ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Lá loài Camellia sp thu hái tại khu vực Vườn Quốc Gia Nam Cát Tiên 03/2021
Vị trí địa lý của khu vực nằm trong khoảng 11°20′50" đến 11°50′20" vĩ Bắc và 107°09′05" đến 107°35′20" kinh Đông, thuận lợi cho hoạt động thu hái dược liệu Sau khi thu hoạch, dược liệu được loại bỏ đất cát, làm sạch, phơi khô trong bóng râm để bảo quản chất lượng, sau đó xay thành bột theo yêu cầu của thí nghiệm.
2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss, Đức
- Cân xác định độ ẩm MA – 45 (Satorius)
- Bể siêu âm Power sonic 410, Hàn quốc
- Đèn UV 254/365 nm Spectrolight CM – 10A
- Tủ sấy Memmert hiệu số UN110
- Nồi cách thủy Memmert WB – 14
- Máy cô quay chân không Hei-VAP Core G3, kèm bộ sinh hàn tự động Hei-VAP Core, Đức
- Cân phân tích Sartorius độ nhạy 0,1 mg BP – 221S, Đức
- Máy sấy chân không (Jeiotech, model OV – 12)
- Máy hút chân không Panasonic GP – 125JP
- Bình sắc ký, cột sắc ký bằng thủy tinh cùng các dụng cụ phòng thí nghiệm
- Máy đọc đĩa Elisa đa năng (Biotek, USA), máy đọc đĩa Elisa iMark TM (Biorad, USA)
- Silica gel (Ấn Độ), cỡ hạt trung bình (37 – 63 μm); Silica gel (Merck, Đức), cỡ hạt mịn (15 – 40 μm)
- Sắc ký lớp mỏng pha thuận dùng bản Silica gel G F254 (Merck)
- Dung môi dùng trong phân tích hóa học, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột đạt chuẩn tinh khiết phân tích
- Các dung môi dùng cho chiết xuất và sắc ký cột thay đổi theo các thực nghiệm cụ thể và được cất lại, làm khan trước khi dùng
- DPPH (Sigma), vitamin C (Sigma), acid gallic (Merck), Folin - Ciocalteu (Merck)
- Hóa chất dùng trong thử nghiệm ức chế α-glucosidase: α-glucosidase (từ Saccharomyces cerevisiae, Sigma), p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG,
Sigma), acarbose (Sigma, ≥95 % HPLC), DMSO (Merck).
Phương pháp nghiên cứu
Hình thái thực vật được xác định thông qua quá trình thu hái mẫu, mô tả phân tính bằng mắt thường, kính lúp và kính hiển vi để quan sát chi tiết các đặc điểm trên từng bộ phận của cây Quá trình đối chiếu mẫu với các khóa phân loại, hình ảnh minh họa và mô tả trong các tài liệu tham khảo giúp xác định chính xác tên loài Việc nhận biết hình thái thực vật chính xác đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phân loại thực vật, góp phần nâng cao hiệu quả trong các lĩnh vực sinh học và bảo tồn thiên nhiên.
Khảo sát vi học: Vi phẫu lá, đặc điểm bột dược liệu bằng phương pháp thường quy
2.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Xác định các chỉ tiêu: độ ẩm, tro và hàm lượng chất chiết được trong dược liệu dựa vào Dược Điển Việt Nam V được xác định như sau 84 :
- Xác định độ ẩm dược liệu bằng cân xác định độ ẩm hồng ngoại theo phụ lục 12.13 theo DĐVN V (trang PL-279)
- Xác định tro toàn phần (phụ lục 9.8) và tro không tan trong acid hydrocloric (phụ lục 9.7) theo DĐVN V (trang PL-203 và PL-204)
Chất chiết được trong dược liệu được xác định bằng phương pháp chiết nóng bằng cồn, theo quy định tại phụ lục 12.10 – DĐVN V (trang PL-278 và PL-279) Phương pháp này sử dụng dung môi là cồn 96% để đảm bảo hiệu quả chiết xuất tối ưu.
Kết quả của các chỉ tiêu trên được lấy giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập
Phương pháp của Ciulei đã được cải tiến bởi bộ môn Dược liệu - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh nhằm sơ bộ xác định sự có mặt của các nhóm hợp chất trong dược liệu Quá trình này sử dụng các dụng cụ chiết xuất thường quy kết hợp với các phản ứng định tính đặc trưng theo thứ tự phân đoạn có độ phân cực tăng dần Phương pháp này giúp đánh giá nhanh chóng thành phần hóa học của dược liệu, hỗ trợ quá trình xác định chất tố một cách hiệu quả.
2.2.4 Định lượng polyphenol từ dịch chiết nước
Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết nước của dược liệu được xác định theo phương pháp DĐVN V, đã được hiệu chỉnh bởi Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp này đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao trong việc phân tích hàm lượng polyphenol, góp phần nâng cao chất lượng nghiên cứu và ứng dụng dược liệu trong y học cổ truyền.
Cân chính xác 1 g bột dược liệu (xay mịn và rây qua rây 125) vào bình định mức
Pha 250 ml dịch, thêm 150 ml nước vừa đun sôi rồi siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 20 phút để hòa tan Sau đó, để nguội, thêm nước vừa đủ, lắc đều và để lắng Tiếp theo, lọc qua giấy lọc và bỏ 20 ml dịch lọc đầu Cuối cùng, hút chính xác lượng dịch cần sử dụng để chuẩn bị mẫu hoặc thực hiện các bước phân tích tiếp theo.
20 ml dịch lọc vào bình định mức 100 ml, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn theo quy trình chính xác bằng cách cân 5 mg acid gallic vào bình định mức 10 ml, hòa tan và lấy 5 ml rồi pha loãng đến 50 ml để có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml Tiếp theo, lấy chính xác các thể tích 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml; 3 ml dung dịch chuẩn vào các bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm thuốc thử F-C, nước và natri carbonat 29% theo đúng lượng quy định, sau đó đo độ hấp thu tại 760 nm Cùng lúc, chuẩn bị mẫu trắng và xây dựng đường chuẩn dựa trên mối quan hệ giữa độ hấp thu và nồng độ dung dịch để thực hiện phân tích chính xác hàm lượng acid gallic trong mẫu.
2.2.4.3 Định lượng polyphenol từ dịch chiết nước
Hướng dẫn huyết chính xác 2 ml dung dịch thử vào bình định mức 25 ml, sau đó thêm 1 ml thuốc thử F-C và trộn đều Tiếp theo, thêm 10 ml nước và dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều để hòa tan Đo 6 độ hấp thụ của dung dịch theo phương pháp chuẩn và tính toán hàm lượng polyphenol theo axit gallic dựa trên đường chuẩn đã xây dựng.
- P: Hàm lượng polyphenol từ dịch chiết nước (mg GAE/g dược liệu)
- Cx: nồng độ acid gallic xỏc định từ đường chuẩn (àg/ml)
- n: Độ pha loãng từ dịch chiết gốc
- V: Thể tích dịch chiết gốc (ml)
- m: khối lượng dược liệu ban đầu
Kết quả được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình Hàm lượng polyphenol của mẫu thử và trà xanh được quy về acid gallic (mg GAE/g dược liệu)
2.2.5 Sàng lọc tác dụng sinh học
Thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của Trieu L H và cộng sự (2019) 86 và được hiệu chỉnh cho phù hợp với thử nghiệm
Chất thử nghiệm được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua tác dụng với gốc tự do DPPH ổn định Quá trình xác định mức độ giảm nồng độ DPPH dựa trên phép đo quang học, đo sự giảm hấp thu ở bước sóng 517 nm Phương pháp này được thực hiện trên đĩa 96 giếng để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong phân tích.
