Nghiên cứu tạo oligochitosan – silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)

Tính cấp thiết của đề tài MỞ ĐẦU Ớt (Capsicum sp.) là cây gia vị trồng ở vùng nhiệt đới, được tiêu thụ trên khắp thế giới do có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, dịch bệnh do nấm, virus và vi khuẩn gây ra trên cây ớt là một vấn đề gây trở ngại lớn đến hiệu quả sản xuất. Trong các loại bệnh trên ớt, bệnh do nấm là trong các bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng và làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc. Các loại bệnh nấm thường gặp trên cây ớt là bệnh héo cây con (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng lá (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), trong đó bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với cây ớt. Bệnh thán thư trên cây ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra, nấm gây hại trên cả cành, lá, hoa và trái, có thể gây thiệt hại làm giảm năng suất 70 - 80%. Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học được sử dụng để phòng trừ các loại nấm gây hại cho cây trồng, tuy nhiên việc sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh và các loài côn trùng có hại cho cây trồng trở nên kháng thuốc. Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và vật nuôi. Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế do năng suất và độ ổn định giống không cao. Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt các cơ chế đề kháng bệnh trong cây trồng là một xu hướng phát triển nông nghiệp xanh đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng các hóa chất độc hại và sử dụng giống chuyển gen. Chitin và silic là hai nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên. Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất của chitin) cùng với silic và silica nano khi dùng riêng lẻ hoặc phối hợp có các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm và làm tăng khả năng chống chịu bệnh ở đa số các loài thực vật, giúp cây tiết ra một số enzyme, hoạt chất chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng [39]. Oligochitosan tạo được có khối lượng phân tử lớn từ 100 kDa đến 30 kDa theo công nghệ cũ dẫn đến khó điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất quy mô lớn. Vì vậy cần tạo được oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ bằng phương pháp chiếu xạ thích hợp ứng dụng trong nông nghiệp. Hoàn thiện quy trình sản xuất oligochitosan có thể ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết, ổn định cao và dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất. Kết hợp được hai loại vật liệu có hiệu ứng kích kháng để chế tạo vật liệu lai ứng dụng trong nông nghiệp. Xuất phát từ các lý do trên đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)’ đã được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên; - Tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt; - Xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được. Nội dung nghiên cứu của luận án Luận án gồm các nội dung sau: - Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, và đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.).

Trang 1

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

PHẠM ĐÌNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN - SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM

Colletotrichum spp GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh – 2020

Trang 2

i

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

TÓM TẮT xii

SUMMARY xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây ớt 5

1.2 Sơ lược về nấm Colletotrichum spp và bệnh thán thư trên cây ớt 6

1.2.1 Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum spp 6

1.2.2 Bệnh thán thư trên cây ớt (Chilli anthracnose) và biện pháp phòng trừ 9

1.3 Tổng quan về cơ chế kháng và kích kháng bệnh ở thực vật 15

1.3.1 Cơ chế kháng bệnh ở thực vật 15

1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) ở thực vật 17

1.4 Chitin/Chitosan và Silic trong kích kháng bệnh cây trồng 19

1.4.1 Vai trò chitin/chitosan trong kích kháng bệnh 19

1.4.2 Vai trò Silic trong kích kháng bệnh 22

1.5 Chế tạo oligochitosan, nano silica và ứng dụng trong kích kháng bệnh 25

1.5.1 Chế tạo oligochitosan 25

1.5.2 Chế tạo nano silica 27

1.5.3 Chế tạo oligochitosan-silica nano 28

1.5.4 Ứng dụng vật liệu nano trong nông nghiệp 30

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nội dung nghiên cứu 35

2.2 Thời gian, địa điểm và điều kiện nghiên cứu 35

Trang 3

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 35

2.2.2 Điều kiện thực hiện nghiên cứu 36

2.3 Vật liệu nghiên cứu 38

2.4 Phương pháp nghiên cứu 39

2.4.1 Nội dung 1 Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập và định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt 39

2.4.2 Nội dung 2 Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano 50

2.4.3 Nội dung 3 Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt chỉ thiên trong điều kiện phòng thí nghiệm 55

2.4.4 Nội dung 4 Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt chỉ thiên trồng trong điều kiện nhà màng và đồng ruộng 58

2.2.5 Xử lý số liệu 60

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.) 61

3.1.1 Phân lập và định danh hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư 61

3.1.2 Khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp đã phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà màng 64

3.2 Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano 74

3.2.1 Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp với H2O2 75

3.2.2 Điều chế hạt nano silica từ nguồn vỏ trấu 84

3.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano 87

3.3 Khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm 92

3.3.1 Tình hình bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra trên ớt 92

Trang 4

3.3.2 Đánh giá về khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và

C truncatum gây ra trên cây ớt 94

3.4 Khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà

màng và đồng ruộng 1053.4.1 Khả năng kích kháng bệnh thán thư do C gloeosporioides gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng 1063.4.2 Khả năng kích kháng bệnh thán thư do Colletotrichum truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng 1153.4.3 Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do C gloeosporioides gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng ở đồng ruộng 1213.4.4 Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng ở đồng ruộng 128

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 137 PHỤ LỤC

Trang 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AATCC American Association of Textile Chemists and Colorists (Hiệp hội các

nhà hoá học ngành dệt may và các nhà phối màu)

CEBiP Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM

CERK1 Chitin elicitor receptor kinase 1

FE-SEM Field emission scanning electron microscopy (kính hiển vi điện tử quét

phân giải cao)

Trang 6

FT-IR Fourier-transform infrared (Phổ hồng ngoại biến đổi fourier)

GPDH Glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase

MAPKK Mitogen activated ptotein kinase

PAL Phenylalanine ammonia lyase

PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns

PR protein Pathogenesis-related (PR) protein

RLCK Receptor Like cytoplasmic Kinase

Trang 7

ROS Reactive oxygen species

SOD2 Partial manganese superoxide dismutase

SEM Scanning electron microscopy (kính hiển vi điện tử quét)

TEM Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền qua)

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia [17] 10 Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia (tiếp

theo) [17] 11

Bảng 2.1 Nhiệt độ và ẩm độ không khí nhà màng trong thời gian thí nghiệm 37

Bảng 2.2 Đặc tính lý hóa đất khu thí nghiệm 38

Bảng 2.3 Đặc điểm khí hậu thời tiết ở Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian thí nghiệm 38

Bảng 2.4 Danh sách các mẫu bệnh đã thu thập được trong đề tài 40

Bảng 2.5 Thông tin về các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 48

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 49

Bảng 3.1 Tình hình bệnh trên lá trong điều kiện gây vết thương (%) 65

Bảng 3.3 Tình hình bệnh trên trái trong điều kiện không gây vết thương (%) 68

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) 70

Bảng 3.5 Chỉ số bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) 71

Bảng 3.6 Kết quả định danh loài Colletotrichum spp dựa vào trình tự các vùng gen 73 Bảng 3.7 Sự suy giảm KLPT của chitosan trong dung dịch 4% có và không có H2O2 theo liều xạ 75

Bảng 3.8 Độ ĐĐA% và chỉ số đa phân tán (PI) của chitosan theo liều xạ 76

Bảng 3.9 KLPT (Mw), PI và ĐĐA của chitosan trong dung dịch 2%/H2O2 0,5% theo liều xạ 78

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,01% đến sự phát triển Colletotrichum spp trên môi trường PDA 80

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 1% đến sự phát triển Colletotrichum spp trên môi trường PDA 84

Trang 9

Bảng 3.15 Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu đã xử lý với HCl 5% 85 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến

mức độ bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra trong

điều kiện phòng thí nghiệm 92

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính chitinase (U/mg protein) trong điều kiện phòng thí nghiệm 96

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính của β 1,3-glucanase (µmol/h/mg protein) trong điều kiện phòng thí nghiệm 97

capsidiol (µg/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm 99

salicylic acid (ng/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm 101

jasmonic acid (ng/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm 103

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) trên cây ớt trong điều kiện nhà màng 107

các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trong điều kiện nhà màng 112

tỷ lệ nhiễm bệnh và chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng 116

các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trong điều kiện nhà màng 118

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng 122

chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng 123

Trang 10

các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trồng ở đồng ruộng 125

tỷ lệ nhiễm bệnh và chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng 130

các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trồng ở đồng ruộng 133

Trang 11

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây ớt: hình thái (A) giống trồng (B) và tỷ lệ diện tích trồng (C) [1] 5

Hình 1.2 Chu trình gây bệnh do nấm Colletotrichum spp trên thực vật (A, B) và cây phân loại của nấm (C) [5] 8

Hình 1.3 Các giai đoạn lây nhiễm của nấm Colletotrichum trên ớt (A, B) [17] 12

Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm ở thực vật (A) và cơ chế kích kháng của chitin (B) [36] 18

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan (DP > 50%) [42] 20

Hình 2.1 Sơ đồ thể hiện sự liên quan giữa các nội dung nghiên cứu của đề tài 35

Hình 2.2 Kiểu nhà màng thông gió cố định sử dụng làm thí nghiệm 36

Các thí nghiệm trong nhà màng được tiến hành từ tháng 03 – 09/2017 Cây ớt được trồng trên bầu giá thể 70% mụn xơ dừa + 20% phân trùn quế + 10% tro trấu 37

Hình 2.3 Mẫu trái và mẫu lá dùng để lây nhiễm các mẫu phân lập nấm Colletotrichum 43

Hình 2.4 Thang phân cấp bệnh trên trái và lá ớt (QCVN 01-160:2014/BNNPTNT) 44

Hình 2.5 Thí nghiệm khả năng kích kháng nấm C gloeosporioides và C truncatum trong phòng thí nghiệm 55

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên trái (A - C), trên lá (D) và trên thân (D) của cây ớt ngoài tự nhiên 61

Hình 3.4 Điện di sản phẩm khuếch đại PCR các mẫu phân lập Colletotrichum spp 72

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (IR) và nhiễu xạ tia X (XRD) của các mẫu chitosan (a) và các phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) và 2,5 kDa (d) 79

Hình 3.7 Nano silica chế tạo từ vỏ trấu: xử lý với nước (a), HCl 5% (b) và 10% (c) 85 Hình 3.8 Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo bằng phương pháp tán xạ laser (C); và các giản đồ XRD (D) và EDX (E) hạt nano silica điều chế 86

Hình 3.9 Sự phối trộn tạo gel tạo chế phẩm (A), khảo sát độ bền gel theo pH 5; 6,5; 7,5; 8,5 (D) thành phẩm pH 7,5 và 1% HEC (E) Các tính chất chế phẩm tạo thành như hình chụp TEM (G) và TEM pH 5 (H) và phổ FTIR ban đầu hạt nano silica (B) oligochitosan (C) khi phối trộn (F) và thành phẩm (I) 88

Trang 12

Hình 3.10 Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính chitinase trong điều kiện phòng thí nghiệm 95

Hình 3.11 Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính β 1,3- glucanase trong điều kiện phòng thí nghiệm 98

capsidiol trong phòng thí nghiệm 100

salicylic acid trong phòng thí nghiệm 102

jasmonic acid trong điều kiện phòng thí nghiệm 105

Trang 13

xii

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích

kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây hại cây ớt (Capsicum

frutescens L.)” đã được thực hiện từ 2014 đến 2018 tại Thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu (1) phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh

và định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên; (2)

tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh

thán thư trên ớt và (3) xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm,

nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được

Đề tài gồm bốn nội dung được thực hiện tuần tự: (1) phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, sinh học phân tử

loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư do nấm trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.); (2) hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano; (3) đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm

của oligochitosan-silica nano tạo được và (4) đánh giá khả năng kích kháng đối với

bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ra của

oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng

Đề tài đã phân lập và định danh được 20 mẫu nấm bệnh thán thư gây bệnh trên cây ớt dựa vào đặc điểm hình thái theo Sutton (1992) và kết quả phân tích DNA Đa số

các mẫu phân lập thuộc loài C gloeosporioides và C truncatum Đã thu được các

phân đoạn oligochitosan khối lượng phân tử nhỏ (7,7 kDa; 4,6 kDa và 2,5 kDa) và phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa 0,5 - 1% có tác dụng kích kháng hiệu quả nhất Điều chế thành công hạt nano silica (kích thước 30 nm) từ vỏ trấu; tạo thành công oligochitosan-silica nano bền ở pH 7,5 với chất làm đặc HEC 1% Một số đặc trưng tính chất của vật liệu oligochitosan, nano silica và oligochitosan-silica nano đã được

Trang 14

ghi nhận Trong điều kiện nhà màng và ngoài ruộng sản xuất hiệu quả kích kháng nấm

C gloeosporioides và C truncatum đạt tốt nhất khi phun oligochitosan 25 ppm hoặc

nano silica 50 - 100 ppm hoặc oligochitosan-silica nano 50 ppm

Về tính mới của luận án: đề tài đã (1) hoàn thiện được quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano có thể ứng dụng trong sản xuất trên quy mô công nghiệp: (a) tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7 kDa, 4,6 kDa và 2,5 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 và dung dịch 2% chitosan/0,5% H2O2; (b) tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao bằng phương pháp thiêu kết vỏ trấu đã được xử lý loại bỏ thành phần khoáng và (c) tạo oligochitosan-silica nano bền ở pH gần trung tính (pH ~ 7,5); (2) ứng dụng oligochitosan-silica nano

tạo được kích kháng bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides và C truncatum trên

cây ớt chỉ thiên trồng tại Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 15

SUMMARY

The project of “Study to produce oligochitosan-silica nano and investigate the

induced systemic resistance against anthracnose disease caused by Colletotrichum spp on hot chilli (Capsicum frutescens L.)” was carried out from 2014 to 2018 at Ho

Chi Minh City The objectives of the study were: (1) identify the pathogenicity

potential and classificate at species level of Colletotrichum spp isolated from hot chilli

in Vietnam; (2) produce stable oligochitosan-silica nano, which potentially highly induced effectively the systemic resistance against anthranose disease on hot chilli, based on the combination of low molecular weight chitosan with nano silica; and (3)

detect the potential control the anthracnose disease caused by C gloeosporioides and

C truncatum on hot chilli in vitro, greenhouse and opened-field conditions of

oligochitosan-silica nano created

Four contents done sequentially were involved in the study: (1) isolate, investigate the pathogenicity potential of isolates and classificate at species level

isolated fungus Colletotrichum spp causing anthracnose disease on hot chilli (Capsicum frutescens L.) based on mophorlogy and molecular characteristics; (2) re-

complete the technology to produce oligochitosan-silica nano; (3) evaluate the induced

systemic resistance (ISR) potential against anthranose disease caused by C gloeosporioides and C truncatum on hot chilli in in vitro condition of oligochitosan-

silica nano created; (4) investigate the induced systemic resistance (ISR) potential

against anthranose disease caused by C gloeosporioides and C truncatum on hot chilli

cultivated in greenhouse and opened-field conditions of oligochitosan-silica nano produced

Twenty fungus isolates causing anthranose disease on hot chilli were isolated and scientific classificated to species based on the mophorlogy characteristics according to

Sutton (1992) and DNA analysis Most of isolates belonged to C gloeosporioides và

C truncatum Low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and

2.5 kDa) were gained and high effective ISR potential was recorded from the oligochitosan 4.6 kDa 0.5 - 1% Succesfully produced nano silica (size 30 nm) from

Trang 16

husk; succesfully created oligochitosan-silica nano, which stable at pH 7.5 when combined with HEC (1%) Some special characteristics of oligochitosan, nano silica and oligochitosan-silica nano were recorded In greenhouse and opened-field

conditions, the high efficiencies of ISR potential against C gloeosporioides và C truncatum were recorded when oligochitosan 25 ppm, nano silica 50 – 100 ppm and

oligochitosan-silica nano 50 ppm sprayed

The scientific and practical significance: (1) the practical technologies for creating oligochitosan-silica nano in industry production were re-completed; (a) low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and 2.5 kDa) were created by irradiation method on to the solution of 4% chitosan/0.5% H2O2 and 2% chitosan/0.5% H2O2; (b) highly pure nano silica particles were produced by firing husk after treated to eliminate mineral components and (c) oligochitosan-silica nano stabling at pH ~ 7.5 was produces; (2) applying oligochitosan-silica created to induce

the systemic resistance against the anthranose disease caused by C gloeosporioides và

C truncatum on hot chilli cultivated at Ho Chi Minh City

Trang 17

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Ớt (Capsicum sp.) là cây gia vị trồng ở vùng nhiệt đới, được tiêu thụ trên khắp

thế giới do có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, dịch bệnh do nấm, virus và vi khuẩn gây

ra trên cây ớt là một vấn đề gây trở ngại lớn đến hiệu quả sản xuất Trong các loại bệnh trên ớt, bệnh do nấm là trong các bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng và làm tổn thất

từ 10 - 80% sản lượng ớt ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Thái Lan,

Hàn Quốc Các loại bệnh nấm thường gặp trên cây ớt là bệnh héo cây con (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng lá (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), trong đó bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra là bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với cây ớt Bệnh thán thư trên cây ớt do nấm Colletotrichum

spp gây ra, nấm gây hại trên cả cành, lá, hoa và trái, có thể gây thiệt hại làm giảm năng suất 70 - 80%

Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học được sử dụng để phòng trừ các loại nấm gây hại cho cây trồng, tuy nhiên việc sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh và các loài côn trùng có hại cho cây trồng trở nên kháng thuốc Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường

và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và vật nuôi Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế do năng suất và độ ổn định giống không cao Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt các cơ chế đề kháng bệnh trong cây trồng là một xu hướng phát triển nông nghiệp xanh đang được

áp dụng rộng rãi trên thế giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng các hóa chất độc hại và sử dụng giống chuyển gen

Chitin và silic là hai nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất của chitin) cùng với silic và silica nano khi dùng riêng lẻ hoặc phối hợp có các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng

Trang 18

nấm và làm tăng khả năng chống chịu bệnh ở đa số các loài thực vật, giúp cây tiết ra một số enzyme, hoạt chất chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng [39] Oligochitosan tạo được có khối lượng phân tử lớn từ 100 kDa đến 30 kDa theo công nghệ cũ dẫn đến khó điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất quy mô lớn Vì vậy cần tạo được oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ bằng phương pháp chiếu xạ thích hợp ứng dụng trong nông nghiệp Hoàn thiện quy trình sản xuất oligochitosan có thể ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết, ổn định cao và dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất Kết hợp được hai loại vật liệu có hiệu ứng kích kháng để chế tạo vật liệu lai ứng dụng trong nông nghiệp

Xuất phát từ các lý do trên đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano

và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)’ đã được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

- Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum

spp gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên;

- Tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt;

- Xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides

và C truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và

ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được

Nội dung nghiên cứu của luận án

Luận án gồm các nội dung sau:

- Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và

định danh bằng hình thái, và đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.)

Trang 19

- Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano

- Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano

tạo được trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm C

gloeosporioides và C truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano tạo được trên

cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng

Phạm vi nghiên cứu của luận án

Luận án được tiến hành từ năm 2014 đến năm 2018 tại Thành phố Hồ Chí Minh

và được thực hiện ở ba địa điểm: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao; Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường – trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ (VINAGAMMA)

Luận án tập trung phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp,

định danh bằng hình thái, đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh

thán thư trên ớt; Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano và đánh giá khả năng kích kháng của oligochitosan-silica nano tạo được đối với bệnh thán thư trên cây

ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.)

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

- Về lý luận: Nghiên cứu của luận án đóng góp thêm vào sự hiểu biết khoa học

về nấm gây bệnh và sự đa dạng phức hợp loài nấm gây bệnh trên cây ớt, về tỷ lệ phối trộn giữa oligochitosan và nano silica, độ pH thích hợp nhất để thu được hỗn hợp oligochitosan-silica nano có độ ổn định cao; khả năng kích kháng của chế phẩm khi

phun trên lá cây ớt giúp cây tăng cường khả năng chống chịu với nấm Colletotrichum

spp gây ra bệnh thán thư trên cây ớt

- Về thực tiễn: Luận án hoàn thiện qui trình công nghệ tạo oligochitosan-silica

nano và đánh giá một số đặc tính kỹ thuật của chế phẩm được tạo thành Đánh giá

Trang 20

được hiệu quả kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra

trên cây ớt của oligochitosan-silica nano, oligochitosan và nano silica đơn lẻ trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng

Về tính mới của luận án

- Hoàn thiện được quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano có thể ứng dụng trong sản xuất trên quy mô công nghiệp:

+ Tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7; 4,6 và 2,5 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 và dung dịch 2% chitosan/0,5% H2O2;

+ Tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao bằng phương pháp thiêu kết vỏ trấu đã được xử lý loại bỏ thành phần khoáng

+ Tạo oligochitosan-silica nano bền ở pH gần trung tính (pH ~ 7,5)

- Ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo được kích kháng bệnh thán thư do nấm

C gloeosporioides và C truncatum trên cây ớt chỉ thiên trồng tại Thành phố Hồ Chí

Minh

Trang 21

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây ớt

Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ, có

dạng bụi nhỏ, thường cao 60 - 80 cm có thể cao đến 1 m; thân nhẵn, có nhiều cành; Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn; Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá (Hình 1.1A) Ớt là cây

dễ trồng, không kén đất và thích hợp với nhiều vùng sinh thái Trong vỏ trái ớt có chứa alkaloid là capsaicin [1]

Hình 1.1 Cây ớt: hình thái (A) giống trồng (B) và tỷ lệ diện tích trồng (C) [1]

Cây ớt đòi hỏi khí hậu ấm áp và độ ẩm cao cho sự tăng trưởng và thời tiết khô trong quá trình trưởng thành Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây ớt là từ 18 – 30oC Nhiệt độ cao trên 32oC hoặc thấp dưới 15oC cây tăng trưởng kém và hoa dễ rụng Chi (genus) ớt có khoảng 25 - 30 loài nhưng có năm loài

(Capsicum frutescens L., C annuum L., C chinense Jacq, C pubescens Keep và C baccatum L.) đã được thuần hóa và canh tác (Hình 1.1B) Hiện nay, C frutescens L là loài được trồng phổ biến nhất kế đó là C annuum L [2]

Trang 22

Cây ớt thường được trồng dưới dạng cây hằng năm, có thể được thu hoạch nhiều lần Cây ớt được trồng với mục đích lấy trái tươi hoặc ớt khô (bột ớt) [1, 2] Ớt

có giá trị về dinh dưỡng, y học, kinh tế; mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người trồng Ngoài công dụng cung cấp vị cay cho thực phẩm, ớt còn cung cấp các chất như acid ascorbic (vitamin C), carotenoid (tiền vitamin A), tocopherol (vitamin E), capsaicinoid và flavonoid có tác dụng tốt cho sức khỏe con người [3] Ớt được sử dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, và thực phẩm Ớt là nguồn giá trị xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới với tổng diện tích trồng chiếm 1,9 triệu ha, trong đó Ấn Độ chiếm 38% sản lượng với 1,4 triệu tấn Việt Nam sản lượng ớt chiếm khoảng 2% sản lượng thế giới (Hình 1.1C) [4]

Trong những giai đoạn 2010 - 2018, cây ớt được trồng ngày càng nhiều ở Việt Nam Năm 2010, diện tích, năng suất và sản lượng ớt các loại ở Việt Nam lần lượt là 44.300 ha, 2.379 kg/ha và 105.400 tấn, đến 2018, diện tích, năng suất và sản lượng ớt các loại ở Việt Nam lần lượt là 107.392 ha, 2.446 kg/ha và 262.658 tấn Các vùng chuyên canh ớt tại Việt Nam là Quỳnh Phụ (Thái Bình), Đại Lộc (Quảng Nam), Phù

Mỹ, Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc (An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Tiền Giang, Long An, Lâm Đồng, Vĩnh Phúc, Thái Bình, Nam Định và một số tỉnh thành khác

1.2 Sơ lược về nấm Colletotrichum spp và bệnh thán thư trên cây ớt

1.2.1 Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum spp

Sordarriomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae Đặc điểm nhận dạng hình

thái của chi Colletotrichum là hiếm khi hình thành giai đoạn sinh sản hữu tính Nấm Colletotrichum spp có sợi nấm nội sinh, mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn,

sợi nấm có nội bào và gian bào; Nhiều giọt dầu được hình thành trong mỗi sợi nấm Khi già sợi nấm trở nên sậm màu và bệnh xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới ngoài

cùng [5] Colletotrichum spp sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển

trên cuống bào tử trong dạng quả cành là cụm cuống bào tử Bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cụm cuống bào tử có dạng

Trang 23

đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề

mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Colletotrichum spp sinh trưởng phát triển và

hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PDA (Phụ lục 1) Khối bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh Sự xâm nhiễm ban đầu của các loài

nấm Colletotrichum spp có liên quan đến sự tiếp xúc bào tử trên bề mặt cây trồng, sự

nảy mầm của bào tử, sự hình thành giác bám, sự xâm nhập vào biểu bì của cây, sự phát triển và xâm nhiễm vào mô cây và sản sinh hình thành đĩa cành và bào tử phân sinh

Các loài Colletotrichum spp sản sinh ra các hạch nấm nhỏ để tồn tại ở trạng thái bảo

tồn ngưng hoạt động trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặp điều kiện bất lợi và những hạch nhỏ này có thể sống sót nhiều năm [5,6,7]

Bệnh do nấm Colletotrichum spp rất phổ biến trên cây trồng (cây hoa kiểng,

rau ăn lá và cây ăn quả) Theo xếp hạng của Tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012),

nấm Colletotrichum spp., gây ra bệnh thán thư, được xếp ở vị trí thứ 8 trong 10 loại

nấm gây bệnh cây hàng đầu, làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sinh trưởng, phát triển

và năng suất trên nhiều loại cây trồng có giá trị như cây có múi, ớt (Capsicum sp.), đậu tương (Glycine max (L.) Merr.), cà chua (Solanum lycopesicum) Bệnh thán thư ở trên các loại trái bơ (Persea americana), ổi (Psidium guajava L.), đu đủ (Carica papaya L.), xoài (Mangifera indica L ) và chanh dây (Passiflora incarnata L.) đã xác định được nguyên nhân gây ra bởi C gloeosporioides và trên chuối (Musa L.) bởi C musae Ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới, tác nhân gây bệnh trên các loại trái như nho (Vitis vinifera L.), táo (Malus domestica), đào (Prunus persica) và kiwi (Actinidia deliciosa) là C acutatum [8]

Trang 24

Hình 1.2 Chu trình gây bệnh do nấm Colletotrichum spp trên thực vật (A, B) và cây

phân loại của nấm (C) [5]

Định danh nấm Colletotrichum spp dựa trên phân tích phân tử ngày càng phổ

biến và dẫn tới nhiều thay đổi trong phân loại các loài thuộc chi này (Cannon và cộng

sự, 2012) [5] Các nghiên cứu này cho thấy, C gloeosporioides và C acutatum thực chất là các phức hợp loài (special complex), trong đó C gloeosporioides gồm ít nhất

22 loài khác nhau và C acutatum gồm ít nhất 31 loài khác nhau Do xác định các loài Colletotrichum spp dựa trên các đặc điểm hình thái thường mất thời gian nên kỹ thuật

phân tử đã được áp dụng Nhiều cặp mồi chuyên biệt đã được thiết kế để phát hiện các

loài Colletotrichum spp gây hại trên ớt Nguyễn Duy Hưng và cộng sự (2018) đã phân

tích định danh dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) và vùng liên gen của 2 gen apn2 và MAT1-2-1 (ApMat) của các mẫu

Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt tại Đồng bằng Sông Hồng, ít nhất 5 loài là C truncatum, C fructicola, C gloeosporioides sensu stricto, C aeschynomenes, C siamense đã được xác định [9] Gardes và Bruns (1993) đã ứng dụng phân tích trình tự

ADN để phân loại cấp loài, nhận diện sự biến đổi vùng ITS1 (Internal transcribed

Bào tử nang phát triển

Nảy mầm

Trang 25

spacer 1) của rDNA giữa sáu loài trong chi Colletotrichum cũng như phát hiện hiện tượng đa hình trong cùng vùng của loài C gloeosporioides từ các ký chủ khác nhau

[10] Weir và cộng sự (2012) đã nghiên cứu xây dựng cây di truyền cho 156 mẫu phân

lập Colletotrichum spp từ nhiều vùng trên thế giới Các vùng gen được nhóm tác giả

sử dụng là GPDH (Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), ACT (Partial actin), TUB2 (β-tubulin), ITS (Internal transcribed spacer) và CAL (Calmodulin) Phân tích

dựa trên các trình tự gen đã phân các mẫu phân lập Colletotrichum spp thành chín phức hợp loài với 119 loài Colletotrichum spp được phân lập (Hình 1.2C) [5]

Do tính chất đa dạng và phức tạp của nấm Colletotrichum spp , các vùng gen

như GS (Glutamine synthetase), CHS (Chalcone synthase), HIS (Histone), ApMat (gene kiểu Mating) đã được dùng để xác định độ tương đồng và phân tích di truyền

của nấm Colletotrichum spp Các nghiên cứu mới đây của Liu và cộng sự (2016) dựa vào 88 loài Colletotrichum spp đã được phân lập từ các mẫu trái ớt bị thối ở Tứ Xuyên (Trung Quốc) đã phát hiện thêm một loài mới, được mô tả là C sichuanensis

dựa trên trình tự các vùng gen GPDH, ACT, TUB2, ITS2 và CAL [11] De Silva

(2016) đã ghi nhận có 45 loài nấm Colletotrichum spp gây ra bệnh thán thư trên cây ớt

ở Úc Phức hợp loài C acutatum được xác định bằng sáu vùng gen ITS, GAPDH, ACT, CHS1, TUB2 và HIS3 Phức hợp loài C gloeosporioides được xác định bằng

bốn vùng gen ITS, TUB2, ApMat và GS Phân tích cây phát sinh loài ghi nhận có bốn

loài Colletotrichum spp gồm C siamene, C simmondsii, C queenslandicum và C truncatum [12] Hiện nay hệ thống phân loại chi Colletotrichum được phân chia thành

11 nhóm phức hợp với 190 loài Colletotrichum sp [13] Sử dụng kết hợp phương pháp

định danh bằng phương pháp giải trình tự gen và nhận diện bằng đặc điểm hình thái được đánh giá là phương pháp thích hợp nhất để hướng đến việc nghiên cứu sự phức

tạp của các loài nấm Colletotrichum spp [13,14,15, 16]

1.2.2 Bệnh thán thư trên cây ớt (Chilli anthracnose) và biện pháp phòng trừ

Bệnh thán thư trên ớt đã được xác định là do nấm Colletotrichum spp., là một

trong 10 loài nấm gây bệnh nguy hiểm nhất trên thế giới [8] Bệnh đã gây thiệt hại ở nhiều quốc gia trồng ớt trên thế giới như Úc, Ấn Độ, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam [17] (Bảng 1.1)

Trang 26

Ở tất cả các loài Colletotrichum spp., các thời điểm đầu của sự tấn công và phát

triển trong quá trình lây nhiễm cơ bản là giống nhau Bào tử nấm tập trung và gắn chặt trên bề mặt mô bệnh Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm và hình thành giác bám, từ đây sợi nấm sẽ xâm nhập vào biểu bì của mô, phát triển và xâm chiếm cả mô bệnh Sau cùng là hình thành đĩa cành và bào tử nấm (Hình 1.3) [17]

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia [17]

C gloeosporioides

C coccodes, C dematium

Park và Kim, 1992

C novae-zelandiae

C nigrum, C coccodes

Damm và cộng sự, 2012b; Liu

và cộng sự, 2013

Trang 27

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia (tiếp

theo) [17]

United States C capsici

Don và cộng sự, 2007

Bệnh thán thư có thể gây hại trên thân, lá, trái, nhưng gây hại chủ yếu trên trái vào thời điểm chín Vết bệnh ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bề mặt vỏ trái, sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thể có đường kính lên tới 1 cm Vết bệnh thường

có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ là đĩa cành của nấm gây bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm trái bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bẩn Nấm

có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiện tượng thối ngọn ớt Chồi bị hại có màu

Trang 28

nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây bị chết dần hoặc cây bệnh có trái nhưng

trái ít, chất lượng kém Bệnh do hai loại nấm C nigrum và C capsici gây ra Hai loại

nấm trên thường song song phá hại làm trái ớt bị thối nhanh chóng Bào tử phân sinh của hai loại nấm này nảy mầm trong nước sau 4 giờ, nhiệt độ thích hợp cho nấm gây bệnh là 28 – 30oC Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm độ cao Bào

tử phát tán nhờ gió và nhờ côn trùng Bào tử phân sinh có sức sống cao, trong điều kiện khô, bị vùi trong đất vẫn có thể nảy mầm vào vụ sau [18,19]

Hình 1.3 Các giai đoạn lây nhiễm của nấm Colletotrichum trên ớt (A, B) [17]

Để phòng trừ một số loại nấm gây hại cho cây trồng người ta đã sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại cho cây trồng kháng thuốc Dư lượng thuốc trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và vật nuôi Hiện nay, có nhiều biện pháp khác nhau

để kiểm soát dịch bệnh trên cây trồng, hiệu quả của việc kiểm soát bệnh thán thư do

nấm Colletotrichum sp gây ra thường liên quan đến việc kết hợp dùng các biện pháp

sinh học như lai tạo chọn giống chống chịu bệnh, biện pháp kích kháng bệnh hay biện

Trang 29

pháp canh tác dùng các vi sinh vật có lợi cho cây trổng, hay nano sinh học [20,21] Vì

là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng nên nấm Colletotrichum

spp được nghiên cứu nhiều trên thế giới Bệnh thán thư ớt đã được chứng minh bị gây

ra bởi nhiều hơn một loài nấm Colletotrichum spp bao gồm C acutatum, C capsici,

C gloeosporioides và C coccodes [22] Các biện pháp sinh học đã được áp dụng như

sử dụng hỗn hợp dịch chiết của thực vật hay các loài nấm có khả năng kiểm soát hay

có khả năng đối kháng với nấm bệnh [23,24]

Việc tìm kiếm các hoạt chất thân thiện với môi trường, có khả năng kháng nấm để làm nguyên liệu tạo chế phẩm diệt nấm phục vụ cho nền nông nghiệp phát triển bền vững đang là một vấn đề rất cấp thiết, cần được tiến hành Một trong những biện pháp phòng trừ nấm đã được nghiên cứu thực hiện rất sớm ở Việt Nam là ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây và đã đạt được những thành tựu sau: i)

Sử dụng vi sinh vật đối kháng nấm như một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh; ii) Tạo được các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm nấm

Trichoderma sp để phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng, tuy nhiên tác dụng phòng trừ

bệnh của chúng còn cho hiệu quả chậm [25]

Tại Việt Nam, cũng đã có các nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra các biện

pháp hạn chế bệnh hại do nấm Colletotrichum spp gây ra Nghiên cứu về khả năng kích kháng bệnh thán thư trên rau do nấm Colletotrichum spp gây ra trong điều kiện

nhà lưới đối với ớt và cà chua và trong điều kiện ngoài đồng ruộng đối với dưa leo của một số hóa chất dựa trên khảo sát về sinh học, mô học và sinh hóa học, - Trần Thị Thu Thủy và cộng sự (2010) cho rằng calcium chlorid không chỉ cho hiệu quả tốt và bền vững trong điều kiện ngoài đồng mà còn giúp gia tăng hoạt tính enzyme chitinase ở giai đoạn sớm và đạt đỉnh cao vào 144 giờ sau khi phun nấm lây bệnh Đối với bệnh thán thư trên cà chua, chitosan có khả năng làm giảm kích thước vết bệnh cấp 1, 2 và

3, giảm sự hình thành bào tử và gia tăng sự tích tụ polyphenol Đối với bệnh thán thư trên ớt, acid salicylic (SA) có khả năng giúp hạn chế bệnh thông qua làm giảm sự mọc mầm của bào tử nấm gây bệnh, ức chế sự hình thành đĩa áp, kích thước đĩa áp, cho phản ứng tế bào thể hiện sớm và gia tăng sự tích tụ polyphenol và callose SA có khả năng giúp ớt chống bệnh tốt do có khả năng giúp cây tạo phản ứng sớm và hiệu quả

Trang 30

kéo dài như ức chế chiều dài ống mầm, sự hình thành đĩa áp, phản ứng phát sáng sớm

và hiệu quả kéo dài, tích tụ callose kéo dài, sự tích tụ polyphenol sớm và làm gia tăng diện tích vùng tích tụ polyphenol [26]

Nguyễn Thụy Đan Huyền và cộng sự (2013) đã sử dụng oligochitosan như một

chất kháng nấm tự nhiên để kiểm soát bệnh thán thư hại ớt do C gloeosporioides gây

ra Quan sát dưới kính hiển vi sau 20 giờ xử lý cho thấy oligochitosan 0,05% ức chế

hoàn toàn sự nảy mầm bào tử C gloeosporioides Ngâm trái ớt trong oligochitosan có

tác dụng ức chế đường kính vết bệnh thán thư trên trái ớt Một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của trái ớt bị giảm so với mẫu không lây bệnh nhân tạo và bảo quản bằng oligochitosan sau 8 ngày [27]

Lê Thanh Long và cộng sự (2015) đã khảo sát khả năng kháng nấm C acutatum L2 gây bệnh thán thư hại trái cà chua sau thu hoạch của nano chitosan ở cả điều kiện in vitro và in vivo Kết quả nghiên cứu chứng minh rằng nano chitosan có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử C acutatum L2 và hạn chế sự sinh trưởng và

phát triển của nấm Hiệu lực ức chế 50% và 90% đường kính tản nấm, sinh khối khô đạt được tương ứng với các nồng độ nanochitosan 0,75 g/L và 1,53 g/L, 0,46 g/L và 1,1 g/L Nồng độ nanochitosan 1,6 g/L ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng, phát triển của

C acutatum L2 Ở điều kiện in vivo, nano chitosan có khả năng hạn chế sự phát triển gây bệnh của C acutatum L2 trên trái cà chua, sau 10 ngày, nồng độ 4 g/L có khả

năng ức chế 76% sự phát triển của đường kính vết bệnh, giá trị MIC50 đạt được ở nồng độ nanochitosan 1,14g/L [28]

Trong xu hướng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, kiểm soát bệnh thán thư bằng

Trichoderma spp là giải pháp đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên

cứu Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Liên Thương (2016)

cho thấy C truncatum và C acutatum là các tác nhân gây bệnh thán thư phổ biến trên cây ớt tại Bình Dương Trong số 16 loài Trichoderma spp phân lập được từ các khu vực trồng rau màu tại Bình Dương, ba loài T koningii T2.2, T koningii T4 và T koningii T5.1 có khả năng đối kháng tốt nhất với các loài Colletotrichum spp phân lập được Chế phẩm bào tử từ các loài Trichoderma spp chọn lọc có khả năng hạn

chế bệnh thán thư trên trái ớt cao hơn 58,4% so với việc sử dụng các chế phẩm

Trang 31

phòng trừ nấm khác Kết quả nghiên cứu này cho thấy tı́nh khả thi của việc ứng dụng

chế phẩm từ bào tử nấm Trichoderma spp trong việc phòng trừ bệnh thán thư trên

1.3.1.1 Cơ chế kháng bệnh thuộc về cấu trúc mô học

Cơ chế kháng bệnh về mặt mô học, tùy thuộc vào cách xâm nhập của nấm gây bệnh Tạo lớp vách tế bào mới chung quanh vết thương để bao vây và ngăn cản sự xâm nhập tiếp theo của các nấm có tính ký sinh yếu, chỉ xâm nhập qua vết thương Rắn chắc hóa vách tế bào bằng cách lignin hóa vách tế bào bị nấm xâm nhiễm Hình thành papillae (vách dầy) bên dưới đĩa áp để ngăn cản sự xâm nhập của nấm gây bệnh Tích tụ hợp chất phenol dẫn đến phản ứng tự chết của tế bào để cô lập nấm gây bệnh [31]

1.3.1.2 Cơ chế kháng bệnh thuộc về sinh hóa học

Sau khi bị tấn công, nơi bị xâm nhiễm tiết ra một loạt các chất chống vi sinh vật, các protein liên quan đến bệnh, các enzyme làm giảm hoạt động của mầm bệnh và nhiều chất khác Về hợp chất chống vi sinh vật có thể chia ra hai nhóm: Nhóm phytoanticipins và nhóm phytoalexins Phytoalexin do ký chủ tiết ra để kháng lại mầm bệnh, trong khi đó phytoanticipin không phải do ký chủ tiết ra mà do sự tương tác giữa các chất của ký sinh và ký chủ tạo ra Hai nhóm này có thể tìm thấy trong các giống có tính kháng bệnh cao [36] Bên cạnh đó một loạt protein có liên quan đến bệnh cây cũng được tế bào tiết ra Các protein này làm giảm sự phát triển của mầm bệnh bằng cách tác động lên vách tế bào, màng nguyên sinh chất hoặc lên ribosom của vi sinh vật Các protein này được xếp vào 18 họ protein trong đó 12 protein được biết đến với tên là PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-8, PR-11, protein bất hoạt ribosom, protein

Trang 32

chuyển hóa chất béo nsLTPs, AMPs, thionins Vai trò của các protein này được tóm lược như sau: PR-2 (β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào vi sinh vật thành β-1,3 glucan và β-1,6 glucan Enzyme β-1,3-glucanase và chitinase có tác động hỗ trợ nhau làm tăng hiệu quả phân hủy vách tế bào mầm bệnh

Bên cạnh đó một loạt các enzyme khác cũng được hình thành trong tế bào bị nấm bệnh xâm nhiễm đóng vai trò chuyển hóa các chất độc do mầm bệnh tiết ra hoặc trung hòa độc tính của các chất do tế bào cây tiết ra khi phản ứng lại mầm bệnh Các chất này ở nồng cao có thể gây hại cho tế bào cây Trong đó có hai enzyme là PAL (phenylalanine ammonia lyase) và peroxidase: enzyme PAL có vai trò thúc đẩy sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol, là chất quan trọng trong sự chống bệnh của cây trồng; enzyme peroxidase có vai trò khử H2O2 và phối hợp với PAL trong lignin hóa vách tế bào bị tấn công, ngăn cản cơ học sự lan ra xa của nấm gây bệnh H2O2 tích tụ trong tế bào với nhiệm vụ oxy hóa các chất độc do nấm tiết ra, Oxy hóa các polyphenol làm giảm độc đối với tế bào Tuy nhiên, H2O2 ở nồng độ cao lại gây hại cho tế bào, cần peroxidase có mặt làm giảm bớt tính độc của H2O2 đối với tế bào ký chủ [30,32]

Bên cạnh sự gia tăng hoạt tính của các enzyme, các hormone thực vật như salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), ethylene (ET), abscisic acid (ABA), auxin (AUX), cytokinin (CK), gibberellins (GA) và brassinosteroid (BR) cũng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống các cơ chế kích thích các gen biểu hiện phản ứng phòng vệ

ở thực vật Trong đó, hệ thống tín hiệu SA – JA - ET đóng vai trò chủ đạo kích thích

hệ miễn dịch thực vật Trong khi ABA, auxin, cytokinin, GA và BR tham gia trong từng đáp ứng miễn dịch cụ thể thông qua điều hòa hệ thống đáp ứng miễn dịch của thực vật chủ Tín hiệu SA quyết định sự biểu hiện của hệ thống kháng SAR (systemic acquired resistance) Methyl salicylate, pipecolic acid, azelaic acid, protein vận chuyển lipid DIR1 và glycerol 3-phosphate là các phân tử tín hiệu trong biểu hiện SAR bởi

SA Phân tử Mediator MED15 và MED16 cũng tham gia khởi động SAR bởi SA Nhờ vậy SAR biểu hiện nhanh sau khi bị tác nhân gây bệnh tấn công Tính chất này được di truyền cho thế hệ sau theo kiểu epigenetic thông qua cải biến methyl hóa DNA Hormone JA cho tín hiệu khởi động hệ miễn dịch kháng bệnh ISR (Induced systemic

Trang 33

resistance) Trong đó phức jasmonoyl-Isoleucine (JA - Ile) có thể là tín hiệu tạo ISR khởi động đáp ứng phụ thuộc JA Khi đó các tiểu đơn vị MED8, MED16 và MED25 của phức trung gian sẽ tương tác với một số yếu tố phiên mã kiểm soát biểu hiện các gen liên quan JA [33] Sự kết hợp của các hệ thống tín hiệu kích thích đáp ứng kháng bệnh ở thực vật cho phép thực vật có nhiều lựa chọn để có chiến lược và chiến thuật phát triển phản ứng phòng vệ của mình đối với các đối tượng gây bệnh khác nhau Ngược lại các yếu tố gây bệnh cũng tìm cách thích nghi với các hệ thống tín hiệu nói trên để tạo sự thích nghi đặc hiệu đối với thực vật chủ [34]

1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) ở thực vật

Trong cơ thể thực vật luôn tồn tại các gen kháng (resistant genes - R genes) cùng gen điều khiển phản ứng đáp trả ảnh hưởng của môi trường Khi các yếu tố bất lợi (nấm, vi khuẩn, virus, côn trùng, tia UV) tác động đến thực vật sau một thời gian sẽ kích hoạt các gen kháng Tính kháng phát huy chậm dẫn đến tình trạng cây trồng giảm khả năng sinh trưởng phát triển Vì thế cần có biện pháp kích thích các gen kháng hoạt động sớm Gần đây một số chất đã được phát hiện có vai trò này, gọi là chất kích kháng (elicitors) Khi xử lý chất kích kháng trực tiếp trên hạt giống, lá cây, rễ cây hoặc cho vào đất, các cơ chế kháng trong cây trồng sẽ được “đánh thức” giúp cây trồng kháng lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh hay hạn chế tổn thương do tác động từ các yếu

tố môi trường Các cơ chế này bao gồm: Quá trình làm dày thành (vách) tế bào; Sản sinh ra các chất có hại đối với mầm bệnh; Phản ứng siêu mẫn cảm của tế bào để cô lập mầm bệnh [35]

Chất kích kháng không trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh mà chỉ kích hoạt các cơ chế đề kháng trong cây trồng Số lượng và nguồn gốc chất kích kháng rất đa dạng Chất kích kháng có liên quan đến mạng lưới phân tử bệnh thực vật được gây ra bởi các tác nhân gây bệnh thực vật từ bên ngoài gọi là PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) hay từ các tác nhân có khả năng gây hại bên trong gọi là DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) hoặc từ sự tương tác của các vi khuẩn không

gây bệnh (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) như Pseudomonas sp hay Bacillus

sp với thực vật gọi là MAMPs (Microbes-Associated Molecular Patterns)

Trang 34

Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm ở thực vật (A) và cơ chế kích kháng

của chitin (B) [36]

Các elicitor thông qua các thụ quan (receptor) và con đường truyền tín hiệu (perception and signal transduction) tạo nên sự đáp ứng miễn dịch ở thực vật (plant innate immunity) Chất kích kháng có thể phân loại thành hai nhóm: Chất kích kháng tổng quát và chất kích kháng chuyên biệt Chất kích kháng tổng quát có khả năng gây

ra sự đề kháng ở bất cứ loài thực vật chủ nào, trong khi đó các chất kích kháng chuyên biệt chỉ tạo tính kháng ở những vật chủ chuyên biệt Chất kích kháng tổng quát tạo nên các đáp ứng miễn dịch sơ cấp thực vật (primary innate immunity) và PTI (PAMP triggered immunity) Chất kích kháng chuyên biệt tạo ra bởi một vài tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn) phóng thích chất cảm ứng đặc biệt (effector hay còn gọi protein Avr)

ức chế con đường kháng bệnh sơ cấp PTI thực vật, làm cho một số thực vật trở nên mẫn cảm với tác nhân gây bệnh Trong trường hợp này để kháng bệnh, thực vật hoạt hóa một con đường đề kháng thứ hai để tạo ra tính miễn dịch (Secondary innate immunity) hay ETI (Effector-triggered-immunity) thông qua trung gian các gen kháng

R (gen R) dùng trung hòa các sản phẩm gen gây nhiễm (gen Avr) Các chất kích kháng thường không có chung một cấu trúc hóa học, nó là một phổ rộng các nhóm chất khác nhau như oligosaccharide, peptide, protein, glycoprotein và lipid Các chất kích kháng oligosaccharide bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan và oligogalacturonic

Trang 35

Chúng thường là những phân tử từ cấu tạo vách tế bào (glucan, chitin, flagellin vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS), hay những chất được xâm nhập bởi sự tấn công của tác nhân gây bệnh Một vài elicitor có chức năng chưa rõ

Trong tương tác gây bệnh thực vật, elicitor cảm ứng sản xuất các enzyme phân hủy vách tế bào, phóng thích các phân đoạn pectic, oligogalacturonides (OGAs) đóng vai trò các nội elicitor Các elicitor do virus hay côn trùng có thể là các acid béo amino acid liên hợp (Fatty acid Amino acid Conjugates) dẫn tới sự hình thành các hợp chất bay hơi dẫn dụ hay hoạt hóa các gen kháng côn trùng Các elicitor hóa học hoạt hóa tính kháng bao gồm việc tích lũy phytoalexin Các elicitor là những tác nhân phi sinh học (abiotic) như ion kim loại và hợp chất vô cơ hay các chất chuyển hóa từ các sinh vật khác như các chất hóa học phóng thích từ vị trí tấn công hay tích lũy trong hệ thống do bệnh hay côn trùng gây ra [36, 37]

1.4 Chitin/Chitosan và Silic trong kích kháng bệnh cây trồng

Chitin và Silic (Si) là hai nguồn nguyên liệu phổ biến và chiếm tỷ trọng trong sinh khối lớn trên trái đất ngoài cellulose [38,40] Các nghiên cứu trên thực vật cho thấy chitin/chitosan và Silic có vai trò trong kích kháng bệnh thực vật có liên quan đến các elicitor là các tác nhân ion kim loại và hợp chất hữu cơ [39,41]

1.4.1 Vai trò chitin/chitosan trong kích kháng bệnh

Chitin cấu thành bộ xương ngoài của các loài động vật chân đốt bao gồm các loài côn trùng và động vật giáp xác Ngoài ra, chitin còn được tìm thấy trong thành tế bào của nhiều loại vi khuẩn, nấm, tảo và các sinh vật đơn bào khác [38]

Chitin (poly N-acetylglucosamin) là một đại phân tử trùng hợp từ glucosamin liên kết bởi cầu nối β (1-4) glucoside, có trọng lượng phân tử lớn Chitosan là một polyglucosamin được chuyển hóa từ chitin sau khi được khử nhóm acetyl (deacetylation) Mức độ deacetyl hóa ảnh hưởng đén khả năng hòa tan của chitosan trong dung dịch acid loãng Một tính năng đặc biệt của cấu trúc hóa học của chitosan là sự hiện diện của các nhóm amin đã bị oxi hóa Những nhóm này trở thành cation trong môi trường acid thúc đẩy sự hòa tan của chitosan thành các đơn vị poly-

Trang 36

N-acetyl-D-electrolyte trong dung dịch Đây là các sản phẩm tự nhiên, không độc, an toàn với môi trường và được sử dụng rộng rãi [42]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan (DP > 50%) [42]

Các khảo sát về chitin và các phân đoạn thủy phân cho thấy chúng có khả năng tác động trực tiếp chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm và Oomycete thông qua cơ chế gia tăng khả năng đề kháng của cây dựa theo con đường PTI (PAMP triggered Immunity), giúp cây tiết ra các chất kháng lại sự xâm nhập của mầm bệnh [34,37] Bên cạnh đó, khi chitin xâm nhập vào mô cây, thường kết dính quanh các vị trí xâm nhập và có ba tác động chính: Thứ nhất là lập hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan và bảo vệ các tế bào khỏe mạnh khác Tại vị trí cách

ly, cây sẽ nhận biết để kích thích sự phản ứng nhạy cảm giúp tiết ra các oxygen hoạt hóa (Reactive oxygen species, ROS) để giúp tăng cường thành tế bào và báo động cho các tế bào bên cạnh Chitin có điện tích dương và có khả năng bám chặt vào màng sinh học, chitin cung cấp khả năng làm lành vết thương nhanh chóng khi có tổn hại cơ học hay mầm bệnh tấn công Chitin là chất có khả năng kích hoạt các cơ chế phòng thủ của cây, chitin tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ như chitinase, glucanase, các protein kháng bệnh hay các hợp chất phytoalexin để từ đó tiêu diệt mầm bệnh và kích kháng cây trồng [37]

Các nghiên cứu sử dụng chitin và oligochitin cho kích kháng bệnh thực vật cho thấy cơ chế kích kháng bệnh của chitin thông qua con đường PTI với vai trò thụ quan kinase của chitin trong tương tác chitin và thực vật [36,43] Chitin liên kết với

Trang 37

các tiểu phần thụ quan là CEBiP (Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM) và CERK1 (Chitin elicitor receptor kinase 1) trên màng tế bào mở đầu con đường truyền tín hiệu RLCK (Receptor Like cytoplasmic Kinase) dẫn truyền đến RLCK185 qua sự phosphoryl hóa MAPKK (Mitogen activated ptotein kinase) theo tầng để cảm ứng tính kháng bệnh thực vật từ chitin (Hình 1.4B) [36] Một cơ chế

tương tự cũng được tìm thấy trên thụ quan PBL27 của Arabidopsis thaliana Trong

thí nghiệm này phân đoạn oligochitin (DP = 7 - 8) được tìm thấy thích hợp cho con

đường truyền tín hiệu trong Arabidopsis thaliana [45] Kết quả dựa trên cây mô hình

được thực hiện khẳng định vai trò kích kháng thực vật của chitin

Chitosan lần đầu tiên được chứng minh có tính kháng nấm từ năm 1979 bởi Allan và Hadwiger Hiện nay có đến hơn 8.700 công trình nghiên cứu về chitosan và các dẫn xuất được công bố trên các tạp chí Scopus cho thấy chitosan/oligochitosan có nhiều hoạt tính sinh học cũng như kháng khuẩn, kháng nấm, tuyến trùng, kháng côn trùng, kháng stress phi sinh học và chống oxi hóa và được áp dụng rộng rãi trong xử lý môi trường, y học, mỹ phẩm, thực phẩm và nông nghiệp [46, 47, 48, 49]

Mặc dù chitosan, oligochitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin và có nhiều công dụng nhưng hiện nay cơ chế kích kháng bệnh cũng như con đường truyền tín hiệu có liên quan đến chất này vẫn còn đang được tìm kiếm và chưa hoàn toàn được hiểu rõ [50] Việc tìm kiếm các oligochitosan trọng lượng phân tử nhỏ có khả năng kích kháng thực vật, nhiều phân đoạn đã được chọn lọc [51, 52] và nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng như cắt mạch hóa học [53], thủy phân bằng enzyme [54], dùng sóng siêu âm [55] và chiếu xạ tia gamma

Phương pháp cắt mạch hóa học được cho là phương pháp đơn giản nhất Tuy nhiên, phương pháp này thường gặp bất lợi do quá trình cắt mạch thường kèm theo sự thay đổi cấu trúc của chitosan, thường là chitosan bị de-amin hóa và thậm chí là phá

vỡ vòng glucopyranose Ngoài ra, phương pháp cắt mạch hóa học có hiệu suất thấp và nguy cơ ô nhiễm môi trường khá cao

Trang 38

Phương pháp khử sinh học sử dụng các enzyme cắt mạch cho hiệu suất tương đối cao nhưng giá thành đắt hơn so với phương pháp hóa học do nguồn enzyme không phải luôn có sẵn và chi phí cao

Một số nghiên cứu dùng sóng siêu âm chỉ cho phép biến đổi chitosan có khối lượng phân tử lớn thành chitosan có khối lượng phân tử trung bình, chưa tạo được chitosan với trọng lượng phân tử nhỏ

Phương pháp chiếu xạ hiện được xem là kỹ thuật hữu hiệu để cắt mạch chitosan trên quan điểm thân thiện với môi trường Phương pháp này ít gây ra sự thay đổi trong cấu trúc chính của phân tử chitosan, ít ảnh huởng tới độ deacetyl của chitosan Hiện nay, phương pháp chiếu xạ được sử dụng nhiều để chế tạo các oligochitosan với khối lượng phân tử nhỏ có khả năng kích kháng nấm gây bệnh cho cây trồng [56]

Sử dụng phương pháp chiếu xạ (tia γ) cho thấy trọng lượng phân tử trung bình chitin/chitosan thay đổi từ 10 - 100 kDa, trong khi các oligochitosan thường có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa Các nghiên cứu gần đây cho thấy các phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử nhỏ (5 kDa) thường có hoạt tính kháng bệnh cao [57] Ngoài phân đoạn 5 kDa còn các phân đoạn khác chưa được khảo sát, đây là một nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng trong các nghiên cứu liên quan đến tính kháng bệnh một số thực vật và kích thích tăng trưởng ở thực vật như một số oligosaccharide khác [58]

Việc kết hợp phương pháp chiếu xạ và xử lý hóa học trong tạo oligichitosan được xem là điểm mới của nghiên cứu này: làm giảm liều chiếu xạ, kiểm soát hiệu quả hơn quá trình cắt mạch chitosan để tạo ra các phân đoạn oligochitosan có kích thước nhỏ phù hợp

1.4.2 Vai trò Silic trong kích kháng bệnh

Silic (Si) được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp và nhiều lĩnh vực khác nhau Si được báo cáo làm tăng cường tăng trưởng và nâng cao năng suất của thực vật

Si cải thiện một số hình thái và đặc tính cơ học (chiều cao, chỉ số ure, tiếp xúc của lá với ánh sáng, kích kháng) ở một số loài thực vật Si giảm bốc hơi nước và tăng cường

Trang 39

sức đề kháng cho cây trồng chịu hạn, mặn, nhiễm độc kim loại và làm tăng hoạt động của enzyme Si còn tham gia vào sự tái tạo vách tế bào một hàng rào phòng thủ hữu hiệu ở thực vật Si bảo vệ thực vật chống lại stress, không làm ảnh hưởng đến tăng trưởng và năng suất cây trồng

Hơn nữa, Si đã được chứng minh giúp cải thiện sức đề kháng ở nhiều thực vật đối với tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn và virus) khác nhau [59, 60] Việc áp dụng

Si đã được đề xuất như là một biện pháp thay thế cho các biện pháp kỹ thuật thông thường nhằm kiểm soát bệnh trên cây trồng Si có thể cải thiện khả năng chịu áp lực môi trường và tăng sản lượng vụ mùa Hơn nữa, sử dụng Si là một biện pháp phòng ngừa chống lại một số bệnh nấm Hai giả thuyết cho rằng Si nâng cao khả năng kháng nấm bệnh đã được đề xuất Đầu tiên là sự liên kết với lắng đọng cao hơn của Si trong

lá để hình thành các rào cản vật lý để cản trở tác nhân gây bệnh xâm nhập Điều thứ hai có liên quan đến vai trò hoạt tính sinh học và điều hòa biểu hiện gen của nó trong

sự biểu hiện của cơ chế phòng vệ tự nhiên (cơ chế sinh hóa và phân tử) (Hình 1.6)

Đối với giả thuyết Si tăng cường sức đề kháng vật lý, Si đọng lại trên bề mặt là một hàng rào chất bảo vệ thực vật khỏi bị nhiễm trùng nấm Trong mô hình này, sự gia tăng tính kháng đã được kết hợp với một số yếu tố kết hợp tế bào có trong lớp biểu bì của lá hình thành các lớp Si dày bên dưới lớp biểu bì (Hình 1.6B) Lớp Si bên dưới lớp biểu bì có thể là chịu trách nhiệm một phần về mầm bệnh xâm nhập Hơn nữa, Si cũng

có thể tạo ra các phức với các hợp chất hữu cơ trong các vách của các tế bào biểu bì (Si-cellulose), do đó tăng khả năng chống lại sự tấn công của các enzyme do nấm gây bệnh trên thực vật tiết ra Si có thể liên kết với phức hợp lignin-carbohydrat có trong thành tế bào của các tế bào biểu bì [61, 62]

Trang 40

Hình 1.6 Cơ chế phòng vệ (A) và rào phòng thủ vật lý (B) của Si đối với nấm bệnh

[59]

Về giả thuyết thứ hai của kích kháng tăng cường sinh hóa, Si hòa tan trong tế bào thực vật có thể liên quan chặt chẽ với sự gia tăng sức đề kháng với nấm bệnh Trong mô hình này, việc tăng cường sức đề kháng là do sự tăng hoạt động của các enzyme phòng vệ liên quan trong lá như polyphenoloxidase, peroxidase, phenylalanine ammonialyase, chitinase, β-1,3-glucanase sự gia tăng hợp chất kháng nấm, như là sản phẩm chuyển hoá phenolic (lignin), flavonoid, phytoalexin và protein liên quan đến bệnh trên thực vật và sự kích hoạt của một số gen phòng bệnh trên thực vật [63] Hàm lượng acid salicylic, acid jasmonic và ethylene đã được báo cáo gia tăng khi bổ sung Si trong một số tương tác cây chủ-tác nhân gây bệnh phấn

trắng trên Arabidopsis thaliana do Gol cichoracearum và đốm nâu trên lúa do Cochliobolus miyabeanus [64]

Si đóng vai trò như một bộ điều biến của cây chủ để kháng lại mầm bệnh Trong điều kiện tối ưu, biểu hiện gen đã có sự khác biệt đáng kể giữa cây được xử lý

Si và không xử lý Si có thể có khả năng phản ứng phòng vệ hoặc như một chất hoạt

Định dạng
Số trang	169
Dung lượng	4,26 MB