- Tách cao toàn phần thành các các phân đoạn đơn giản hơn bằng phân bố lỏng –lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần.. Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform - Tiến hành SK
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN
ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN
XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA)
TRỒNG Ở ĐỒNG NAI
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN
ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN
XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA)
TRỒNG Ở ĐỒNG NAI
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương
Ký tên
Thành phố Hồ Chí Minh – 2019
Trang 3I ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 3
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu…… 3
2.2 Phương pháp nghiên cứu……….4
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……….4
3.1 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn……… 5
3.2 Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform……….6
3.3 Phân lập các chất trong cao CHCl3………7
3.4 Xác định cấu trúc các chất phân lập được………12
III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 17
IV TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 18
Trang 4I ĐẶT VẤN ĐỀ:
Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill, thuộc họ
Cam (Rutaceae) phân bố chủ yếu ở Việt Nam và Thái Lan [12] Tại Việt Nam, Xáotam phân mọc chủ yếu ở Khánh Hòa, Ninh Thuận Vào năm 2013, tin đồn Xáo tamphân chữa được năm loại bệnh ung thư nở rộ, người dân ở khắp nơi đã “đua nhau”tìm mua sử dụng, và xem đó như một “thần dược” Do nhu cầu Xáo tam phân tăngcao, người dân ở các địa phương nói trên đã đổ xô đi thu hái Xáo tam phân trong tựnhiên để bán Hệ quả của việc khai thác tràn lan này đã làm cho Xáo tam phân hầunhư bị tận diệt trong tự nhiên Do nhu cầu sử dụng Xáo tam phân cao nên một sốngười dân đã nghiên cứu nhân giống thành công và đã trồng khá tập trung trên cácvùng đất ven đồi ở một vài huyện của tỉnh Đồng Nai Việc trồng Xáo tam phânmang lại hiệu quả kinh tế khá cao, cây trồng khoảng 3-5 năm là có thể thu hoạchđược Hiện tại, trên thị trường giá của Xáo tam phân khá cao khoảng (5 – 6 triệuđồng/ kg rễ tươi loại tốt; 2 triệu đồng/ kg thân, lá tươi)
Cho tới nay, các báo cáo về cây Xáo tam phân hầu như chỉ thực hiện chủ yếu trên rễcây mọc tự nhiên về thực vật, hóa học, tác dụng dược lý và kiểm nghiệm với các nộidung cụ thể như sau:
- Về thực vật: Báo cáo về hình thái và vi học của Xáo tam phân [18]
- Về hóa học: Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của một số hợp chấtthuộc nhóm coumarin, triterpenoid và acridon alkaloid [14], [7], [3], [16], [15], [6]
- Về tác dụng dược lí: Về tác dụng: Cao chiết methanol, phân đoạn n-hexan và hợpchất ostruthin phân lập từ Xáo tam phân có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp khi thửnghiệm trên nhuột nhắt trắng; có tác dụng ức chế và tiêu diệt đối với 5 dòng tế bàoung thư gồm: ung thư gan Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDAMB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela, trong đó tácdụng mạnh nhất đối với ung thư cổ từ cung Hela và ung thư gan Hep-G2 nghiêncứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thưcủa Xáo tam phân [13]
- Về kiểm nghiệm: Đã có 2 công trình trong nước công bố về định lượng ostruthin[1] hoặc định lượng đồng thời ostruthin và 8-methoxxy ostruthin trong rễ Xáo tamphân bằng HPLC [5]
Trang 5Theo kinh nghiệm dân gian, bộ phận dùng chủ yếu của Xáo tam phân là rễ Cònphần trên mặt đất của Xáo tam phân thì ít được sử dụng Nếu phần thân cũng có tácdụng tốt như phần rễ thì sẽ càng nâng cao giá trị của cây Xáo tam phân.Vấn đề đặt
ra là các bộ phận trên mặt đất có tác dụng không và thành phần hóa học của chúng
như thế nào? Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn
clorororm của thân Xáo tam phân Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill
Rutaceae” được tiến hành góp phần giải đáp một phần câu hỏi ở trên Đề tài được
thực hiện với những nội dung sau:
- Chiết xuất cao toàn phần từ thân Xáo tam phân thu hái tại Đồng Nai
- Tách cao toàn phần thành các các phân đoạn đơn giản hơn bằng phân bố lỏng –lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần
- Phân lập và tinh chế các hợp chất trong phân đoạn CHCl3
- Xác định cấu trúc và định danh các hợp chất phân lập được
Trang 6II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Nguyên liệu là thân cây Xáo tam phân trồng 3 năm được lấy mẫu trực tiếp ở ĐồngNai Sau khi thu hái, rửa sạch, thái lát mỏng (bằng máy thái dược liệu của cơ sởtrồng trọt), sấy nhẹ cho khô và xay bột thô cho chiết xuất (Hình 1.)
Thân xáo tam phân trồng ở Đồng Nai thái lát
2.1.2 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Dung môi: cồn 96%, n-butanol, diethyl ether, n-hexan, cloroform, ethyl acetat,methanol,… dùng loại AR do Trung Quốc sản xuất
- Thuốc thử FeCl3 1% và KOH 5%/cồn, vanilin-sulfuric (VS) và một số hóa chất cơbản khác
- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art 1.05554)
- Silica gel (HiMedia Laboratories) cỡ hạt 40-63 μm
2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị:
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire
C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art 1.05554)
- SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn(Merck) cỡ hạt 15- 40µm)
Máy cô quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấyGallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký và các dụng
Trang 7cụ thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu vàPhòng nghiên cứu hóa các hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo và nghiêncứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM.
- Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters)
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóahọc thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội
- Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire
C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm)
- Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trênmáy HPLC
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
- Bột thân Xáo tam phân được chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi dung môibằng áp suất giảm, thu được cao lỏng
- Cao lỏng được lắc phân bố với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần,bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol, cô dưới áp suất giảm cho các cao tươngứng: n-hexan, cao cloroform, cao n-butanol và cao nước Sử dụng cao CHCl3 đểphân lập các hợp chất
2.2.2 Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform
- Tiến hành SKLM và khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau
- Chọn hệ dung môi phân tích cho kiểm tra các phân đoạn và chất tinh khiết
- Chọn hệ dung môi cho SKC
2.2.4 Phân lập
2.2.4.1 SKC chân không (VLC): Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm
2.2.4.2 Phân lập bằng SKC cổ điển: Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm
- Tinh chế: Các phân đoạn sau khi cô quay được kết tinh hay kết tinh phân đoạn
trong lượng tối thiểu dung môi thích hợp (có gia nhiệt) Kiểm tra chất kết tinh trênSKLM với ít nhất 2 hệ dung môi khác nhau
2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM: Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm
Trang 82.2.6 Xác định cấu trúc các chất phân lập
- Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA,NMR, so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các chất tương tự đãcông bố trong tài liệu
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tạiViện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫuđược hòa tan trong CD3OD hoặc CD3COCD3 với TMS là chất chuẩn nội Phổproton (1H-NMR) được đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125
MHz Độ dịch chuyển hóa học được tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tínhiệu của TMS Các hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz)
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Chiết xuất và phân tách các phân đoạn
Bột thân Xáo tam phân (5,3 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn 96% (90 lít), cô thuhồi dung môi bằng áp suất giảm, thu được 430 ml cao lỏng (d = 1 g/ml) Cao lỏngđược lắc phân bố với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol Các dịch sau khi lắc phân bố được cô áp suất giảm chocác cao n-hexan (Ho, 36g), cao cloroform (19 g), cao n-butanol (39,7g) và cao nước(92g) Sơ đồ chiết xuất được trình bày ở Hình 3.1