- Chuẩn bị hóa chất, mẫu thử dùng trong thử nghiệm
Thuốc thử DPPH pha trong MeOH nồng độ 0,6 mM (0,2 mM với chất tinh khiết) Mẫu thử pha trong MeOH để thu được dãy nồng độ khảo sát
Chứng dương là vitamin C được pha tương tự mẫu thử trong MeOH
Các mẫu được bố trí theo bảng 2.1 và hình 2.1
Bố trí các mẫu trong thử nghiệm DPPH
Bố trí thí nghiệm thử DPPH cao cồn và cao phân đoạn trên đĩa 96 giếng
Bước 1: Cho vào giếng lần lượt MeOH, dung dịch thử, dung dịch chuẩn, DPPH Bước 2: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trong tối
Bước 3: Xác định độ hấp thu ở bước sóng 517 nm
Bước 4: Đánh giá kết quả
Hoạt tính chống oxy hóa được xác định theo công thức:
Abs: Độ hấp thu đo được ở bước sóng 517 nm Khả năng thu dọn gốc tự do DPPH được đánh giá dựa trên giá trị IC50
2.2.5.2 Mô hình ức chế enzym α-glucosidase
Thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của Trieu L H và cộng sự (2018) 87 , được điều chỉnh cho phù hợp với thử nghiệm
Bước 1: Thêm vào mỗi giếng thử 60 μl mẫu thử và 50 μl enzym (0,2 U/ml)
Bước 2: Ủ hỗn hợp ở 37 o C trong 10 phút
Bước 3: Thêm 50 μl pNPG (10 mM trong đệm K3PO4 (0,1 M, pH 6,8) và 40 μl đệm
Bước 4: Ủ hỗn hợp ở 37 o C trong 20 phút
Bước 5: Đo độ hấp thu của sản phẩm ở bước sóng 405 nm
Các mẫu trên dĩa 96 giếng được bố trí theo bảng 2.2 và hình 2.2
Bố trí các mẫu trong thử nghiệm ức chế enzym α -glucosidase Đơn vị ( μl) Mẫu chứng trắng (CT)
Mẫu thử - - 60 60 α -glucosidase (0,2 U/ml) - 50 - 50 p -NPG 10 mM/ K 3 PO 4 0,1 M 50 50 50 50 Đệm K 3 PO 4 0,1 M (pH 6,8) 110 60 50 0
Bố trí thí nghiệm ức chế enzym α -glucosidase trên đĩa 96 giếng
Trong quá trình thử nghiệm, các mẫu thử được pha với các nồng độ khác nhau, sử dụng acarbose làm chứng dương để đánh giá khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Khả năng ức chế enzyme của các mẫu thử được xác định dựa trên công thức tính toán đặc trưng, nhằm đánh giá hiệu quả ức chế một cách chính xác và khách quan Các kết quả này giúp hiểu rõ hơn về tiềm năng của mẫu thử trong việc giảm hấp thụ đường và kiểm soát đường huyết, góp phần nghiên cứu các sản phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường.
Abs: Độ hấp thu đo được ở bước sóng 405 nm
Kết quả của thí nghiệm được trình bày bằng giá trị trung bình cộng với độ lệch chuẩn dựa trên 3 lần thử nghiệm, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy Dữ liệu được xử lý và biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel, giúp dễ dàng vẽ đồ thị và phân tích số liệu Phương trình phù hợp (với R² ≥ 0,99) được xác định dựa trên dữ liệu, từ đó giúp tính toán chính xác giá trị IC50 của mẫu nghiên cứu.
2.2.6 Chiết xuất và phân lập
Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% giúp thu được cao cồn đặc, sau đó cô đặc và phân tán vào nước để tiến hành chiết lỏng lần lượt với các dung môi như n-hexan, CHCl3, EtOAc, và n-BuOH Phương pháp này cho phép phân tách hỗn hợp các chất trong cao chiết thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau Việc chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết được thực hiện dựa trên mục tiêu khám phá tác dụng sinh học của các hợp chất này.
Quy trình chiết xuất và phân lập được trình bày trong hình 2.3
Quy trình chiết xuất và phân lập
2.2.6.2 Phân lập và tinh chế
Sắc ký cột dùng để tách cao chiết thành các phân đoạn đơn giản hơn và phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn
Kết hợp các phương pháp sắc ký khác nhau và tinh chế phân đoạn bằng cách sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp với lượng tối thiểu để tối ưu hóa quá trình Khi tinh thể hình thành, tiến hành lọc qua phễu thủy tinh xốp, rửa tinh thể bằng dung môi phù hợp để làm sạch Sau đó, sấy chân không để loại bỏ hơi ẩm và xác định chính xác khối lượng tinh thể sau khi sấy để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
Để kiểm tra độ tinh khiết của các chất, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng Chất phân lập được sắc ký trên ba bản mỏng sử dụng ba hệ dung môi khác nhau, giúp xác định độ tinh khiết chính xác hơn Quá trình quan sát được thực hiện dưới ánh sáng UV 254 nm và UV 365 nm, kết hợp với hiện màu bằng thuốc thử phù hợp để xác định các vết phân tích Chất được xem là tinh khiết khi chỉ xuất hiện một vết phân tích duy nhất trên bản mỏng, có hệ số Rf trong khoảng từ 0,25 đến 0,75, đảm bảo độ tinh khiết đạt yêu cầu.
2.2.7 Xác định cấu trúc chất phân lập được
Các chất phân lập được xác định cấu trúc dựa trên dữ liệu phổ UV, MS và NMR, kết hợp với thông tin từ tài liệu tham khảo để đảm bảo độ chính xác Phổ NMR được đo bằng các kỹ thuật 1D và 2D như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và COSY, giúp phân tích chi tiết cấu trúc phân tử Mẫu được hòa tan trong dung môi phù hợp cùng chất chuẩn nội TMS và tiến hành đo trên máy ADVANCE 600 của Bruker tại Phòng Cấu Trúc, Viện Hóa Học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Độ dời hóa học được tính theo thang δ (ppm), với δ TMS quy ước là 0,00, đảm bảo độ chính xác trong phân tích cấu trúc.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát thực vật học loài Camellia sp
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ cao từ 3 đến 15 mét, có cành non thưa, nhẵn, màu xanh lục nhạt chuyển sang nâu hoặc xám khi già Lá có cuống dài từ 0,4 đến 1cm, nhẵn, phiến hình elip từ hẹp đến rộng (kích thước 3,9 – 7,2 cm rộng, 10,4 – 18 cm dài), đỉnh nhọn dài, gốc tròn, mặt trên màu xanh lục đậm, nhẵn, mặt dưới màu xanh nhạt với gân nổi rõ, nhiều điểm tuyến nâu và 6 – 9 đôi gân phụ rõ ràng Mép lá răng cưa, lá bắc màu xanh, mỗi hoa mang một lá bắc phủ lông mịn ngoài mép và mặt ngoài, trong nhẵn Cuống hoa ngắn từ 0,1 đến 0,3cm, được bao phủ gần như hoàn toàn bởi các lá đài phụ hình móng màu xanh lục nhạt, kích thước 1,5 – 3,0 x 1 – 2mm, mọc đối nhau thành từng chùm gồm 3 – 4 lá xếp chồng lên nhau Các đài hoa từ 5 đến 6 – 7 chiếc, có màu xanh lục nhạt, góp phần tạo nên vẻ đẹp đặc trưng của loài cây này.
Hoa có kích thước khoảng 0,8 – 1,6 cm rộng x 0,9 – 1,8 cm dài, hình thìa, bên ngoài màu vàng sẫm đến cam, bên trong màu vàng nhạt và bóng, xếp lộn xộn thành 2 vòng không rõ rệt gồm vòng ngoài 3 (4) lá đài và vòng trong 3 (4) lá đài Hoa chủ yếu mọc đơn ở ngọn cành hoặc nách lá, nụ hoa hình cầu, cánh hoa rời, số cánh từ 12 – 22, xếp thành nhiều lớp lộn xộn, kích thước 1,7 – 2,8 cm dài x 1,4 – 2,4 cm rộng, các cánh ngoài phủ nhiều lông, các cánh còn lại có lông thưa, mặt trong của tất cả các cánh đều không lông Các cánh hoa thay đổi hình dạng từ ngoài vào trong, từ gần tròn, bầu dục đến thuôn dài, màu vàng sẫm hoặc vàng nhạt, sáp, giòn, dày, chuyển dần sang màu nhạt hơn và mỏng hơn ở rìa, bên ngoài màu vàng đến vàng đậm, bên trong màu vàng sáng hơn Nhị hoa nhiều, dài 1,5 – 2,0 cm, dạng sợi mảnh, xếp thành bó kích thước 2,5 – 3 cm, các nhị bên ngoài dính với nhau và với các cánh hoa bên trong, chỉ nhị rộng 5 – 7 mm, dài 15 – 20 mm Vòi nhụy hợp nhất khoảng 2/3 chiều dài, phần còn lại rời, với 5 hoặc 6 ô, mỗi ô chứa 2 lá noãn màu vàng, không lông.
Các bộ phận của cây gồm có cành già (A), cành non (B), chồi nách (C), lá mặt trước và mặt sau (D), hoa đầu cành (E) và (F), nụ hoa (G), nụ hoa cắt ngang (H) và cắt dọc (I), lá bắc (J), và lá đài phụ (K) Những phần này góp phần quan trọng vào đặc điểm nhận dạng và sinh trưởng của cây, với mỗi bộ phận đóng vai trò riêng trong quá trình phát triển cũng như khả năng sinh sản của cây Hiểu rõ các bộ phận này không những giúp xác định và phân loại cây chính xác mà còn hỗ trợ trong việc nghiên cứu và bảo tồn các loài thực vật.
Lá đài (L), Cánh hoa (M), Nhị (N), Hạt phấn (O), Vòi nhụy (P), Bầu nhụy (Q)
Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thực vật loài Camellia sp được thu hái tại Đồng Nai
Hình 3.2 Hình thái và hoa ngoài tự nhiên
Dựa trên phân tích các mẫu thu thập được, mẫu nghiên cứu có đặc điểm tiêu biểu phù hợp với loài C dormoyana, bao gồm: hoa mọc đơn đầu cành, cuống nhỏ hoặc không có cuống, được bao phủ bởi các lá đài phụ chồng lên nhau; hoa có màu vàng đến vàng đậm, kích thước trung bình từ 5 đến 6 cm; cánh hoa nhiều hơn 12, hình thìa, màu vàng nhạt đến vàng đậm, phần rìa nhạt màu hơn, sáp, giòn và dễ gãy; bầu trên là loại 5 – 6 ô, nhẵn; vòi nhụy nhẵn, gồm 5 – 6 vòi hợp nhất; và quả nang hình cầu với các khía sâu dọc, thường có 5 khía sâu 11.
Tiến sĩ Lương Văn Dũng, Giám đốc Trung tâm Đa dạng sinh học và Biến đổi khí hậu tại Đại học Đà Lạt, xác nhận và kiểm tra kết quả so sánh, đồng thời xác định rằng đối tượng nghiên cứu chính của đề tài là Trà hoa vàng Dormoy.
Biểu bì lá có tế bào biểu bì trên và dưới có kích thước không đều, vách uốn lượn và chứa các cấu trúc như hạt tinh bột, lục lạp và tinh thể calcium oxalat hình cầu gai Tế bào lỗ khí hình bầu dục hoặc gần tròn, phân bố chủ yếu ở biểu bì dưới và được bao quanh bởi 2-3 tế bào bạn hình dẹt, nhỏ hơn tế bào biểu bì, nằm rải rác hoặc thành từng cụm 2 lỗ khí Điểm tuyến (cork-wart) màu nâu tập trung ở biểu bì dưới, có vai trò trao đổi khí, cả hai mặt lá đều không có lông Đặc điểm của biểu bì lá được trình bày rõ trong hình 3.3.
Hình ảnh phóng đại 40X cho thấy các thành phần chính của mô thực vật, bao gồm biểu bì trên (A) và biểu bì dưới (B+C), giúp nghiên cứu cấu trúc và chức năng của lớp bảo vệ ngoài cùng của cây Trong đó, các hạt tinh bột (a) nằm trong tế bào, cung cấp nguồn dự trữ năng lượng, còn lục lạp (b) thực hiện quá trình quang hợp để sản xuất thức ăn cho cây Cầu gai chứa calci oxalat (c), đóng vai trò trong khiếu nại và dự trữ khoáng chất, trong khi tế bào lỗ khí (d) là các cấu trúc giúp trao đổi khí giữa cây và môi trường Các tế bào bạn (e) và điểm tuyến (f) liên quan đến hệ thống vận chuyển chất dinh dưỡng, còn tế bào biểu bì (g) bảo vệ mô khỏi tác động bên ngoài, tất cả đều đóng vai trò quan trọng trong sinh lý và sinh trưởng của thực vật.
Cụm khí khổng; i: Lỗ khí
Hình 3.3 Đặc điểm cấu tạo biểu bì lá của C dormoyana
Vi phẫu mặt trên lõm, mặt dưới lồi tròn, gân giữa dày gấp 4-5 lần phiến lá, cho thấy cấu trúc đặc trưng của bộ phận này Biểu bì trên và dưới có hình chữ nhật đến gần tròn, vách cellulose đều, tế bào biểu bì trên lớn gấp đôi tế bì dưới, lớp cutin và vách trong cũng dày hơn, tăng cường khả năng chống chịu Mô dày góc nằm dưới biểu bì trên và trên biểu bì dưới gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác, vách cellulose dày, kích thước không đều và xếp lộn xộn, tạo sự linh hoạt và ổn định cho cấu trúc Tiếp theo là mô mềm đạo gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, tế bào lớn hơn gấp 2-3 lần tế bì trên, tập trung chủ yếu ở vùng mô mềm đạo dưới, giúp cung cấp chất dinh dưỡng và hỗ trợ sinh trưởng Trụ bì hóa mô cứng phía ngoài libe, gồm các mạch libe nhỏ nằm xen kẽ trong mô mềm gỗ, thể cứng vách hóa gỗ dày, phân nhánh nhỏ, ngắn và nhọn, phân bố chủ yếu trong vùng mô mềm đạo, tăng cường độ bền vững của mô Mạch gỗ phát triển mạnh mẽ, mô mềm gỗ gồm các tế bào hình đa giác đến gần tròn với vách tẩm chất gỗ, xếp xuyên tâm, thể cứng vách hóa gỗ rất dày, nhiều phân nhánh nhỏ Ngoài ra, tinh thể calci oxalat hình cầu gai phân bố rải rác trong vùng mô mềm gỗ và mô mềm đạo, góp phần vào chức năng sinh lý của mô.
Phiến lá gồm biểu bì trên và biểu bì dưới là lớp tế bào hình chữ nhật, trong đó tế bào biểu bì trên lớn hơn tế bào biểu bì dưới, có vách trong rất dày và cutin dày, với nhiều lỗ khí tập trung chủ yếu ở biểu bì dưới Cấu tạo của phiến lá mang đặc điểm dị thể bất đối xứng Mô mềm giậu nằm phía dưới, gồm lớp tế bào thuôn dài dài hơn tế bì từ 1,5 đến 2 lần, xếp chặt và vuông góc với mặt lá Trong khi đó, mô mềm khuyết gồm 10-13 lớp tế bào đa giác gần tròn, xếp lộn xộn và chứa các khuyết lớn gấp 2-5 lần tế bào mô mềm Gân phụ có vòng bao mô cứng bao quanh bó mạch dẫn rải rác trong lá, còn trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat dạng cầu gai rải rác Ngoài ra, còn xuất hiện nhiều thể cứng kích thước lớn, nhọn, ít phân nhánh, kéo dài từ biểu bì trên tới biểu bì dưới, đặc trưng cho vi cấu trúc lá được trình bày trong hình 3.4 và 3.5.
Hình 3.4 Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo lá C dormoyana
Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu lá C dormoyana
Vi phẫu tiết diện dần tròn với mặt trên hơi lõm, các tế bào biểu bì trên và dưới giống nhau, có dạng chữ nhật đến gần tròn, trong đó biểu bì trên lớn hơn biểu bì dưới, lớp cutin dày và vẫn có lông che chắn đơn bào thưa thớt Dưới lớp biểu bì là mô dày góc gồm 15-20 lớp tế bào xếp xuyên tâm ở dưới biểu bì trên và xếp lộn xộn ở dưới biểu bì dưới Tiếp theo là mô mềm khuyết gồm các tế bào đa giác hoặc gần tròn, vách cellulose kích thước không đều, xếp lộn xộn Bó dẫn gồm các mạch gỗ hình đa giác hoặc gần tròn, không đều về kích thước, xếp thành dãy xuyên tâm xen kẽ với 1-2 dãy mô mềm gỗ có vách cellulose Trong hệ thống mô dẫn, libe gồm các tế bào đa giác, vách cellulose không đều, xếp lộn xộn; dưới libe là nhiều lớp mô dày, gồm các tế bào vách cellulose dày, kích thước không đều, xếp lộn xộn và tạo thành vòng cung bao quanh libe Trong cấu trúc còn có nhiều thể cứng và calci oxalat hình cầu gai phân bố chủ yếu trong vùng mô dày và mô mềm, thể cứng có kích thước lớn.
Hình 3.6 Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo của cuống lá C dormoyana
Hình 3.7 Đặc điểm vi phẫu cuống lá C dormoyana
Võ tiết diện gần tròn, vùng vỏ chiếm 20% diện tích, trong khi vùng trung trụ chiếm đến 80%, thể hiện đặc điểm cấu trúc chính của thực vật Biểu bì gồm một lớp tế bào hình đa giác, có kích thước không đều và vách cellulose chắc chắn, giúp bảo vệ và bảo toàn khả năng trao đổi chất của cây Dưới biểu bì là các mô cơ bản hỗ trợ quá trình vận chuyển nước và dưỡng chất trong cây.
Lớp tế bào mô dày góc, kích thước không đều thể hiện cấu trúc vỏ đạo phức tạp Mô mềm vỏ đạo gồm nhiều lớp tế bào đa giác gần tròn có vách cellulose uốn lượn, tạo nên đặc điểm nhận diện rõ ràng của mô Các tế bào ở lớp phía trong bị ép dẹp, góp phần vào chức năng bảo vệ và vận chuyển của vỏ đạo.
Trụ bì hoá sợi gồm 2-4 lớp tế bào hình đa giác có kích thước đều, vách tẩm chất gỗ, xếp thành vòng liên tục, với mô cứng rải rác trong trụ bì, trong khi tầng sinh bần bên trong trụ bì tạo bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật có vách cellulose uốn lượn Libe 1 gồm một tế bào hình đa giác nhỏ, không đều, vách cellulose, xếp thành từng cụm, còn libe 2 gồm 2-4 lớp tế bào hình đa giác, vách cellulose, xếp xuyên tâm Gỗ 2 liên tục, mạch gỗ hình đa giác hoặc gần tròn, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ, gồm các tế bào hình đa giác hoặc chữ nhật có vách tẩm chất gỗ, kích thước không đều Mô mềm gỗ gồm các tế bào hình đa giác hoặc chữ nhật, xếp thành dãy, còn tia tủy hẹp, gồm 1-3 dãy tế bào hình bầu dục hoặc đa giác gần tròn, vách tẩm chất gỗ Gỗ 1 gồm các tế bào hình đa giác gần tròn, vách tẩm chất gỗ, xếp thành dãy xuyên tâm, mỗi dãy gồm 2-6 mạch hình đa giác Mô mềm gỗ 1 gồm các tế bào hình đa giác hoặc gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn thành cụm trong vùng mô mềm tủy Mô mềm tủy đạo gồm các tế bào hình đa giác tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều, nhiều tế bào bề mặt vách hóa mô cứng có ống trao đổi phân nhánh, bên trong gồm các tế bào hóa mô cứng có kích thước nhỏ xen kẽ với tế bào lớn vách cellulose Thể cứng nhỏ, dày vách, ít phân nhánh, phân bố rải rác trong vùng mô mềm vỏ, còn mô cứng đều khắp thành vòng trong trụ bì Calci oxalat hình cầu gai tập trung nhiều trong vùng libe 1 và mô mềm tủy Các đặc điểm vi phẫu của thân được trình bày cụ thể trong hình 3.8 và 3.9.
Hình 3.9 Đặc điểm vi phẫu thân C dormoyana 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá có màu xanh rêu, mùi thơm đặc trưng và vị đắng chát, thể hiện qua hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi Trong đó, các thành phần chính bao gồm mảnh biểu bì trên và dưới có mang lỗ khí, thể cứng lớn, phân nhánh và bị đứt gãy một phần Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác trong mẫu, cùng với các bó sợi, mạch xoắn, khối nhựa, và hạt tinh bột hình cầu có mặt ngoài nhẵn và nằm rời rạc, tạo thành cấu trúc đặc trưng của bột dược liệu (hình 3.10).
Chú thích: A: Bột dược liệu; B: biểu bì trên; C: Biểu bì dưới và lỗ khí; D: Bó sợi; E+F: Thể cứng; G: Tinh thể calci oxalat; H: Mạch xoắn; I: Khối nhựa; J: Tinh bột
Hình 3.10 Một số cấu tử trong bột lá Camellia dormoyana
Kiểm tra độ tinh khiết
Các chỉ tiêu về độ ẩm, độ tro và hàm lượng chất chiết được thực hiện theo quy chuẩn DĐVN V (phụ lục 9.6, 9.7, 9.8 và 12.10) Phương pháp phân tích được tiến hành trên 3 mẫu và kết quả trung bình được tính để đảm bảo độ chính xác Kết quả phân tích sẽ được trình bày rõ ràng trong Bảng 3.1, cung cấp thông tin quan trọng về đặc tính của mẫu thử nghiệm.
Bảng 3.1 Kết quả kiểm tinh khiết của lá C dormoyana
Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ ẩm (%) 11,02 10,88 11,22 11,04
Tro không tan trong acid (%) 0,28 0,36 0,29 0,31
Hàm lượng chất chiết được
Nghiên cứu đã xác định các thông số lý hóa quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu thuốc Kết quả cho thấy, các mẫu đạt độ tinh khiết cao, với các chỉ tiêu nằm trong giới hạn tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam V Điều này đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của nguyên liệu làm thuốc theo tiêu chuẩn dược phẩm quốc gia.
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong lá loài C dormoyana
Kết quả phân tích cho thấy lá của loài C dormoyana chứa nhiều hợp chất quan trọng như saponin, phenolic gồm tannin, polyphenol, flavonoid và acid hữu cơ Ngoài ra, trong thành phần còn phát hiện các chất khử, carotenoid, triterpen, cùng tinh dầu, thể hiện tiềm năng khai thác đa dạng sinh học của loài này Các kết quả được trình bày rõ ràng trong Bảng 3.2, góp phần nâng cao hiểu biết về thành phần hoá học của C dormoyana.
Bảng 3.2 Kết quả sơ bộ thành phần hóa học trong lá C dormoyana
Nhóm hợp chất Dịch chiết ether
Dịch chiết cồn 96% Dịch chiết nước Kết luận
3.4 Định lượng polyphenol từ dịch chiết nước
Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu mô tả ở mục 2.2.7
3.4.1 Phương trình đường chuẩn acid gallic
Mối tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thu quang học ở bước sóng
760 nm được trình bày trong Bảng 3.3, hình 3.11 và phụ lục
Bảng 3.3 Mối tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thu
Nồng độ acid gallic (μg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Hình 3.11 Phương trình đường chuẩn acid gallic 3.4.2 Hàm lượng polyphenol từ dịch chiết nước từ lá C dormoyana
Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol có trong lá
C dormoyana, có so sánh với lá loài C sinensis được cung cấp bởi TS Nguyễn
Thành Triết – Khoa YHCT – ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh.
Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol dịch chiết nước từ lá C dormoyana
Khối lượng (g) Hàm ẩm tb (%) OD (760 nm) Hàm lượng polyphenol
(g) Hàm ẩm tb (%) OD (760 nm) Hàm lượng polyphenol
Như vậy, hàm lượng polyphenol từ dịch chiết nước có trong 1 g lá C dormoyana và C sinensis được xác định lần lượt là 31,80 ± 0,9538 và 75,71 ± 1,9670 (mg
GAE/g) Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol của trà vàng thấp hơn nhiều so với trà xanh ở cùng điều kiện và phương pháp thử
3.5.1 Chiết các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana
Bột lá C dormoyana (4 kg) được ngấm kiệt với cồn 96% để thu dịch chiết cồn, sau đó cô quay chân không và để bay hơi trên bếp cách thủy, cho ra 570 g cao cồn Quá trình lắc phân bố lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần giúp phân đoạn các hợp chất có trong dịch chiết, và các phân đoạn này được trình bày rõ ràng trong hình 3.12.
Hình 3.12 trình bày kết quả phân tách các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana sử dụng phương pháp ký lớp mỏng với dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – HCOOH (8:2:0,1), giúp sơ bộ đánh giá và so sánh thành phần hóa học của mẫu Các kết quả thu được được trình bày rõ ràng trong hình 3.13, hỗ trợ xác định các hợp chất chính trong cao cồn lá C dormoyana dựa trên các đặc điểm phân tách Phương pháp này mang lại cái nhìn ban đầu về thành phần hóa học của mẫu, góp phần trong quá trình nghiên cứu và phân tích dược liệu.
Hình 3.13 Sắc ký các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana
Kết quả sắc ký cho thấy phân đoạn EtOAc và n-BuOH có nhiều vết tắt quang ở
UV254 và một số vết phát huỳnh quang tại UV365 cho thấy sự xuất hiện của các vết màu vàng và vàng cam khi nhúng bản mỏng vào dung dịch thử VS, phản ánh hiện tượng quang học liên quan Tuy nhiên, phần lớn các vết tắt quang tại UV254 không hiển thị màu khi tiếp xúc với thuốc thử, cho thấy sự khác biệt về bước sóng và khả năng phản ứng quang quang của mẫu Những phát hiện này giúp hiểu rõ hơn về tính chất quang của các chất phân tích trong quy trình kiểm tra cấp độ UV, hỗ trợ các nghiên cứu liên quan đến xử lý nước hoặc phân tích mẫu sinh học.
Phân đoạn EtOAc của bản mỏng được nhúng thuốc thử FeCl3 1% cho thấy nhiều vết màu xanh đen và xanh đậm, cho thấy khả năng chứa các hợp chất pyrogallic Các phân đoạn này được tiếp tục sàng lọc sinh học nhằm lựa chọn các phân đoạn có hoạt tính sinh học cao Cuối cùng, các phân đoạn có hoạt tính được phân lập để thu được các hợp chất tinh khiết, phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
3.5.2 Khảo sát hoạt tính sinh học các cao phân đoạn
3.5.2.1 Khảo sát hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH
Các mẫu cao được đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH được mô tả Kết quả được trình bày ở bảng 3.5, phụ lục 2, 3 và 4
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/ml)
Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng chống oxy hóa của cao cồn toàn phần và các phân đoạn có sự khác biệt rõ rệt, trong đó một số cao thể hiện tác dụng rất mạnh Phân đoạn EtOAc cho thấy hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 4,91 ± 0,0519 µg/ml, vượt xa cả vitamin C, chất chống oxy hóa chuẩn (IC50 5,21 ± 0,2143 µg/ml) Tiếp theo là phân đoạn n-BuOH và cao cồn toàn phần, với giá trị IC50 lần lượt là 10,63 ± 1,1751 và 10,07 ± 0,1585 µg/ml, cho thấy khả năng chống oxy hóa tốt Trong khi đó, phân đoạn CHCl3 có hoạt tính yếu hơn với IC50 là 54,63 ± 2,1262 µg/ml, và phân đoạn n-Hex thể hiện khả năng chống oxy hóa yếu nhất, với mức giảm 25,14% ở nồng độ 100 µg/ml.
3.5.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Các mẫu cao cồn và cao phân đoạn đều được đánh giá về hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu điều trị các bệnh chuyển hóa Kết quả đánh giá chi tiết của các mẫu này đã được trình bày rõ ràng trong bảng 3.6 cùng với phụ lục 5, 6 và 7, thể hiện mức độ ức chế và tiềm năng ứng dụng của chúng trong ngành y học và dược phẩm.
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym α -glucosidase Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/ml)
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao toàn phần và các phân đoạn của nó đều có khả năng ức chế enzym α-glucosidase mạnh, trong đó phân đoạn EtOAc đạt giá trị IC50 thấp nhất là 0,85 ± 0,0072 µg/ml, cho thấy hiệu quả ức chế vượt trội Tiếp theo là cao cồn toàn phần (IC50 1,15 ± 0,0522 µg/ml), phân đoạn n-BuOH (IC50 1,99 ± 0,0503 µg/ml) và CHCl3 (IC50 4,23 ± 0,0636 µg/ml), với khả năng ức chế không chênh lệch nhiều Trong khi đó, n-Hex thể hiện khả năng ức chế yếu nhất với IC50 là 42,19 ± 1,7010 µg/ml, nhưng vẫn cho thấy khả năng ức chế tốt hơn nhiều so với thuốc đối chứng acarbose, có IC50 là 584,70 ± 56,51 µg/ml.
Dựa trên quá trình sàng lọc ban đầu, cao cồn toàn phần cùng các phân đoạn CHCl3, EtOAc và n-BuOH từ lá C dormoyana thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ, trong đó phân đoạn EtOAc nổi bật với tác dụng vượt trội trên cả hai mô hình chống oxy hóa DPPH và ức chế enzyme α-glucosidase Tiếp theo là phân đoạn n-BuOH và cao cồn có hoạt tính cao, trong khi phân đoạn CHCl3 cũng thể hiện khả năng ức chế α-glucosidase đáng kể Phân đoạn n-Hex cũng cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase khá tốt, tuy nhiên mức độ dọn gốc tự do còn hạn chế.
DPPH (100 µg/ml) có hoạt tính yếu hơn nhiều so với các phân đoạn cũ, trong khi cao cồn toàn phần thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao trên cả hai mô hình thử nghiệm, thậm chí vượt trội so với các phân đoạn như n-BuOH, CHCl3 và n-Hex Điều này có thể nhờ vào sự hiệp đồng tác động của các hợp chất có trong cao cồn, góp phần tăng cường khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase Kết quả so sánh này được trình bày rõ ràng tại hình 3.14.
Dựa trên kết quả khảo sát, phân đoạn EtOAc được chọn làm bước tiếp theo để phân lập các hợp chất, nhằm đánh giá hoạt tính sinh học của chúng Các hợp chất phân lập từ phân đoạn này sẽ được thử nghiệm trên hai mô hình thử nghiệm khác nhau để xác định tiềm năng hoạt chất Việc lựa chọn phân đoạn EtOAc dựa trên khả năng chiết xuất hiệu quả và tiềm năng chứa các hoạt chất sinh học quan trọng, góp phần thúc đẩy nghiên cứu và phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên.
Hình 3.14 So sánh hoạt tính các cao chiết trên 2 mô hình 3.5.3 Phân tách phân đoạn EtOAc bằng các kỹ thuật sắc ký
Phân đoạn EtOAc (E) được phân tách thành các phân đoạn nhỏ hơn bằng kỹ thuật sắc ký cột quá tải với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 8 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 500 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 45 g phân đoạn EtOAc, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy gradient với dung môi nền là CHCl3, tăng dần tỷ lệ MeOH đến 50%, cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 100 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH (100:17:13:0,2) để xác định thành phần của mẫu Quá trình phát hiện diễn ra qua việc soi dưới ánh sáng UV 254 nm và UV 365 nm, đồng thời nhúng thuốc thử VS và FeCl3 để nhận biết các hợp chất có trong phân đoạn Theo dõi sắc ký đồ giúp phân chia các phân đoạn có cùng đặc điểm sắc ký đồ, sau đó gộp các phân đoạn này và cô quay để thu được các mẫu tinh khiết, đảm bảo chất lượng phân tích và tối ưu hóa quy trình chiết xuất.
Kết quả: Từ 40g phân đoạn EtOAc, qua sắc ký cột quá tải thu được 7 phân đoạn từ E.1 - 7 Khối lượng các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.15
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn EtOAc
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột (CHCl 3 - MeOH) Khối lượng (g)
Hình 3.15 Kết quả sắc ký phân đoạn EtOAc
Phân tách phân đoạn E.3 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 1,80 g phân đoạn E.3, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 10 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-HCOOH (9:1:0,2) giúp xác định thành phần chất Phương pháp phát hiện chính bao gồm quang phổ UV tại 254 nm và 365 nm, cùng với nhúng thuốc thử VS và FeCl3 để nhận diện các hợp chất Quá trình theo dõi sắc ký đồ và gộp các phân đoạn có cùng đặc điểm giúp tối ưu hóa việc thu nhận các phân đoạn chứa thành phần mong muốn Sau đó, cô quay các phân đoạn để thu được mẫu tinh khiết phù hợp cho các bước phân tích tiếp theo.
Kết quả: Từ 1,80 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 6 phân đoạn từ
E.3.1-6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.16
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.3
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.16 Kết quả phân tách phân đoạn E.3 bằng sắc ký cột
Phân tách phân đoạn E.4 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 2,32 g phân đoạn E.4, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 15 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH, theo dõi phản ứng với thử VS và FeCl3 để xác định thành phần Quá trình này giúp phân tích sắc ký đồ, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ tương tự và cô quay để thu được các phân đoạn tinh khiết.
Kết quả: Từ 2,32 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn từ
E.4.1-7 Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.17.
Bảng 3.9 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.4
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.17 Kết quả phân tách phân đoạn E.4 bằng sắc ký cột
Phân tách phân đoạn E.5 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 3,19 g phân đoạn E.5, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 15 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-HCOOH (8:2:0,2) để xác định thành phần hợp chất Quá trình phát hiện thực hiện bằng cách soi dưới ánh sáng UV 254 nm và UV 365 nm, đồng thời nhúng thuốc thử VS và FeCl3 để nhận diện các hợp chất có trong mẫu Theo dõi sắc ký đồ giúp so sánh và gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, sau đó cô đặc để thu được các phân đoạn có chứa hợp chất mong muốn.
Kết quả: Từ 2,32 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn từ
E.5.1-6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.18
Bảng 3.10 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.5
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.18 Kết quả phân tách phân đoạn E.5 bằng sắc ký cột 3.5.4 Phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn
Nghiên cứu hóa học
3.5.1 Chiết các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana
Bột lá C dormoyana (4 kg) được ngấm kiệt với cồn 96%, tạo thành dịch chiết cồn, sau đó cô quay chân không và bay hơi trên bếp cách thủy để thu được 570 g cao cồn Quá trình lắc phân bố lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần giúp tách các phân đoạn hoạt chất, được trình bày rõ ràng trong hình 3.12 Phương pháp này giúp tối ưu hóa việc chiết xuất các hợp chất sinh học từ bột lá C dormoyana một cách hiệu quả.
Hình 3.12 trình bày kết quả phân tách các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana bằng phương pháp phân đoạn trên lớp mỏng sử dụng dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – HCOOH (8:2:0,1) Phân tích này nhằm sơ bộ đánh giá và so sánh thành phần hóa học của cao cồn, kết quả được thể hiện trong hình 3.13 để giúp xác định thành phần chính của mẫu phân đoạn.
Hình 3.13 Sắc ký các phân đoạn từ cao cồn lá C dormoyana
Kết quả sắc ký cho thấy phân đoạn EtOAc và n-BuOH có nhiều vết tắt quang ở
UV254 và các vết phát huỳnh quang xuất hiện ở UV365 cho thấy sự hiện diện của các hợp chất huỳnh quang trong mẫu Bản mỏng khi nhúng thuốc thử VS cho thấy xuất hiện một số vết màu vàng và vàng cam, tương ứng với các vết tắt quang Tuy nhiên, phần lớn các vết tắt quang ở UV254 đều không phát sáng màu với thuốc thử, cho thấy mức độ phát huỳnh quang thấp hoặc không có trong mẫu Kết quả này giúp đánh giá khả năng phát huỳnh quang của các hợp chất trong mẫu và hỗ trợ phân tích chất lượng nước hiệu quả.
Trong bản mỏng nhúng thuốc thử FeCl3 1%, phân đoạn EtOAc cho nhiều vết màu xanh đen và xanh đậm, chứng tỏ chứa các hợp chất pyrogallic Các phân đoạn này tiếp tục được sàng lọc sinh học để xác định các phân đoạn có hoạt tính sinh học mạnh, từ đó tiến hành phân lập các hợp chất tinh khiết Quá trình này giúp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên tiềm năng trong các phân đoạn EtOAc, góp phần phát triển các sản phẩm dược phẩm và mỹ phẩm.
3.5.2 Khảo sát hoạt tính sinh học các cao phân đoạn
3.5.2.1 Khảo sát hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH
Các mẫu cao được đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH được mô tả Kết quả được trình bày ở bảng 3.5, phụ lục 2, 3 và 4
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/ml)
Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng chống oxy hóa của cao cồn toàn phần và các phân đoạn có sự khác biệt rõ rệt Phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng mạnh nhất với giá trị IC50 chỉ 4,91 ± 0,0519 µg/ml, vượt xa cả chứng dương là vitamin C (IC50 5,21 ± 0,2143 µg/ml), cho thấy khả năng chống oxy hóa vượt trội Tiếp theo, phân đoạn n-BuOH và cao cồn toàn phần có giá trị IC50 lần lượt là 10,63 ± 1,1751 và 10,07 ± 0,1585 µg/ml, thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt Trong khi đó, phân đoạn CHCl3 có tác dụng yếu hơn với IC50 là 54,63 ± 2,1262 µg/ml, và phân đoạn n-Hex thể hiện khả năng chống oxy hóa thấp nhất với mức giảm 25,14% ở nồng độ 100 µg/ml, cho thấy khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn khác nhau đáng kể, phù hợp với các tiêu chuẩn về hoạt tính chống oxy hóa trong phân tích thực phẩm và dược phẩm.
3.5.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Các mẫu cao cồn và cao phân đoạn được đánh giá về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, giúp xác định tiềm năng của chúng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa đường Kết quả nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng 3.6 cũng như các phụ lục 5, 6 và 7, cung cấp dữ liệu quan trọng về khả năng hoạt động sinh học của các mẫu thử Những phát hiện này góp phần làm rõ tiềm năng ứng dụng của cao cồn và cao phân đoạn trong phát triển dược phẩm hỗ trợ kiểm soát đường huyết.
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym α -glucosidase Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/ml)
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao toàn phần và các phân đoạn chiết xuất đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase mạnh, đặc biệt phân đoạn EtOAc với giá trị IC50 là 0,85 ± 0,0072 μg/ml thể hiện hiệu quả vượt trội Các phân đoạn như cao cồn toàn phần (IC50 1,15 ± 0,0522 μg/ml), n-BuOH (IC50 1,99 ± 0,0503 μg/ml), và CHCl3 (IC50 4,23 ± 0,0636 μg/ml) cũng có khả năng ức chế enzyme, với sự khác biệt không đáng kể so với nhau Trong khi đó, cao n-Hex chỉ đạt hiệu quả trung bình yếu nhất với IC50 là 42,19 ± 1,7010 μg/ml, tuy nhiên vẫn cho thấy mức ức chế cao hơn nhiều so với chất chuẩn acarbose (IC50 584,70 ± 56,51 μg/ml), chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát đường huyết.
Qua quá trình sàng lọc ban đầu, các phân đoạn cao cồn toàn phần, CHCl3, EtOAc và n-BuOH từ lá C dormoyana thể hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ Trong đó, phân đoạn EtOAc nổi bật với tác dụng vượt trội trên cả hai mô hình DPPH và ức chế enzym α-glucosidase, tiếp theo là phân đoạn n-BuOH, cao cồn và CHCl3 Phân đoạn n-Hex cũng cho thấy khả năng ức chế enzym α-glucosidase khá tốt, mặc dù khả năng quét gốc tự do còn hạn chế.
DPPH (100 µg/ml) cho thấy hoạt tính yếu hơn nhiều so với các phân đoạn cũ còn lại, trong khi cao cồn toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa cao trên cả hai mô hình thử nghiệm Hoạt tính này thậm chí còn vượt trội hơn so với các phân đoạn như n-BuOH, CHCl₃ và n-Hex, nhờ vào sự hiệp đồng tác động của các hợp chất có trong cao cồn Kết quả so sánh về khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn được trình bày rõ ràng trong hình 3.14.
Dựa trên kết quả khảo sát, phân đoạn EtOAc được chọn để tiếp tục quá trình phân lập các hợp chất hoạt tính Các hợp chất đã phân lập từ phân đoạn này sẽ được thử nghiệm trên hai mô hình thử nghiệm khác nhau để đánh giá hoạt tính sinh học của chúng Phương pháp này giúp xác định các hợp chất tiềm năng có khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực y học và dược phẩm.
Hình 3.14 So sánh hoạt tính các cao chiết trên 2 mô hình 3.5.3 Phân tách phân đoạn EtOAc bằng các kỹ thuật sắc ký
Phân đoạn EtOAc (E) được phân tách thành các phân đoạn nhỏ hơn bằng kỹ thuật sắc ký cột quá tải với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 8 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 500 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 45 g phân đoạn EtOAc, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy gradient với dung môi nền là CHCl3, tăng dần tỷ lệ MeOH đến 50%, cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 100 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH (100:17:13:0,2) giúp xác định các hợp chất Quá trình phát hiện diễn ra qua việc soi dưới ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, kết hợp với nhúng thuốc thử VS và FeCl3 để quan sát các phản ứng màu sắc Theo dõi các sắc ký đồ và gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau sau đó cô quay để thu được các phân đoạn tinh khiết, đảm bảo hiệu quả và độ chính xác trong phân tích hợp chất.
Kết quả: Từ 40g phân đoạn EtOAc, qua sắc ký cột quá tải thu được 7 phân đoạn từ E.1 - 7 Khối lượng các phân đoạn được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.15
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn EtOAc
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột (CHCl 3 - MeOH) Khối lượng (g)
Hình 3.15 Kết quả sắc ký phân đoạn EtOAc
Phân tách phân đoạn E.3 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 1,80 g phân đoạn E.3, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 10 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-HCOOH (9:1:0,2) giúp xác định các hợp chất trong mẫu Quá trình phát hiện được thực hiện bằng cách soi tia UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, cùng với nhúng thuốc thử như VS và FeCl3 để xác định các hợp chất có trong phân đoạn Theo dõi sắc ký đồ và gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, sau đó cô quay để thu được các phân đoạn cuối cùng, đảm bảo hiệu quả và chính xác trong phân tích.
Kết quả: Từ 1,80 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 6 phân đoạn từ
E.3.1-6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.16
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.3
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.16 Kết quả phân tách phân đoạn E.3 bằng sắc ký cột
Phân tách phân đoạn E.4 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 2,32 g phân đoạn E.4, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 15 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH kết hợp thử phản ứng với VS và FeCl3 để xác định thành phần Quá trình theo dõi sắc ký đồ giúp phân chia các phân đoạn có cùng đặc điểm, sau đó cô quay để cô thành các phân đoạn riêng biệt Phương pháp này giúp xác định chính xác thành phần trong mẫu phân đoạn một cách hiệu quả và nhanh chóng.
Kết quả: Từ 2,32 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn từ
E.4.1-7 Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.17.
Bảng 3.9 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.4
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.17 Kết quả phân tách phân đoạn E.4 bằng sắc ký cột
Phân tách phân đoạn E.5 bằng sắc ký cột cổ điển với các thông số sau:
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 2,5 x 60 cm, rửa sạch, sấy khô
- Pha tĩnh: 100 g silica gel, cỡ hạt trung bình 40 – 63 μm, nhồi cột ướt
- Mẫu: 3,19 g phân đoạn E.5, nạp mẫu khô
- Pha động: chạy với dung môi nền là EtOAc, sau đó tăng lên EtOAc-MeOH (90:10) cuối cùng là MeOH 100%
- Thể tích hứng phân đoạn: 15 ml
Kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-HCOOH (8:2:0,2) giúp xác định các thành phần trong mẫu Quá trình phát hiện diễn ra qua phương pháp soi dưới tia UV 254 nm và 365 nm, cùng với nhúng thuốc thử VS và FeCl3 để xác nhận sự có mặt của các hợp chất Theo dõi quá trình sắc ký và gộp các phân đoạn có cùng đặc điểm sắc ký giúp thu được các phân đoạn riêng biệt, đảm bảo phân tích chính xác và hiệu quả.
Kết quả: Từ 2,32 g phân đoạn E.3 tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn từ
E.5.1-6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.18
Bảng 3.10 Kết quả sắc ký cột quá tải phân đoạn E.5
Phân đoạn Phân đoạn hứng Hệ chạy cột EtOAc Khối lượng (mg)
Hình 3.18 Kết quả phân tách phân đoạn E.5 bằng sắc ký cột 3.5.4 Phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn
Phân đoạn E.3.3 (280,6 mg) sau quá trình phân tích xuất hiện tủa màu vàng và đã được lọc rửa nhiều lần bằng EtOAc để loại bỏ tạp chất Tiếp theo, tủa được kết tinh nhiều lần trong MeOH lạnh, giúp thu được 20,8 mg tủa vô định hình màu vàng sáng đảm bảo độ tinh khiết cao Quá trình này góp phần nâng cao hiệu quả thu nhận hợp chất tinh khiết, phù hợp cho các nghiên cứu phân tích và ứng dụng tiếp theo.
Thử nghiệm tác dụng sinh học các một số hợp chất phân lập được
3.6.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa bằng mô hình loại gốc tự do DPPH
Thử nghiệm được tiến hành theo mục 3.3.2.2 với chứng dương là vitamin C Kết quả được trình bày trong bảng 3.25, phụ lục 46 và 47
Bảng 3.25 Kết quả thử nghiệm hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH của chất phân lập Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/àM)
Các hợp chất C2, C3, C5, C6 đều có khả năng thu dọn gốc tự do trong các mô hình thử nghiệm, góp phần chống oxy hóa hiệu quả Trong đó, hợp chất C5 nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh nhất, thể hiện qua giá trị IC50 chỉ 10,61 ± 0,1628 µM, vượt xa so với chứng dương là vitamin C These findings suggest that C5 có tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và chống lão hóa nhờ hoạt tính chống oxy hóa vượt trội.
Trong nghiên cứu, mức độ chống oxy hóa của các chất được đánh giá qua mô hình DPPH, trong đó C1, C4 và C7 thể hiện khả năng chống oxy hóa rất yếu Các chất C3, C6 và C2 lần lượt xếp theo thứ tự giảm dần về hoạt tính chống oxy hóa, tuy nhiên sự khác biệt giữa chúng và kết quả dương tính không đáng kể Kết quả cho thấy, các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa thấp, phù hợp để nghiên cứu thêm về tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực liên quan đến chống oxy hóa.
3.6.2 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α -glucosidase
Thử nghiệm được tiến hành theo mục 3.3.2.2 với chứng dương là acarbose Kết quả được trình bày trong bảng 3.26, phụ lục 48 và 49
Bảng 3.26 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzym α -glucosidase của chất phân lập Mẫu Nồng độ (àg/ml)/ % ức chế R 2 IC 50 (àg/àM)
Các hợp chất C1, C2, C3, C6 đều thể hiện khả năng ức chế enzym α-glucosidase vượt trội hơn so với thuốc tiêu chuẩn acarbose (IC50 862,85 ± 54,31 μM) Trong đó, C2 có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 51,70 ± 0,90 μM, tiếp theo là C1 (IC50 69,21 ± 4,67 μM), C6 (IC50 251,36 ± 10,82 μM), và C3 (IC50 272,40 ± 3,55 μM) Ngược lại, các hợp chất C4, C5, C7 cho thấy mức độ ức chế enzym α-glucosidase yếu hơn rất nhiều so với các hợp chất còn lại, theo bảng 3.27.
Bảng 3.27 Giá trịnh IC 50 của các chất phân lập trên 2 mô hình thử nghiệm
Kết quả thử nghiệm cho thấy các hợp chất C2, C3 và C6 đều thể hiện hoạt tính tích cực trên cả hai mô hình thử nghiệm Trong nghiên cứu này, hợp chất C1 nổi bật với khả năng ức chế enzym α-glucosidase, góp phần vào hoạt tính kiểm soát đường huyết Hợp chất C5 thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do rất mạnh mẽ, góp phần chống oxy hóa hiệu quả Trong khi đó, hợp chất C4 và C7 thể hiện hoạt tính rất yếu trên cả hai mô hình thử nghiệm, cho thấy tiềm năng hạn chế trong ứng dụng.
Bàn luận
Trong thời gian thực hiện, đề tài đã nghiên cứu đặc điểm thực vật học và hóa học của loài Trà hoa vàng Camellia sp thu hái tại Vườn Quốc Gia Nam Cát Tiên Nghiên cứu tập trung vào khả năng chống oxy hóa của trà bằng phương pháp DPPH, cho thấy khả năng quét các gốc tự do hiệu quả Bên cạnh đó, trà còn được khảo sát về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase, góp phần làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate thành glucose, hỗ trợ kiểm soát đường huyết Các kết quả này cho thấy Trà hoa vàng có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe và phòng ngừa các bệnh liên quan đến oxy hóa và rối loạn chuyển hóa.
3.7.1 Về đối tượng nghiên cứu Đề tài đã định danh được đối tượng nghiên cứu thông qua phân tích các mẫu thu thập được Nhận thấy mẫu có các đặc điểm tương đồng với loài C dormoyana như:
Hoa mọc đơn đầu cành, cuống nhỏ hoặc không có cuống, được bao phủ bởi các lá đài phụ chồng lên nhau Hoa có màu vàng đến vàng đậm, cỡ vừa với kích thước từ 5 cm trở lên, tạo nên vẻ đẹp rực rỡ và hấp dẫn.
Cây Camellia có hoa dài khoảng 6 cm, với từ 12 cánh hoa hình thìa có màu vàng từ nhạt đến đậm, phần rìa nhạt hơn, giống sáp, giòn và dễ gãy Phần bầu trên của hoa có 5-6 ô nhẵn, vòi nhụy nhẵn, gồm 5-6 vòi hợp nhất Quả nang hình cầu, thường có 5 khía dọc sâu khoảng 1.1 cm Các đặc điểm của loài Camellia sp được so sánh với mẫu C dormoyana ở các khu vực Lâm Đồng và Bình Phước để xác định chính xác loài, và mẫu đã được xác định là C dormoyana (Pierre) Sealy, xác nhận bởi TS Lương Văn Dũng.
Mẫu A-G mô tả quá trình thu hái tại Lâm Đồng, bao gồm các bộ phận như hoa, cành non, đài phụ, lá đài, cánh hoa, đài hoa và bộ nhụy, nhụy, cụm hoa, nụ hoa, hoa, đài và nhụy hoa, và quả Trong khi đó, Mẫu H-M ghi nhận các mẫu từ tỉnh Bình Phước, tập trung vào các bộ phận tương tự như hoa, cành non, đài phụ, lá đài, cánh hoa, đài hoa và bộ nhụy, nhụy, cụm hoa, nụ hoa, hoa, đài và nhụy hoa, cùng quả Các mẫu này giúp xác định đặc điểm của từng phần cây trong các khu vực khác nhau, hỗ trợ nghiên cứu và thu hái các loại cây tại Lâm Đồng và Bình Phước một cách chính xác, phù hợp với quy trình thu hái và phân loại theo từng tỉnh.
Hình 3.35 Hình thái loài được thu hái và sưu tầm từ Lâm Đồng và Bình Phước 3.7.2 Về kết quả sàng học sinh học và nghiên cứu hóa học
3.7.2.1 Sơ bộ thành phần hóa học
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá C dormoyana cho thấy sự hiện diện của saponin, tanin, polyphenol, flavonoid, axit hữu cơ, chất khử, carotenoid, triterpen, và tinh dầu, phù hợp với các kết quả đã công bố trước đây Thành phần này cũng tương đồng với nhiều loài trà hoa vàng và hoa đỏ như C dalatensis, C longii, C thuongiana, và C dilinhensis Đặc biệt, các loài trà hoa vàng không chứa alkaloid, nhóm thường có trong trà xanh, và caffein cũng không được phát hiện trong lá và hoa của C chrysantha, theo nghiên cứu của Phạm Cao Bách và cộng sự (2020) Các loài trà hoa vàng không chứa caffein cho thấy tiềm năng trở thành nguyên liệu thay thế không chứa caffein, giúp tránh các tác dụng phụ không mong muốn của caffein.
3.7.2.2 Hàm lượng polyphenol từ dịch chiết nước
Polyphenol là các hợp chất tự nhiên quan trọng với khả năng chống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ung thư đại trực tràng, rối loạn chức năng gan, béo phì và đái tháo đường Hiện nay, trà được chế biến chủ yếu bằng cách hãm nước nóng, và việc xác định hàm lượng polyphenol trong nước nóng là cần thiết để đánh giá tiềm năng của phương pháp này Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng polyphenol trong dịch chiết từ lá C dormoyana là 31,80 ± 0,9538 mg GAE/g, thấp hơn so với trà xanh (C sinensis) cùng điều kiện thử Mặc dù hàm lượng polyphenol chiết bằng nước khá thấp, nhưng nếu vượt 20 mg GAE/g, sẽ có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, điều này cho thấy lá C dormoyana vẫn có tiềm năng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gốc tự do.
3.7.2.3 Quá trình chiết xuất và sàng lọc ban đầu quả sàng lọc sinh học ban đầu cho thấy phân đoạn CHCl3, EtOAc và n-BuOH đều cho tác dụng tốt trên cả 2 mô hình thử nghiệm Phân đoạn EtOAc cho thấy tác dụng tốt nhất, tiếp theo sau là n-BuOH và CHCl3, phân đoạn n-hex cho thấy tiềm năng trên mô hình ức chế enzyme α-glucosidase Như vậy phân đoạn EtOAc được đề xuất tiếp tục nghiên cứu
Từ phân đoạn EtOAc toàn phần, chúng tôi tiến hành phân tách thành các phân đoạn đơn giản hơn nhằm mục đích phân lập các hoạt chất sinh học quan trọng Phân đoạn này đặc trưng bởi khả năng hấp thụ UV mạnh, thể hiện qua nhiều vết tối sáng tại quang phổ UV, giúp xác định các hoạt chất tiềm năng trong quá trình phân tích hóa học.
Quá trình phân lập sử dụng sắc ký đã thu được 7 phân đoạn, trong đó phân đoạn E.6 có một tủa lớn (468,8 mg) sau nhiều lần kết tinh để thu được C7 tinh khiết, còn phân đoạn E.7 có khối lượng lớn (24,48 g) và cho màu xanh đậm với thuốc thử FeCl₃ 1 %, chứa nhiều hợp chất phenol rất phân cực nhưng khó phân lập, tinh chế hoặc làm sạch bằng các kỹ thuật sắc ký thông thường Các vết quang dễ theo dõi bằng UV-254 trên sắc ký lớp mỏng giúp thuận tiện trong quá trình phân tách và tinh khiết hóa các hợp chất phenolic Sự khác biệt giữa các phân đoạn phản ánh mức độ dễ hoặc khó trong quá trình phân lập các hợp chất polyphenol từ mẫu ban đầu.
Kết quả phân đoạn EtOAc đã dẫn xuất và xác định cấu trúc của 8 hợp chất, trong đó bao gồm các nhóm flavonoid và acid phenolic Các hợp chất flavonoid phân lập thuộc khung flavonol, gồm kaempferol (C2), kaempferol-7-O-α-L-rhamnose (C3), và kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid 7-O-α-L-rhamnopyranosid (C7) Kaempferol là một flavonoid phổ biến có mặt trong nhiều nguồn tự nhiên như trà đen, trà xanh, bông cải, dâu tây, với các đặc tính sinh học chính gồm khả năng chống oxy hóa, ức chế 5α-reductase, chống viêm và bảo vệ da Hợp chất epicatechin (C6), thuộc khung flavan-3-ol, nổi bật với các tác dụng có lợi cho sức khỏe như chống oxy hóa, chống ung thư, phòng ngừa bệnh tim mạch, kháng khuẩn, chống vi-rút và bảo vệ thần kinh Các hợp chất thuộc nhóm acid phenolic cũng góp phần vào nhóm các hợp chất phân lập từ phân đoạn này.
C1 (acid 3’-methoxy-3,4-methylendioxyellagic 4’-O-β-D-glucopyranosid), C4 (acid
Các hợp chất như 3,3’,4-trimethoxylellagic, C5 (axit gallic), C8 (axit 3’-methoxyellagic-4-O-β-D-(6’’-galloyl)glucopyranosid) đã được xác định trong nghiên cứu này Axit gallic đã được chứng minh có khả năng chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, chống đột biến và chống ung thư Ngoài ra, các hợp chất axit ellagic thể hiện khả năng chống ung thư, bảo vệ gan, ức chế DNA topoisomerase, cũng như chống oxy hóa, viêm và bảo vệ dạ dày Các hợp chất này đều được phân lập và báo cáo lần đầu tiên từ loài C dormoyana Qua các công cụ tìm kiếm như Google Scholar, ChemSpider, SciFinder, hợp chất C4 được xác định lần đầu tiên từ loài thuộc chi Camellia.
C8 là cấu trúc lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên, nhưng dữ liệu hình thành của C8 vẫn chưa đầy đủ do tín hiệu trên phổ NMR còn thấp và một số tín hiệu bị mất Vì vậy, cấu trúc C8 hiện vẫn chỉ là cấu trúc dự kiến, cần phân lập thêm để xác định chính xác cấu trúc của nó.
3.7.2.5 Thử nghiệm sinh học các chất phân lập được
Hợp chất C8 có khối lượng khá thấp (3,5 mg) chỉ đủ để xác định cấu trúc, vì vậy
7 hợp chất (C1-7) được khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Kết quả thử nghiệm cho thấy 4 trên 7 chất có tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH (C2, C3, C5, C6) Trong đó C2 và C3 là các chất thuộc nhóm kaempferol
Kaempferol thể hiện khả năng chống oxy hóa vượt trội trong mô hình DPPH nhờ khả năng cho đi H●, tạo liên kết hydro giữa gốc phenoxy và H● của nhóm OH để ngăn chặn sự phân chia điện tử chưa ghép đôi, hình thành kaempferol quinon bền vững Các nhóm 3-OH, 3’-OH, 4’-OH và liên kết đôi tại C-2 đều góp phần vào khả năng chống oxy hóa của hợp chất này, giải thích vì sao C7 trong khung kaempferol lại thể hiện khả năng chống oxy hóa yếu khi nhóm 3-OH bị thay thế bằng nhóm -O- glucosyl Epicatechin thuộc nhóm flavan-3-ol thiếu nhóm carbonyl tại C-4 và liên đôi tại C-2=C-3, dẫn đến quá trình oxy hóa catechin phức tạp hơn, có thể đi kèm với sự hình thành quinon và dimer hóa Nghiên cứu cho thấy các hợp chất flavanol phản ứng chậm và kéo dài hơn so với các flavonoid khác, do đặc điểm riêng của cấu trúc flavanol không tuân theo các quy tắc phản ứng thông thường.
Hình 3.36 Cơ chế cho H ● liên quan khả năng chống oxy hóa của kaempferol
Acid gallic (C5) là chất chống oxy hóa mạnh nhất trong các hợp chất phenolic, thường được sử dụng làm chuẩn trong các thử nghiệm khả năng chống oxy hóa Cấu trúc của acid gallic gồm ba nhóm -OH trên vòng thơm và một nhóm -COOH, nhờ đó hợp chất có khả năng cho proton từ các nhóm -OH và khả năng phân ly proton của -COOH trong dung dịch, tạo nên khả năng trung hòa gốc tự do DPPH vượt trội Giá trị IC50 của acid gallic trong các nghiên cứu phù hợp với các báo cáo trước về khả năng chống oxy hóa của nó Trong khi đó, các hợp chất C1 và C4, được tổng hợp từ hai đơn vị acid gallic nhưng đã thay thế nhóm -OH bằng -OCH3 hoặc -O-glucosyl, thể hiện khả năng chống oxy hóa yếu hơn nhiều trên mô hình DPPH.
