Bài 2: Khảo sát tính đối kháng của nấm trichoderma sp (NLU)

Bài 2: Khảo sát tính đối kháng của nấm trichoderma sp (NLU)Bài 2: Khảo sát tính đối kháng của nấm trichoderma sp (NLU)Bài 2: Khảo sát tính đối kháng của nấm trichoderma sp (NLU)Bài 2: Khảo sát tính đối kháng của nấm trichoderma sp (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA

VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP

Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn

: THỰC TẬP NGHIÊN CỨU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Mã môn học : 211912 Giảng viên : TS LÊ THỊ DIỆU TRANG Nhóm thực hiện : NHÓM 3

Tháng 5 năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA

VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP

Tháng 5 năm 2022

STT Tên MSSV

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tự nhiên, đất chứa nhiều loại vi sinh vật sống chung với nhau và nấm

Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống

khác Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên

rễ Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh, lấy

chất dinh dưỡng từ các loài nấm và có khả năng kiểm soát tất cả các loài nấm gây bệnh

khác Trichoderma cũng sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh

cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây

Hiện nay, ngoài những yếu tố thuận lợi cho sự phát triển của cây như đất đai màu

mỡ, nguồn nước và nhân lực phong phú, điều kiện thời tiết khí hậu thuận lợi, mà bên cạnh đó, trong quá trình sản xuất, các nhà làm vườn cũng gặp các khó khăn như không nắm vững kỹ thuật canh tác, không đủ vốn đầu tư, phát triển tự phát không có quy hoạch phát triển, tình hình dịch bệnh Đáng chú ý hơn là sự xuất hiện bệnh thối rễ, vàng lá chết

chậm ở cây do nấm Fusarium sp đang tàn phá các vùng trồng cây, làm nhiều nhà vườn

lâm vào cảnh khốn khó vì cây chết do bệnh thối rễ Tuy nhiên, việc phòng trừ bệnh thối

rễ bằng phương pháp hóa học không những không đạt hiệu quả, chi phí cao mà còn gây

ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của người nông dân

Do đó, trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sử dụng các tác nhân sinh học đối kháng với các tác nhân gây bệnh trong đất được các nhà nghiên cứu khoa học hết sức quan tâm Trong số nhiều tác nhân sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng

trong sản xuất, thì nấm Trichoderma làm tác nhân đối kháng với một số tác nhân gây

bệnh có nguồn gốc từ đất được đánh giá cao nhất

Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm em tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá khả

năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium

sp.”

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Trichoderma

2.1.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma

Chủng nấm Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi

Imperfecti), sinh sản vô tính bằng bào tử bụi, sắp xếp theo kiểu đính bào tử Chúng

phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay

trên xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay ký sinh trên những loại nấm khác Nấm

Trichoderma phát triển nhanh ở 25 - 300C có một số ít loài Trichoderma tăng trưởng được ở 450C Các loài Trichoderma tạo khuẩn lạc có dạng cụm, bông (floccose) hay

mọc thành búi (tufted) với màu sắc khác nhau (trắng, vàng, lục)

2.1.2 Vai trò của nấm Trichoderma

− Khả năng đối kháng

Nấm Trichoderma thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc

cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh, kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh, giúp cây trồng phục hồi, sinh trưởng, phát triển, có khả năng tiêu diệt và khống chế ngăn ngừa các loại nấm bệnh hại cây trồng gây bệnh xì mủ, vàng lá thối rễ,

chết yểu, héo rũ như: Rhizoctonia solani, Fusarium, Pythium, Phytophthora sp., Sclerotium rolfsii,…

Ngoài hiệu quả trừ nấm gây bệnh, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh, chế phẩm từ nấm

Trichoderma còn có tác dụng tốt đối với cây trồng Dùng chế phẩm nấm Trichoderma

làm cho cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng cây trồng, gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng được bệnh

− Xử lý hạt giống

Trichoderma gây ảnh hưởng mạnh đến vi khuẩn và các loại nấm khác trong đất Việc

sử dụng các tác nhân sinh học để xử lý hạt giống hoặc tưới với đất đóng vai trò quan trọng trong phòng trừ bệnh hại do nấm gây ra do cơ chế trực tiếp đó là cạnh tranh dinh dưỡng, tiết ra các chất kháng sinh hoặc gián tiếp bằng các cơ chế kích kháng

− Kích thích tăng trưởng của cây trồng

Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, giúp bộ rễ thực

vật phát triển mạnh hơn so với bộ rễ thông thường Hiện nay, một số giống nấm

Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như ngô hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán Đáng chú ý nhất là những cây ngô có sự hiện diện của nấm

Trichoderma dòng T22 ở rễ, thì có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