Trang 9Hình 0.1 Sơ đồ chiết xuất thân xáo tam phân
3.2 Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform
Tiến hành phân tích cao CHCl3 trên SKLM với các hệ dung môi khác nhau, pháthiện bằng soi UV 365, 254 nm và phun thuốc thử VS Kết quả như bảng dưới đây:
Bảng 0.1 Thăm dò hệ dung môi sắc kí phân tích cao cloroform
Trang 108 CHCl 3 – EtOAc (7:3) 9 0,9 ++ Khá tốt
Từ kết quả thăm dò trên, chọn hệ dung môi CHCl3 – EtOAc (8:2) làm hệ dung môiphân tích cho toàn bộ quá trình phân lập các chất trong cao CHCl3
3.3 Phân lập các chất trong cao CHCl 3
Tiến hành phân lập các chất trong cao CHCl3 bằng sắc ký cột chân không (VLC)
3.3.1 Thăm dò dung môi cho VLC
SKLM cao CHCl3 với 3 hệ dung môi: n-hexan – cloroform (5:5), n-hexan – CHCl3(2:8) và CHCl3 (100%) Kết quả đã chọn hệ n-hexan – cloroform (5:5) có khả năngtách khá tốt các chất trong cao này
- Phát hiện: bằng soi UV 365 nm, UV 254 nm, thuốc thử VS
Dựa vào UV 365 nm, đặt tên các vết chính có giá trị Rf từ cao đến Rf thấp trong hệcloroform – EtOAc (8:2) Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 0.2 Kết quả phân tách qua cột VLC
46-(XI) 360
Nhận xét:
- Phân đoạn V giàu vết 8 có thể tiếp tục phân lập chất bằng cột cổ điển
Trang 11- Phân đoạn VIII giàu vết 7, 9, 10 có thể tiếp tục phân lập qua cột cổ điển.
- Phân đoạn IX giàu vết 9, 10 có thể tiếp tục phân lập qua cột cổ điển
- Các phân đoạn còn lại có thành phần phức tạp hay có khối lượng nhỏ
3.3.2 Phân lập các chất từ phân đoạn V của VLC bằng cột cổ điển 1 (CĐ1)
Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn V được sắc ký lớp mỏng với một số hệ dungmôi và đã chọn được hệ dung môi n-hexan – EtOAc (6:4) có khả năng tách tốt chocác hợp chất trong phân đoạn 5 của cột VLC
Phân đoạn V được sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện:
- Cột 2×25 cm, nạp 12 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dungmôi n-hexan – EtOAc (6:4)
- Mẫu thử: 210 mg phân đoạn V được hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3,nhỏ từng giọt lên 200 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều sấy trong tủsấy chân không để tạo bột khô, tơi xốp và nạp mẫu khô
- Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 3 ml
- Theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển làCHCl3-EtOAc (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộpcác phân đoạn chứa riêng chất 8
- Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS
Kết quả sắc ký: Sau khi sắc ký thu được 7 phân đoạn (VA → VF), trong đó:
- Phân đoạn VD (50 mg) có thành phần chính là chất 8, sẽ được xử lý tiếp tục để lấychất tinh khiết
- Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý
Tinh chế chất 8: Phân đoạn VD khi cô quay được tủa hình cầu gai vàu vàng xanh,
kết tinh lại trong methanol được tinh thể hình cầu gai của chất 8, lọc và rửa với hexan, MeOH lạnh thu được chất 8 (12 mg) ở dạng tinh khiết Đặt tên là PT-T8
n-3.3.2 Phân lập các chất từ phân đoạn VIII của VLC bằng cột cổ điển 2 (CĐ2)
• Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn VIII được SKLM với nhiều hệ dung môivà đã chọn được dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) chạy lặp lại có khả năng táchtốt Phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS
• Tiến hành phân lập phân đoạn VIII trên sắc ký cột cổ điển với điều kiện:
- 400 mg phân đoạn VIIIđược hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ từng giọt
Trang 12lên 400 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy trong tủ sấychân không và nạp mẫu khô lên cột.
- Cột SK, 2×25 cm, nạp 24 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dungmôi n-hexan – EtOAc (6:4)
- Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 5 ml
- Theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển làCHCl3 – EtOAc (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp cácphân đoạn chứa chất 9
- Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm và thuốc thử VS
- Kết quả sắc ký phân đoạn VIII: Thu được 9 phân đoạn VIIIA → VIIIG
Nhận xét
- Phân đoạn VIIID (80 mg) có thành phần chính là vết 9 sẽ được xử lý tiếp tục
để lấy chất tinh khiết
- Các phân đoạn khác khá phức tạp, không tiếp tục xử lý
• Phân lập các chất từ phân đoạn VIIID của cột CĐ2 bằng SKC cổ điển
- Thăm dò dung môi sắc ký:
Phân đoạn VIIID được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi và đã chọn được hệdung môi CHCl3 : EtOAc (8:2), khai triển lặp lại 3 lần có khả năng tách tốt, pháthiện bằng UV 254, 365 nm, thuốc thử VS
Tiến hành phân lập phân đoạn VIIID trên SKC cổ điển 3 (SKC) với điều kiện:
- Mẫu sắc ký: Phân đoạn VIIID(80 mg) được hòa trong một lượng tối thiểu dungmôi CHCl3 - EtOAc (8:2) và nạp mẫu ướt
- Cột 1×20 cm, nạp 5 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dung môiCHCl3 : EtOAc (8:2)
- Pha động: CHCl3 : EtOAc (8:2) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 2 ml
- Tiến hành SKC và theo dõi thành phần của các phân đoạn trên SKLM với dung môiCHCl3 – EtOAc (6:4), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp cácphân đoạn chứa riêng chất 9
- Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS
Kết quả: Sau khi SKC thu được 5 phân đoạn từ D1 đến D3, trong đó:
- Phân đoạn D3 chứa chất 9 (20mg), kết tinh lại trong ethylacetat, lọc và rửa với
Trang 13n-hexan, MeOH lạnh thu được chất 9 (10mg) ở dạng tinh khiết, đặt tên là PT-T9.
- Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý.3.3.3 Phân lập các chất từ phân đoạn IX của cột VLC bằng cột cổ điển 4 (CĐ4)
- Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn IX được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dungmôi, chọn được dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1) có khả năng tách tốt Phát hiện bằng
UV 254, 365 nm, thuốc thử VS
- Tiến hành phân lập phân đoạn IX trên SKC với với điều kiện như sau:
- 350 mg IX được hòa trong một lượng tối thiểu dung môi CHCl3 : EtOAc(9:1), nạp cột theo phương pháp nạp mẫu ướt
- Cột 2×25 cm, nạp 21g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch (dung môiCHCl3 : EtOAc (9:1))
- Pha động: CHCl3 : EtOAc (9:1) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 4 ml
Tiến hành SKC và theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môikhai triển CHCl3 – EtOAc (7:3), phát hiện bằng UV 254, 365 nm Gộp các phân đoạnchứa chủ yếu chất 10
- Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS
Kết quả: Sau khi SKC thu được 7 phân đoạn (IXA→IXG), trong đó:
- Phân đoạn IXD chứa chủ yếu chất 10 (90mg)
- Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý.3.3.4 Phân lập các chất từ phân đoạn IXD của cột CĐ4 bằng cột cổ điển 5 (CĐ5)
- Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn IXD được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệdung môi, chọn được dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) có khả năng tách tốt Pháthiện bằng UV 254, 365 nm, thuốc thử VS
- Tiến hành phân lập Phân đoạn IXD được sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện:
- 90 mg IXDđược hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ từng giọt lên mộtlượng tối thiểu silica gel hạt mịn vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi,sấy trong tủ sấy chân không Mẫu sau đó được nạp khô vào cột
- Cột 1×20 cm, nạp 5 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dungmôi n-hexan : EtOAc (6:4)
- Pha động: C5 = n-hexan : EtOAc (6:4) Thể tích hứng mỗi phân đoạn 2 ml.Tiến hành phân lập trê SKC, theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với