 02 nhóm

CH2 ở trường cao tại δC 37,9 và 38,0; 03 nhóm CH-O tại δC 72,2; 72,6; 72,8; và 01 nhóm carbon bậc 4 tại 70,0; tương ứng trên phổ 1H-NMR cho thấy 2 tín hiệu của nhóm

CH2 tại δH 2,0 và 2,2( 4H, multiplet) 03 tín hiệu của nhóm CH-O tại δH 4,14(1H, m, H-4); 3,75(1H, m, H-3); 5,30(1H, ddd, H-5) Từ những tín hiệu này nhận định được phần alcol của chất B là acid quinic (Hình 3.10) Khung feruloyl có thể gắn vào 3 vị trí

có nhóm OH của acid quinic (C-3, 4, 5) Kết hợp các dữ liệu phổ thu được với tài liệu

đã công bố, hợp chất B được kết luận là 3-O-feruloylquinic acid (Hình 3.11)

30

H nh 3.12 Chất C ảng 3.3 i u ph hất C v h p rin th o t i i u th m h o[50]

δ* : đo trong CD3OD

Phổ khối ESI-MS cho đỉnh ion tại m/z: 463 [M-H]- cho biết công thức phân tử

của chất C là C21H20O12

Hình 3.13 Cấu trú hó họ v ph hợp hất C