2.1.3 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma

− Cơ chế ký sinh nấm: Ký sinh nấm là sự tấn công trực tiếp của một loài nấm trên loài

nấm khác và thường được định nghĩa là sự đối kháng trực tiếp, bao gồm 4 bước liên tiếp:

❖ Bước đầu tiên là sự phát triển có tính chất hướng hóa (chemotrophic growth), tức

là tiết ra một tác nhân kích thích hóa học gây ra bởi nấm ký chủ đã hấp dẫn chủng nấm ký sinh (nấm đối kháng)

❖ Bước thứ hai là sự nhận diện đặc hiệu

❖ Bước thứ ba bao gồm hai quá trình tách biệt nhau

➢ Quá trình thứ nhất được gọi là sự quấn (coiling), tức sợi nấm ký sinh

Trichoderma bao quanh sợi nấm ký chủ

➢ Quá trình thứ hai bao gồm sự tương tác và tiếp xúc sợi nấm gắn kết với nhau, tức sợi nấm Trichoderma phát triển hoàn toàn dọc theo sợi nấm ký chủ

❖ Bước thứ tư và cũng là bước cuối cùng bao gồm sự tiết các enzyme phân giải đặc biệt, chúng sẽ phân hủy vách tế bào của nấm ký chủ

− Cơ chế kháng sinh

Trichoderma có khả năng tiết ra một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau

có thể ức chế nấm và vi khuẩn Cơ chế kháng sinh thường diễn ra phối hợp với ký sinh nấm Theo đó, các chất kháng sinh có thể ức chế sự tạo thành vách tế bào, làm gia tăng hoạt động của những enzyme thủy phân hoặc tác động tới nấm mục tiêu thông qua một loạt các cơ chế khác nhau, như kìm hãm sự phát triển, sự sản xuất các chất chuyển hóa,

sự hấp thu các chất dinh dưỡng và sự hình thành bào tử

− Cơ chế cạnh tranh

Tương tác cạnh tranh giữa Trichoderma và vi sinh vật đất có thể được xem là sự đối kháng gián tiếp Trichoderma có thể ức chế hoặc làm giảm sự phát triển của mầm

bệnh cây trồng thông qua việc cạnh tranh về không gian, cơ chất enzyme, chất dinh dưỡng và oxygen Tuy nhiên, khả năng xâm chiếm của chúng bị ảnh hưởng rất lớn bởi những nhân tố môi trường đất, bao gồm pH, nhiệt độ và nước

− Cơ chế thúc đẩy sự phát triển và gia tăng sức đề kháng của cây trồng

Trichoderma thúc đẩy sự phát triển của cây trồng thông qua việc kích thích trực

tiếp sự hấp thu các chất dinh dưỡng của chúng, hoặc việc tiết các chất chuyển hóa có khả năng đẩy nhanh sự phát triển cây trồng như các hormone tăng trưởng Với bản chất đối kháng nấm bệnh cây trồng của hầu hết các loài

Trichoderma, chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng một cách gián tiếp

thông qua việc ức chế các mầm bệnh và vì thế, làm gia tăng sự sinh trưởng của cây trồng

− Cơ chế tiết enzyme thủy phân của nấm Trichoderma

Việc các loài Trichoderma có thể phân giải nhanh và hiệu quả đối với hầu như

bất kỳ loại hợp chất hữu cơ nào là nhờ vào lượng enzyme thủy phân mà chúng có khả năng tạo ra Các vật liệu hữu cơ bao gồm các loại đường, hormon và

heteropolysaccharide Vài loại enzyme thủy phân của các loài Trichoderma đối kháng

khác nhau đã được tạo dòng

2.2 Fusarium

Fusarium oxysporum là một loài Ascomycetes trong họ Nectriaceae thuộc chi Fusarium Loài này được Schltdl miêu tả khoa học đầu tiên năm 1824, đây là loài gây hại của cây Pterocarpus indicus, phát triển phổ biến ở Seychelles

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: nấm Trichoderma sp

- Vật liệu nghiên cứu: Chủng nấm Trichoderma sp

Chủng nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp.

3.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

- Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy gồm 2 nghiệm thức (1 chủng nấm Trichoderma sp và 1 nghiệm thức đối chứng), mỗi nghiệm thức lặp lại 4

lần Nuôi cấy các chủng Trichoderma sp và chủng nấm Fusarium sp riêng biệt trong

các đĩa Petri chứa môi trường PDA ở 25oC Sau 2 ngày, chuyển một khoanh hệ sợi nấm

Trichoderma sp đường kính 5mm sang đĩa Petri chứa môi trường PDA; đồng thời, đặt

một khoanh nấm Fusarium sp đường kính 5mm ở phía đối diện của cùng đĩa Petri sao

cho đối xứng nhau qua đường kính đĩa và cả hai cách mép đĩa 2cm Đối với nghiệm

thức đối chứng, chỉ cấy hệ sợi nấm gây bệnh Fusarium sp Nuôi cấy các đĩa Petri này ở

25oC Đo bán kính khuẩn lạc nấm bệnh ở các nghiệm thức vào các ngày 3, 5, 7 sau cấy

- Đánh giá tính đối kháng của chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần

trăm ức chế theo công thức: (C - T)/C *100

Trong đó: C: bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh trong nghiệm thức đối chứng; T: bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh khi được nuôi cùng với Trichoderma sp

3.4 Các bước tiến hành

- Trước tiên chuẩn bị đủ dụng cụ thí nghiệm ( 5 đĩa petri, đèn cồn, que cấy, mẫu cấy ( nấm trichoderma và nấm fusarium, cồn sát khuẩn )

- Vệ sinh tủ cấy theo đúng quy trình kĩ thuật

- Sát khuẩn tay, đưa đụng cụ thí nghiệm vào tủ, khởi động tủ, châm lửa đèn cồn

- Đổ môi trường DPA vào đĩa, mở nắp cho môi trường nhanh đặc

- Khi môi trường đã đông đặc, tiến hành cấy nấm

- Cấy 5 đĩa, một đĩa đối chứng cấy nấm fusarium, còn 4 đĩa còn lại, mỗi đĩa chia làm đôi, một bên cấy nấm fusarium và bên còn lại cấy nấm trichoderma Và cây một loại nấm hết 5 đĩa rồi mới chuyển sang cấy loại nấm thứ hai

- Cấy xong đậy nắp đĩa và quấn keo, để không cho mẫu nấm phát tán ra bên ngoài Bỏ tất cả các đĩa vào túi nilon và buộc lại

- Trong quá trình làm thí nghiệm để tránh mẫu bị nhiễm bẩn, cần tuân thủ theo các quy trình kĩ thuật, và cần đặt mẫu gần đèn cồn trong suốt quá trình thí nghiệm

IV ĐÁNH GIÁ VÀ KẾT LUẬN

4.1 Thu thập số liệu và tính toán số liệu

4.1.1 Thu thập số liệu

Đường kính nấm ở nghiệm thức Trichoderma (cm)

Số lần lặp lại

Giá trị trung bình

Hình 1 Các đĩa petri sau 3 ngày nuôi cấy (72 giờ)

Đường kính nấm ở nghiệm thức Fusarium (cm)

Hình 2 Đĩa petri nuôi cấy nấm Fusarium cùng với Trichoderma (trái) và đĩa petri đối

chứng (phải) sau 5 ngày nuôi cấy

Số lần lặp lại Thời gian

Giá trị trung bình

Đường kính nấm ở nghiệm thức đối chứng (Fusarium) (cm)

Hình 3 Các đĩa petri sau 7 ngày nuôi cấy

4.1.2 Tính toán số liệu

Tính tổng bình phương độ lệch

Đường kính nấm ở nghiệm thức Trichoderma (cm)

Số lần lặp lại

Thời gian

Giá trị trung bình

Tính giá trị phương sai Variance

Phương sai =Tổng bình phương độ lệch/N-1

0.4475

4 = 0.1119

Độ lệch chuẩn SD (standart deviation) = (phương sai)1/2

(0.1119)12 ≈ 0.3345

Đường kính nấm ở nghiệm thức Fusarium (cm)

Tính giá trị phương sai Variance

Phương sai =Tổng bình phương độ lệch/N-1

0.2067

4 = 0.0517

Độ lệch chuẩn SD (standart deviation) = (phương sai)1/2

(0.0517)12 ≈ 0.2274

Đường kính nấm ở nghiệm thức đối chứng (Fusarium) (cm)

Tính giá trị phương sai Variance

Lần lập

Trung bình

(sd)2

Lần lập

(sd)2

Lần lập

Trung bình

(sd)2

Phương sai =Tổng bình phương độ lệch/N-1

2.3819

4 = 0.5955

Độ lệch chuẩn SD (standart deviation) = (phương sai)1/2

(0.5955)12 ≈ 0.7717

Đánh giá tính đối kháng của chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần

trăm ức chế theo công thức: (C - T)/C *100

Trong đó: C = 3 (cm): bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh trong nghiệm thức đối chứng; T: bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh khi được nuôi cùng với Trichoderma sp

Hình 4 Hiệu quả tính đối kháng của Trichoderma với Fusarium

2

4.2 Nhận xét

Nhìn chung, kết quả sau 4 lần lặp lại thí nghiệm cho ta thấy được khả năng đối kháng của Trichoderma, Phần trăm ức chế Fusarium từ 16.66% - 36.66%

4.3 Kết luận và đánh giá

Trichoderma có khả năng kiểm soát loài nấm gây bệnh như Fusarium Những

phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số giống có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo

vệ của thực vật, từ đó những giống này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm

4.4 Đề xuất

Trong tương lai các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây