Báo cáo thực hành thực tập nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bài 2 (NLU)

Báo cáo thực hành thực tập nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bài 2 Báo cáo thực hành thực tập nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bài 2 Báo cáo thực hành thực tập nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bài 2 Báo cáo thực hành thực tập nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bài 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM

TRICHODERMA SP

VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP

Môn học: Thực tập Nghiên cứu trong Phòng thí nghiệm

Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Thị Diệu Trang

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1 – Sáng thứ 4

Ngô Khánh Linh 20126786

Võ Sông Hương 20126254 Huỳnh Minh Nguyệt 20126320 Kiều Trọng Vinh 20126412 Phạm Thị Kiều My 18126096

Tháng 05 năm 2022

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 3

1 Đặt vấn đề 3

2 Mục tiêu đề tài 4

3 Nội dung đề tài 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI KIỆU 5

1 Nấm đối kháng 5

2 Nấm Trichoderma sp 5

2.1 Phân loại 5

2.2 Nguồn gốc 6

2.3 Đặc điểm hình thái 6

2.4 Đặc điểm sinh học 6

2.5 Ứng dụng 8

3 Nấm Fusarium sp 10

3.1 Phân loại 10

3.2 Nguồn gốc 10

3.3 Đặc điểm hình thái 11

3.4 Đặc điểm sinh học 11

3.5 Ứng dụng 12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

1 Vật liệu nghiên cứu 13

1.1 Đối tượng nghiên cứu 13

1.2 Dụng cụ và thiết bị 13

1.3 Hóa chất 13

2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.1 Cách bố trí thí nghiệm: 13

2.2 Các bước thực hiện: 14

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

1 Kết quả 14

2 Xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 19

1 Kết luận 19

2 Kiến nghị 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bệnh hại cây trồng đóng vai trò trực tiếp trong việc phá hủy tài nguyên thiên nhiên trong nông nghiệp và là nguyên nhân chính làm giảm sản lượng lương thực hàng năm trên thế giới, ước tính giảm 10–40% Những thiệt hại nghiêm trọng nhất, cả đối với hệ sinh thái

tự nhiên và sản xuất, là do các mầm bệnh truyền qua đất, trong đó nấm là nhóm tác nhân gây bệnh trên thực vật nhiều nhất, phá hủy tới một phần ba tổng số cây trồng hàng năm Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), các loại nấm thực vật thường ảnh hưởng nhiều nhất đến 5 loại cây trồng quan trọng nhất trên thế giới - lúa, lúa mì, ngô, khoai tây và đậu tương

Trong những thập kỷ gần đây, phương pháp phổ biến nhất để bảo vệ thực vật chống lại nấm là sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật Các sản phẩm hóa chất bảo vệ thực vật mặc dù có hiệu quả cao nhưng vẫn còn nhiều lo ngại về tính an toàn, tác động tiêu cực đến sức khỏe con người, động vật và tạo áp lực nghiêm trọng lên hệ sinh thái Kết quả của việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học là sự gia tăng sức đề kháng của mầm bệnh với thuốc trừ sâu, ô nhiễm đất và nước ngầm Hơn nữa, thuốc trừ sâu có tác động bất lợi đối với các sinh vật không phải mục tiêu (ví dụ, côn trùng có ích, bao gồm cả các loài thụ phấn), các vi sinh vật trong đất,…

Để bảo vệ môi trường khỏi những tác động tiêu cực của thuốc diệt nấm hóa học, các hành động và chiến lược khác nhau của hệ thống sản xuất lương thực bền vững được thực hiện, bao gồm Quản lý Dịch hại Tổng hợp (IPM) và canh tác hữu cơ Một trong những chiến lược này là sử dụng các Tác nhân Kiểm soát Sinh học (BCA), dựa trên các vi sinh vật sống hoặc các chất chuyển hóa của chúng, và các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên để kiểm soát quần thể mầm bệnh thực vật

Trong vài thập kỷ qua, người ta đã nỗ lực nhiều nhất để kiểm tra tính hiệu quả và tính thực tiễn của vi khuẩn và nấm không gây bệnh với hy vọng thương mại hóa chúng dưới dạng BCA Kết quả của các nghiên cứu đã tiến hành, một số lượng lớn các chủng vi khuẩn

và nấm đã được sử dụng làm BCA, bao gồm Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Trichoderma spp., Glomus mosseae , Gliocladium virens , Pythium oligandrum và

Beauveria bassiana , đã kiểm soát thành công các bệnh truyền qua đất của các loại cây

trồng có giá trị do nấm, oomycetes, vi khuẩn và tuyến trùng gây ra

Trong số các loài nấm sợi, hầu hết các BCA thuộc họ Ascomycota phylum và chủ yếu

là đại diện của nhiều loài thuộc chi Trichoderma Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận các đặc tính có lợi của các chủng nấm Trichoderma có lợi cho phép sử dụng chúng trong việc bảo

vệ thực vật, kích thích sinh học và thụ tinh sinh học

2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp

3 Nội dung đề tài

Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp Dựa trên vòng kháng khuẩn

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI KIỆU

1 Nấm đối kháng

Nấm đối kháng là tên thường gọi của các chủng nấm vi sinh có khả năng tiêu diệt nấm bệnh gây hại đối với cây trồng Chúng ngăn cản, phá vỡ, làm tan vách tế bào, sau đó chúng tiết kháng sinh tiêu diệt các chủng nấm bệnh xâm nhập gây vùng rễ, thân và lá cây trồng Đây là các chủng nấm rất hữu ích đối với cây trồng.Trichoderma là một chủng nấm đối

kháng mạnh có vai trò rất lớn trong canh tác trồng cây ăn trái

Theo phân loại MycoBank hiện tại, Trichoderma thuộc Eukaryota, giới Nấm, ngành

Ascomycota, phân ngành Pezizomycotina, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ

Hypocreaceae, chi Trichoderma đã bao gồm hơn 300 loài có đặc điểm hình thái và phân tử,

nhiều loài trong số đó chưa được mô tả chính thức

2.2 Nguồn gốc

Trichoderma phổ biến trên khắp thế giới, chúng thường cư trú trên gỗ mục nát và các

dạng vật chất hữu cơ khác của thực vật Trichoderma là thành phần chủ yếu của mycobiome

của các hệ sinh thái đất khác nhau (chẳng hạn như đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm lầy muối và sa mạc) ở tất cả các vùng khí hậu, bao gồm cả vùng ôn đới và nhiệt đới, Nam Cực,

Trichoderma là một chi chủ yếu là nấm sợi vô tính (dạng đa hình là Hypocrea ), chúng

phát triển sợi nấm màu trắng hoặc trong suốt (hyalin) trên Potato Dextrose Agar (PDA), và khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau (thường là màu xanh lục - vàng hoặc hơi đỏ) tùy thuộc vào màu sắc bào tử

Những loại nấm này được đặc trưng bởi tế bào đồng bào nhiều nhánh có hình chóp

và các cụm phân kỳ, thường uốn cong không đối xứng, phialit hình bình / hình trụ , trong khi các bào tử không màu hoặc có nhiều sắc thái khác nhau như xanh lục, xám hoặc nâu

2.4 Đặc điểm sinh học

Nấm Trichoderma là loại nấm có khả năng tiết ra một số enzym như cellulase,

chitinase, protease, pectinase, amlylase giúp phân hủy mùn trong đất sau đó giải phóng ra các chất dinh dưỡng mà cây trồng dễ hấp thu nhất Hơn nữa, một số loài tạo ra mùi ngọt hoặc mùi dừa đặc trưng

Các loài Trichoderma có tiềm năng của như một chất bảo vệ thực vật sinh học được

mô tả lần đầu tiên vào đầu những năm 1930 Nhà nghiên cứu Weindling đã quan sát thấy

rằng chủng T lignorum bảo vệ cây con có múi chống lại mầm bệnh Rhizoctonia solani

thông qua cơ chế gây bệnh viêm màng túi hoại tử Kể từ đó, các đặc tính kiểm soát sinh

học của Trichoderma đã được nghiên cứu rộng rãi để kiểm soát các bệnh do nhiều loại

phytopathogens trong đất gây ra

Các loài thuộc giống Trichoderma đóng vai trò như một tác nhân kiểm soát sinh học

trong hệ sinh thái đất nhờ khả năng phát triển nhanh, sử dụng nhiều loại giá thể và khả năng chống lại nhiều hóa chất độc hại, bao gồm cả thuốc diệt nấm (ví dụ: azoxystrobin, 3,4 -dichloroaniline, và trifloxystrobin), chất diệt cỏ, và các chất ô nhiễm hữu cơ khác Ngoài

ra, Trichoderma còn được phát hiện có khả năng phân giải một số chất gây ô nhiễm độc hại

thông qua các enzym tham gia vào quá trình phân hủy cellulose/lignin đã được chứng minh

là có tiềm năng enzym chuyển hóa xenobiotic

Nấm Trichoderma sử dụng nhiều cơ chế phức tạp trực tiếp hoặc gián tiếp làm giảm

sự xuất hiện của các bệnh thực Tác động trực tiếp lên mầm bệnh bao gồm sản xuất các enzym phân hủy thành tế bào (CWDE) của nấm bệnh, tổng hợp kháng sinh, tổng hợp các chất chuyển hóa kháng nấm, cạnh tranh không gian và chất dinh dưỡng (chủ yếu là cacbon, nitơ và sắt) và thiết lập mối quan hệ ký sinh trực tiếp với nấm bệnh (Mycoparasitism) cũng như cảm ứng sự kháng thuốc của cây trồng

Mycoparasitism là hiện tượng một loại nấm đối kháng (mycoparasite) có thể ký sinh

trên một loại nấm khác (vật chủ) Các loại nấm thuộc giống Trichoderma hầu hết được phân loại là nấm mycoparasite hoại sinh Hơn 75 loài Trichoderma có tiềm năng ký sinh trùng

Tác động ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm bệnh bao gồm cảm ứng con mồi và phản ứng hóa học, bám dính vào vật chủ, và tấn công vật lý thông qua sự phân nhánh mạnh và cuộn quanh sợi nấm của vật chủ

Mặt khác, Trichoderma gián tiếp gây ra sức đề kháng tại chỗ hoặc toàn thân cho cây

trồng thông qua các sản phẩm (chất tạo màng) tiết ra từ thành tế bào của vật chủ thực vật (endoelicytors) và vi sinh vật lây nhiễm (exoelicytors) Loại cơ chế liên quan thường là đặc

tính của dòng và phụ thuộc vào kiểu tương tác giữa vi sinh vật đối kháng, mầm bệnh và cây

ký chủ

Việc bổ sung các chủng Trichoderma vào đất đã làm tăng năng suất và chất lượng của

các loại cây một lá mầm và hai lá mầm, chẳng hạn như dưa chuột, cà chua, cà rốt, đậu, ngô, bông, thuốc lá, kê và cỏ cảnh

Hơn nữa, Trichoderma có thể thích nghi với những thay đổi của điều kiện môi trường

và tạo ra nhiều bào tử bào tử và bào tử trùng Trichoderma có thể hoạt động tốt nhất trong

khoảng nhiệt độ từ 15 - 21 ° C Tuy nhiên, đối với chủng DEMTkZ3A0 ở nhiệt độ 12 ° C

là tối ưu cho khả năng tổng hợp auxin và gibberellin và thích hợp cho ACC aminocyclopropan-1-cacboxylat) ngừng hoạt động

(1-Tuy nhiên, nấm Trichoderma cũng có thể gây hại cho một số lĩnh vực nông nghiệp và

sức khỏe con người Tác dụng bất lợi của chúng trong nông nghiệp chủ yếu liên quan đến khả năng nhiễm nấm và gây ra một thực thể bệnh gọi là nấm mốc xanh trong trồng nấm

(nấm hương, nấm sò và nấm champignons) Một số loài Trichoderma cũng nằm trong các tác nhân gây bệnh cho cây trồng Ví dụ, T viride là tác nhân gây bệnh thối mốc hành lá Đặc biệt, T brevicompactum , T atroviride , và T harzianum , có thể gây nhiễm trùng cơ

hội ở người bao gồm viêm xoang, nhiễm trùng da và gan, viêm phổi và viêm miệng

2.5 Ứng dụng

Hiệu quả của việc sử dụng nấm Trichodermatrong nông nghiệp phụ thuộc vào hoạt

động trao đổi chất của chúng và kiểu tương tác với thực vật và các vi sinh vật khác Những loại nấm này cư trú hiệu quả trên thân rễ cây, sinh quyển, đồng thời tạo ra một số chất chuyển hóa có tính năng chống vi khuẩn (enzym phân hủy thành tế bào, kháng sinh, các hợp chất dễ bay hơi và không bay hơi) và kích thích sinh học (phytohormones,

phytoregulators) Hơn nữa, Trichoderma được biết đến với khả năng hấp thụ sâu lịch trình

rễ và tương tác không chỉ với vi sinh vật gây bệnh, mà còn tương tác với toàn bộ hệ vi sinh vật trong đất

Nấm Trichoderma được sử dụng nhiều trong quá trình xử lí phân chuồng giúp rút

ngắn quá trình ủ và khử mùi hôi của phân chuồng và phế phẩm nông nghiệp

Trichoderma tiết ra loại enzym có khả năng làm tan vách tế bào của các loại nấm có

hại khác, các enzym này tấn công vào bên trong nấm bệnh gây hại, biến chúng thành thức

ăn và tạo nên hữu cơ có lợi cho đất trồng, bảo vệ vùng rễ cây trồng và chống lại nấm thối

rễ

Trichoderma giúp tiêu diệt nấm Fusarium solani (tác nhân gây Vàng lá thối rễ trên

nhiều loại cây trồng, chết nhanh chết chậm trên cây tiêu) Giúp phân hủy cellulose, phân giải lân tan chậm Giúp tăng số lượng rễ mọc sâu Tăng khả năng chống khô hạn của cây trồng, cân bằng pH, giải độc đất hiệu quả

Trichoderma giúp tiết kiệm được lượng phân bón trong quá trình chăm sóc Chúng có

khả năng phòng trị, cạnh tranh hoặc tiêu diệt các tác nhân gây bệnh giúp cải thiện sức khỏe của cây

Ngoài hiệu quả trực tiếp trên các tác nhân gây bệnh ở cây, nhiều loài Trichoderma kí

sinh ở bề mặt rễ cây giúp thay đổi khả năng biến dưỡng của cây Nhiều dòng nấm đã kích thích sự tăng trưởng của cây Giúp gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng được bệnh

Nấm Trichoderma khi sử dụng trong đất cũng sẽ bám vào xung quanh rễ cây, tiết ra

đất những chất kích thích giúp rễ cây ăn sâu vào lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ trước nấm và khuẩn cho rễ

Trichoderma khi sống trong đất, sẽ liên tục sinh khối tạo thành lớp lớp trichoderma

xung quanh rễ như một lớp bảo vệ rễ cây tránh được sự xâm nhập của nhiều loại nấm hại

từ bên ngoài Làm giảm khả năng nhiễm bệnh vùng rễ cho cây lên đến trên 70%

Nhờ nấm Trichoderma bám vào các đầu rễ, liên tục sản sinh ra enzym và chất dinh

dưỡng cho rễ nên giúp cho cây tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất, chất lượng cây trồng

Đối với nấm Trichoderma có khả năng sinh khối rất nhanh trong đất Gần như chúng

sẽ xâm chiếm hoàn toàn vùng đất xung quanh tán cây khi được cấy vào đó Tuy nhiên,

Trichoderma có một điểm yếu đó là khi các chủng nấm hại trong đất quá đông sẽ khiến khả

năng đối kháng của chúng giảm đi khá nhiều Đây là lý do vì sao Trichoderma chủ yếu

được sử dụng trong việc phòng bệnh chứ không phải là trị bệnh

Fusarium có mối liên kết với rễ của cây, được tìm thấy ở trong ao, sông, hệ thống

khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới hoặc những nói có khí hậu ôn hòa và không sinh sống ở những vùng núi cao

khiến chúng xuất hiện nhiều Fusarium nhạy cảm đối với những loại thuốc diệt nấm trong

đất Ngoài ra, trên cơ thể của các loài thuộc chi Glischrochilus cũng có thể có những cá thể còn non và trưởng thành

3.3 Đặc điểm hình thái

Fusarium sp hình thành tản nấm có hình dạng tròn, có màu trắng tuyết, sau 7 ngày

nuôi cấy trên môi trường PGA thấy có xuất hiện màu tím hồng đậm ở trung tâm tản nấm

và lan dần ra xung quanh, bề mặt xốp và dày

Bào tử Fusarium sp nhỏ có vách ngăn tế bào mỏng, chúng có dạng hình trứng, bầu

dục hay hình elip, được hình thành sau 2 - 3 ngày nuôi cấy Các bào tử này hình thành đơn

lẻ hoặc hình thành cụm bao tử trên hệ sợi Bào tử lớn thường có 2 - 5 vách ngăn tế bào, vách tế bào dày Chúng có hình liềm, một đầu cong nhọn, một đầu hình bàn chân, được hình thành sau 3 - 5 ngày nuôi cấy Các bào tử lớn cũng được hình thành đơn lẻ hoặc hình thành cụm trên hệ sợi nấm tạo thành túi bào tử

3.4 Đặc điểm sinh học

Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử đính lớn

(Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử -

Chlamydospores)

Macroconidia dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử Đầu

và cuối bào tử lớn thuôn nhọn Một vài loài bào tử lớn tách rời và không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình (phialide)

Microconidia thường đơn nhân, đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh

ra từ một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh Tiểu bào

tử đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu bào tử đính của Fusarium rất giống bào tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được qui vào nấm Cephalosporium

Chlamydospores hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu bào tử gặp điều kiện thuận lợi, Hậu bào tử hay bào tử vách dầy rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài

Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp là: bón phân

đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ vi sinh vật có trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho